CN103732076B - 从含油种子中分离蛋白质 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种从粕或油饼中分离蛋白质的方法，包括下列步骤：·用水提取粕，以得到水溶液；·浓缩水提取物，至包含5至30wt%的蛋白质、优选10至30wt%的蛋白质的水溶液；·向所述浓缩的水溶液添加水溶性溶剂，以得到蛋白质沉淀；和·将蛋白质沉淀与液体部分分离。

Description

从含油种子中分离蛋白质

技术领域

本发明涉及一种从诸如油菜籽、向日葵籽、椰子或大豆的含油种子中分离蛋白质的方法。

背景技术

存在于含油种子中的油通常用己烷萃取。然而，提取和脱溶剂方法的组合可能造成蛋白质的变性。这导致了对于蛋白质在广泛的食品应用中的用途来说，蛋白质没有表现出必要的技术功能的构象状态。此外，该溶剂已成为关于安全和环境影响的关注焦点（正己烷已被列为有害空气污染物）。

为了从含油种子中提取蛋白质部分，使用了多种萃取技术。已提到的方法可以是用水或碱、NaCl和六偏磷酸钠溶液萃取。碱性萃取方法导致最高的产率，但有使产品的颜色变深的风险并且对味道或气味产生不利影响。

作为示例，将更详细地讨论油菜籽。油菜籽是全世界最重要的含油种子之一（在大豆和棕榈油之后排名第3）。油菜籽含有高量的油（30-45%）和蛋白质（20-30%）。然而，油菜籽中也存在抗营养化合物，例如硫代葡萄糖苷、多酚和植酸。表1显示了油菜籽中这些成分的典型范围：

表1:油菜籽中的抗营养化合物

硫代葡萄糖苷 10-20μmol/kg

芥子碱(Sinapin) 1-1.5%(总酚类(1-3%))

植酸 1-2%

对于从油菜籽中分离蛋白质来说，要解决下列问题：

-存在酚类化合物，其可能在处理之后产生深的颜色并增加了香味和气味强度。与大豆中发现的酚类化合物（如芥子碱和单宁酸）的量相比，加拿大油菜（油菜籽）包含约10至30倍的酚类化合物。氧化之后，这些化合物产生深色。尤其是强碱性条件导致酚类物质迅速氧化为所谓的醌，然后其可以与蛋白质反应（产生深颜色）。这些酚类化合物可以部分地结合到蛋白质上（参见美国专利6905713）。

-存在肌醇六磷酸，其可以充当人体内的螯合剂并减少某些金属的生物利用度。

-存在硫代葡萄糖苷。硫代葡萄糖苷水解可能会产生有毒产物。硫代葡萄糖苷也会降低油菜籽粕的适口性（palatability）。

发明概述

本发明提供了一种用于从含油种子粕（meal）中提取和分离蛋白质的改进方法，其中该分离通过向含有从粕中提取的蛋白质的水溶液添加足够量的水溶性溶剂（例如乙醇）来进行，由此使蛋白质沉淀。为了保持蛋白质的本性，用于蛋白质提取的粕最好来源于非己烷处理的含油种子。

任选地，该沉淀物可通过用水溶性溶剂（如乙醇）洗涤进一步纯化。蛋白质分离物可以使用合适的干燥方法进行干燥。

根据本发明的一个方面，提供了一种从粕或油饼中分离蛋白质的方法，包括下列步骤：

·用水提取粕，以得到水溶液；

·浓缩水提取物，至包含5至30wt%的蛋白质、优选10至30wt%的蛋白质的水溶液；

·向浓缩的水溶液添加水溶性溶剂，以得到蛋白质沉淀；和

·将蛋白质沉淀与液体部分分离。

优选地，本发明的方法包括洗涤蛋白质沉淀的附加步骤。本发明的方法任选地提供干燥该蛋白质沉淀的附加步骤。有利的是，在本发明的方法中，在提取步骤之后和添加水溶性溶剂之前，水溶液或浓缩的水溶液优选通过使用UF（超滤）进行渗滤。优选地，从水溶液或浓缩的水溶液中除去可溶性碳水化合物、硫代葡萄糖苷或其衍生物、肌醇六磷酸或多酚（或酚类）化合物或这些化合物中的一种或多种的组合。根据本发明的一个实施方式中，渗滤在浓缩水提取物之前、期间或之后进行。根据另一个优选的实施方式，水溶性溶剂是甲醇、乙醇或丙酮，优选乙醇。在本发明的方法中使用的粕可以例如是油菜籽粕、向日葵粕或大豆粕。有利地，与从己烷处理的粕中或本领域现有的提取方法得到的蛋白质相比，本发明的分离的蛋白质具有更高程度的天然蛋白质，从而导致本发明的分离蛋白质具有更好的技术功能性。该功能有利于蛋白质在在广泛的食品应用中使用。

本发明还提供了一种分离的蛋白质或蛋白质组合物，其具有：

-蛋白质含量为至少80wt%，优选至少85wt%，更优选至少90wt%，最优选介于92和99wt%之间(基于干物质)；

-乙醇含量小于0.2wt%，优选小于0.1wt%(基于干物质)；

-乙醇含量大于0.001wt%，优选大于0.01wt%(基于干物质)；和

-表示为芥子酸当量的酚含量小于0.1wt%，优选小于0.05wt%，更优选小于0.02wt%(基于干物质)。

如果蛋白质分离物或蛋白质组合物包含油菜籽蛋白质，组合物具有小于0.1wt%的酚含量，优选小于0.05wt%，更优选小于0.02wt%（基于干物质），酚含量表示为芥子酸当量。如果蛋白质分离物或蛋白质组合物包含大豆蛋白质，所述组合物具有小于0.1wt%的酚含量，优选小于0.05wt%，更优选小于0.02wt%（基于干物质），酚含量表示为芥子酸当量。如果蛋白质分离物或蛋白质组合物包含向日葵蛋白质，所述组合物具有小于0.1wt%的酚含量，优选小于0.05wt%，更优选小于0.02wt%（基于干物质），酚含量表示为芥子酸当量。

