CN103739659A - 一种化合物、其提取方法、其制备抗肿瘤药物的应用及其制备的抗肿瘤药物 - Google Patents

Abstract

本发明涉及药物化学技术领域，特别涉及一种化合物、其提取方法、其制备抗肿瘤药物的应用及其制备的抗肿瘤药物；本发明提供的化合物提取自油茶根，结构鉴定结果显示，该化合物为新化合物，结构如式Ⅰ所示；体外细胞试验表明，式Ⅰ所示化合物作用24h后，对人肺癌A549细胞、B16小鼠黑素瘤细胞、人肝癌BEL-7402细胞和人乳腺癌细胞MCF-7细胞的生长具有显著（P<0.05）的抑制作用；小鼠移植瘤模型试验表明，该化合物对小鼠肝癌H₂₂移植瘤和小鼠S₁₈₀肉瘤的生长具有非常显著（P<0.01）的抑制作用，量效关系明显。

Description

一种化合物、其提取方法、其制备抗肿瘤药物的应用及其制备的抗肿瘤药物

技术领域

本发明涉及药物化学技术领域，特别涉及一种化合物、其提取方法、其制备抗肿瘤药物的应用及其制备的抗肿瘤药物。

背景技术

油茶（CameLLia oLeifera AbeL）属于山茶科（Theaceae）山茶属（CameLLiaLinn），是一种常绿小乔木。因其种子可榨油（茶油）供食用，故名油茶。油茶主要分布于热带及亚热带地区，产于我国的西南部和东南部，遍布17个省区。茶油的不饱和脂肪酸含量高达90%，远远高于菜油、花生油和豆油，与橄榄油比维生素E含量高一倍，具有极高的营养价值，因此茶油备受关注。

此外，油茶还有很高的药用价值，《本草纲目》中记载：“茶籽，苦寒香毒（皂素），主治喘急咳嗽，去疾垢”；《中华本草》也有记载，油茶的根及其根皮具有清热解毒、理气止痛、活血消肿的功效，主治咽喉肿痛、胃痛、牙痛、跌打伤痛、水火烫伤，其疗效远远超过茶油。但油茶的药用价值未受到足够重视。

近年来，人们对油茶的化学成分和生物活性进行了研究，目前，已经从油茶的茶子心、茶油、茶子饼、油茶叶中分离得到皂苷类、黄酮类、脂肪酸类、鞣质、芳香苷类、生物碱等化合物。研究发现，部分皂苷类化合物具有肠胃保护、降血脂、减肥、抗过敏或抗肿瘤的功效。马丽媛等发现，油茶茶子饼中95%以上的油茶总皂苷具有显著的抗肿瘤活性。因此，油茶皂苷具有很高的药用价值。油茶皂苷主要提取自油茶，但之前人们对油茶研究多集中在茶子心、茶子饼、油茶叶、茶油中，对油茶根研究较少，油茶根中可能存在未被发现的具生物活性的油茶皂苷类化合物，因此，对油茶根中皂苷成分的研究具有重要的意义。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了一种化合物、其提取方法、其制备抗肿瘤药物的应用及其制备的抗肿瘤药物。本发明通过体外细胞试验和动物移植瘤试验发现，式Ⅰ所示化合物对人体多种癌细胞的生长具有显著的抑制作用。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种如式Ⅰ所示结构的化合物：

式Ⅰ。

本发明还提供了一种如式Ⅰ所示结构的化合物的提取方法，包含以下步骤：

步骤1：将油茶根粉碎，取第一溶剂提取，浓缩，得到流浸膏；

步骤2：取流浸膏与水混合，过滤，收集滤液，离心，收集上清液，再经D101型大孔树脂柱分离，取乙醇-水系统梯度洗脱，收集乙醇和水体积比为70：30～95：5洗脱所得组分，分离、纯化，即得；

第一溶剂为乙醇和水体积比为0：100～95：5。

作为优选，油茶根粉碎的目数为10目～60目。

作为优选，第一溶剂为乙醇和水体积比为20：80～80：20。

更优选的，第一溶剂为乙醇和水体积比为70：30。

作为优选，步骤2取流浸膏与水混合步骤中，流浸膏与水的体积比为1：1～10，所用水的量达到将流浸膏溶解的目的即可。

作用优选，过滤所用滤布的目数为100～300目。

作为优选，分离、纯化的技术为沉析技术、结晶技术或色谱技术中的任意一种或两者以上的技术，但不限于以上技术。

作为优选，分离、纯化的技术为色谱技术。

作为优选，分离、纯化具体为：取组分经硅胶柱分离，取氯仿-甲醇系统梯度洗脱，收集氯仿和甲醇体积比为80：20～60：40洗脱所得组分；再经ODS柱分离，取甲醇-水系统梯度洗脱，收集甲醇和水体积比为70：30～90：10洗脱所得组分；再经动态轴向压缩柱分离，取甲醇-水系统梯度洗脱，收集甲醇和水体积比为75：25洗脱所得组分；最后通过高效液相色谱分离，采用C₁₈色谱柱，第二溶剂洗脱，流速为2mL/min，收集39.0min组分，即得；

