CN103735537A

CN103735537A - 一种黄腐酚在制备抑制α-葡萄糖苷酶活性的药物或保健品中的应用

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Publication number: CN103735537A
Application number: CN201410004543.0A
Authority: CN
Inventors: 刘明; 缪锦来; 刘格
Original assignee: Ocean University of China
Current assignee: Ocean University of China
Priority date: 2014-01-06
Filing date: 2014-01-06
Publication date: 2014-04-23
Anticipated expiration: 2034-01-06
Also published as: CN103735537B

Abstract

本发明公开了一种黄腐酚在制备抑制α-葡萄糖苷酶活性的药物或保健品中的应用。本发明经实验证明黄腐酚在低浓度条件下，对α-葡萄糖苷酶有较强的抑制活性，其体外抑制α-葡萄糖苷酶的IC₅₀为8.8μM，抑制类型为非竞争性抑制，能有效抑制α-葡萄糖苷酶活性，对α-葡萄糖苷酶的活性具有可逆性，有效避免了不可逆抑制剂的潜在的副作用。而且，黄腐酚来源于啤酒酿造的主要原料啤酒花，属于食品来源的天然产物，来源丰富，制备工艺成熟，能够大量提取制备。同时，黄腐酚安全无毒，无毒副作用，避免了药物毒副作用的出现。可以应用于制备治疗糖尿病、艾滋病、恶性肿瘤、溶酶体贮积症的药物，具有良好的市场应用前景。

Description

一种黄腐酚在制备抑制α-葡萄糖苷酶活性的药物或保健品中的应用

技术领域

本发明属于医药领域，具体涉及一种黄腐酚在制备抑制α-葡萄糖苷酶活性的药物或保健品中的应用。

背景技术

α-葡萄糖苷酶（α-glucosidase, EC 3.2.1.20）是一类能够催化碳水化合物非还原末端的α-1,4-糖苷键水解并释放出葡萄糖的酶，包括麦芽糖酶、异麦芽糖酶、蔗糖酶和海藻糖酶等。它在动物体内许多代谢途径中有重要意义，包括糖蛋白和糖脂的合成后加工、小肠内碳水化合物的降解等。近年来的研究表明，α-葡萄糖苷酶与糖尿病、艾滋病、恶性肿瘤、溶酶体贮积症等疾病的发生机制有重要关系，已经成为治疗这些疾病的重要靶点。

糖尿病是一种因胰岛素分泌绝对或相对不足，导致以高血糖为特征的内分泌代谢性疾病，患者中90%以上为II型糖尿病。目前，临床上用于II型糖尿病治疗的口服药物主要有双胍类、α-葡萄糖苷酶抑制剂类、噻唑烷二酮类和非磺脲类胰岛素分泌促进剂等。α-葡萄糖苷酶位于小肠上皮细胞，此酶的抑制剂能延缓或抑制葡萄糖在小肠内的消化、吸收，进而控制餐后高血糖的发生，因此在临床上可单独或与磺脲类、双胍类、胰岛素联合使用。目前临床上用于治疗糖尿病的药物中，阿卡波糖和米格列醇都是以小肠上皮的α-葡萄糖苷酶为靶点的葡萄糖苷酶抑制剂。

α-葡萄糖苷酶抑制剂也是HIV病毒的潜在抑制剂。HIV病毒外壳由双脂层和一种env蛋白组成，env蛋白包括糖蛋白gp41（穿膜）和gp120，后者存在于病毒表面，与gp41连接。在gp120的合成中，α-葡萄糖苷酶催化未成熟蛋白在其N端连接上Glc3Man9GlcNAc2 残基，这个糖残基的作用是使病毒在感染初期被T4淋巴细胞的CD4受体识别。 gp120的抗原性调节依赖于蛋白表面糖基化的范围和可变性，因此有可能成为治疗艾滋病药物的设计中的一个可以利用的靶点。