优选地，本发明的蛋白质分离物或蛋白质组合物具有小于10μmol/g的硫代葡萄糖苷含量，优选小于1μmol/g（基于干物质）。

一般而言，在油菜籽蛋白质或向日葵蛋白质的情况下，本发明的蛋白质分离物或蛋白质组合物将具有2-15wt%的脂质含量，优选2-10wt%，更优选2-8wt%(基于干物质)，或者在大豆蛋白质的情况下，脂质含量为2-20wt%，更优选2-15wt%(基于干物质)。

本发明的蛋白质分离物或蛋白质组合物将具有小于0.5wt%、优选小于0.2wt%(基于干物质)的肌醇六磷酸含量(P x3.5)。

优选地，本发明蛋白质分离物或蛋白质组合物将具有至少30NS%、优选至少50NS%、更优选至少60NS%、甚至更优选至少70NS%、最优选至少75NS%的溶解度。

优选地，本发明蛋白质分离物或蛋白质组合物具有至少70wt%、优选至少80wt%、更优选至少85wt%、甚至更优选至少90wt%、还要更优选至少91wt%的干物质含量，甚至还要更优选具有92-99wt%、最优选93-98wt%的干物质含量。

本发明蛋白质分离物或蛋白组合物包括油菜籽蛋白质、向日葵蛋白质或大豆蛋白质。在油菜籽的情况下，优选地，本发明的蛋白质分离物或蛋白质组合物的2S蛋白和12S蛋白将以1:6到6:1的比例、优选为1:2到2:1(基于干物质的重量比，wt/wt)的比例存在。

对于三种可商购的、不是根据本发明生产的蛋白质分离物来说，经测量，溶解度分别为69NS%、55NS%和67NS%。

发明详述

对于工业加工者或配方设计师来说，来源于植物或油籽且用于消费的蛋白质分离物或浓缩物共同存在一个主要问题，即，抗氧化因子的存在，例如源材料中存在的酚类化合物。酚类化合物普遍存在于如大豆、向日葵和油菜籽的含油种子，并且是造成蛋白质分离物着色、变味和产生异味的原因。因此，有必要除去最终产物中不想要的化合物（例如酚类化合物）或使其降低到痕量水平，特别是在意欲用于（人类）食用的情况下。

一种从蛋白质制剂中除去酚类化合物的方法是用水溶性溶剂（如甲醇、丙酮、乙醇等）冲洗它们。其它不同的方法也是可能的，例如预处理，如在蛋白质提取之前施加溶剂浸提步骤；或后处理，如在提取或分离之后的蛋白质分离物的洗涤。

本发明的方法提供了在蛋白质提取之后但在蛋白质分离物发生分离之前引入溶剂处理。本发明人业已发现，通过将蛋白质引入水溶液，可以使一般的蛋白质纯化，除去不需要的化合物（例如酚类化合物）。优选地，所述蛋白质被纯化除去粗制的提取物中所存在的低分子化合物（例如碳水化合物）和其它化合物（例如部分酚类化合物）。这样的纯化可以例如通过在UF（超滤步骤）中渗滤来实现。本发明人观察到，存在于粗提取物中的酚类化合物的主要部分可以通过例如UF除去，但不是全部除去。不过，仍有一些不能通过例如渗滤去除的酚类化合物留在蛋白质分离物中。在文献中，已经对于向日葵观察到这种现象。

一种可能的解释可能是，这些酚类化合物包埋在蛋白质的三级结构中，并且通过弱吸引力附着于蛋白质的疏水性表位。根据本发明，通过在使用溶剂之前选择适当的处理条件，蛋白质优选保持为天然或非变性的蛋白质。总而言之，重要的是防止酚类化合物与蛋白质形成不可逆的复合体。这些复合体可能在某些条件下形成，例如溶解的氧的存在下、高于8的pH和/或在高于60℃的高温下。

根据本发明的蛋白质的分离可以通过向水溶液添加如乙醇的水溶性溶剂而实现，优选同时搅拌。酚类化合物与蛋白质之间的吸引力将因乙醇的存在被削弱，从而允许酚类化合物从氨基酸链中离解。这些酚类化合物随后将扩散到液相本体中。为了使不可逆变性的风险最小化，温度优选保持在0到30℃的范围内，优选为0到20℃。然而，本发明并不表明该解释或假说成立与否，本发明人提出该解释或假说仅仅是为了使方法步骤容易理解，而不是要限制本发明的范围。

为了实现该效果，例如以油菜籽蛋白质为例，在最终母液中乙醇含量优选介于60-80vol%之间，更优选介于65-75vol%之间。如果该含量显著更低，纯化效果较差。如果该含量更高，蛋白质可能经历更快的变性并且纯化效率不太理想。

在WO02/060273中，有人建议，向日葵蛋白质暴露于超过40%乙醇的乙醇溶液可能导致蛋白质的变性。我们惊奇地发现，油菜籽蛋白质在70vol%的乙醇溶液中分离，随后干燥，将保持天然的蛋白质和保存其与食物应用有关的功能特性，例如：发泡能力、溶解性、水结合能力等。

用于向日葵种子时，本发明的方法以高收率、高纯度和低酚类化合物含量提供了蛋白质分离物。这种蛋白质分离物也表现出良好的功能特性，为我们的解释或假设提供支持。

在整个本说明书和所附的权利要求中，词语“包含”和“包括”及其语法变化形式（如“comprises”、“comprising”、“includes”和“including”）应被解释为包含在内。也就是说，这些词是为了表达有可能包括没有具体列举的其它要素或整数，只要情况允许。

