CN103736471B

CN103736471B - 一种高效液相色谱固定相封端方法

Info

Publication number: CN103736471B
Application number: CN201310718977.2A
Authority: CN
Inventors: 李广庆; 孙晓莉
Original assignee: Beijing Dima Outai Science Technology Development Center
Current assignee: Beijing Dima Outai Science Technology Development Center
Priority date: 2013-12-23
Filing date: 2013-12-23
Publication date: 2018-05-15
Anticipated expiration: 2033-12-23
Also published as: CN103736471A

Abstract

本发明公开了一种高效液相色谱固定相封端方法，其将硅烷封端试剂、催化剂和色谱键合相置于高压釜中，在200～400 ^oC惰性气体气氛下进行催化封端反应，制得高效液相色谱固定相。与传统方法相比，本发明方法具有反应完全、耗时少、重现性好、合成方法稳定可靠，操作简便，易于规模化生产。合成的液相色谱固定相具有柱效高，分离性能好，应用范围宽，对碱性化合物具有良好的色谱峰形等特点。

Description

一种高效液相色谱固定相封端方法

发明领域

本发明涉及一种高效液相色谱固定相的封端方法，属于液相色谱分离材料制备技术领域。

发明背景

高效液相色谱（HPLC）是一种广泛使用的分析技术。其具有以下特点：速度快、重复性高、样品不被破坏；色谱柱可反复使用；易于实现自动化和高通量分析，精确度高、应用范围广，百分之七十以上的有机化合物可用高效液相色谱分析。在生物化学、医药卫生、食品检验、石油化工及环境污染监测等领域得到广泛的应用，成为分析科学家用以解决他们面临各种实际分析和分离必不可缺的工具。

在药物分析与纯化，代谢物分析，食品、环境分析和农药残留物的分析中，极性化合物的色谱分析一直是分析测试领域中的一个难题。随着蛋白质组学、代谢组学、中药现代化、环境保护等研究领域的迅速发展，强极性和亲水性的小分子物质迅速成为重要分析对象，但这类物质往往较难在液相色谱上得到有效分离。样品的复杂性、未知性的提高，对液相色谱的分离能力提出了更高的要求，促使液相色谱技术向着更高端的水平发展。

液相色谱柱是液相色谱的"心脏"，色谱柱填料的性能是决定色谱分离能力的关键。因而制备性能优良的色谱固定相是实现这些分离的关键。

硅胶基质固定相是目前应用最广泛的一类反相液相色谱固定相，其制备过程的关键是硅烷试剂与硅胶的键合。但由于空间位阻效应，较大的硅烷分子不可能与硅胶表面上较小的硅羟基全部发生反应，事实上，目前最好的键合技术也只能覆盖硅胶表面约50%的硅羟基。因而残余硅羟基是不可避免的，当使用双或三官能团硅烷化试剂时，还有新生的硅羟基产生，这些残余硅羟基会造成色谱峰拖尾，柱效和分离度下降及重现性差等多种问题。特别是在反相固定相的情况下，对产品的性能影响很大，它可以减小表面的疏水性，剩余硅羟基可与极性碱性化合物作用，导致色谱峰拖尾，保留时间延长，甚至产生不可逆吸附，产生的二次化学吸附，使溶质在两相间的平衡速度减慢，降低了键合相填料的稳定性。残余硅羟基浓度的变化也是产品性能不重复的重要原因。限制了高效液相色谱方法在极性碱性化合物分离分析中的应用。因而，键合反应结束后，一般都要用三甲基氯硅烷（TMCS）或六甲基二硅胺（HMDS）等小分子硅烷进行处理，即封端（endcapping），以尽量减少残余硅羟基，这对提高键合相填料的稳定性和重现性是十分重要的。目前广泛使用的液相封端法是以有机溶剂为反应介质，在常压、回流条件下用小分子硅烷对硅胶或硅胶键合相进行处理。该反应耗时长，消耗溶剂多，后处理繁琐，批次重现性差，键合密度低，分离性能差。不能满足食品、环境和制药等行业对高性能色谱填料的需求。