第二溶剂为：甲醇和水按体积比为72：28组成的混合溶液再与占混合溶液质量百分含量为0.2%的甲酸混合所得的混合物。

C₁₈色谱柱的规格为250mm×10mm，填料粒度为5μm。

作为优选，硅胶柱为减压硅胶柱。

作为优选，硅胶柱中硅胶的目数为60～100目。

作为优选，氯仿-甲醇系统梯度洗脱的溶剂依次为氯仿和甲醇体积比为90：10→80：20→70：30→60：40→50：50→30：70→20：80→0：100。

作为优选，ODS柱为中压反相ODS柱。

作为优选，中压反相ODS柱的规格为：460mm×26mm。

作为优选，ODS柱梯度洗脱的溶剂为甲醇和水体积比为50：50～100：0。

作为优选，ODS柱梯度洗脱的溶剂为甲醇和水体积比为50：50→60：40→70：30→80：20→90：10。

作为优选，ODS柱流速为25mL/min。

作为优选，ODS柱的检测波长为203nm。

作为优选，动态轴向压缩柱为ODS柱。

作为优选，动态轴向压缩柱的规格为：650mm×100mm，30μm，1500g；NewstyLe。

作为优选，动态轴向压缩柱梯度洗脱的溶剂依次为甲醇和水体积比为60：40→75：25→80：20→90：10。

作为优选，动态轴向压缩柱的流速为150mL/min。

作为优选，动态轴向压缩柱的检测波长为203nm。

作为优选，高效液相色谱为半制备高效液相色谱。

作为优选，半制备高效液相色谱的检测波长为203nm。

作为优选，化合物检测方法包含薄层板分析、高效液相色谱分析。

作为优选，式Ⅰ所示结构的化合物的检测波长为203nm。

作为优选，步骤2梯度洗脱的溶剂依次为乙醇和水体积比为0：100→30：70→50：50→60：40→70：30→80：20→95：5。

作为优选，步骤1所述提取的温度为40℃～100℃，步骤1所述提取的时间为1h～15.5h。

作为优选，步骤1提取的温度为80℃～90℃，步骤1提取的时间为1.5h～2.5h。

作为优选，提取包括浸泡、回流提取、过滤和收集滤液步骤。

作为优选，浸泡步骤中，以g/mL计，油茶根与第一溶剂的质量体积比为1：5～20。

更优选的，浸泡步骤中，以g/mL计，油茶根与第一溶剂的质量体积比为1：5～15。

更优选的，浸泡步骤中，以g/mL计，油茶根与第一溶剂的质量体积比为1：10。

步骤1提取过程中，第一溶剂只要过量均可达到相近效果，均在本发明的保护范围内。

作为优选，浸泡的时间为10h～12h，浸泡的温度为30℃～50℃。

作为优选，回流提取的温度为80℃～85℃。

更优选的，回流提取的温度为80℃。

作为优选，回流提取的时间为0.5h～3h。

更优选的，回流提取的时间为2.0h。

作为优选，回流提取的次数为1～3次。

更优选的，回流提取的次数为2次。

过滤步骤可以在每次回流提取后进行，也可以在回流提取2～3次后进行，收集全部滤液，即为提取液。

作为优选，过滤步骤在每次回流提取后进行，过滤所得滤渣再与第一溶剂混合，进行下一次回流提取。

作为优选，以g/mL计，滤渣与第一溶剂的质量体积比为1：3～20。

作为优选，步骤1所述浓缩的温度为80℃～100℃，步骤1所述浓缩的时间为2h～5h。

作为优选，步骤1浓缩的温度为80℃～85℃，步骤1浓缩的时间为3h～4h。

作为优选，浓缩为减压浓缩。

作为优选，浓缩的倍数为20～100倍。

本发明还提供了式Ⅰ所示结构的化合物在制备抗肿瘤药物中的应用。本发明首先通过MTT法测定药物对肿瘤细胞株的抑制作用。MTT法，又称MTT比色法，是一种检测细胞存活和生长的方法。其检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒（Formazan）并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。二甲基亚砜（DMSO）能溶解细胞中的甲瓒，用酶联免疫检测仪在490nm波长处测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量。在一定细胞数范围内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比。该方法已广泛用于一些生物活性因子的活性检测、大规模的抗肿瘤药物筛选、细胞毒性试验以及肿瘤放射敏感性测定等。它的特点是灵敏度高、经济。因此，本试验采用MTT法对受试药物进行筛选。本研究将人肺癌A549细胞，B16小鼠黑素瘤细胞，人肝癌BEL-7402细胞和人乳腺癌细胞MCF-7，作为受试细胞，并将受试药物的作用时间设为24h。试验结果表明，本发明提供的式Ⅰ所示化合物作用24h后，对人肺癌A549细胞、B16小鼠黑素瘤细胞、人肝癌BEL-7402细胞和人乳腺癌细胞MCF-7细胞在的IC₅₀值均小于30μg/mL，且对人肺癌A549细胞、人肝癌BEL-7402细胞生长的抑制作用显著优于（P<0.05）阳性对照5-FU。由此可见，式Ⅰ所示化合物对上述4种肿瘤细胞的生长具有显著的抑制作用。

本发明还通过小鼠移植瘤模型试验测试该化合物的抑瘤效果，结果表明，式Ⅰ所示化合物对小鼠肝癌H₂₂移植瘤和小鼠S₁₈₀肉瘤的生长具有非常显著（P<0.01）的抑制作用，量效关系明显，其中对小鼠S₁₈₀肉瘤生长的抑制作用显著优于阳性对照CTX，因此，本发明提供了式Ⅰ所示结构的化合物在制备抗肿瘤药物中的应用。

作为优选，肿瘤为肺癌、肝癌、黑素瘤或乳腺癌。肿瘤还可以为本发明没有公开，但有抑制效果的其他种类的肿瘤。

本发明还提供了一种抗肿瘤药物，其包含式Ⅰ所示结构的化合物及药学上可接受的辅料。

本发明抗肿瘤药物的剂型可以为本领域可实现的任意剂型，所用辅料为所用剂型的常规辅料，制备方法为相应剂型的常规制备方法。

作为优选，抗肿瘤药物的剂型为散剂、片剂、颗粒剂、胶囊剂、溶液剂、乳剂、混悬剂、注射液、粉针剂或喷雾剂。

本发明提供了一种如式Ⅰ所示结构的化合物，该化合物由油茶根中提取获得，结构鉴定结果显示，该化合物为新化合物，命名为：21β-O-当归酰基-22α-O-(2-甲基丁酰基)-15α,16α,28-三羟基齐墩果-12-烯-23-醛3β-O-β-D-木糖-(1→2)-β-D-半乳糖-(1→3)-[β-D-半乳糖-(1→2)]-β-D-葡萄糖醛酸苷。本发明采用MTT法进行体外细胞试验，结果表明，本发明提供的式Ⅰ所示化合物作用24h后，对人肺癌A549细胞、B16小鼠黑素瘤细胞、人肝癌BEL-7402细胞和人乳腺癌细胞MCF-7细胞的IC₅₀值均小于30μg/mL，且对人肺癌A549细胞、人肝癌BEL-7402细胞生长的抑制作用显著优于（P<0.05）阳性对照5-FU。由此可见，式Ⅰ所示化合物对上述4种肿瘤细胞的生长具有显著的抑制作用。本发明还通过小鼠移植瘤模型试验测试该化合物的抑瘤效果，测试结果表明，式Ⅰ所示化合物对小鼠肝癌H22移植瘤和小鼠S₁₈₀肉瘤的生长具有非常显著（P<0.01）的抑制作用，量效关系明显，其中对小鼠S₁₈₀肉瘤生长的抑制作用显著优于阳性对照CTX，因此，本发明提供的式Ⅰ所示化合物还可用于制备抗肿瘤药物。

