CN103739866A - 一种生物功能化羟丙基纤维素酯类液晶膜的制备及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种生物功能化羟丙基纤维素酯类液晶膜的制备及其应用，属于生物医用材料领域。本发明的制备步骤为：首先通过羟丙基纤维素的酰氯化反应制备低取代烷基酰基羟丙基纤维素酯类液晶；再与戊二酸酐反应，将羧基官能团接枝到羟丙基纤维素酯类液晶上，然后采用溶液浇注法制备液晶膜，薄膜表面的羧基经EDC/NHS活化后，与含RGDS的短肽发生异相反应，获得表面接枝含RGDS短肽的生物功能化羟丙基纤维素酯类液晶。制备的表面固定含RGDS短肽的液晶薄膜，具有类细胞外基质的结构和成分，有效改善细胞-材料之间的相互作用，促进细胞在材料表面的粘附和增殖，可作为细胞模型或细胞支架在组织工程、再生医学等领域应用。
Description
技术领域
本发明属于生物医用材料领域，具体涉及一种生物功能化羟丙基纤维素酯类液晶膜的制备及其应用。
背景技术
生物材料和再生医学的一个基本主题是细胞-材料之间的相互作用，理想的生物材料应能最大程度对细胞或组织产生有益的响应。组织工程是通过应用生命科学和工程化原理，借助生物材料结合细胞和合适的刺激因子实现受损组织的修复和再生的新兴技术。组织工程技术的众多策略之一是设计可以为细胞粘附和结构支架提供初始支撑，并为细胞构成功能性组织提供结构骨架的生物材料。近年来已发展了很多方法对生物材料进行表面改性以改善细胞-基体相互作用从而拓宽其应用前景，其中通过在体外模拟天然微环境发展可以控制细胞行为的模型体系已证实可提供结构性支持和适当的物质传送因此有利于引导组织再生。这些模型体系不仅可提供结构完整性，而且能控制大量信号的转导过程，这个过程直接引导细胞的生存、细胞循环级数及不同显型表达。生物功能化细胞模型体系的构建对调控细胞-基质相互作用提供了一种新思路，在生物医学领域具有重要的应用价值。
液晶相作为一种有序结构，是自然界两大基本法则流动性和有序性通过自组装的有机结合。生命体中的细胞膜、核酸、蛋白质、脂类、多糖等亦都是通过自组装而呈现与细胞形态和组织功能表达有关的液晶态[Y.Bouligand,V.Norris.Chromosome separation and segregation in dinoflagellates and bacteria maydepend on liquid crystalline states[J].Biochimie2001,83,187-192(2001)]，利用溶液中的自组装或细胞表面作用，将生物大分子引入膜中，是生命现象中典型液晶行为的体现。研究表明，新型的生物液晶态薄膜和支架材料，均对细胞的黏附、生长及分化产生很好的促进作用。将与生命结构及特性相似的液晶态结构引入基底材料，已成为生物材料领域仿生设计的一个新的思考角度。生物学家公认的生物膜流体镶嵌模型认为膜糖蛋白是浸泡在二维脂类双亲分子液体膜中的溶致液晶结构，如果把双亲分子脂类分子膜当成普通流体，则无法解释蛋白质在细胞膜上的扩散本领，也无法解释为什么人的红细胞是双碟形而不是其他形状，只有将分子膜视为液晶，并采用液晶膜曲率弹性理论才能让上述现象得到证明。蛋白质的形成、细胞的生成及演化、DNA分子间的信号储存和传递都是通过分子自组装来实现的。生物膜本身也在从事大量精细而高度可控的基于分子自组装的生命活动，如生物膜的变形过程等。分子自组装和生物学的交叉是仿生研究的必由之路，构建自组装结构可以模拟生命的某些过程，以实现最大程度的仿生设计。基于仿生学的角度，国内外一些学者对处于液晶态的生物材料与细胞的相互作用进行了研究，已有的数据显示，这些处于液晶态的生物材料，能很好地促进细胞的粘附及分化，其作用机理的研究也越来越引起人们的关注。因此，从仿生学的角度,对液晶生物材料的研究为人们开发新型的生物材料提供了新的方向。研究显示，生物体内的液晶态均为胆甾相液晶，胆甾醇液晶对细胞膜具有高度的热力学亲和性，并能改变生物膜的渗透性和流动性。胆甾醇的这些优越性质使其被广泛应用在仿生材料设计中。纤维素是分布最广、含量最多的天然大分子多糖，具有良好的生物相容性、可降解性和可再生性，许多的纤维素在一般的溶剂或一定温度下呈现热致和溶致的胆甾型液晶态。
