CN103713120A - 基于液相芯片技术判断体液环境中细胞状态的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种基于液相芯片技术判断体液环境中细胞状态的方法,利用液相芯片技术对卵泡液的生物标志物进行分析,以此判断与卵泡液来自同一卵泡的卵子形成胚胎的质量,与形态学分析相结合,从而决定将优质胚胎选择。本发明通过提供卵子质量的客观指标,可以提高IVF的临床妊娠率和胚胎植入率,改善IVF治疗结局。卵泡液判断卵子质量的多个因子组合可以制成商品化的液相芯片试剂盒,用于辅助生殖技术。
Description
技术领域
本发明属辅助生殖技术领域,涉及一种基于液相芯片技术判断体液环境中细胞状态的方法,是基于液相芯片技术,通过分析体液中的成分来判断卵子质量的方法。
背景技术
(1)体外受精技术
体外受精,是指哺乳动物的精子和卵子放在一起体外培养,在严格的实验室条件下发育成受精卵(也称胚胎),因为此项技术的受精过程是在体外人工控制的环境中完成的,所以称为体外受精(in vitro fertilization, IVF)。通过IVF技术获得受精卵后,再将受精卵放入子宫发育成为胎儿,这一过程就是胚胎移植技术(embryo transfer, ET)。体外受精-胚胎移植(IVF-ET)是目前解决不孕问题最有效的技术手段。临床工作中,IVF-ET包括 1)药物促排卵2)采卵3)精液收集和处理4)体外受精5)胚胎培养6)胚胎选择7)胚胎移植等过程。
IVF-ET的妊娠率与所选择胚胎的发育潜能密切相关,如何在不损害胚胎的前提下评判胚胎的质量,十分重要。目前尚无准确方法预测胚胎发育潜能,主要是根据不同时期胚胎的发育情况及形态特征来进行判断。但是胚胎的形态与实际的发育潜能并不完全一致,一些形态良好的胚胎也有发育停滞的可能。目前IVF的胚胎着床率在30%左右,即虽然经过形态学选择,移植胚胎中仍有70%不能着床。而且,形态学观察具有一定主观性和个体差异,不同观察者之间甚至同一观察者都可能对胚胎的质量判断出现偏差。
为获得良好的妊娠率,目前临床上通常移植2至3个胚胎,但同时导致多胎妊娠率明显增加。多胎妊娠大大增加了孕妇胎儿/新生儿围产期疾病和并发症的发病风险,减少移植胚胎数甚至行选择性单胚胎移植逐渐成为IVF的发展趋势。但如果不能准确判断胚胎质量,减少移植胚胎数将降低临床妊娠率。因此,采用无创手段选择优质胚胎进行移植至关重要。
卵泡是卵子生长发育的环境,卵泡液的成分包括各类激素、生长因子、细胞因子等,通过测定卵泡液的雌孕激素、生长因子等发现与卵子的成熟和质量有着一定联系。但至今尚无公认的反映卵子质量的指标,而且,采用常规ELISA等方法,一次实验只能测定一个指标,对预测卵子质量有一定局限性。考虑到卵子在整个发育过程中都处在多种因子调节的生理条件下,我们有理由相信综合测定多个分子将比单独测定某个分子更准确地反应卵子质量。
(2)液相芯片技术
液相芯片(liquichip),又称为悬浮阵列(suspension array)技术是20世纪90年代后期开发出来的既能保证信息质量,又能提供相对高通量的新一代分子诊断技术平台。由于反应是在悬浮溶液中进行,检测速度极快,其设计理念亦同样体现了计算机芯片的并行处理和高密度集成、高通量的精髓,所以称作“液相芯片”。液相芯片体系由许多不同的微球(microsphere)为主要基质构成,每种微球上固定有不同的探针分子,将这些微球悬浮于一个液相体系中,就构成了一个液相蛋白质芯片系统,利用这个系统,我们可以对同一个样品中的多个不同的分子同时进行定性、定量检测。在液相系统中,为了区分不同的探针,每一种用于标记探针的微球基质都带有一个独特的色彩编号。在微球基质的制造过程当中,掺入了两种不同的红色分类荧光,根据这两种红色分类荧光的比例不同,可以把微球基质分为100种。利用这100种微球基质,可以标记上100种不同的探针分子,同时对一个样本中的100种不同的目的分子进行检测。