不定冠词（“a”和“an”）在本文中用于指一个或多于一个（即一个或至少一个）的冠词的语法对象。作为例子，“元件”可以表示一个元件或多于一个元件。

油菜（Brassica napus），也被称为rape、oilseed rape、rapa、rappi、rapaseed（并且在特定品种的情况下，加大拿油菜(canola)）是一种十字花科（Brassicaceae，芥菜或白菜科）的亮黄色开花植物（Wanasundara，2011）。油菜籽中存在的蛋白质包括2S蛋白（单体蛋白，如芸苔素(napin)）和12S蛋白（六聚体蛋白，例如十字花科蛋白(cruciferin)）。在天然核（kernel）中，存在约7wt%的2S蛋白、2wt%的7S蛋白和12wt%的12S蛋白。

栽培的向日葵（Helianthus annuus L.）是向日葵（Helianthus）属的67个品种之一，是菊（Asteraceae）科家族的一员。存在于向日葵中的蛋白质包括两个主要类别，11S球蛋白（如半日花素(helianthinin)）和2S向日葵白蛋白。在向日葵籽中，约60%的蛋白质由11S蛋白组成，而2S向日葵白蛋白约占蛋白质的20%。

基于干物质（DM），大豆含有约40%的蛋白质。基于它们的沉降系数，大豆蛋白可以分为2S级分（13-18%）、7S级分（30-46%）、11S级分（36-53%）和15S级分（0-4%）。11S和15S级分分别由大豆球蛋白和大豆球蛋白聚合物组成。大多数7S级分是β-伴大豆球蛋白。2S级分由Bowman-Birk和Kunitz型胰蛋白酶抑制剂、细胞色素c和α-伴大豆球蛋白组成。

通过压碎、排出（expelling）以及任选地从油菜籽中提取油，用于生产油的油菜籽的处理提供了油菜籽粕或油饼作为副产品，并且一般是粕的形式。“油饼”指的是压碎和排出后的产品。“粕”指的是已从油饼中除去至少部分油，例如通过萃取。油饼和粕副产品具有高蛋白质含量。其他含油种子给出类似的粕或油饼作为副产品。

本发明的目的是提供一种从包含蛋白质和多酚化合物的粕或油饼中分离蛋白质的方法。因此，本发明的方法包括下列步骤：

-用水提取粕，以得到的水溶液；

-浓缩水提取物，至包含5至30wt%的蛋白质、优选10至30wt%的蛋白质的水溶液；

-向浓缩的水溶液添加水溶性溶剂，以得到的蛋白质沉淀；和

-将蛋白质沉淀与液体部分分离。

有利地，该方法可以进一步包括一个或多个附加的或随后的步骤的组合：

-洗涤蛋白质沉淀；和

-干燥蛋白质沉淀。

在本发明优选的实施方式中，在提取步骤之后以及在添加水溶性溶剂之前，水溶液或浓缩的水溶液优选通过使用UF（超滤）来渗滤。在该渗滤步骤，可溶性碳水化合物、硫代葡萄糖苷或其衍生物、肌醇六磷酸或多酚化合物或这些化合物中的一种或多种的组合可以从水溶液或浓缩的水溶液中除去。渗滤在浓缩水提取物之前、期间或之后进行。渗滤可以与浓缩步骤分开进行或者可以与浓缩步骤组合进行，例如通过使用UF。

水溶性溶剂优选为甲醇、乙醇或丙酮，更优选为乙醇。优选地，分离后的液体部分含有多酚类化合物。

本发明公开了一种以经济上有吸引力并且同时可持续的方式生产分离的蛋白质或蛋白质组合物的方法，因为使用例如水和水溶性溶剂（如乙醇）之类的可回收化合物可以提供食品级蛋白质产品的生产。

干燥的蛋白质沉淀物或蛋白质分离物具有至少80wt%的蛋白质含量。蛋白质含量是通过Kjeldahl法以干物质为基础确定的。蛋白质分离物是含油种子粕中分离的蛋白质部分，其中所述分离物具有大于或等于80wt%、优选至少90wt%的蛋白质含量（基于干物质）。通常情况下，蛋白质分离物具有92-99wt%的蛋白质含量（基于干物质）。通常情况下，蛋白质分离物的非蛋白质含量包括非蛋白质化合物，如抗营养物质、脂肪、纤维、和其他组分。油籽粕的实例包括种子饼、脱脂粕或富含蛋白质的粕。该粕是含油种子的粕，如油菜籽、大豆、向日葵籽、椰子、传统的亚麻、亚麻（linola）或芥菜籽，优选地，所述粕为油菜籽粕。虽然本文中具体公开了本发明的方法特别用于油菜籽粕，但本发明也可以应用于其他含油种子粕。粕可以是从种子中除去油而得到的具有不同水平的天然（非变性）蛋白质的任何粕，例如通过热或冷的油压榨法。天然或非变性的蛋白质是指很大程度上保留与其在食品工业中的应用相关的功能特性的蛋白质，例如

-在水溶液中的溶解性，

-水结合能力，

-脂肪结合能力和/或

-起泡能力。

粕是从含油种子或油饼中压制或提取油之后的副产品。本发明的方法的产品可以用于人类食用。有利的是，在用于从含油种子分离油的过程中的条件不会导致存在于含油种子或粕中的蛋白质的大量变性。优选地，选择条件使得粕中蛋白质的本性和功能得以保存。温和条件的实例是冷压含油种子（例如油菜籽）。油分离期间的温和条件以及本方法的条件将导致蛋白产物具有高功能，因此具有人类食用的很高价值。已发现，通过本发明的方法生产的蛋白质分离物是天然（非变性）的蛋白质。有利的是，本发明的方法产生这样的蛋白质，其中所生成的蛋白质的天然蛋白质的含量相当高。天然蛋白质含量是蛋白质中存在的天然蛋白质（以wt%计）的比例。