精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸（RGD）序列是纤连蛋白最小的结合域[M.D.Pierschbacher,E.Ruoslahti.The cell attachment activity of fibronectin can beduplicated by small synthetic fragments of the molecule.Nature309,30-33(1984).]，可被细胞表面整合素识别。材料表面的RGD改性已被证明可以通过提高细胞迁移速率而促进细胞的粘附、伸展和伤口的愈合[P.R.Patel,R.C.Kiser,Y.Y.Lu,E.Fong,W.C.Ho,D.A.Tirrell,R.H.Grubbs.Synthesis and cell adhesive properties oflinear and cyclic RGD functionalized polynorbonene thin films.Biomacromolecules13,2546-2553(2012).]。RGD肽链已被用于与多种不同的生物材料结合如透明质酸和聚乙二醇水凝胶、钛合金植入体、聚氨酯和聚二甲基硅烷表面，而在液晶生物材料表面实施RGD功能化仍未有报道。
发明内容
为克服上述现有仿生改性技术的缺陷和不足，本发明的首要目的在于提供一种生物功能化羟丙基纤维素酯类液晶膜的制备方法。该制备方法为通过异相反应在羟丙基纤维素酯类液晶膜表面接枝含RGDS短肽。
本发明的另一目的在于提供上述制备方法获得的生物功能化羟丙基纤维素酯类液晶膜。
本发明的再一目的在于提供上述的生物功能化羟丙基纤维素酯类液晶膜在生物医药领域的应用。
本发明的目的通过下述技术方案实现：一种生物功能化羟丙基纤维素酯类液晶膜的制备方法，包括如下步骤：
（1）将羟丙基纤维素溶于丙酮中形成均相溶液，而后与脂肪酰氯发生反应，产物经水中透析，烘干，得到低取代烷基酰基羟丙基纤维素酯类液晶；
（2）取步骤（1）制备的低取代烷基酰基羟丙基纤维素酯类液晶溶于丙酮溶液，在4-二甲基吡啶催化下与戊二酸酐反应，产物经过水透析后，真空烘干，获得羧基功能化的羟丙基纤维素酯类液晶；
（3）将步骤（2）制备的羧基功能化的羟丙基纤维素酯类液晶溶于四氢呋喃形成均一溶液，采用溶液浇注法在聚丙烯基底上成膜，获得羧基功能化的羟丙基纤维素酯类液晶膜；
（4）用EDC(1-乙基-3-(3-二甲胺基丙基)碳二亚胺碘甲烷盐)/NHS(N-羟基琥珀酰亚胺)/PBS溶液活化步骤（3）制备的液晶膜表面的羧基；
（5）将步骤（4）处理过的液晶膜在RGDS(10-4～10-3M)/PBS溶液中4℃下反应12～24h；纯水浸泡，洗去物理吸附的RGDS，获得生物功能化羟丙基纤维素酯类液晶膜。
步骤（1）中所述羟丙基纤维素分子量为5万～10万；
步骤（1）中所述脂肪酰氯的烷基碳链长度为C3-C8；
步骤（1）中所述的羟丙基纤维素与脂肪酰氯的质量体积比为15g：5～6ml；
步骤（1）中所述反应的反应温度为55～60℃，反应时间为5～6小时，磁力搅拌；
步骤（1）中所述的透析优选为在水中透析3天，每天换水3次；
步骤（1）中所述的烘干优选为在50～55℃真空烘干；
步骤（1）中所述的低取代烷基酰基羟丙基纤维素酯类液晶的侧链烷基酰基的取代度为40～50%；所述的低取代烷基酰基羟丙基纤维素酯类液晶在生理温度下呈现液晶态，其分子链上仍保留50～60%的羟基；