液相芯片的独特设计使得它拥有常规的蛋白质检测方法所不具备的特点:通量大—— 可对同一样本中的多种不同目的分子同时进行分析;反应时间短—— 在35-60分钟内可完成检测;液相环境更有利于保持蛋白质的天然构象,也更有利于探针和被检测物的反应;只需要微量的样品即可进行检测。这些特点使其成为测定生物标志物的理想方法。
目前,已经商业化的液相芯片试剂盒包括炎症因子组合、肿瘤因子组合、糖尿病组合等,但尚无卵子/胚胎质量相关因子。
发明内容
本发明的目的在于提供基于液相芯片技术判断体液环境中细胞状态的方法,是一种辅助生殖技术方法,在目前IVF主要依靠主观形态学分析的基础上,提供判断卵子质量的客观指标,并将胚胎形态学结果和卵泡液分析结果相结合,决定该卵子体外受精后形成胚胎的命运。
本发明通过如下的技术手段来实现:
1.选取与卵子质量相关的因子:选择粒细胞集落刺激因子,白介素15,干细胞因子和干扰素诱导蛋白组成液相芯片检测系统。选择与卵子发育潜能相关,能预测胚胎成功植入的因子:我们通过前期实验研究,发现卵泡液多个因子的表达情况与卵子成熟、受精、胚胎植入存在关联性,可以作为反应卵子质量/胚胎发育潜能的指标。
所述胚胎是通过用精子使卵子在体外受精而获得的。胚胎的质量是指植入子宫的能力以及后续的发育能力,以胚胎移植后临床妊娠率,胚胎植入率以及活产率为判断标准。
2.选择相关因子的合适抗体,采用Bio-Plex 氨基耦联试剂盒将抗体耦联到荧光染色的微球上,组成液相芯片测试系统;
(1)蛋白质准备:如果样品不含有叠氮钠、BSA、甘氨酸、Tris或其他含自由氨基的添加物,可直接用于耦联;否则需要使用Bio-spin微型柱更换缓冲液。
(2)耦联反应:
a. 微球活化:选择微球,漩涡混合,离心后去上清,加入EDC(50 mg/ml)和S-NHS(50 mg/ml),漩涡混合,离心后去上清,加入PBS重悬。
b. 蛋白耦联:加入5-12ug的蛋白质到活化的微球中,室温旋转混合2小时,14000g离心4分钟, PBS清洗微球后,用封闭缓冲液重悬微球。室温旋转混合0.5小时,14000g离心4分钟,去上清,加入储存缓冲液洗涤后,加入150ul储存缓冲液保存微球。
(3)耦联效率验证:标记两个小离心管,测试管和阴性对照管。耦联的微球漩涡混合,稀释生物素标记的抗体至2ug/ml,加50ul到测试管中,阴性对照管加50ul稀释缓冲液,14000g离心4分钟,去上清,加入50ul的2ug/ml的Streptavidin-PE,盖上铝箔,室温孵育10分钟,用125ul的储存缓冲液重悬微球,漩涡混合15秒,取125ul样品到平底96孔板,开始用Bio-Plex仪器检测。阴性对照的荧光值不得超过100MFI,耦联微球的荧光值超过2000MFI认为耦联成功。
3. 组成液相蛋白质芯片系统:这些固定了生物标志物探针的微球悬浮于一个液相体系中,通过对同一反应体系内N种捕获分子与N种分析物的最适结合反应条件的优化,就构成了一个液相蛋白质芯片系统,利用这个系统,我们可以对同一个卵泡液中的多个不同的分子同时进行检测。
4. 液相芯片技术辅助选择移植胚胎:接受IVF-ET的人群在采卵时,通过穿刺卵泡同时获得卵子和卵泡液,将卵泡液采用液相芯片技术同时进行多个标志物检测,而卵子则进行体外受精-胚胎培养。胚胎在体外培养48-72小时,依据液相芯片检测结果和胚胎形态,选择1-3个优质胚胎移植回病人子宫。
5.继续调整细胞因子、生长因子、激素的组合:继续选择可能反映胚胎质量的细胞因子,生长因子,激素,重复2,3步骤,通过统计分析卵泡液的液相芯片测定结果与胚胎的植入成功之间的相关性,相关性不强的因子予以剔除,将相关性强的因子入选液相芯片测试系统。
所说的卵子、胚胎、子宫是人类的卵子、胚胎、子宫。
所说的分析检验是指采用液相芯片技术同时测定多个细胞因子、生长因子、激素或它们的组合。
所说的细胞因子、生长因子、激素是指粒细胞集落刺激因子(granulocyte-colony stimulating factor,CSF),白介素15(interleukin 15, IL-15),干细胞因子(stem cell factor, SCF)和 干扰素诱导蛋白10(interferon induced protein 10,IP-10)的组合。
