CN103710422A - 筛选评价海洋防污剂的试剂组合 - Google Patents

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徐焕志
孙静亚
沈明
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Abstract

本发明公开了筛选评价海洋防污剂的试剂组合，以分离自海洋的海洋细菌为受试生物，将凝胶剂加入到细菌液体培养基中加热溶解、冷却后，将受试化合物均匀分散在凝胶溶液中，然后将含受试化合物凝胶溶液均匀涂布玻璃板上制成凝胶测试板；将凝胶测试板置于接种受试生物的海水中，连续培养后，将凝胶测试板取出、淋洗，定容于容量瓶中，测试OD值（光密度值）或吸光度值，将OD值或吸光度值换算成抑菌率，通过比较抑菌率的大小评价受试化合物的防污性能。本发明的优点是评价方法操作简单、易行，评价周期短，用海洋细菌为受试生物，可应用于海洋防污涂料研发过程防污剂的筛选。

Description

筛选评价海洋防污剂的试剂组合
技术领域
本发明涉及一种快速筛选评价方法的试剂，尤其涉及筛选评价海洋防污剂的试剂组合。
背景技术
海洋生物污损问题，制约着人类对海洋资源的开发利用，并带来巨大的经济损失。目前，防除海洋生物污损最常用的方法是涂装防污涂料。防污剂是防污涂料最主要的防除海洋生物污损有效成份之一，筛选评价防污剂是防污涂料研发过程不可缺少的步骤。提高完善防污性能的评价方法，对防污涂料开发具有重要意义。国标GB/T5370-2007《防污漆样板浅海浸泡试验方法》中提供了一种防污涂料评价方法，将防污剂配成防污涂料后也可用来国标GB/T5370-2007中方法评价防污剂的防污性能，但是评价周期长。中国作者田斌2005年的硕士论文《海洋防污涂层生物学性能研究》中用金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、酒精酵母3种菌株作为受试生物来评价防污剂的防污性能，但由于受试生物不是典型海洋细菌，不能代表海洋菌种,评价结果代表性常受质疑。
发明内容
本发明的目的是提供筛选评价海洋防污剂的试剂组合和应用，它以分离自海洋的海洋细菌为受试生物，将凝胶剂加入到细菌液体培养基中加热溶解后冷却制成凝胶溶液，将受试化合物均匀分散在凝胶溶液中，然后将含受试化合物凝胶溶液均匀涂布玻璃板上制成凝胶测试板，再将凝胶测试板置于接种受试生物的海水中，连续培养后，将凝胶测试板取出、淋洗，定容于容量瓶中，测试OD值（光密度值）或吸光度值，将OD值或吸光度值换算成抑菌率，通过比较抑菌率的大小评价受试化合物的防污性能。所述的评价方法操作简单、易行，评价周期短，用海洋细菌为受试生物，可应用于海洋防污涂料研发过程中防污剂的筛选。
上述的海洋细菌，其特征是用选择性培养基，自海水、海洋沉积物、涉海设施浸海部分分离出。
上述的选择性培养基是Zobell 2216 E培养基、海洋弧菌用TCBS培养基、分离放线菌用高氏合成1号培养基、腐殖酸培养基、天门冬素培养基、精氨酸培养基、上述的改良型培养基的一种或几种。
上述的液体培养基是Zobell 2216 E液体培养基、海洋弧菌用TCBS液体培养基、分离放线菌用高氏合成1号液体培养基、腐殖酸液体培养基、天门冬素液体培养基、精氨酸液体培养基、上述的改良型液体培养基的一种或几种。
上述的凝胶剂是琼脂、明胶、鱼胶、卡拉胶中的一种或几种。
上述凝胶测试板的制作方法，其特征是将凝胶剂加入到细菌液体培养基中加热溶解后冷却制成凝胶溶液，将受试化合物均匀分散在凝胶溶液中，然后将含受试化合物凝胶溶液均匀涂布在玻璃板上制成。
上述的玻璃板，是长100 mm、宽100mm或长200 mm、宽200mm或长250 mm、宽2500mm表面光滑的玻璃板。
上述的测试OD值或吸光度值的方法，其特征是是用酶标仪或可见分光光度计，以液体基培养基为参比，测定凝胶测试板淋洗液的OD值或吸光度值。
上述的评价方法在研发海洋防污涂料过程中筛选防污剂时的应用。
本发明的筛选评价海洋防污剂方法的优点是以海洋细菌为受试生物，代表性强，评价方法操作简单、易行，评价周期短。
具体实施方式
以下结合附实施例对本发明作进一步详细描述。
实施例：
1、海洋细菌的分离
用海水选择性培养基，用滤膜富集的的方法或涂布法或划线法中的一种或几种方法培养并分离取自海水、海洋沉积物、涉海设施浸海部分的海洋细菌，低温下保存备用。
（1）从海水中分离细菌：
用灭菌的硝化纤维滤膜按不同体积海水量进行富集，富集后的滤膜取下，接种到预先编号的平板培养基上，培养一定时间后，进行分离，并在低温下保存菌种。
用无菌采水瓶从舟山东极岛附近海区三个站位取水样。用灭菌的硝化纤维滤膜（0.45um），分别对100mL、200mL、300mL海水样品进行富集，取下滤膜，分别紧贴于上述三种预先编好号的含有Zobell 2216 E固体培养基的培养皿上。将培养皿放置10min后，倒置放于25℃生化培养箱中，培养3-5天，观察其形态，记录数量，如菌落不纯，挑取菌落用划线法分离，直到纯化，而后接种于斜面，甘油液封，-20℃下，保存备用。
（2）从涉海设施浸海部分分离细菌：
对从涉海设施浸海部分所取的样品进行低速离心，取上清液，并稀释成不同倍数，选择适当倍数的稀释液，在预先编号的平板培养基上接种，培养一段时间后，分离，于低温下保存备用。上述的稀释成倍数范围为10-1～10-6 倍。