附图说明

图1是21β-O-当归酰基-22α-O-(2-甲基丁酰基)-15α,16α,28-三羟基齐墩果-12-烯-23-醛3β-O-β-D-木糖-(1→2)-β-D-半乳糖-(1→3)-[β-D-半乳糖-(1→2)]-β-D-葡萄糖醛酸苷的高分辨质谱谱图；

图2是21β-O-当归酰基-22α-O-(2-甲基丁酰基)-15α,16α,28-三羟基齐墩果-12-烯-23-醛3β-O-β-D-木糖-(1→2)-β-D-半乳糖-(1→3)-[β-D-半乳糖-(1→2)]-β-D-葡萄糖醛酸苷的核磁共振氢谱图；

图3是21β-O-当归酰基-22α-O-(2-甲基丁酰基)-15α,16α,28-三羟基齐墩果-12-烯-23-醛3β-O-β-D-木糖-(1→2)-β-D-半乳糖-(1→3)-[β-D-半乳糖-(1→2)]-β-D-葡萄糖醛酸苷的核磁共振氢谱图（放大图）；

图4是21β-O-当归酰基-22α-O-(2-甲基丁酰基)-15α,16α,28-三羟基齐墩果-12-烯-23-醛3β-O-β-D-木糖-(1→2)-β-D-半乳糖-(1→3)-[β-D-半乳糖-(1→2)]-β-D-葡萄糖醛酸苷的核磁共振氢谱图（放大图）；

图5是21β-O-当归酰基-22α-O-(2-甲基丁酰基)-15α,16α,28-三羟基齐墩果-12-烯-23-醛3β-O-β-D-木糖-(1→2)-β-D-半乳糖-(1→3)-[β-D-半乳糖-(1→2)]-β-D-葡萄糖醛酸苷的核磁共振碳谱图；

图6是21β-O-当归酰基-22α-O-(2-甲基丁酰基)-15α,16α,28-三羟基齐墩果-12-烯-23-醛3β-O-β-D-木糖-(1→2)-β-D-半乳糖-(1→3)-[β-D-半乳糖-(1→2)]-β-D-葡萄糖醛酸苷的核磁共振碳谱图（放大图）；

图7是21β-O-当归酰基-22α-O-(2-甲基丁酰基)-15α,16α,28-三羟基齐墩果-12-烯-23-醛3β-O-β-D-木糖-(1→2)-β-D-半乳糖-(1→3)-[β-D-半乳糖-(1→2)]-β-D-葡萄糖醛酸苷的HSQC图；

图8是21β-O-当归酰基-22α-O-(2-甲基丁酰基)-15α,16α,28-三羟基齐墩果-12-烯-23-醛3β-O-β-D-木糖-(1→2)-β-D-半乳糖-(1→3)-[β-D-半乳糖-(1→2)]-β-D-葡萄糖醛酸苷的HMBC图；

图9是21β-O-当归酰基-22α-O-(2-甲基丁酰基)-15α,16α,28-三羟基齐墩果-12-烯-23-醛3β-O-β-D-木糖-(1→2)-β-D-半乳糖-(1→3)-[β-D-半乳糖-(1→2)]-β-D-葡萄糖醛酸苷的¹H-¹H COSY图；

图10是21β-O-当归酰基-22α-O-(2-甲基丁酰基)-15α,16α,28-三羟基齐墩果-12-烯-23-醛3β-O-β-D-木糖-(1→2)-β-D-半乳糖-(1→3)-[β-D-半乳糖-(1→2)]-β-D-葡萄糖醛酸苷的NOESY图。

具体实施方式

本发明提供了一种化合物、其提取方法、其制备抗肿瘤药物的应用及其制备的抗肿瘤药物。本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

本发明实施例中用到的材料和试剂均可由市场购得，在本发明实施例中，原料来源具体如下：

核磁共振仪500Hz(Varian Inc.,Palo Alto,CA,美国)；高分辨质谱Q-TOF2（英国Micromass公司）；电子天平（梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司）；旋光仪241(PerkinElmer Inc.,Waltham,MA,美国)；半制备高效液相色谱仪（LC-20AT，SPD-20A，日本岛津公司）；C18半制备色谱柱（250mm×10mm，5μm，美国Kromsil公司）；中压制备液相色谱（Büchi色谱系统，C-650泵，中压柱(460mm×26mm i.d.,Büchi Corp.,Flawil,Swiss);动态轴向柱色谱（NP7000泵(Newstyle),NU3000UV-VIS检测器(Newstyle)和ODS柱(650mm×100mm,30μm,1500g;Newstyle)；旋转蒸发仪（东京理化器械独资工厂）；化学试剂（分析纯，国药集团化学试剂有限公司）；薄层色谱硅胶板（HSGF254，烟台市芝罘黄务硅胶开发试验厂出品）；各种柱色谱用硅胶均为青岛海洋化工厂出品。