溶酶体贮存病是由于溶酶体内编码糖水解酶的基因突变造成的鞘糖脂堆积而引发的细胞功能紊乱病变，常伴有有神经变性过程。常见的此类疾病有戈谢病、蓬佩病等。此类疾病的治疗方法很少，大部分的研究集中在增加酶的含量来补充其基因缺陷造成的不足，包括骨髓移植，酶替换和基因治疗，一种可选的治疗方法是减少底物，即通过减少鞘糖脂的合成来减少其在溶酶体内的贮积。临床上已经用一种亚胺基糖类α-葡萄糖苷酶抑制剂脱氧野尻霉素来治疗代谢病。蓬佩病是一种典型的溶酶体贮存病。患者体内过量糖原的聚集会显著的降低心肌和骨骼肌的力量。出现这种症状的婴儿往往因为心肌活力不足而夭折，年长的患者常需要人工辅助呼吸。这种状况的发生是由于α-葡萄糖苷酶的活力降低造成的。Hug等证明含有酸性麦芽糖酶的黑曲霉提取物能够增加肝脏内α-葡萄糖苷酶的活性，从而降低蓬佩病患者肝糖原含量。

糖蛋白的合成后加工是在在内质网膜腔内发生的，新生蛋白合成后在葡萄糖苷酶和糖基转移酶的共同作用下连接上糖基。首先，α-葡萄糖苷酶切断Glc(1-2)Glc键，释放出十四聚糖Glc3Man9GlcNAc2残基。然后，寡糖转移酶催化十四聚糖Glc3Man9-GlcNAc2连接到新生蛋白N端的天冬氨酸上，从而完成了蛋白质N端的糖基化。这个连接在蛋白质N端的寡糖残基在许多细胞代谢过程中起到关键作用，比如免疫应答，细胞内识别（包括受精），细胞分化等。同样，这个寡糖基在某些疾病的发生和控制中也有重要作用，比如炎症的发生和恶性肿瘤的转移。

发明内容

本发明的目的是提供了一种黄腐酚在制备抑制α-葡萄糖苷酶活性的药物或保健品中的应用，所述黄腐酚来源于啤酒花，安全无毒，可以用于制备治疗糖尿病、艾滋病、恶性肿瘤、溶酶体贮积症的药物。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

一种黄腐酚在制备抑制α-葡萄糖苷酶活性的药物或保健品中的应用，所述黄腐酚如式I所示或式I化合物药学上可接受的盐或溶剂合物，

式 I。

对上述技术方案的进一步改进：所述抑制α-葡萄糖苷酶活性的药物为治疗糖尿病、艾滋病、恶性肿瘤、溶酶体贮积症的药物。

对上述技术方案的进一步改进：所述黄腐酚用于制备α-葡萄糖苷酶的抑制剂时，所述黄腐酚的摩尔浓度为8.8-80 μM。

对上述技术方案的进一步改进：所述黄腐酚与DMSO、乙醇、甲醇或乙酸乙酯中的至少一种相混合用于制备α-葡萄糖苷酶的抑制剂。

对上述技术方案的进一步改进：所述黄腐酚对α-葡萄糖苷酶的抑制类型为非竞争性抑制。

对上述技术方案的进一步改进：所述黄腐酚对肠道上皮细胞单层的α- 葡萄糖苷酶具有显著的抑制活性。

与现有技术相比，本发明的优点和技术效果是：本发明化合物黄腐酚式（I）所示可从啤酒花中提取，自然界中黄腐酚仅存在于酒花中，是酒花中特有的成分，其含量占酒花干重的0.1%-1%，含量丰富。其在低浓度条件下，对α-葡萄糖苷酶有较强的抑制活性，其体外抑制α-葡萄糖苷酶的IC₅₀为8.8 μM，抑制类型为非竞争性抑制，能有效抑制α-葡萄糖苷酶活性，对α-葡萄糖苷酶的活性具有可逆性。

非竞争性抑制是指抑制剂不能与游离酶结合，但可与酶和底物复合物结合并阻止产物生成，使酶的催化活性降低，其作用特点为抑制剂与底物可同时与酶的不同部位结合，因此相比较于竞争性抑制剂，非竞争性抑制剂有可能能够在浓度更低的条件下抑制酶的活性。同时，其作用的可逆性，有效避免了不可逆抑制剂的潜在的副作用。