对于从粕中水提取蛋白质来说，适宜的条件是介于8和80℃之间的温度，优选介于10和55℃之间。通常，pH介于5和10之间，优选介于6和8之间。

从含油种子粕中提取蛋白质是以与从含油种子粕中进行连续提取蛋白质相符的任何适当的方式进行，例如使含有种子粕和食品级水溶液的混合物通过具有一定长度的管道，并且在一定流速保持足够的停留时间以实现所需提取。

或者，提取可以在搅拌罐中进行，在其中含有种子粕和水溶液的混合物连续地或不连续地进料并从其中连续地或不连续地除去蛋白质水溶液。此外，该过程可以以半连续的方式（相当于连续）进行，其中含油粕和水溶液的混合物进料到第一搅拌容器内，在其中进行提取以形成蛋白质水溶液，而蛋白质水溶液连续从第二搅拌容器进料到下面所描述的残留粕分离步骤。当蛋白质水溶液已经在所述第一容器中形成并且所述第二容器已耗尽蛋白质水溶液时，所述第一容器然后变成第一容器，反之亦然。

由所述提取步骤产生的水相或水溶液可以以任何适当的方式与残留的粕分离，例如通过使用过滤和/或离心以除去残留的粕。分离的残留粕可以干燥。

水相或水溶液可以在接下来的步骤（添加水溶性溶剂，如乙醇）中原样使用，或优选可在接下来的添加水溶性溶剂（如乙醇）的步骤之前浓缩。浓缩步骤可以以与（半）连续或间歇（不连续）操作相符的任何适当的方式进行，例如通过使用任何适当的选择性膜技术，例如超滤（UF），以允许所期望的蛋白质水溶液浓缩程度。有利的是，在浓缩步骤之前、之后或期间，可以进行渗滤。在提取步骤之后和添加水溶性溶剂之前进行该渗滤。UF可用于渗滤。所以UF可用于渗滤以及浓缩，或者UF可用于渗滤，而浓缩步骤是分开进行的。通过使用用于渗滤的UF，存在于水提取物中的大部分可溶性碳水化合物和ANF（抗营养因子，如硫代葡萄糖苷及其衍生物、肌醇六磷酸和大多数多酚化合物）可以被有利地除去。

浓缩步骤可以在任何适当的温度下进行，一般为20到80℃，保持一段时间以实现所需的浓缩程度。所用的温度和其他条件在一定程度上取决于例如实现浓缩和所需的溶液的蛋白质浓度而使用的膜设备。

在其中加入水溶性溶剂（如乙醇）的步骤中，优选使用至少90vol%溶剂的水溶性溶剂，优选至少92vol%的溶剂。因此，在其中加入乙醇的步骤中，优选使用至少90vol%的乙醇，优选至少92vol%。需要加入水溶性溶剂（例如乙醇），以获得足够高的水溶性溶剂（如乙醇）的浓度，使得所存在的蛋白质沉淀。约70vol%乙醇的浓度便足以使蛋白质沉淀。

蛋白质沉淀物和液体部分的分离可以在任何合适的分离器中进行，例如通过使用过滤和/或离心分离。在使用油菜籽粕作为起始粕的情况下，液体部分将主要包含抗营养化合物（如肌醇六磷酸、酚类和硫代葡萄糖苷）和糖。在使用如之前所述的渗滤步骤的情况下，可能仅仅存在这些化合物的剩余物。从油菜籽开始时，沉淀物主要包含2S蛋白（芸苔素(napins)或白蛋白）和12S蛋白（十字花科蛋白或球蛋白）。

沉淀物可以例如用包含有小于70vol%的水溶性溶剂的水/水溶性溶剂（如乙醇）洗涤，优选包含50-70wt%的水溶性溶剂，更优选50-70vol%的乙醇，甚至更优选为50-65vol%的乙醇，最优选50-60vol%的乙醇。

沉淀物可被干燥以除去残余的水溶性溶剂（如乙醇），至优选小于0.2wt%、优选小于0.1wt%水溶性溶剂（如乙醇）的水平。一般而言，通过本发明的方法得到的蛋白质分离物或蛋白质组合物具有大于90wt%的纯度（基于干物质）。（多）酚类化合物以小于0.1wt%、优选小于0.05wt%、更优选小于0.02wt%、最优选小于0.01wt%（基于干物质）的浓度存在。蛋白质分离物或蛋白质组合物可以以任何适当的方式进行干燥，例如通过喷雾干燥、流化床干燥、冷冻干燥或真空转鼓干燥，得到干燥的形式，以提供蛋白质含量为至少70wt%、优选至少80wt%、更优选至少85wt%、甚至更优选至少90wt%的干燥的蛋白质分离物。优选地，干燥的蛋白质分离物或蛋白质组合物具有至少70wt%、优选至少80wt%、更优选至少85wt%、甚至更优选至少90wt%、更优选至少91wt%的干物质含量，甚至还更优选具有92-99wt%的干物质含量，最优选93-98wt%。通常，在干燥期间蛋白质分离物的温度保持在低于60℃。

根据本发明的一个目，用本发明的方法得到的蛋白质分离物适用于人们食用。肌醇六磷酸、酚类（或多酚）和硫代葡萄糖苷的去除可以防止不吸引人的风味和变色以及蛋白质分离物的营养价值降低。同时，该除去增强蛋白质分离物的蛋白质含量。

在本发明的方法中使用具有不同量的水溶性溶剂（如乙醇）的液体。本领域技术人员应当理解，一些水溶性溶剂（如在工艺过程中的流）可以再循环，可以在该方法的其它部分再次使用，或者可以在例如蒸馏以增大溶剂含量的处理之后被重新使用。本领域技术人员将会理解，可以设计水溶性溶剂（如乙醇）的最佳使用，在过程中尽可能更少地“消耗”水溶性溶剂（如乙醇），以获得一个持续的过程。