步骤（2）中所述低取代烷基酰基羟丙基纤维素酯类液晶溶于丙酮溶液的质量百分浓度为6～10%；
步骤（2）中所述的戊二酸酐与4-二甲基吡啶的摩尔比为15:10～15:12；
步骤（2）中所述反应的反应温度为50～55℃，反应时间为45～60min；
步骤（2）中戊二酸酐与羟丙基纤维素液晶中羟基的摩尔比为1:1～1.5:1；
步骤（2）中所述的水中透析的透析时间为3～5天，每天更换纯净水3次；
步骤（2）中所述羧基功能化的羟丙基纤维素酯类液晶，在生理温度下呈现液晶态，羧基的取代度为30～40%；
步骤（3）中所述羧基功能化的羟丙基纤维素酯类液晶溶于四氢呋喃形成的溶液质量浓度为5～10%；
步骤（3）中所述的溶液浇注法在聚丙烯基底上成膜具体操作为：溶液浇注在铺有聚丙烯基底膜的玻璃培养皿上，室温下溶剂完全挥发后形成羧基功能化的羟丙基纤维素酯类液晶膜。
步骤（4）中所述的EDC/NHS/PBS溶液为PBS缓冲液作为溶剂，EDC浓度为0.2mol/L，NHS浓度为0.1mol/L，活化温度为4℃，活化时间为4～6小时；
步骤（5）中所述的含RGDS(精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-丝氨酸)的短肽购自Sigma公司；
步骤（5）中通过异相反应把含RGDS(精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-丝氨酸)的短肽接枝到液晶膜表面；
步骤（5）中所述的RGDS/PBS溶液中PBS缓冲液为溶解溶剂，RGDS的浓度为10-4～10-3mol/L；
步骤（5）中所述的纯水浸泡时间为72～96小时，每12小时更换1次纯水。
一种生物功能化羟丙基纤维素酯类液晶膜有上述制备方法获得。制备获得的生物功能化羟丙基纤维素酯类液晶膜为表面接枝含RGDS短肽的羟丙基纤维素酯类液晶膜。
本发明获得的生物功能化羟丙基纤维素酯类液晶膜可作为细胞模型(或支架)在组织工程、再生医学等领域获得广泛应用。
本发明的原理为：首先通过羟丙基纤维素的酰氯化反应制备低取代烷基酰基羟丙基纤维素酯类液晶；再与戊二酸酐反应，将羧基官能团接枝到羟丙基纤维素酯类液晶上，然后采用溶液浇注法制备液晶膜。薄膜表面的羧基经EDC(1-乙基-3-(3-二甲胺基丙基)碳二亚胺碘甲烷盐)/NHS(N-羟基琥珀酰亚胺)活化后，与含RGDS(精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-丝氨酸)的短肽发生异相反应，反应结束后反复清洗，洗去物理吸附的RGDS即得表面接枝含RGDS短肽的生物功能化羟丙基纤维素酯类液晶。本发明制备的表面固定含RGDS短肽的液晶薄膜，具有类细胞外基质的结构和成分，有效改善细胞-材料之间的相互作用，促进细胞在材料表面的粘附和增殖，可作为细胞模型(或细胞支架)在组织工程、再生医学等领域展现广阔的应用前景。
本发明利用异相反应在生物相容性较好的液晶膜表面通过共价键固定含RGDS的短肽，异相反应既保证了RGDS的活性，又能使RGDS均匀分布在材料表面，提高了RGDS的利用率。因此本发明制备的含RGDS短肽功能化液晶膜可显著提高基质与细胞之间的亲和性，是一种新型的生物功能化细胞基质，将来可作为细胞模型体系(或细胞支架)在生物医学工程领域获得广阔的应用前景。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
1.本发明在液晶膜表面引入生物活性分子，液晶作为模拟生物膜结构与性质的软物质，具有良好的细胞相容性，在液晶膜表面接枝含RGDS的短肽系列，为细胞提供结合位点，可进一步提高液晶膜的细胞亲和性。