人肺癌A549细胞，B16小鼠黑素瘤细胞，人肝癌BEL-7402细胞和人乳腺癌细胞MCF-7，均购于中国科学院上海细胞所。

H22小鼠肝癌(肉瘤)细胞：购于中科院上海细胞库。

S180小鼠肝癌(肉瘤)细胞：购于中科院上海细胞库。

ICR小鼠：清洁级，雄性，体重18-22g，由上海斯莱克实验动物有限公司提供。

小鼠：品种为ICR，由上海斯莱克实验动物有限公司购得，实验动物生产许可证号SCXK(沪)2007-0005。

完全培养基：配方为含10%灭活胎牛血清的RPMI1640培养基，生产厂家为美国GIBCOBRL公司。

其余试剂及材料均由市场购得。

下面结合实施例，进一步阐述本发明：

实施例1化合物的提取

取干燥的油茶根2kg，用粉碎机粉碎成10-40目的木屑，经6L水50℃浸泡12h后，在100℃下加热回流0.5h，过滤，滤渣再加入10L水，在80℃下加热回流3.0h，过滤，滤渣再与6L的20%乙醇混合，100℃下加热回流2h，合并三次过滤所得滤液，在85℃下减压浓缩4h，得到流浸膏500mL。

取制得的流浸膏与5.5L水混合，100目滤布过滤，离心滤液，取上清液经D101型大孔树脂柱分离，依次用水、30%乙醇、50%乙醇、60%乙醇、70%乙醇、80%乙醇、95%乙醇洗脱，收集70%乙醇～95%乙醇洗脱所得的组分，减压浓缩，得到油茶总皂苷。

取制得的油茶总皂苷先经60目硅胶的减压硅胶柱分离，依次用氯仿和甲醇体积比为90：10→80：20→70：30→60：40→50：50→40：60→20：80→0：100梯度洗脱，得到组分1～组分8，经薄层板分析，合并其中的氯仿和甲醇体积比80:20～60:40洗脱所得组分（展开剂系统为BAW系统时，Rf值为0.4-0.7），再经中压反相ODS柱分离，甲醇-水系统50：50→60：40→70：30→80：20→90：10梯度洗脱，流速25mL/min，检测波长为203nm，得到6个组分，经过高效分析液相分析，用甲醇和水体积比为60:40～90:10梯度洗脱30min，合并甲醇和水体积比为70:30～90:10的组分（峰位于20min-28min），经动态轴向压缩柱分离，分别用60%、75%、80%和90%的甲醇洗脱，流速150mL/min，检测波长203nm，共得到五个组分，经高效分析液相分析，将75%甲醇洗脱所得组分（峰位于13.5-15.0min）通过半制备高效液相分离，甲醇-水(72:28，v/v)-0.2%甲酸洗脱洗脱，设定流速为2mL/min，检测波长203nm，于39.0min处得到白色无定形粉末63mg。

取制得的白色无定形粉末，检测显色特性、水解特性，再经¹H-NMR，¹³C-NMR，HMBC，HSQC，¹H-¹H COSY，NOESY和HR-ESI-MS进行波谱解析，波谱数据图如图1～图10所示，NMR数据如表1所示，结构解析过程如下：经显色分析，硫酸乙醇显紫红色斑点，醋酐-浓硫酸反应阳性，Molish反应阳性，提示该化合物可能为皂苷类化合物。图1所示的质谱显示，该化合物的HR-ESI-MS的准离子峰m/z1317.6122[M-H]^-，表明该化合物的分子式为C₆₃H₉₈O₂₉(计算值[M-H]-，m/z1317.6116，计算值是根据分子式，由最高丰度精确值计算而来)。用2N TFA完全酸水解得到单糖，糖经衍生化后进行GC分析，检测到D-葡萄糖醛酸、D-半乳糖、D-木糖的存在。

图5、图6的化合物的¹³C-NMR谱谱图可知，此化合物共显示有63个碳信号（如表1所示)，图7所示的化合物的HSQC谱可知，该化合物共含有10个甲基碳，11个亚甲基碳，31个次甲基碳以及11个季碳。进一步分析¹³C-NMR谱，该谱图显示出四个糖端基碳信号δ104.3,101.8,107.9和103.1，分别是D-葡萄糖醛酸、D-半乳糖、D-木糖以及另外一个D-半乳糖的端基碳。此外，还有一个位于低场区δ210.2的醛基碳信号。由图2、图3、图4所示的化合物的氢谱图可知，¹H-NMR谱中高场区有六个明显的三萜皂苷角甲基氢信号δ0.88(Me-25),1.04(Me-26),1.17(Me-29),1.38(Me-30),1.54(Me-24)和1.89(Me-27)；一个连氧亚甲基δ3.55(H-28,d,J=11.0Hz)和3.82(H-28,d,J=11.0Hz)；五个连氧次甲基δ4.11(1H,dd,J=11.0,4.5Hz,H-3),4.23(1H,brs,H-15),4.46(1H,brs,H-16),6.73(1H,d,J=10.5Hz,H-21)和6.34(1H,d,J=10.5Hz,H-22)；一个烯氢质子δ5.56(1H,brs,H-12)以及一个醛基氢质子δ9.96(1H,brs,H-23)。此外，化合物的¹H-NMR谱还显示出一组当归酰基信号δ[6.16(1H,dq,J=7.5,1.5Hz,21-O-Ang-3'),2.25(3H,d,J=7.5Hz,21-O-Ang-4')和2.12(3H,s,21-O-Ang-5')]；以及一组2-甲基丁酰基信号δ[2.15(1H,m,22-O-MB-2''),1.30(1H,m,22-O-MB-3''a),1.67(1H,m,22-O-MB-3''b),0.75(3H,t,J=7.5Hz,22-O-MB-4'')和1.10(3H,d,J=6.5Hz,22-O-MB-5'')]。

由图9所示的¹H-¹H COSY谱中可知，与连氧次甲基质子相邻的次甲基δ_H4.23(1H,brs)与δ_H4.46(1H,brs)相关,说明它们处在邻位且δ_H4.46为H-16信号，δ_H4.23为H-15信号；δ_H6.73(1H,d,J=10.5Hz)与δ_H6.34(1H,d,J=10.5Hz)间的相关信号说明它们处在邻位且δ_H6.73为H-21信号，δ_H6.34为H-22信号。