方法和材料

蛋白质含量

根据AOAC官方方法991.20（牛奶中的(总)氮）通过Kjeldahl法测定蛋白质含量。使用6.25的转换因子来确定蛋白质的量(%(w/w))。

含水量

根据Food Chemical Codex,第7版,检验与化验（General tests and assays）,附录II,第1133–1134页测定含水量。

总的灰分含量

根据Food Chemical Codex, 第7版, 检验与化验（General tests and assays）,附录II,C,第1746页测定总的灰分含量。

肌醇六磷酸含量

肌醇六磷酸含量是基于在Food Chemical Codex（FCC7,检验与化验，附录V,第1207-1208页）所述的肌醇六磷酸酶测定法。所用的试剂和溶液是类似的，不同之处在于所用的乙酸盐缓冲液，其中还含有1%(v/v)Tween20。使用在乙酸盐缓冲液中含有10mM的肌醇六磷酸的参照肌醇六磷酸溶液，代替底物溶液。使用在每ml乙酸盐缓冲液含有1.25单元植酸酶的溶液用于转化肌醇六磷酸。肌醇六磷酸校准线已经在0.1至0.5mM的肌醇六磷酸的范围内创建。对于所有样品和标准品，在37℃下进行培养120分钟。样品中肌醇六磷酸的含量已经直接从肌醇六磷酸标准品的肌醇六磷酸的浓度与415nm处反应后的吸收之间的关系得到。

氮的溶解度（NS%）

通过以在去离子水中2%(w/w)的蛋白质浓度溶解蛋白质粉末，来制备蛋白质溶液。用4M HCl或4M NaOH将pH调节至8.0（不加入额外的盐）。

溶液在50℃下培养2小时，同时剧烈振荡。随后，在20000g下使样品离心5分钟，收集上清液。上清液和蛋白质粉末样品中的蛋白质含量通过Kjeldahl法分析。氮的溶解度（NS%）被定义为：

多酚或酚含量

使用用于定量测定芥子酸及其类似物的UPLC-UV方法测定多酚或酚浓度。该方法是基于Narváez-Cuenca等人Journal of Agricultural and Food Chemistry,2011,59(10247-10255)所述的对马铃薯酚类的分析，具有如下所述的细微调整。

Acquity UPLC（Waters）系统装有Acquity UPLC BEH C18柱（1.7μm,2.1x150mm,Waters），使用PDA检测器在320nm处用于检测。流动相A由溶于水的0.1%的甲酸组成，流动相B由溶于乙腈的0.1%甲酸组成，以梯度模式施加0.4mL/min的流量。柱温度设定在30℃，进样量为2μL。

芥子酸被用作参考标准物(校准曲线0.1-100mg/L)，溶解于含有0.5wt%乙酸的50vol%的甲醇中。约1.0g样品溶解在10ml70vol%的甲醇中，随后混合1小时。将一份等分样品转移到Eppendorf管中，在14000rpm下离心10min，将上清液用含有0.5wt%乙酸的50vol%的甲醇1:1稀释。

通过用芥子酸的校准曲线内插确定芥子酸及其类似物的总峰面积，来计算多酚浓度。总的多酚浓度表示为wt%。

碳水化合物含量：

通过如Rao等人Anal.Biochem.181(1989),pp.18–22所述的苯酚-硫酸分析法来确定。该方法包括：用硫酸(约70%)在高温下使多糖通过酸水解降解成单糖（如葡萄糖、甘露糖）。在这种酸性环境中，单糖随后脱水并转化为2-糠醛（2-furaldehyde），也称为糠醛（furfural）。在酸性环境中，苯酚被质子化，留下将与糠醛分子反应的活性分子。该缩合产物是高度共轭的，并是显色的。可以用分光光度法在490nm处测量橙色的强度。

该化合物的颜色对应于所存在的单糖的量。实际含量是来自于以葡萄糖为标准物制作的校准曲线。

脂肪含量

根据AOCS第六版，Ce1-62的方法测定脂肪含量。

硫代葡萄糖苷含量

根据COMMISSION REGULATION(EEC)No1864/90，1990年6月29日修订Regulation（EEC）No1470/68，测定硫代葡萄糖苷的含量。

（本发明的产物或组合物的）乙醇含量

使用GC顶空分析来确定乙醇含量。

将25mg的样品和1.5g氯化钠放入带盖的玻璃小瓶中。将样品悬浮在1ml水中，将小瓶封闭。在60℃的温度下达到顶空平衡之后，通过1:20的分流进样（split injection）的方式将1ml的顶空注射到气相色谱仪。

该气相色谱仪装有DB624柱(60m x0.25mm内径,膜1.2μm)和火焰离子化检测器。氮气以3ml/min的流速被用作载气。柱温最初设定在50℃，接着以30℃/min的线性温度梯度升至200℃，在该值下保持6min。

使用火焰离子化检测器测定乙醇，并且使用Chromeleon进行数据处理。通过注入标准乙醇来确定乙醇在该系统中的保留值。样品中乙醇的量是通过在合适的范围内向样品加入标准乙醇来确定。

S级分中的蛋白质含量的确定，例如，油菜籽蛋白中的2S蛋白含量和12S蛋白含量

采用体积排阻色谱法测定S级分的含量，市售纯化油菜籽蛋白作为参考。蛋白样品已经溶解在洗脱液0.1MNaCl溶液中。分离在Waters BEH200柱(1.7μm,4.6X150mm)中、在40℃和0.5ml/min下进行。使用在280nm处的UV吸收和折射率来进行蛋白质峰的检测。基于参考蛋白质的色谱图中主要峰的面积，来进行S级分含量的定量。

实施例1

将1kg经过2次压榨的油菜籽饼悬浮在5升水中。在混合期间，使用氢氧化钠溶液将pH调至7。在搅拌下，提取在30℃控制温度下进行1小时。固体液体的分离在约4000g下在环境温度(22℃)下进行约30分钟。通过滗析和过筛(0.15-0.25mm的筛子)收集上清液，以除去顶部的脂肪层。