发明内容

本发明的目的是提供一种柱效高、分离性能好、应用范围宽的高效液相色谱固定相封端方法。

本发明实现过程如下：

一种高效液相色谱固定相封端方法，将硅烷封端试剂、催化剂和色谱键合相置于高压釜中，在200～400 ^oC惰性气体气氛下进行催化封端反应，制得高效液相色谱固定相，

所述的催化剂选自氨气、甲胺、二甲胺、N, N-二甲基乙基胺、N, N-二甲基丙基胺、N, N-二甲基丁基胺、三甲胺、乙胺、二乙胺、三乙胺、六氢吡啶、吡啶、N-甲基吡啶、2-甲基吡啶、2-乙基吡啶、4-甲基吡啶、2, 4-二甲基吡啶、2, 6-二甲基吡啶、2, 4, 6-三甲基吡啶、咪唑、1-甲基咪唑、1-乙基咪唑、2-甲基咪唑、4-甲基咪唑、1,2-二甲基咪唑。

所述的硅烷封端试剂是单、二、三、四、五、六或七硅烷中的一种或几种。

所述的单硅烷选自三甲基氯硅烷、N,N-二甲基三甲基硅胺、三甲基硅基咪唑、甲基三氯硅烷、二甲基二氯硅烷、二甲氧基二甲基硅烷、三甲基硅醇或N-三甲基硅基乙酰胺；所述的二硅烷为六甲基二硅氮烷或1,3-二甲氧基四甲基二硅氧烷；所述的三硅烷是六甲基环三硅氧烷；所述的四硅烷是八甲基环四硅氧烷；所述的五硅烷是十甲基环五硅氧烷；所述的六硅烷是十二甲基环六硅氧烷；所述的七硅烷是十四甲基环七硅氧烷。

将硅烷、催化剂和硅胶基质颗粒用液相键合法制得色谱键合相，所述的硅烷是单或双或三官能团的C₁～C₃₀有机硅烷中的一种或几种，其化学结构通式为：

其中R¹ = C₁–C₃₀取代或未取代烷基，环烷基，杂环烷基，取代或未取代苯基；

R² = C₁–C₈取代或未取代烷基，环烷基，杂环烷基，取代或未取代苯基;α= 0, 1,2;

X = 卤素，烷氧基，酰氧基或胺基。

所述的硅胶基质颗粒是球形多孔硅胶，金属杂质含量小于30 ppm，硅胶基质颗粒的粒径范围为1-60μm，孔径范围为50-1000 Å，比表面积范围为50-500 m²/g。

上述反应在200～400 ^oC惰性气体气氛下反应8-24小时，反应压力为1.5-5 kg/cm²进行催化封端反应，制得高效液相色谱固定相。

所述的惰性气体是氮气、氩气或氦气。

本发明的优点与积极效果：与传统方法相比，本发明方法具有反应完全，耗时少，重现性好，合成方法稳定可靠，操作简便，易于规模化生产，且节能降耗，环境友好。制备的液相色谱填料作为固定相具有柱效高，分离性能好，应用范围宽等特点。

附图说明

图1是使用（a）本发明实施例1制备的C₁₈色谱柱和（b）本发明实施例2制备的C₁₈色谱柱对地昔帕明-去甲替林-丙米嗪-阿米替林-三甲丙咪嗪混合物分离的色谱图，1地昔帕明，2去甲替林，3丙米嗪，4阿米替林，5三甲丙咪嗪；

图2是使用（a）本发明实施例3制备的C₈色谱柱和（b）本发明实施例4制备的C₈色谱柱对吲哚洛尔-醋丁洛尔-美托洛尔-比索洛尔-普奈洛尔-阿普洛尔混合物分离的色谱图，1吲哚洛尔，2 醋丁洛尔，3美托洛尔，4比索洛尔，5普奈洛尔，6阿普洛尔；