黄腐酚来源于啤酒酿造的主要原料啤酒花，属于食品来源的天然产物，来源丰富，制备工艺成熟，能够大量提取制备。同时，经过长期的食用，黄腐酚被证实安全无毒，无毒副作用，避免了药物毒副作用的出现，可以用于制备糖尿病、艾滋病、恶性肿瘤、溶酶体贮积症的药物，具有广泛的市场应用前景。

附图说明

图1表明本发明中黄腐酚体外抑制α-葡萄糖苷酶的IC₅₀为8.8 μM。

图2表明本发明中黄腐酚体外抑制α-葡萄糖苷酶的作用方式为非竞争性抑制。

图3表明本发明中黄腐酚淬灭α-葡萄糖苷酶分子的内部荧光。

图4表明本发明中黄腐酚体外减低α-葡萄糖苷酶的疏水结构。

图5表明本发明中黄腐酚体外改变α-葡萄糖苷酶的二级结构比例。

图6表明本发明中黄腐酚抑制肠道上皮细胞α-葡萄糖苷酶对麦芽糖的降解作用。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明的技术方案做进一步详细的说明。

实施例1

本发明所述黄腐酚对α-葡萄糖苷酶抑制活性的测定，包括以下步骤：

1）配制溶液A（K₃PO₄ 0.1M，MgCl₂ 3.2mM，pH 6.8）和溶液B（K₃PO₄ 0.5 M，MgCl₂ 16mM，pH 6.8）。

2）配制酶溶液：将0.1unit/ml的α-葡萄糖苷酶（Sigma, Ⅰ型 , 酵母中提取，购于sigma公司）溶于溶液A；配制底物溶液：将6mM的底物p-对硝基苯-α-D-吡喃葡萄糖（Sigma）溶于溶液A。

3）取1.02ml溶液B，加入2.82ml蒸馏水，而后加入2ml步骤2）配制的底物溶液，混合摇匀得检测液。

4）在96孔板上相应孔中各加入58.4μl步骤3）的检测液，同时在每孔中加入12μl黄腐酚，并作2-3个重复，同时设两组对照（Ab为空白对照组，不加酶，不加待测样品； Ac为阴性对照，加酶，不加待测样品），于37℃水浴温育5min。

5）将上述水浴中取出96孔板，放在冰上，并在每孔中加20μl步骤2）中配制的酶液，同时在对照孔中加入20μl溶液A，于37℃水浴反应30min。

6）将上述96孔板取出放在冰上，并在每孔和对照空中加120μl 甘氨酸溶液（0.4M，pH 10.4）终止反应。

7）用酶标仪（Thermo 型号：Varioskan flash ）在测定405nm处吸光值A。

8）抑制率计算：抑制率= (A-Ab)/Ac；其中Ab为空白对照的吸光值，Ac为阴性对照的吸光值。

测得结果如图1所示，从图1可知：黄腐酚体外抑制α-葡萄糖苷酶的IC₅₀为8.8 μM。

实施例2

本发明所述黄腐酚对α-葡萄糖苷酶抑制方式的确定，包括以下步骤：

1）黄腐酚的抑制类型的确定

在抑制剂量一定的条件下，加入0.25，0.5，0.75，1.5 mM的PNPG溶液，测定酶活力。测定体系中黄腐酚选用(0–25 μM) 3组，得出3组在不同底物质量浓度条件下的酶活力，用双倒数作图法确定抑制类型。

2）黄腐酚的抑制作用可逆性的确定

以高浓度的黄腐酚 100 μM 与α-葡萄糖苷酶共孵育24 h, 然后以磷酸盐缓冲液(5 mM, pH 6.7) 在4°C下透析 24 h，不同组别的α-葡萄糖苷酶按照实施1例中的方法测定其活性，确定黄腐酚对α-葡萄糖苷酶的抑制作用是否可逆。