使用10kD超滤（UF）模块和泵来进行水提取物的浓缩。鉴于浓缩之前的上清液，浓缩物大约进行10次浓缩。用水洗涤3次浓缩物（浓缩物与水的体积比=1:3），并且从UF单元中收集洗涤的浓缩物。用一些水洗涤膜以增大蛋白质的产率，最终的浓缩系数约为4倍。

通过向洗涤的浓缩物添加食品级浓缩的乙醇(95%)，使得最终的浓度为70vol%乙醇(浓缩物与乙醇的体积比=1:2.3)，来进行乙醇诱导的沉淀。在添加乙醇期间，对混合物进行彻底的混合。离心（在环境温度下以4000g进行15min）之后除去沉淀，并且再次悬浮在70vol%的乙醇(重量比为1:5)中。离心（在环境温度下以4000g进行15min）之后，在真空恒温箱(120mbar,45℃)中干燥球团，以产生干物质含量为93.6%干物质的210g油菜籽蛋白质。

实施例2.实验室规模，在30℃下提取

进行实验室规模的实验，其包括用油菜籽饼在30℃下通过乙醇沉淀(乙醇诱导沉淀，Ethanol Induced Precipitation=EIP)提取。

将1500g油菜籽饼悬浮在7500g生产用水中。通过加入70g4NNaOH将pH调至7。在10L的容器中使用顶置式搅拌装置和折叠的浆式搅拌器，提取在温和的搅拌下在30℃下进行90分钟。通过在加入油菜籽饼之前使用预热的水，使得油菜籽悬浮液的起始温度为30℃。

通过使用摆动式离心机(4000g,30分钟,10℃)来进行脂肪、固体和液相的分离。通过使提取物倾倒在筛子(0.25mm)上而从水相中分离顶部的脂肪层。

使用泵和10kD的膜在室温下浓缩并洗涤水相部分（aqueous fraction）。施加1bar的跨膜压力。使水相部分从6342g浓缩到400g之后，用3x3体积的去离子水进行洗涤。最终经洗涤的浓缩物(1018g)的干物质含量为23%。

970g的浓缩物悬浮在10℃的2266ml的96vol%乙醇中。使用顶置式搅拌装置和折叠的浆式搅拌器彻底混合之后，混合物在摆动式离心机(4000g,10分钟,10℃)中离心。将球团再次悬浮在10℃的1440ml的70vol%乙醇中，彻底混合之后，再次离心。用勺子将球团弄碎之后，干燥。干燥的材料进一步均匀化，并且通过使用IKA M20混合器降低尺寸(即粉碎)。

表2.在30℃下以实验室规模处理的油菜籽的级分的组成

实施例3.实验室规模,在15℃下提取

进行实验室规模的实验，其包括用油菜籽饼在15℃下通过乙醇沉淀提取。

将800g油菜籽饼悬浮在4000g生产用水中。通过加入35g4NNaOH将pH调至7。在具有连接水浴的夹套的10L的容器中使用顶置式搅拌装置和折叠的浆式搅拌器，提取在温和的搅拌下在15℃下进行30分钟。通过在加入油菜籽饼之前使用冷水，使得油菜籽悬浮液的起始温度为15℃。

通过使用摆动式离心机(4000g,30分钟,10℃)来进行脂肪、固体和液相的分离。通过使提取物倾倒在筛子(0.25mm)上而从水相中分离顶部的脂肪层。

使用泵和10kD的膜在15℃下浓缩并洗涤水相部分。施加1bar的跨膜压力。使水相部分从3193g浓缩到519g（干物质含量为19%）之后，用3x3体积的去离子水进行洗涤。

496g的浓缩物悬浮在10℃的1165ml的96vol%乙醇中。使用顶置式搅拌装置和折叠的浆式搅拌器彻底混合之后，混合物在摆动式离心机(4000g,10分钟,10℃)中离心。将球团再次悬浮在10℃的1000ml的70vol%乙醇中，彻底混合之后，再次离心。用勺子将球团弄碎之后，干燥。干燥的材料进一步均匀化，并且通过使用IKA M20混合器降低尺寸。

表3.在15℃下以实验室规模处理的油菜籽的级分的组成

在EIP和干燥之后，经洗涤的浓缩物的氮的溶解度为74%。

实施例4.实验室规模,在50℃下提取

在3次实验中，进行更大规模的实验室实验，其包括用油菜籽饼在50℃下通过乙醇沉淀提取。

在3个独立的实验中，将4800g油菜籽饼悬浮在24000g生产用水中。通过加入212g4N NaOH将pH调至7。在10L的容器中使用顶置式搅拌装置和折叠的浆式搅拌器，提取在温和的搅拌下在50℃下进行30分钟。通过在加入油菜籽饼之前使用60℃的水，使得油菜籽悬浮液的起始温度为50℃。

培养之后，通过将水浴中的水换为冰冷的水，而使油菜籽悬浮液的温度降低到15°。冷却时间为约30分钟。

通过使用摆动式离心机(4000g,30分钟,10℃)来进行脂肪、固体和液相的分离。通过使提取物倾倒在筛子(0.25mm)上而从水相中分离顶部的脂肪层。

使用泵和10kD的膜在15℃下浓缩并洗涤水相部分（3批次）。施加2.5bar的跨膜压力。使水相部分从6000g浓缩到600g之后，用3x3体积的去离子水进行洗涤。

1000g的浓缩物悬浮在10℃的2300ml的96vol%乙醇中。使用顶置式搅拌装置和折叠的浆式搅拌器彻底混合之后，混合物在摆动式离心机(4000g,10分钟,10℃)中离心。将球团再次悬浮在10℃的2000ml的70vol%乙醇中，彻底混合之后，再次离心。用勺子将球团弄碎之后，干燥。干燥的材料进一步均匀化，并且通过使用IKA M20混合器降低尺寸。