本发明的有益效果在于,(1)通过分析检验卵泡液,判断与卵泡液来自同一卵泡的卵子形成胚胎的质量,与胚胎形态学指标相结合,将能更准确地选择质量好的胚胎植入子宫,从而提高IVF的临床妊娠率和胚胎植入率,改善IVF治疗结局。(2)我们采用液相芯片技术可以同时分析卵泡液的多个因子,克服了一般检测手段一次仅能分析一个指标的局限,考虑到卵子在整个发育过程中都处在多种因子调节的生理条件下,综合测定多个分子将比采用其他技术手段单独测定某个分子更准确地反应卵子质量。(3)卵泡液判断卵子质量的多个因子组合可以制成商品化的液相芯片试剂盒,用于辅助生殖技术。
附图说明
图1是检测体系设计流程图。
图2是微球活化流程。
图3是抗体耦联流程图。
图4是耦联效率验证流程图。
图5是G-CSF有助于准确选择优质胚胎。
具体实施方式
本发明结合附图和实施例作进一步的说明。
实施例1
1. 根据文献选择与卵子发育潜能相关,能预测胚胎成功植入的因子,比如粒细胞集落刺激因子(granulocyte-colony stimulating factor,CSF),白介素15(interleukin 15, IL-15),干细胞因子(stem cell factor, SCF)和 干扰素诱导蛋白10。
2. 为选择的因子选择购买适合液相芯片技术的抗体
3. 蛋白质准备:如果抗体不含有叠氮钠、BSA、甘氨酸、Tris或其他含自由氨基的添加物,可直接用于耦联;否则需要使用Bio-spin微型柱更换缓冲液。
4. 耦联反应:
a. 微球活化:选择微球,漩涡混合,离心后去上清,加入EDC(50 mg/ml)和S-NHS(50 mg/ml),漩涡混合,离心后去上清,加入PBS重悬。
b. 蛋白耦联:加入5-12ug的蛋白质到活化的微球中,室温旋转混合2小时,14000g离心4分钟,去上清,加入PBS清洗微球,14000g离心4分钟,去上清,用封闭缓冲液重悬微球。室温旋转混合0.5小时,14000g离心4分钟,去上清,加入储存缓冲液,16000g离心6分钟,去上清,加入150ul储存缓冲液保存微球。
5. 耦联效率验证:标记两个小离心管,测试管和阴性对照管。耦联的微球漩涡混合,稀释生物素标记的抗体至2ug/ml,加50ul到测试管中,阴性对照管加50ul稀释缓冲液,14000g离心4分钟,去上清,加入50ul的2ug/ml的Streptavidin-PE,盖上铝箔,室温孵育10分钟,用125ul的储存缓冲液重悬微球,漩涡混合15秒,取125ul样品到平底96孔板,开始用Bio-Plex仪器检测。阴性对照的荧光值不得超过100MFI,耦联微球的荧光值超过2000MFI认为耦联成功。
6. 组成液相蛋白质芯片系统
这些固定了生物标志物探针的微球悬浮于一个液相体系中,通过对同一反应体系内N种捕获分子与N种分析物的最适结合反应条件的优化,就构成了一个液相蛋白质芯片系统,利用这个系统,我们可以对同一个卵泡液中的多个不同的分子同时进行检测。
实施例2
1.患者经超促排卵,卵泡发育成熟后在B超引导下采卵,一个卵泡的内容物收集至一个无菌试管,并将其倒入无菌培养皿,在体视显微镜下寻找卵子,找到卵子后转入G-IVF(Vitrolife)培养液,在37度,6%二氧化碳培养箱中培养,相应的培养液经采用液相芯片技术进行生物标志物分析。
2.卵泡液生物标志物测定过程如下:
(1)准备好标本,1000g离心15分钟
(2)准备耦联好的微球:在15 ml试管中加入适量缓冲液,耦联好的微球漩涡混合30秒,加入适量的微球至15ml试管,避光,室温平衡20分钟。
(3)将耦联好的微球,样品等加入96孔板:每孔加入50ul耦联好的微球,洗板两次,每孔加入50ul对照,标准品或样品,室温孵育1小时。
(4)加入检测抗体:孵育结束后,洗板3次,每孔加入25ul检测抗体,室温震荡孵育30分钟。
(5)加入Streptavidin-PE:洗板3次,每孔加入50ul Streptavidin-PE,震荡孵育10分钟。洗板三次,每孔加入125ul缓冲液,室温震荡30秒,然后用Luminex液相芯片仪对96孔板进行检测。