通过图8所示的化合物的HMBC谱图分析得知，该当归酰基连在化合物的21位上，而2-甲基丁酰基连在该化合物22位上，因为在HMBC中δ_H6.73(1H,d,J=10.5Hz,H-21)与δ_C167.8(21-O-Ang-1')相关，δ_H6.34(1H,d,J=10.5Hz,H-22)与δ_C176.8(22-O-MB-1'')相关。结合¹³C-NMR谱和¹H-NMR谱数据进行综合分析，并且与文献“Helvetica Chimica Acta2013.96,1126-1133”报道的已知苷元(21β-O-当归酰基-22α-O-(2-甲基丁酰基)-15α,16α,28-三羟基齐墩果-12-烯-23-醛)的核磁数据对比，确定该化合物的苷元结构为21β-O-当归酰基-22α-O-(2-甲基丁酰基)-15α,16α,28-三羟基齐墩果-12-烯-23-醛。

对化合物如图7所示的HSQC谱图进行分析，归属了该皂苷上连接的糖的端基碳、氢信号，如下：δ_H4.83(1H,d,J=6.5Hz),5.80(1H,d,J=7.5Hz),5.10(1H,d,J=7.0Hz)和5.96(1H,d,J=7.5Hz),分别连在δ_C104.3(葡萄糖醛酸-C-1),101.8(半乳糖-C-1),107.9(木糖-C-1),103.1(半乳糖′-C-1)上。另外该化合物苷元3位向低场位于12.9ppm表明糖链连在苷元3位上，并且在HMBC谱中，葡萄糖醛酸端基质子δ_H4.83与苷元3位δ_C84.6相关，进一步证实了糖链连在苷元的3位。进一步查阅文献发现该化合物糖链与文献“Bioorganic&medicinal chemistry letters2010,20,7435-7439”中报道的camellenodiol糖链数据相近，从而推断出该化合物糖链为β-D-木糖-(1→2)-β-D-半乳糖-(1→3)-[β-D-半乳糖-(1→2)]-β-D-葡萄糖醛酸。该糖链的连接顺序也可以通过分析HMBC谱证实，HMBC中葡萄糖醛酸端基质子δ_H4.83与苷元3位碳δ_C84.6相关，半乳糖端基质子δ_H5.80与葡萄糖醛酸3位碳δ_C85.0相关，木糖端基质子δ_H5.10与半乳糖2位碳δ_C84.1相关，半乳糖2位氢δ_H4.58与木糖端基碳δ_C107.9相关,另一个半乳糖端基质子δ_H5.96与葡萄糖醛酸2位碳δ_C78.2相关,葡萄糖醛酸2位氢δ_H4.57与该半乳糖端基碳δ_C103.1相关。此外，四个糖的端基质子偶合常数³J_H-1,H-2较大，表明这四个糖都为β-构型。

图10所示的NOESY谱显示，δ_H6.73(1H,d,J=10.5Hz,H-21)与δ_H1.17(3H,s,H-29)相关，提示H-21为α构型；δ_H4.11(1H,dd,J=4.5,11.0Hz,H-3)与δ_H9.96(1H,brs,H-23)相关，提示H-3为α构型；δ_H4.46(1H,brs,H-16)与δ_H3.55(1H,d,J=11.0Hz,H-28)、3.82(1H,d,J=11.0Hz,H-28)相关提示提示H-16为β构型,δ_H6.34(1H,d,J=10.5Hz,H-22)与δ_H1.38(3H,s,H-30)相关，提示H-22为β构型。

因此，该化合物结构命名为21β-O-当归酰基-22α-O-(2-甲基丁酰基)-15α,16α,28-三羟基齐墩果-12-烯-23-醛3β-O-β-D-木糖-(1→2)-β-D-半乳糖

式Ⅰ。

-(1→3)-[β-D-半乳糖-(1→2)]-β-D-葡萄糖醛酸苷。化合物结构如式Ⅰ所示：

表1式Ⅰ所示化合物的NMR(pyridine-d5,500MHz)数据

表中化学位移以ppm为单位，偶合常数（J）以Hz为单位

实施例2化合物的提取

取干燥的油茶根2kg，用粉碎机粉碎成20-30目的木屑，经40L的95%乙醇40℃浸泡8h后，在80℃下加热回流0.5h，过滤，滤渣再加入95%乙醇40L，在80℃下加热回流3.0h，过滤，合并两次过滤所得滤液，在90℃下减压浓缩3h，得到流浸膏500mL。

取制得的流浸膏与5.0L水混合，200目滤布过滤，离心滤液，取上清液经D101型大孔树脂柱分离，依次用水、30%乙醇、50%乙醇、60%乙醇、70%乙醇、80%乙醇、95%乙醇洗脱，收集70%乙醇～95%乙醇洗脱所得的组分，减压浓缩，得到油茶总皂苷。

取制得的油茶总皂苷先经100目硅胶的减压硅胶柱分离，依次用氯仿和甲醇体积比为90：10→80：20→70：30→60：40→50：50→40：60→20：80→0：100梯度洗脱，得到组分1～组分8，经薄层板分析，合并其中的氯仿和甲醇体积比80:20～60:40洗脱所得组分（展开剂系统为BAW系统时，Rf值为0.4-0.7），再经中压反相ODS柱分离，甲醇-水系统50%-100%梯度洗脱，流速25mL/min，检测波长为203nm，得到6个组分，经过高效分析液相分析，用甲醇和水体积比为60:40～90:10梯度洗脱30min，合并甲醇和水体积比为70:30～90:10的组分（峰位于20min-28min），经动态轴向压缩柱分离，分别用60%、75%、80%和90%的甲醇洗脱，流速150mL/min，检测波长203nm，共得到五个组分，经高效分析液相分析，将75%甲醇洗脱所得组分（峰位于13.5-15.0min）通过半制备高效液相分离，甲醇-水(72:28，v/v)-0.2%甲酸洗脱洗脱，设定流速为2mL/min，检测波长203nm，于39.0min时得到白色无定形粉末71mg，经核磁共振氢谱检测，所得数据与实施例1所得化合物的氢谱数据一致，因此，确定此化合物为21β-O-当归酰基-22α-O-(2-甲基丁酰基)-15α,16α,28-三羟基齐墩果-12-烯-23-醛3β-O-β-D-木糖-(1→2)-β-D-半乳糖-(1→3)-[β-D-半乳糖-(1→2)]-β-D-葡萄糖醛酸苷，化合物结构如式Ⅰ所示。