表4.以实验室规模的处理，在50℃下提取的油菜籽的级分的组成

在EIP和干燥之后，经洗涤的浓缩物（实验1、2和3的混合物）的

氮的溶解度为74%。

实施例5.中试规模,在50℃下提取

以中试规模在50℃下提取油菜籽饼。经洗涤的浓缩物的其它处理以实验室规模进行。

将60kg油菜籽饼悬浮在300kg水中。通过加入2.625kg1N NaOH将pH调至6。在500L的容器中使用顶置式搅拌装置和小型折叠的浆式搅拌器，在搅拌下在50℃进行提取。在加入油菜籽饼之前使水沸腾并冷却到60℃。由于所用的滗析器的能力有限(300kg/hr)，培养持续2小时。

滗析器之后，通过热交换器使提取的温度降低到15℃。使用连续的圆盘堆叠离心机进行脂肪和液相的分离。脂肪侧流的体积为总体积的10%。

将水相部分浓缩，并用具有10kD陶瓷膜的超滤装置在50℃下洗涤。施加的跨膜压力为2.5bar。浓缩之后的洗涤用4倍体积的去离子水连续进行。

在搅拌下，向10kg经洗涤的浓缩物（干物质含量为16%）缓慢加入23L乙醇（96vol%,10℃）。在70vol%乙醇中的混合物在摆动式离心机（4000g，10分钟，10℃）中离心。将球团再次悬浮在10℃的4L的70vol%乙醇中，彻底混合之后，再次离心。用勺子将球团弄碎之后，干燥。干燥的材料（1230g，含有97%的干物质）进一步均匀化，并且通过使用Alpine磨粉机降低尺寸。

表5.以中试规模的处理，在50℃下提取的油菜籽的级分的组成

在EIP和干燥之后，经洗涤的浓缩物的氮的溶解度为81%。

实施例6.向日葵饼的乙醇沉淀

为了显示乙醇沉淀对除油菜籽之外的其他含油种子的效果，对向日葵饼（压榨1次之后）进行处理。。

将1600克研磨的向日葵饼悬浮在8000克生产用水中。内源性pH为7所以不用调整。加入亚硫酸盐(1g/l)，以控制微生物和防止酚类化合物的氧化。在10L的容器中使用顶置式搅拌装置和折叠的浆式搅拌器，提取在温和的搅拌下在15℃下进行30分钟。

通过使用摆动式离心机(4000g,30分钟,10℃)来进行脂肪、固体和液相的分离。通过使提取物倾倒在筛子(0.25mm)上而从水相中分离顶部的脂肪层。

使用超滤装置和10kD的膜在15℃下浓缩并洗涤水相部分。施加2.5bar的跨膜压力。浓缩水相部分之后，用3x3体积的去离子水进行洗涤。

在搅拌下，向200g经洗涤的浓缩物（干物质含量为10.0%）缓慢加入460ml乙醇（96vol%,10℃）。在70vol%乙醇中的混合物在摆动式离心机（4000g，10分钟，10℃）中离心。将球团再次悬浮在10℃的200ml的70vol%乙醇中，彻底混合之后，再次离心。用勺子将球团弄碎之后，干燥。

表6.在15℃下以中试规模的处理的向日葵饼的级分的组成

实施例7.大豆粉的乙醇沉淀

用全脂酶活性的大豆粉进行冷沉淀和乙醇沉淀的工艺组合。

将1600克研磨的向日葵饼悬浮在8000g生产用水中。内源性的pH为6.8，所以不用调整。加入亚硫酸盐(1g/l)，以控制微生物和防止酚类化合物的氧化。在10L的容器中使用顶置式搅拌装置和折叠的浆式搅拌器，提取在温和的搅拌下在15℃下进行30分钟。

通过使用摆动式离心机(4000g,30分钟,10℃)来进行脂肪、固体和液相的分离。通过使提取物倾倒在筛子(0.25mm)上而从水相中分离顶部的脂肪层。

在恒温的容器中，使用泵和10kD的膜在15℃下浓缩并洗涤水相部分。施加2.5bar的跨膜压力。浓缩水相部分之后，用3x3体积的去离子水进行洗涤。

在搅拌下，向上清液（765g）缓慢加入10℃的1780ml（1419g）乙醇（96vol%）。在70vol%乙醇中的混合物在摆动式离心机（4000g，10分钟，<10℃）中离心。将球团再次悬浮在10℃的1500ml的70vol%乙醇中，彻底混合之后，再次离心。用勺子弄碎之后，干燥球团。干燥的材料（189g，含有83%的干物质）使用IKA M20混合器进一步均匀化。

表7.全脂酶活性的大豆粉在15℃下的实验室规模的处理后，级分的组成

实施例8.用异己烷或乙醇预处理油菜籽饼

为了显示压榨之后油菜籽饼的预处理对除去酚类化合物的影响，进行实验来比较用异己烷或70vol%的乙醇预处理的油菜籽饼的水提取物以及未经预处理的水提取物。结果表明，与水以及与水不可混溶的溶剂相比，乙醇对酚的去除具有特定效果。

异己烷预处理：

使用5L异己烷提取1000g的油菜籽饼。在室温下培养1小时之后，通过过滤进行固体-液体分离。干燥之后球团的重量为831.5g，干物质占92.5%。

将异己烷预处理的油菜籽饼悬浮在4332g生产用水中。通过加入62.72g4N NaOH将pH调至7。在10L的容器中使用顶置式搅拌装置和小型折叠的浆式搅拌器，提取在搅拌下在30℃进行。

乙醇预处理：

使用5L70vol%的乙醇提取1000g的油菜籽饼。在30℃下培养1小时之后，通过离心(4000g,30分钟,20℃)进行固体-液体分离。干燥之后球团的重量为844.2g，干物质占86.0%。