2.本发明通过异相反应在液晶膜上接枝含RGDS的短肽，既可保证RGDS的活性不被破坏，同时RGDS全部均匀分布在薄膜表面，提高了其生物利用率。
3.本发明制备的生物功能化羟丙基纤维素酯类液晶膜上接枝的RGDS短肽密度达到9.32×10-9mol/cm2，促进细胞在材料表面的粘附和增殖，能够很好的实现细胞亲和性。
4.本发明制备的表面固定含RGDS短肽的液晶薄膜，具有类细胞外基质的结构和成分，有效改善细胞-材料之间的相互作用，促进细胞在材料表面的粘附和增殖。
5.本发明的制备方法工艺简单，制备得到表面固定有含RGDS短肽的纤维素酯类液晶膜可作为细胞模型体系在组织工程、再生医学等领域获得广阔的应用前景。
附图说明
图1为羟丙基纤维素辛酯的偏光显微镜照片。
图2为羟丙基纤维素辛酯-戊二酸酐的偏光显微镜照片。
图3为羟丙基纤维素辛酯-戊二酸酐-RGDS-FITC的荧光显微镜照片。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例
实施例1：羟丙基纤维素丙酯-戊二酸酐液晶的合成及其表面接枝含RGD短肽的制备过程：
（1）3g羟丙基纤维素在丙酮中与1.2mL丙酰氯，55℃，磁力搅拌反应反应6小时后，经水中透析3天，每天换水3次，50℃真空烘干，制得低取代羟丙基纤维素丙酯(PPC)。
（2）3g低取代PPC溶于50mL蒸馏过的丙酮中并加热至50℃，往均质溶液中加入2g戊二酸酐(GA)和0.15g4-二甲基吡啶，磁力搅拌下反应45分钟。把反应产物转移至透析袋中，在超纯水中透析3天，每天换水3次，透析结束后，产物在50℃真空烘箱中烘干，得到产物记作PPC-GA。
（3）PPC-GA溶于四氢呋喃中形成质量浓度为5%的均质溶液，然后通过溶液浇注法在聚丙烯基底膜上形成PPC-GA膜。
（4）制备的PPC-GA膜裁剪成Φ10的尺寸置于24孔板中，每孔加入1mL的EDC(0.2M)/NHS(0.1M)/PBS溶液中，于4℃下活化薄膜表面的羧基4h，取出，清洗。
（5）往活化后的样品中加入1mL RGDS(10-4M)/PBS溶液，在4℃下反应12h。反应结束后，吸去RGDS溶液，加入超纯水浸泡薄膜72h，每12h更换一次水，以洗去物理吸附的RGDS。PPC-GA液晶膜上接枝的含RGDS短肽经水解成氨基酸后，用超高效液相色谱-三重四级杆串联质谱测得密度为2.63×10-11mol/cm2。[检测方法参考如下文献：C.Deng,X.Chen,H.Yu,J.Sun,T.Lu,X.Jing.A biodegradable triblock copolymer poly(ethyleneglycol)-b-poly(L-lactide)-b-poly(L-lysine):Synthesis,self-assembly,and RGDpeptide modification]
实施例2：羟丙基纤维素丁酯-戊二酸酐液晶的合成及其表面接枝含RGDS短肽的制备步骤：
（1）3g羟丙基纤维素在丙酮中与1mL丁酰氯，60℃，磁力搅拌反应5小时后，经水透析，55℃真空烘干，制得低取代羟丙基纤维素丁酯(BPC)。
（2）3g低取代BPC溶于50mL蒸馏过的丙酮中并加热至50℃，往均质溶液中加入2g戊二酸酐(GA)和0.15g4-二甲基吡啶，磁力搅拌下反应45分钟。把反应产物转移至透析袋中，在超纯水中透析5天，每天换水3次，透析结束后，产物在50℃真空烘箱中烘干，得到产物记作BPC-GA。
（3）BPC-GA溶于四氢呋喃中形成质量浓度5%的均质溶液，然后通过溶液浇注法在聚丙烯基底膜上形成BPC-GA膜。
（4）制备的BPC-GA膜裁剪成Φ10的尺寸置于24孔板中，每孔加入1mL的EDC(0.2M)/NHS(0.1M)/PBS溶液中，于4℃下活化薄膜表面的羧基4h，取出，清洗。