实施例3化合物的提取

取干燥的油茶根2kg，用粉碎机粉碎成10-20目的木屑，经20L的70%乙醇40℃浸泡12h后，在85℃下加热回流3h，过滤，收集滤液，在100℃下减压浓缩2h，得到流浸膏300mL。

取制得的流浸膏与5.2L水混合，300目滤布过滤，离心滤液，取上清液经D101型大孔树脂柱分离，依次用水、30%乙醇、50%乙醇、60%乙醇、70%乙醇、80%乙醇、95%乙醇洗脱，收集70%乙醇～95%乙醇洗脱所得的组分，减压浓缩，得到油茶总皂苷。

取制得的油茶总皂苷先经80目硅胶的减压硅胶柱分离，依次用氯仿和甲醇体积比为90：10→80：20→70：30→60：40→50：50→40：60→20：80→0：100梯度洗脱，得到组分1～组分8，经薄层板分析，合并其中的氯仿和甲醇体积比80:20～60:40洗脱所得组分（展开剂系统为BAW系统时，Rf值为0.4-0.7），再经中压反相ODS柱分离，甲醇-水系统50%-100%梯度洗脱，流速25mL/min，检测波长为203nm，得到6个组分，经过高效分析液相分析，用甲醇和水体积比为60:40～90:10梯度洗脱30min，合并甲醇和水体积比为70:30～90:10的组分（峰位于20min-28min），经动态轴向压缩柱分离，分别用60%、75%、80%和90%的甲醇洗脱，流速150mL/min，检测波长203nm，共得到五个组分，经高效分析液相分析，将75%甲醇洗脱所得组分（峰位于13.5-15.0min）通过半制备高效液相分离，甲醇-水(72:28，v/v)-0.2%甲酸洗脱洗脱，设定流速为2mL/min，检测波长203nm，于39.0min时得到白色无定形粉末58mg，经核磁共振氢谱检测，所得数据与实施例1所得化合物的氢谱数据一致，因此，确定此化合物为21β-O-当归酰基-22α-O-(2-甲基丁酰基)-15α,16α,28-三羟基齐墩果-12-烯-23-醛3β-O-β-D-木糖-(1→2)-β-D-半乳糖-(1→3)-[β-D-半乳糖-(1→2)]-β-D-葡萄糖醛酸苷，化合物结构如式Ⅰ所示。

实施例4化合物的提取

取干燥的油茶根2kg，用粉碎机粉碎成30-50目的木屑，经30L的80%乙醇35℃浸泡10h后，在85℃下加热回流0.5h，在80℃下加热回流3.0h，在90℃下加热回流2h，过滤，收集滤液，在80℃下减压浓缩5h，得到流浸膏600mL。

取制得的流浸膏与5.5L水混合，250目滤布过滤，离心滤液，取上清液经D101型大孔树脂柱分离，依次用水、30%乙醇、50%乙醇、60%乙醇、70%乙醇、80%乙醇、95%乙醇洗脱，收集70%乙醇～95%乙醇洗脱所得的组分，减压浓缩，得到油茶总皂苷。

取制得的油茶总皂苷先经60目硅胶的减压硅胶柱分离，依次用氯仿和甲醇体积比为90：10→80：20→70：30→60：40→50：50→40：60→20：80→0：100梯度洗脱，得到组分1～组分8，经薄层板分析，合并其中的氯仿和甲醇体积比80:20～60:40洗脱所得组分（展开剂系统为BAW系统时，Rf值为0.4-0.7），再经中压反相ODS柱分离，甲醇-水系统50%-100%梯度洗脱，流速25mL/min，检测波长为203nm，得到6个组分，经过高效分析液相分析，用甲醇和水体积比为60:40～90:10梯度洗脱30min，合并甲醇和水体积比为70:30～90:10的组分（峰位于20min-28min），经动态轴向压缩柱分离，分别用60%、75%、80%和90%的甲醇洗脱，流速150mL/min，检测波长203nm，共得到五个组分，经高效分析液相分析，将75%甲醇洗脱所得组分（峰位于13.5-15.0min）通过半制备高效液相分离，甲醇-水(72:28，v/v)-0.2%甲酸洗脱洗脱，设定流速为2mL/min，检测波长203nm，于39.0min时得到白色无定形粉末81mg，经核磁共振氢谱检测，所得数据与实施例1所得化合物的氢谱数据一致，因此，确定此化合物为21β-O-当归酰基-22α-O-(2-甲基丁酰基)-15α,16α,28-三羟基齐墩果-12-烯-23-醛3β-O-β-D-木糖-(1→2)-β-D-半乳糖-(1→3)-[β-D-半乳糖-(1→2)]-β-D-葡萄糖醛酸苷，化合物结构如式Ⅰ所示。

实施例5体外细胞试验

取人肺癌A549细胞、B16小鼠黑素瘤细胞、人肝癌BEL-7402细胞和人乳腺癌细胞MCF-7，分别用含10％灭活NBS的RPMI1640培养基(另加GLu0.03％，Hepes0.06％，NaHCO₃0.2%)于37℃、5%CO₂条件下培养，3天传代，取对数生长期细胞进行试验。

用完全培养基调节制得的对数生产期的细胞的浓度，使细胞浓度均为5×10⁴个/mL，接种于96孔培养板中，100μL/孔，在37℃、5%CO₂条件下培养24h后，分为以下几组：

试验组加入实施例1制备的式Ⅰ所示化合物，加溶剂1%DMSO和99%PBS，调节终浓度分别为6.25μg/mL、9.375μg/mL、12.5μg/mL、18.25μg/mL、25.00μg/mL，10μL/孔。