将乙醇预处理的油菜籽饼悬浮在4309g生产用水中。通过加入30.73g4N NaOH将pH调至7。在10L的容器中使用顶置式搅拌装置和小型折叠的浆式搅拌器，提取在搅拌下在30℃进行。

未经预处理的油菜籽饼：

将1000g油菜籽饼悬浮在5000g生产用水中。通过加入40.66g4NNaOH将pH调至7。在10L的容器中使用顶置式搅拌装置和小型折叠的浆式搅拌器，提取在温和的搅拌下在30℃进行60分钟。

对于全部的3种悬浮液来说，通过使用摆动式离心机(4000g,30分钟,10℃)来进行脂肪、固体和液相的分离。通过使提取物倾倒在筛子(0.25mm)上而从水相中分离顶部的脂肪层。

在2L的容器中，使用泵和10kD的膜在室温下浓缩并洗涤水相部分。施加1bar的跨膜压力。使水相部分从4000g浓缩至600g之后，用3x3体积的去离子水进行洗涤。

表8.预处理的油菜籽饼在30℃下的实验室规模的处理后，级分的组成

实施例9.实验室规模,在30℃下提取

将1500g油菜籽饼悬浮在7500g生产用水中。通过加入59g4NNaOH将pH调至7。在10L的容器中使用顶置式搅拌装置和小型折叠的浆式搅拌器，提取在温和的搅拌下在30℃进行60分钟。在加入油菜籽饼之前使用预热的水，使得油菜籽饼的起始温度为30℃。

通过使用摆动式离心机(4000g,30分钟,10℃)来进行脂肪、固体和液相的分离。通过使提取物倾倒在筛子(0.25mm)上而从水相中分离顶部的脂肪层。

使用泵和10kD的膜在室温下浓缩并洗涤水相部分。施加1bar的跨膜压力。使水相部分从6000g浓缩至650g之后，用3x2.5体积的去离子水进行洗涤。最终经洗涤的浓缩物（928g）的干物质含量为21%。

将842g的浓缩物悬浮在10℃的2062ml的96vol%乙醇中。使用顶置式搅拌装置和折叠的浆式搅拌器彻底混合之后，混合物在摆动式离心机(4000g,10分钟,10℃)中离心。将球团再次悬浮在10℃的1000ml的70vol%乙醇中，彻底混合之后，再次离心。用勺子将球团弄碎之后，干燥。干燥的材料进一步均匀化，并且通过使用IKA M20混合器降低尺寸。

EIP和干燥之后，经洗涤的浓缩物的乙醇含量为0.15wt%。

Claims (15)

1.一种从含油种子粕或含油种子油饼中分离天然蛋白质的方法，包括下列步骤：

●用水提取含油种子粕或含油种子油饼，以得到水溶液；

●浓缩水提取物，至包含5至30wt％的蛋白质的浓缩的水溶液；

●向所述浓缩的水溶液添加水溶性溶剂，以得到蛋白质沉淀，其中所述水溶性溶剂是乙醇并且乙醇被添加至最终含量介于60-80vol％之间；和

●将蛋白质沉淀与液体部分分离，

其中，所述蛋白质包括油菜籽蛋白质、向日葵蛋白质或大豆蛋白质。

2.如权利要求1所述的方法，其包括洗涤蛋白质沉淀的附加步骤。

3.如权利要求1所述的方法，其包括干燥蛋白质沉淀的附加步骤。

4.如权利要求1所述的方法，其中，在提取步骤之后和添加水溶性溶剂之前，所述水溶液或浓缩的水溶液进行渗滤。

5.如权利要求1所述的方法，其中，在提取步骤之后和添加水溶性溶剂之前，所述水溶液或浓缩的水溶液通过使用超滤进行渗滤。

6.如权利要求4或5所述的方法，其中在渗滤步骤中，从所述水溶液或浓缩的水溶液中除去可溶性碳水化合物、硫代葡萄糖苷或其衍生物、肌醇六磷酸或多酚化合物或这些化合物中的一种或多种的组合。

7.如权利要求4或5所述的方法，其中，所述渗滤在浓缩所述水提取物之前、期间或之后进行。

8.通过权利要求1-7中任意一项所述的方法获得的一种分离的含油种子天然蛋白质或含油种子天然蛋白质组合物，其具有：

-蛋白质含量为基于干物质的至少80wt％；

-乙醇含量为基于干物质的小于0.2wt％；

-乙醇含量为基于干物质的大于0.001wt％；和

-表示为芥子酸当量的酚含量为基于干物质的小于0.1wt％，

其中，所述蛋白质包括油菜籽蛋白质、向日葵蛋白质或大豆蛋白质。

9.如权利要求8所述的分离的含油种子天然蛋白质或含油种子天然蛋白质组合物，其具有基于干物质的小于10μmol/g的硫代葡萄糖苷含量。

10.如权利要求8所述的分离的含油种子天然蛋白质或含油种子天然蛋白质组合物，其具有基于干物质的2-15wt％的脂质含量。

11.如权利要求8所述的分离的含油种子天然蛋白质或含油种子天然蛋白质组合物，在大豆蛋白质的情况下，其具有基于干物质的2-20wt％的脂质含量。

12.如权利要求8所述的分离的含油种子天然蛋白质或含油种子天然蛋白质组合物，其具有基于干物质的小于0.5wt％的肌醇六磷酸含量，以Px3.5计。

13.如权利要求8所述的分离的含油种子天然蛋白质或含油种子天然蛋白质组合物，其具有至少30NS％的溶解度。

14.如权利要求8所述的分离的含油种子天然蛋白质或含油种子天然蛋白质组合物，其具有至少70wt％的干物质含量。

15.如权利要求8所述的分离的含油种子天然蛋白质或含油种子天然蛋白质组合物，所述蛋白质包括油菜籽蛋白质，其中2S蛋白和12S蛋白以基于干物质的重量比的1:6到6:1的比例存在。