CN103698296B - 冬虫夏草子座的红外光谱分析鉴定方法 - Google Patents

冬虫夏草子座的红外光谱分析鉴定方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及分析化学领域。具体地说，涉及冬虫夏草子座的红外光谱分析鉴定方法。本发明所要解决的是目前冬虫夏草子座难于分真伪的技术问题。本发明解决上述技术问题的技术方案是提供一种快速准确鉴别冬虫夏草子座的方法，包括以下步骤：a、冬虫夏草子座标准光谱绘制；b、冬虫夏草子座红外光谱必备特征峰和冬虫夏草子座红外光谱常见特征峰的采集；c、被测冬虫夏草子座样品的红外光谱特征峰鉴别以及红外光谱相似度鉴别。本发明为快速准确鉴别冬虫夏草子座提供了一种新方法。

Description

冬虫夏草子座的红外光谱分析鉴定方法
技术领域
本发明涉及分析化学领域。具体地说，涉及冬虫夏草子座的红外光谱分析鉴定方法。
背景技术
冬虫夏草是麦角菌科真菌冬虫夏草菌（Cordycepssinensis(Berk.)Sacc.）寄生在蝙蝠蛾科昆虫蝙蝠蛾幼虫上的子座与幼虫尸体的复合体，具有补肾益肺、止血化痰之功效，与人参、鹿茸并称为中国三大补药。
冬虫夏草生长环境特殊，主要分布于我国青藏高原海拔3000～5000米的高山草甸和高山灌丛。青海、西藏、四川、甘肃和云南是冬虫夏草的主要产区，青海的产量和质量居各省区之首，玉树、果洛等是青海冬虫夏草主产地。冬虫夏草目前尚不能进行人工培育，而野生冬虫夏草的分布区域狭小，自然寄生率低，对环境条件要求苛刻，加之近年来的生态破坏和掠夺式采挖，使冬虫夏草的产量逐年下降，价格不断攀升。因此，市场上存在严重的掺伪、增重等造假现象。除了冬虫夏草之外，其他虫草属真菌寄生在昆虫体上形成的复合体也被称为“虫草”，其中一些常被用作冬虫夏草的伪品，性状相似而难以区分。因此建立快速准确的冬虫夏草子座真伪品鉴别方法，对规范市场、保证药材质量具有非常重要的意义。
发明内容
本发明所要解决的是目前冬虫夏草子座难于分真伪的技术问题。
本发明解决上述技术问题的技术方案是提供一种快速准确鉴别冬虫夏草子座的方法，包括以下步骤：
a、冬虫夏草子座标准光谱绘制：多个不同产地的标准冬虫夏草子座样品分别压成薄片进行透射测试，所有样品的平均光谱即为冬虫夏草子座标准光谱；
b、冬虫夏草子座红外光谱必备特征峰和冬虫夏草子座红外光谱常见特征峰的采集；
c、被测冬虫夏草子座样品的红外光谱特征峰比对以及红外光谱相似度比对：被测样品的红外光谱中包含全部冬虫夏草子座红外光谱必备特征峰以及冬虫夏草子座红外光谱常见特征峰的60%以上，并且被测样品光谱与冬虫夏草子座标准光谱之间的显著性水平为0.01时的相关系数下限阈值为0.95，则该被测样品是真品冬虫夏草子座。
其中，上述冬虫夏草子座的红外光谱分析鉴定方法的步骤a中，所述的冬虫夏草子座样品是选自全国主产区青海玉树州、果洛州、海南州以及西藏、四川和甘肃6个地区，每个产地选择不低于8个大小均一的样品。
其中，上述冬虫夏草子座的红外光谱分析鉴定方法的步骤a中，所述的冬虫夏草子座样品是将冬虫夏草的虫体部分自然干燥后粉碎，取过200目筛后的细粉用于红外光谱测试。
其中，上述方法的步骤a中，在多个不同产地的标准冬虫夏草子座样品分别压成薄片进行透射测试时，用未加任何样品的纯溴化钾在相同条件下进行压片测试，作为光谱背景。
其中，上述方法的步骤a中，每张样品红外光谱的透过率最大值与最小值相差应当不低于60%。
其中，上述方法的步骤a中，每个样品重复测定3～5次，取其平均光谱作为该样品的光谱。
其中，上述方法的步骤a中，红外光谱扫描范围为4000～400cm-1，光谱分辨率为4cm-1，每张光谱累加扫描16次或32次，实时扣除二氧化碳和水蒸气干扰。
其中，上述方法的步骤b中，所述的冬虫夏草子座红外光谱必备特征峰是指比较所有样品的红外光谱吸收峰位置，将在所有样品中都出现的吸收峰作为冬虫夏草子座红外光谱的必备特征峰。所述冬虫夏草子座红外光谱的必备特征峰如表1所示：
表1冬虫夏草子座红外光谱的必备特征峰
峰编号 峰位置平均值（cm-1） 99%置信度下峰位置偏差（cm-1）
A01 3299 17.0
A02 2935 2.8
A03 1656 2.6
A04 1549 3.6
A05 1254 10.8
A06 1080 2.8
A07 628 7.2