阳性对照组加入5-FU，加溶剂1%DMSO和99%PBS，调节浓度为50μg/mL，10μL/孔。

阴性对照组加入完全培养基，10μL/孔。

每组均设3复孔，分别培养24h。终止培养前4h加入浓度为5mg/mL的MTT，10μL/孔，在培养结束后每孔加入DMSO100μL，放置摇床10min，于酶标仪检测波长为490nm时的吸光度A值。计算肿瘤细胞生长抑制率(Inhibition Rate)，计算公式如下：

Inhibition Rate（%）=[（A阴性对照组-A试验组）/A阴性对照组]×100%

根据肿瘤细胞生长抑制率计算出IC₅₀（半数抑制浓度），试验结果如表2所示：

表2实施例1制备的化合物对4种肿瘤细胞24h的IC₅₀(μg/mL)值

由表2所示的试验结果可知，实施例1制备的式Ⅰ所示化合物对人肺癌A549细胞、B16小鼠黑素瘤细胞、人肝癌BEL-7402细胞和人乳腺癌细胞MCF-7的24h后的IC₅₀值均小于30μg/mL，其中对于A549细胞的IC₅₀值为22.23μg/mL，表明实施例1制备的式Ⅰ所示化合物对上述4种肿瘤细胞的生长具有显著(P<0.05)的抑制作用，对人肺癌A549细胞生长的抑制效果最为显著。

试验过程中发现，阳性对照5-FU在浓度为50μg/mL时作用24小时后，对人肺癌A549肿瘤细胞抑制率仅为32%，而实施例1制备的式Ⅰ所示化合物在浓度为22.23±0.25μg/mL时作用24h后，对人肺癌A549肿瘤细胞抑制率达到50%，由此可见，实施例1制备的式Ⅰ所示化合物对人肺癌A549肿瘤细胞的抑制作用显著优于（P<0.05）阳性对照5-FU。

试验过程中还发现，阳性对照5-FU在浓度为50μg/mL时作用24小时后，对人肝癌BEL-7402肿瘤细胞的抑制率仅为24%，而实施例1制备的式Ⅰ所示化合物在浓度为28.32±0.16μg/mL时作用24h后，对人肝癌BEL-7402肿瘤细胞的抑制率达到50%，由此可见，实施例1制备的式Ⅰ所示化合物对人肝癌BEL-7402肿瘤细胞的抑制作用显著优于（P<0.05）阳性对照5-FU。

试验过程中还发现，阳性对照5-FU在浓度为50μg/mL时作用24小时后，对B16小鼠黑素瘤细胞的抑制率为52%，由此可知，实施例1制备的式Ⅰ所示化合物对B16小鼠黑素瘤细胞的抑制作用优于阳性对照5-FU。

试验过程中还发现，阳性对照5-FU在浓度为50μg/mL时作用24小时后，对人乳腺癌细胞MCF-7的抑制率为46%，由此可知，实施例1制备的式Ⅰ所示化合物对人乳腺癌细胞MCF-7的抑制作用优于阳性对照5-FU。

将本发明实施例2～实施例4制备的式Ⅰ所示化合物进行体外细胞试验，试验方法同实施例5，所得结果与实施例5相似，即本发明实施例2～实施例4提供的式Ⅰ所示化合物对人肺癌A549细胞、B16小鼠黑素瘤细胞、人肝癌BEL-7402细胞和人乳腺癌细胞MCF-7细胞的生长具有良好的抑制效果，其中对人肺癌A549细胞和人肝癌BEL-7402细胞生长的抑制作用显著优于（P<0.05）阳性对照5-FU。

综合上述试验结果可知，本发明实施例1～4提供的式Ⅰ所示化合物对人肺癌A549细胞、B16小鼠黑素瘤细胞、人肝癌BEL-7402细胞和人乳腺癌细胞MCF-7细胞的生长具有良好的抑制效果，其中对人肺癌A549细胞、人肝癌BEL-7402细胞生长的抑制作用显著优于（P<0.05）阳性对照5-FU。

实施例6小鼠移植瘤模型试验

分别取H₂₂和S₁₈₀小鼠肝癌(肉瘤)细胞冻存管，置于37℃恒温水浴中解冻，离心收集细胞，用PBS液洗涤两次，再用PBS液重悬细胞，经ICR小鼠腹腔传3代以上，取腹部明显膨大的小鼠，脱臼处死，对腹部酒精消毒，一次性无菌注射器抽取乳白色腹水，注入已灭菌的离心管中，细胞计数器计数，用生理盐水调整细胞密度至5×10⁶个/mL，给每只小鼠右腋下接种0.2mL细胞悬液进行造模，次日将小鼠随机分为以下几组：

空白对照组：接种移植瘤的小鼠8只，腹腔注射0.9%生理盐水0.2mL，每日一次，给药10天。

阳性对照组：接种移植瘤的小鼠8只，腹腔注射环磷酰胺（CTX），20mg/kg，隔日1次，给药10天。

试验组1：接种移植瘤的小鼠8只，腹腔注射实施例1制备的式Ⅰ所示化合物，1.5mg/kg，每日一次，连续给药10天。

试验组2：接种移植瘤的小鼠8只，腹腔注射实施例1制备的式Ⅰ所示化合物，3.0mg/kg的，每日一次，连续给药10天。

末次给药后2h，剥离瘤体，称取瘤重，计算抑瘤率，计算公式如下所示：

其中给药组为阳性对照组、试验组1或试验组2。

试验结果如表3和表4所示：

表3实施例1制备的式Ⅰ所示化合物对小鼠肝癌H₂₂移植瘤瘤重的影响

*P<0.05，**P<0.01，vs空白对照组

由表3所示的试验数据可知，本发明实施例1制备的式Ⅰ所示化合物在剂量分别为1.5mg/kg和3.0mg/kg时，连续用药10天，对小鼠肝癌H₂₂移植瘤的抑制率分别达到36.5%和50.0%，与空白对照组相比，抑瘤效果非常显著(P<0.01)，且随剂量的增加，抑瘤率显著增强；阳性对照组在20mg/kg时，对小鼠肝癌H₂₂移植瘤的抑制率为57.1%，实施例1制备的式Ⅰ所示化合物与阳性对照组比，对小鼠肝癌H22移植瘤的抑制效果不如阳性对照。