3. 体外受精-胚胎培养过程如下:卵子经GMOPS(Vitrolife)漂洗后,转入G-IVF(Vitrolife)培养液培养2-4小时后,加入经洗涤的病人丈夫的精液,最终密度约为1-5×105/ml。在授精后16-18小时,在显微镜下观察卵子的原核、极体和胞浆,评估受精状态。然后转入G-1(Vitrolife)培养液培养。48小时后进行卵裂期胚胎观察,同时结合生物标志物测定结果,以此判断与卵泡液来自同一卵泡的卵子形成胚胎的质量,将此结果和胚胎形态学分析相结合,从而选取最佳胚胎移植回子宫,并决定将其余胚胎冻存或放弃。
4. 继续调整细胞因子、生长因子、激素的组合:通过统计分析卵泡液的液相芯片测定结果与胚胎的植入成功之间的相关性,相关性不强的因子予以剔除,增加相关性强的因子。
实施例3
2011.10-2012.3期间,我们选择了部分体外受精-胚胎移植病人,进行卵泡液液相芯片生物标志物检测,初步结果显示:增加液相芯片生物学客观指标,有助于增加胚胎植入率。比如选择G-CSF,胚胎植入预测准确率达80.6%,而一般情况下胚胎植入率在30%-40%左右。结果参见图5。
Claims (3)
1.基于液相芯片技术判断体液环境中细胞状态的方法,其特征在于,通过以下步骤实现:
(1)选择粒细胞集落刺激因子,白介素15,干细胞因子和干扰素诱导蛋白组成液相芯片检测系统;
(2)采用Bio-Plex 氨基耦联试剂盒将抗体耦联到荧光染色的微球上,组成液相芯片测试系统:
(a)蛋白质准备:如果样品不含有叠氮钠、BSA、甘氨酸、Tris或其他含自由氨基的添加物,可直接用于耦联;否则需要使用Bio-spin微型柱更换缓冲液;
(d)耦联反应:微球活化:选择微球,漩涡混合,离心后去上清,加入50 mg/ml EDC和50 mg/ml S-NHS,漩涡混合,离心后去上清,加入PBS重悬;蛋白耦联:加入5-12ug的蛋白质到活化的微球中,室温旋转混合2小时,14000g离心4分钟, PBS清洗微球后,用封闭缓冲液重悬微球,室温旋转混合0.5小时,14000g离心4分钟,去上清,加入储存缓冲液洗涤后,加入150ul储存缓冲液保存微球;
(c)耦联效率验证:标记两个小离心管,测试管和阴性对照管,耦联的微球漩涡混合,稀释生物素标记的抗体至2ug/ml,加50ul到测试管中,阴性对照管加50ul稀释缓冲液,14000g离心4分钟,去上清,加入50ul的2ug/ml的Streptavidin-PE,盖上铝箔,室温孵育10分钟,用125ul的储存缓冲液重悬微球,漩涡混合15秒,取125ul样品到平底96孔板,开始用Bio-Plex仪器检测,阴性对照的荧光值不得超过100MFI,耦联微球的荧光值超过2000MFI认为耦联成功;
(3)组成液相蛋白质芯片系统:将生物标志物探针的微球悬浮于一个液相体系中,通过对同一反应体系内N种捕获分子与N种分析物的最适结合反应条件的优化,构成一个液相蛋白质芯片系统;
(4)液相芯片技术辅助选择移植胚胎:将卵泡液采用液相芯片技术同时进行多个标志物检测,而卵子则进行体外受精-胚胎培养,胚胎在体外培养48-72小时,依据液相芯片检测结果和胚胎形态,选择优质胚胎移;
(5)继续调整细胞因子、生长因子、激素的组合:继续选择可能反映胚胎质量的细胞因子,生长因子,激素,重复2,3步骤,通过统计分析卵泡液的液相芯片测定结果与胚胎的植入成功之间的相关性,相关性不强的因子予以剔除,将相关性强的因子入选液相芯片测试系统。
2.根据权利要求1所述的基于液相芯片技术判断体液环境中细胞状态的方法,其特征在于,所说的分析检验是指采用液相芯片技术同时测定多个细胞因子、生长因子、激素或它们的组合。
3.根据权利要求2所述的基于液相芯片技术判断体液环境中细胞状态的方法,其特征在于,所说的细胞因子、生长因子、激素是指粒细胞集落刺激因子,白介素15,干细胞因子和干扰素诱导蛋白10的组合。
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GR01 | Patent grant |