图3是使用（a）本发明实施例3制备的C₈色谱柱和（b）本发明实施例4制备的C₈色谱柱对非那西丁-托尔米丁-酮洛芬-非诺洛芬-双氯芬酸-布洛芬混合物分离的色谱图，1非那西丁，2托尔米丁，3酮洛芬，4非诺洛芬，5双氯芬酸，6布洛芬。

具体实施方式

实施例1

在三颈瓶中加入10克球形硅胶（AGC Si-Tech Co. Ltd., 5μm, 100 Å, 440 m²/g），在170 ⁰C下干燥24小时。待硅胶在氩气气氛下冷却后，加入二甲苯（100毫升），十八碳二甲基氯硅烷（18克）和吡啶（5毫升），机械搅拌并在氩气下加热至回流，反应16小时。停止反应，真空抽滤，依次用甲苯，二氯甲烷，四氢呋喃，丙酮，甲醇-水（1：1，v/v），甲醇洗涤，80⁰C干燥24小时。

将键合硅胶放入高压釜中，加入二甲苯（100毫升），吡啶（5毫升）和八甲基环四硅氧烷（15毫升），搅拌均匀，密封高压釜，然后用氩气加压至3 kg/cm²，并将反应釜升温到280⁰C，反应8小时。停止加热，混合物在氩气气氛下冷却至室温，过滤，依次用甲苯，二氯甲烷，四氢呋喃，丙酮，甲醇-水（1：1，v/v），甲醇洗涤，80 ⁰C干燥24小时，获得固定相。

实施例2

与实施例1类似，不同的是在280 ^oC氩气气氛下进行封端反应时未加入吡啶（5毫升），其余方法相同，获得固定相。

实施例3

在三颈瓶中加入10克球形硅胶（AGC Si-Tech Co. Ltd., 5μm, 100 Å, 440 m²/g），在170 ⁰C下干燥24小时。待硅胶在氩气气氛下冷却后，加入二甲苯（100毫升），碳八二甲基氯硅烷（15毫升）和吡啶（5毫升），机械搅拌并在氩气下加热至回流，反应16小时。停止反应，真空抽滤，依次用甲苯，二氯甲烷，四氢呋喃，丙酮，甲醇-水（1：1，v/v），甲醇洗涤，80⁰C干燥24小时。

将键合硅胶放入高压釜中，加入二甲苯（100毫升），吡啶（5毫升）和六甲基环三硅氧烷（10毫升），搅拌均匀，密封高压釜，然后用氩气加压至3 kg/cm²，并将反应釜升温到250⁰C，反应8小时。停止加热，混合物在氩气气氛下冷却至室温，过滤，依次用甲苯，二氯甲烷，四氢呋喃，丙酮，甲醇-水（1：1，v/v），甲醇洗涤，80 ⁰C干燥24小时，获得固定相。

实施例4

将键合硅胶放入三颈瓶中，加入二甲苯（100毫升）和六甲基环三硅氧烷（10毫升），机械搅拌并在氩气气氛下加热至回流，反应16小时。停止反应，真空抽滤，依次用甲苯，二氯甲烷，四氢呋喃，丙酮，甲醇-水（1：1，v/v），甲醇洗涤，80 ⁰C干燥24小时，获得固定相。

将上述实施例中制备的硅胶填料，采用匀浆法填充于150 x 4.6 mm I.D.不锈钢柱管中，填装压力为40-80 MPa，所得色谱柱用于分离混合物样品。

实施例5

分别使用（a）本发明实施例1制备的C₁₈色谱柱和（b）本发明实施例2制备的C₁₈色谱柱，分离了1 地昔帕明, 2 去甲替林, 3 丙米嗪, 4 阿米替林, 5 三甲丙咪嗪混合物，图1为其色谱图。色谱条件如下：流动相，MeCN:20 mM磷酸缓冲液（pH 7.0）, 2:1；流速, 1.0mL/min；检测波长, UV 254 nm。本发明中采用高温加压催化封端技术制备的C₁₈色谱柱所得到的峰形明显优于传统液相封端技术制备的C₁₈色谱柱所得的相应结果。