由此可见，实施例1制备的式Ⅰ所示化合物对小鼠肝癌H₂₂移植瘤的生长具有非常显著（P<0.01）的抑制作用，量效关系明显。

表4实施例1制备的式Ⅰ所示化合物对小鼠S₁₈₀肉瘤瘤重的影响

*P<0.05，**P<0.01，vs空白对照组

由表4所示的试验数据可知，本发明实施例1制备的式Ⅰ所示化合物在剂量分别为1.5mg/kg和3.0mg/kg时，连续用药10天，对小鼠S₁₈₀肉瘤的抑制率分别达到25.8%和49.8%，与空白对照组相比，抑瘤效果非常显著（P<0.01），且随剂量的增加，抑瘤率显著增强；阳性对照组在20mg/kg时，对小鼠S₁₈₀肉瘤的抑制率仅为37.1%，实施例1制备的式Ⅰ所示化合物对小鼠S₁₈₀肉瘤的抑制效果显著优于（P<0.05）阳性对照CTX。

由此可见，实施例1制备的式Ⅰ所示化合物对小鼠S₁₈₀肉瘤的生长具有非常显著（P<0.01）的抑制作用，抑瘤效果显著优于阳性对照CTX，且量效关系明显。

将实施例2～实施例4制备的式Ⅰ所示化合物进行小鼠移植瘤模型试验，试验方法同实施例6，所得试验结果与实施例6相似，即实施例2～实施例4制备的式Ⅰ所示化合物对小鼠肝癌H₂₂移植瘤的生长具有非常显著（P<0.01）的抑制作用，量效关系明显；对小鼠S₁₈₀肉瘤的生长具有非常显著（P<0.01）的抑制作用，抑瘤效果显著优于阳性对照CTX，且量效关系明显。

综上所述，本发明实施例1～实施例4制备的式Ⅰ所示化合物对小鼠肝癌H₂₂移植瘤的生长具有非常显著（P<0.01）的抑制作用，量效关系明显；对小鼠S₁₈₀肉瘤的生长具有非常显著（P<0.01）的抑制作用，抑瘤效果显著优于阳性对照CTX，且量效关系明显。

实施例7药物的制备

取实施例1制备的式I所示结构的化合物添加散剂的常规辅料，按照常规方法制成散剂。

实施例8药物的制备

取实施例2制备的式I所示结构的化合物添加片剂的常规辅料，按照常规方法制成片剂。

实施例9药物的制备

取实施例3制备的式I所示结构的化合物添加颗粒剂的常规辅料，按照常规方法制成颗粒剂。

实施例10药物的制备

取实施例4制备的式I所示结构的化合物添加胶囊剂的常规辅料，按照常规方法制成胶囊剂。

实施例11药物的制备

取实施例2制备的式I所示结构的化合物添加溶液剂的常规辅料，按照常规方法制成溶液剂。

实施例12药物的制备

取实施例1制备的式I所示结构的化合物添加乳剂的常规辅料，按照常规方法制成乳剂。

实施例13药物的制备

取实施例3制备的式I所示结构的化合物添加混悬剂的常规辅料，按照常规方法制成混悬剂。

实施例14药物的制备

取实施例4制备的式I所示结构的化合物添加注射剂的常规辅料，按照常规方法制成注射剂。

实施例15药物的制备

取实施例2制备的式I所示结构的化合物添加粉针剂的常规辅料，按照常规方法制成粉针剂。

实施例16药物的制备

取实施例1制备的式I所示结构的化合物添加喷雾剂的常规辅料，按照常规方法制成喷雾剂。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种如式Ⅰ所示结构的化合物：

式Ⅰ。

2.一种如权利要求1所述化合物的提取方法，其特征在于，包含以下步骤：

步骤1：将油茶根粉碎，取第一溶剂提取，浓缩，得到流浸膏；

步骤2：取所述流浸膏与水混合，过滤，收集滤液，离心，收集上清液，再经D101型大孔树脂柱分离，取乙醇-水系统梯度洗脱，收集乙醇和水体积比为70：30～95：5洗脱所得组分，分离、纯化，即得；

所述第一溶剂为乙醇和水体积比为0：100～95：5。

3.根据权利要求2所述的提取方法，其特征在于，所述分离、纯化具体为：取所述组分经硅胶柱分离，取氯仿-甲醇系统梯度洗脱，收集氯仿和甲醇体积比为80：20～60：40洗脱所得组分；再经ODS柱分离，取甲醇-水系统梯度洗脱，收集甲醇和水体积比为70：30～90：10洗脱所得组分；再经动态轴向压缩柱分离，取甲醇-水系统梯度洗脱，收集甲醇和水体积比为75：25洗脱所得组分；最后通过高效液相色谱分离，采用C₁₈色谱柱，第二溶剂洗脱，流速为2mL/min，收集39.0min组分，即得；

所述第二溶剂为：甲醇和水按体积比为72：28组成的混合溶液再与占所述混合溶液质量百分含量为0.2%的甲酸混合所得的混合物。

4.根据权利要求2所述的提取方法，其特征在于，步骤2所述梯度洗脱的溶剂依次为乙醇和水体积比为0：100→30：70→50：50→60：40→70：30→80：20→95：5。

5.根据权利要求2所述的提取方法，其特征在于，步骤1所述提取的温度为40℃～100℃，步骤1所述提取的时间为1h～15.5h。

6.根据权利要求2所述的提取方法，其特征在于，步骤1所述浓缩的温度为80℃～100℃，步骤1所述浓缩的时间为2h～5h。

7.一种如权利要求1所述化合物在制备抗肿瘤药物中的应用。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述肿瘤为肺癌、肝癌、黑素瘤或乳腺癌。

9.一种抗肿瘤药物，其特征在于，其包含权利要求1所述化合物及药学上可接受的辅料。

10.根据权利要求9所述的抗肿瘤药物，其特征在于，其剂型为散剂、片剂、颗粒剂、胶囊剂、溶液剂、乳剂、混悬剂、注射液、粉针剂或喷雾剂。

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