（5）往活化后的样品中加入1mL RGDS(10-4M)/PBS溶液，在4℃下反应12h。反应结束后，吸去RGDS溶液，加入超纯水浸泡薄膜72h，每12h更换一次水，以洗去物理吸附的RGDS。BPC-GA液晶膜上接枝的含RGDS短肽经水解成氨基酸后，用超高效液相色谱-三重四级杆串联质谱测得密度为2.63×10-11mol/cm2。[检测方法参考如下文献：C.Deng,X.Chen,H.Yu,J.Sun,T.Lu,X.Jing.A biodegradable triblock copolymer poly(ethyleneglycol)-b-poly(L-lactide)-b-poly(L-lysine):Synthesis,self-assembly,and RGDpeptide modification]
实施例3：羟丙基纤维素辛酯(OPC)-戊二酸酐膜表面接枝含RGD短肽的制备，包括如下步骤：
（1）3g羟丙基纤维素在丙酮中与1mL辛酰氯，60℃，磁力搅拌反应4小时后，经水透析，55℃真空烘干，制得低取代羟丙基纤维素辛酯(OPC)。
（2）5g低取代OPC溶于50mL蒸馏过的丙酮中并加热至50℃，往均质溶液中加入3g戊二酸酐和0.225g4-二甲基吡啶，磁力搅拌下反应1小时。反应结束后，把反应产物转移至透析袋中，在超纯水中透析5天，每天换水3次，除去副产物和未反应的小分子。透析结束后，产物在50℃真空烘箱中烘干，除尽水分，得到产物，记作羟丙基纤维素辛酯(OPC)-戊二酸酐（OPC-GA）。
（3）OPC-GA溶于四氢呋喃中形成质量浓度5%的均质溶液，然后通过溶液浇注法在聚丙烯基底膜上形成OPC-GA膜。
（4）制备的OPC-GA膜裁剪成Φ10的尺寸置于24孔板中，每孔加入1mL的EDC(0.2M)/NHS(0.1M)/PBS溶液中，于4℃下活化薄膜表面的羧基4h。
（5）吸去步骤（4）中的溶液，加入超纯水反复清洗15min，然后往活化后的样品中加入1mL RGDS(10-3M)/PBS溶液，在4℃下反应过夜。反应结束后，吸去RGDS溶液，加入超纯水浸泡薄膜72h，每12h更换一次水，以洗去物理吸附的RGDS，获得羟丙基纤维素辛酯-戊二酸酐-RGDS液晶膜。OPC-GA液晶膜上接枝的含RGDS短肽经水解成氨基酸后，用超高效液相色谱-三重四级杆串联质谱测得密度为9.32×10-9mol/cm2。[检测方法参考如下文献：C.Deng,X.Chen,H.Yu,J.Sun,T.Lu,X.Jing.A biodegradable triblock copolymerpoly(ethylene glycol)-b-poly(L-lactide)-b-poly(L-lysine):Synthesis,self-assembly,and RGD peptide modification]。
上述步骤（1）制备获得的羟丙基纤维素辛酯(OPC)的偏光显微镜照片见图1，图中显示OPC在偏光下为彩色油状织构，具有典型的胆甾醇液晶的特征。
上述步骤（2）中制备获得的羟丙基纤维素辛酯-戊二酸酐的偏光显微镜照片图见图2，图中显示羟丙基纤维素辛酯-戊二酸酐偏光下也显示典型的胆甾醇液晶的彩色油状织构。
上述实施例3步骤（5）中的RGDS用经FITC标记的RGDS，即RGDS-FITC(购自Sigma公司)等摩尔量替代，制备获得的羟丙基纤维素辛酯-戊二酸酐-RGDS-FITC，荧光显微镜下观察，激发波长494nm，发射波长520nm，可激发出绿色荧光。荧光显微镜照片图如图3所示，图中绿色荧光为FITC标记的RGDS，可见RGDS均匀地分布在材料表面。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种生物功能化羟丙基纤维素酯类液晶膜的制备方法，其特征在于包括如下步骤：