用无菌采样瓶，在舟山东极岛附近深水网箱上选择9个点进行取样（用捏子采集不同的附着物），对样品进行离心，转速2000r/min，离心1分钟，取上清液，用无菌海水稀释到10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6 倍。选取10-4、10-5和10-6 倍的稀释液，用涂布法在编好号的Zobell 2216 E固体培养基的培养皿上进行涂布，每个浓度稀释液涂3个板。将培养皿放置10min后，倒置放于25℃生化培养箱中，培养3-5天，观察其形态，记录数量，如菌落不纯，挑取菌落用划线法分离，直到纯化，而后接种于斜面，甘油液封，于-20℃下，保存备用。
（3）从海洋沉积物中分离细菌：
取一定量海洋沉积物样品，分散于无菌海水中，震荡成悬浮液，稀释不同倍数后，取适当倍数的稀释液，涂布到含有培养基的培养皿中，编号，培养一段时间后，观察记录菌落生长情况，采用划线法对菌落进行纯化分离，于低温下保存备用。上述的稀释成倍数范围为10-1～10-6 倍。
取10g海泥或海沙样品，分散于10mL无菌海水中，震荡成悬浮液，用无菌海水稀释成10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、 10-6 g/mL。取10-4、10-5和10-6 g/mL稀释液用涂布法在编好号的Zobell 2216 E固体培养基的培养皿上进行涂布，每个浓度稀释液涂3个板。将培养皿放置10min后，倒置放于25℃生化培养箱中，培养3-5天，观察其形态，记录数量，如菌落不纯，挑取菌落用划线法分离，直到纯化，而后接种于斜面，甘油液封，于-20℃下，保存备用。
2、凝胶测试板的制备
向液体培养基中，分别加入凝胶剂， 加热溶解配制一定浓度的凝胶剂溶液，冷却后，向其中分别加入受试化合物防污剂，制成含受试化合物的凝胶溶液，均匀涂布在玻璃板上。上述的一定浓度的凝胶剂溶液是指凝胶剂浓度范围为1％～30％的溶液（重量百分数）。上述的含受试化合物的凝胶溶液是指浓度范围1 mg/mL～400 mg/mL受试化合物的凝胶溶液。
向Zobell 2216 E 液体培养基中，加入琼脂粉，加热溶解配制成琼脂浓度为1%的琼脂凝胶溶液，冷却至50 ～ 60℃，待用。取5份上述的琼脂凝胶溶液分别加入TBTO、CPT、ZPT、DCDMA、Diuron五种受试化合物，制成受试化合物浓度为1 mg/mL的5种琼脂凝胶溶液，均匀涂布在规格为100×100mm玻璃板上，晾干，形成光滑平整的凝胶表面。以不加受试化合物的琼脂凝胶溶液制做的凝胶测试板作为空白对照。
3、凝胶测试板在接种受试生物海水中的培养
在规格为630×370×500mm玻璃缸中，加入10L无菌海水，以及培养10小时后的受试菌悬液各1mL，保持温度25℃，培养至指数生长期后，将琼脂凝胶测试板置入玻璃缸海水中，连续培养24h。  
4、OD值的测定与防污效果评价
将琼脂凝胶测试板取出，用液体培养基淋洗，用液体培养基定容至50 mL容量瓶中，测定OD值或吸光度值。
24h抑菌率的计算：R/% =                                                
Figure 2013107258611100002DEST_PATH_IMAGE002
，
其中，R—抑菌率；
B—空白对照板淋洗液的平均OD值或平均吸光度值；
C—含不同受试化合物凝胶测试板淋洗液的平均OD值或平均吸光度值。
将OD值或吸光度值换算成抑菌率见表1。
表1不同防污剂24h室内挂板结果
Figure 2013107258611100002DEST_PATH_IMAGE004
由表1可见，5种受试生物的抑菌性大小顺序为TBTO＞CPT＞ZPT＞DCDMA＞Diuron。抑菌性大小顺序与按国标GB/T5370-2007《防污漆样板浅海浸泡试验方法》测试的防污性能结果一致。
尽管已结合优选的实施例描述了本发明，然其并非用以限定本发明，任何本领域技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，能够对在这里列出的主题实施各种改变、同等物的置换和修改，因此本发明的保护范围当视所提出的权利要求限定的范围为准。

Claims (4)

1.筛选评价海洋防污剂的试剂组合，其特征是：包括液体培养基和胶凝剂。
2.根据权利要求1所述的筛选评价海洋防污剂的试剂组合，其特征是：所述的液体培养基为选择性培养基，该培养基分离自海水或海洋沉积物或浸海设施浸海部分。
3.根据权利要求2所述的筛选评价海洋防污剂的试剂组合，其特征是：所述的培养基选自Zobell 2216E培养基、海洋弧菌用TCBS培养基、分离放线菌用高氏合成1号培养基、腐殖酸培养基、天门冬素培养基、精氨酸培养基一种或几种，以及对上述培养基进行海水或海洋沉积物或浸海设施浸海部分的改良型培养基。
4.权利要求1所述的筛选评价海洋防污剂的试剂组合，其特征是：所述的凝胶剂，其特征是琼脂、明胶、鱼胶、卡拉胶中的一种或其组合；所述的胶凝剂的浓度为重量百分数1％～30％的溶液。
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