实施例6

分别使用（a）本发明实施例3制备的C₈色谱柱和（b）本发明实施例4制备的C₈色谱柱，分离了1吲哚洛尔, 2 醋丁洛尔, 3美托洛尔, 4比索洛尔, 5普奈洛尔, 6阿普洛尔混合物，图2为其色谱图。色谱条件如下：流动相，MeOH:5 mM NH₄HCO₃ (pH 10.0) = 60:40；流速, 1.0 mL/min；检测波长, UV 220 nm。

实施例7

分别使用（a）本发明实施例3制备的C8色谱柱和（b）本发明实施例4制备的C8色谱柱，分离了1非那西丁, 2托尔米丁, 3酮洛芬, 4非诺洛芬, 5双氯芬酸, 6布洛芬混合物，图3为其色谱图。色谱条件如下：流动相，0.1% HCOOH in MeCN:0.1% HCOOH in H₂O = 55:45；流速, 1.0 mL/min；检测波长, UV 254 nm。

Claims

1.一种高效液相色谱固定相封端方法，其特征在于：将硅烷封端试剂、催化剂和色谱键合相置于高压釜中，在200～400 ^oC惰性气体气氛下进行催化封端反应，制得高效液相色谱固定相，

所述的硅烷封端试剂是单、二、三、四、五、六或七硅烷中的一种或几种；

所述色谱键合相是将硅烷、催化剂和硅胶基质颗粒用液相键合法制得色谱键合相，所述的硅烷是单或双或三官能团的C₁～C₃₀有机硅烷中的一种或几种，其化学结构通式为：

R² = C₁–C₈取代或未取代烷基，环烷基，杂环烷基，取代或未取代苯基;

α= 0, 1, 2;

X = 卤素，烷氧基，酰氧基或胺基；

所述的催化剂选自氨气、甲胺、二甲胺、N, N-二甲基乙基胺、N, N-二甲基丙基胺、N, N-二甲基丁基胺、三甲胺、乙胺、二乙胺、三乙胺、六氢吡啶、吡啶、N-甲基吡啶、2-甲基吡啶、2-乙基吡啶、4-甲基吡啶、2, 4-二甲基吡啶、2, 6-二甲基吡啶、2, 4, 6-三甲基吡啶、咪唑、1-甲基咪唑、1-乙基咪唑、2-甲基咪唑、4-甲基咪唑、1,2-二甲基咪唑。

2.根据权利要求1所述的高效液相色谱固定相封端方法，其特征在于：所述的单硅烷选自三甲基氯硅烷、N,N-二甲基三甲基硅胺、三甲基硅基咪唑、甲基三氯硅烷、二甲基二氯硅烷、二甲氧基二甲基硅烷、三甲基硅醇或N-三甲基硅基乙酰胺；所述的二硅烷为六甲基二硅氮烷或1,3-二甲氧基四甲基二硅氧烷；所述的三硅烷是六甲基环三硅氧烷；所述的四硅烷是八甲基环四硅氧烷；所述的五硅烷是十甲基环五硅氧烷；所述的六硅烷是十二甲基环六硅氧烷；所述的七硅烷是十四甲基环七硅氧烷。

3.根据权利要求1所述的高效液相色谱固定相封端方法，其特征在于：所述的硅胶基质颗粒是球形多孔硅胶，金属杂质含量小于30 ppm，硅胶基质颗粒的粒径范围为1-60μm，孔径范围为50-1000 Å，比表面积范围为50-500 m²/g。

4.根据权利要求1所述的高效液相色谱固定相封端方法，其特征在于：在200～400 ^oC惰性气体气氛下反应8-24小时，反应压力为1.5-5 kg/cm²进行催化封端反应，制得高效液相色谱固定相。

5.根据权利要求1所述的高效液相色谱固定相封端方法，其特征在于：所述的惰性气体是氮气、氩气或氦气。