（1）将羟丙基纤维素溶于丙酮中形成均相溶液，而后与脂肪酰氯发生反应，产物经水中透析，烘干，得到低取代烷基酰基羟丙基纤维素酯类液晶；
（2）取步骤（1）制备的低取代烷基酰基羟丙基纤维素酯类液晶溶于丙酮溶液，在4-二甲基吡啶催化下与戊二酸酐反应，产物经过水透析后，真空烘干，获得羧基功能化的羟丙基纤维素酯类液晶；
（3）将步骤（2）制备的羧基功能化的羟丙基纤维素酯类液晶溶于四氢呋喃形成均一溶液，采用溶液浇注法在聚丙烯基底上成膜，获得羧基功能化的羟丙基纤维素酯类液晶膜；
（4）用EDC/NHS/PBS溶液活化步骤（3）制备的液晶膜表面的羧基；
（5）将步骤（4）处理过的液晶膜在RGDS/PBS溶液中4℃下反应12～24h；纯水浸泡，洗去物理吸附的RGDS，获得生物功能化羟丙基纤维素酯类液晶膜。
2.根据权利要求1所述的生物功能化羟丙基纤维素酯类液晶膜的制备方法，其特征在于：步骤（1）中所述羟丙基纤维素分子量为5万～10万；
步骤（1）中所述脂肪酰氯的烷基碳链长度为C3-C8；
步骤（1）中所述的羟丙基纤维素与脂肪酰氯的质量体积比为15g：5～6ml。
3.根据权利要求1所述的生物功能化羟丙基纤维素酯类液晶膜的制备方法，其特征在于：步骤（1）中所述反应的反应温度为55～60℃，反应时间为5～6小时，磁力搅拌；
步骤（1）中所述的透析为在水中透析3天，每天换水3次；
步骤（1）中所述的烘干为在50～55℃真空烘干；
步骤（1）中所述的低取代烷基酰基羟丙基纤维素酯类液晶的侧链烷基酰基的取代度为40～50%。
4.根据权利要求1所述的生物功能化羟丙基纤维素酯类液晶膜的制备方法，其特征在于：步骤（2）中所述低取代烷基酰基羟丙基纤维素酯类液晶溶于丙酮溶液的质量百分浓度为6～10%；
步骤（2）中所述的戊二酸酐与4-二甲基吡啶的摩尔比为15:10～15:12；
步骤（2）中所述反应的反应温度为50～55℃，反应时间为45～60min。
5.根据权利要求1所述的生物功能化羟丙基纤维素酯类液晶膜的制备方法，其特征在于：步骤（2）中戊二酸酐与羟丙基纤维素液晶中羟基的摩尔比为1:1～1.5:1；
步骤（2）中所述的水中透析的透析时间为3～5天，每天更换纯净水3次。
6.根据权利要求1所述的生物功能化羟丙基纤维素酯类液晶膜的制备方法，其特征在于：步骤（3）中所述羧基功能化的羟丙基纤维素酯类液晶溶于四氢呋喃形成的溶液质量浓度为5～10%；
步骤（3）中所述的溶液浇注法在聚丙烯基底上成膜具体操作为：溶液浇注在铺有聚丙烯基底膜的玻璃培养皿上，室温下溶剂完全挥发后形成羧基功能化的羟丙基纤维素酯类液晶膜。
7.根据权利要求1所述的生物功能化羟丙基纤维素酯类液晶膜的制备方法，其特征在于：步骤（4）中所述的EDC/NHS/PBS溶液为PBS缓冲液作为溶剂，EDC浓度为0.2mol/L，NHS浓度为0.1mol/L，活化温度为4℃，活化时间为4～6小时。
8.根据权利要求1所述的生物功能化羟丙基纤维素酯类液晶膜的制备方法，其特征在于：步骤（5）中所述的RGDS/PBS溶液中PBS缓冲液为溶解溶剂，RGDS的浓度为10-4～10-3mol/L；
步骤（5）中所述的纯水浸泡时间为72～96小时，每12小时更换1次纯水。
9.一种生物功能化羟丙基纤维素酯类液晶膜由权利要求1～8任一项所述的制备方法获得。
10.权利要求9所述的生物功能化羟丙基纤维素酯类液晶膜作为细胞模型或支架在组织工程、再生医学领域应用。
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2013
- 2013-12-19 CN CN201310713996.6A patent/CN103739866B/zh active Active
Patent Citations (2)
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