测得结果如图2所示，从图2可知：黄腐酚体外抑制α-葡萄糖苷酶的抑制类型为非竞争性抑制，且这种抑制作用具有可逆性。

实施例3

本发明所述黄腐酚对α-葡萄糖苷酶抑制机理的研究，包括以下步骤：

1）黄腐酚对α-葡萄糖苷酶分子内部色氨酸的影响

将不同体积的黄腐酚溶液依次加入到酶溶液（5 μM）中，使其浓度比为0:1，1:1，10:1，20:1，40:1，80:1，各组混匀。分别在37°C、25°C作用30min。295 nm作为激发波长，测定300-400 nm间的荧光发射强度光谱，实验结果如图3所示。

2）黄腐酚对α-葡萄糖苷酶分子疏水性的影响

将不同体积的黄腐酚溶液依次加入到上述酶溶液中，使其浓度比为0:1，1:1，10:1，20:1，40:1，80:1，各组混匀。另外，设置单纯的黄腐酚组、溶剂对照、探针组。37°C 作用30 min。除一组黄腐酚组外，其他各组，加入探针bis-ANS，使其终浓度为15 μM。混匀，37°C下孵育15 min。激发光为395 nm，在400 nm-600 nm间检测发射光，实验结果如图4所示。

3）黄腐酚对α-葡萄糖苷酶分子二级结构的影响

将不同体积的黄腐酚溶液依次加入到上述酶溶液中，使其浓度比为0:1，1:1，10:1，20:1，40:1，80:1，各组混匀。37°C作用30 min。以10:1组体积的甲醇为空白，在190-250 nm 内扫描，累加10次，利用随机软件对数据进行处理，计算酶分子二级结构的比例。，实验结果如图5所示。

图3-图5实验结果发现：黄腐酚与酶分子存在明显的相互作用，可使酶分子内部的色氨酸荧光发生明显变化，改变酶分子的疏水结构，并使其二级结构比例发生显著改变。

实施例 4

本实施例利用肠道单层细胞模型验证黄腐酚对α-葡萄糖苷酶的影响

接种Caco-2 细胞于6 孔板的多聚碳酸酯膜上14～15d后，可得到腔侧和基底侧的Caco-2 单细胞层，用PBS液冲洗以除去葡萄糖。含有28mM 蔗糖的或28mM 麦芽糖的950μL PBS 作为底物，黄腐酚50μL 加入Caco-2 细胞的腔侧，另外加入1mL PBS 在基底侧。37℃孵育2h 后，分别吸取浸渍细胞两面的液体100μL在96 孔板内，测定游离葡萄糖的浓度。

实验结果如图6所示，检测结果发现：黄腐酚对肠道上皮细胞单层的α-葡萄糖苷酶具有显著的抑制活性。

以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其进行限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的普通技术人员来说，依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案的精神和范围。

Claims

1.一种黄腐酚在制备抑制α-葡萄糖苷酶活性的药物或保健品中的应用，其特征在于：所述黄腐酚如式I所示或式I化合物药学上可接受的盐或溶剂合物，

式 I。

2.根据权利要求1所述的黄腐酚在制备抑制α-葡萄糖苷酶活性的药物或保健品中的应用，其特征在于：所述抑制α-葡萄糖苷酶活性的药物为治疗糖尿病、艾滋病、恶性肿瘤、溶酶体贮积症的药物。

3.根据权利要求1所述的黄腐酚在制备抑制α-葡萄糖苷酶活性的药物或保健品中的应用，其特征在于：所述黄腐酚用于制备α-葡萄糖苷酶的抑制剂时，所述黄腐酚的摩尔浓度为8.8-80 μM。

4.根据权利要求3所述的黄腐酚在制备抑制α-葡萄糖苷酶活性的药物或保健品中的应用，其特征在于：所述黄腐酚与DMSO、乙醇、甲醇或乙酸乙酯中的至少一种相混合用于制备α-葡萄糖苷酶的抑制剂。

5.根据权利要求1所述的黄腐酚在制备抑制α-葡萄糖苷酶活性的药物或保健品中的应用，其特征在于：所述黄腐酚对α-葡萄糖苷酶的抑制类型为非竞争性抑制。

6.根据权利要求1所述的黄腐酚在制备抑制α-葡萄糖苷酶活性的药物或保健品中的应用，其特征在于：所述黄腐酚对肠道上皮细胞单层的α-葡萄糖苷酶具有显著的抑制活性。