其中，上述方法的步骤b中，所述的冬虫夏草子座红外光谱常见特征峰是指所有样品的红外光谱吸收峰中，除必备特征峰以外，将出现概率不低于80%的吸收峰，作为冬虫夏草子座红外光谱的常见特征峰。所述冬虫夏草子座红外光谱的常见特征峰如表2所示：
表2冬虫夏草子座红外光谱的常见特征峰
峰编号 峰位置平均值（cm-1） 99%置信度下峰位置偏差（cm-1）
B01 1401 4.1
B02 929 3.9
B03 886 5.7
B04 531 3.4
其中，上述方法的步骤c中，所述的相关系数由以下公式计算得到：
R ij = R ji = Σ k = 1 n x ik · x jk Σ k = 1 n x ik 2 · Σ k = 1 n x jk 2 （式1）
式1中，Rij代表红外光谱i和红外光谱j的相关系数，xik和xjk分别代表样品i和样品j在波数k处的吸光度值。
本发明使用AssureID软件计算1800～800cm-1范围内各个样品红外光谱与标准光谱的相关系数，统计各个样品红外光谱与标准光谱的相关系数的分布区间，确定显著性水平为0.01时的相关系数下限阈值。
本发明选取全国主产区不同产地的典型样本，确定了冬虫夏草子座的共有特征峰，建立了冬虫夏草子座标准红外光谱，并确定了真品与标准光谱的相关系数阈值。综合使用红外光谱特征峰鉴别法与相似度鉴别法，可以客观、准确、简便、快速地对冬虫夏草子座进行鉴别。
近年来，红外光谱已经广泛且成功地用于各种中药材的真伪鉴别，具有客观量化、结果准确、操作简便、测试迅速、成本低廉等诸多优点。本发明利用红外光谱法建立冬虫夏草子座的指纹图谱，为冬虫夏草真伪鉴别提供客观、准确、简便、快速的分析方法。
附图说明
图1冬虫夏草子座样品的标准光谱。
图2古尼虫草子座红外光谱。
具体实施方式
本发明提供的冬虫夏草子座的红外光谱分析鉴定方法，包括以下步骤：
a、冬虫夏草子座标准光谱绘制：选取15份青海玉树州|、15份果洛州、15份海南州、15份西藏、15份四川和8份甘肃的冬虫夏草样品，每个产地选择大小均一的样品，采用溴化钾压片法进行透射测试，所有样品的平均光谱即为冬虫夏草子座标准光谱。
本发明中红外光谱的数据处理与分析使用美国PerkinElmer公司的Spectrum(v6)和AssureID(v4)软件。初始测得的样品红外光谱为透过率图，包含散射造成的光谱基线漂移、样品用量导致的光谱强度差异等误差因素，需要通过基线校正、归一化等谱图预处理措施加以消除。因此，依次使用Spectrum软件的纵坐标转换（透过率转换为吸光度）、自动基线校正、归一化（全光谱范围内最高吸光度为1，最低吸光度为0）功能对原始透过率谱图进行处理。使用Spectrum软件的光谱计算功能得到每个样品3～5次重复测定光谱的平均光谱，作为该样品的光谱。根据所有样品的红外光谱可以计算其平均光谱，作为冬虫夏草子座的标准光谱。
b、冬虫夏草子座红外光谱必备特征峰和冬虫夏草子座红外光谱常见特征峰的采集。
使用Spectrum软件读出各个样品红外光谱特征峰位置，峰强度阈值为0.01A（与两侧相邻峰谷的强度差异最小值），峰位置确定使用最大值法（InterpolatedPeak）。使用Excel或其他软件分析所有样品的特征峰位置。
c、被测冬虫夏草子座样品的红外光谱特征峰比对以及红外光谱相似度比对：被测样品的红外光谱中包含全部冬虫夏草子座红外光谱必备特征峰以及冬虫夏草子座红外光谱常见特征峰的60%以上，并且被测样品光谱与冬虫夏草子座标准光谱之间的显著性水平为0.01时的相关系数下限阈值为0.95，则该被测样品是真品冬虫夏草子座。
其中，上述冬虫夏草子座的红外光谱分析鉴定方法的步骤a中，所述的冬虫夏草子座样品是将冬虫夏草的虫体部分自然干燥后粉碎，取过200目筛后的细粉用于红外光谱测试。
其中，上述方法的步骤a中，在多个不同产地的标准冬虫夏草子座样品分别压成薄片进行透射测试时，用未加任何样品的纯溴化钾在相同条件下进行压片测试，作为光谱背景。
其中，上述方法的步骤a中，每张样品红外光谱的透过率最大值与最小值相差应当不低于60%。
其中，上述方法的步骤a中，每个样品重复测定3～5次，取其平均光谱作为该样品的光谱。
其中，上述方法的步骤a中，红外光谱扫描范围为4000～400cm-1，光谱分辨率为4cm-1，每张光谱累加扫描16次或32次，实时扣除二氧化碳和水蒸气干扰。
其中，上述方法的步骤b中，所述的冬虫夏草子座红外光谱必备特征峰是指比较所有样品的红外光谱吸收峰位置，将在所有样品中都出现的吸收峰作为冬虫夏草子座红外光谱的必备特征峰。
进一步的，上述方法的步骤b中，冬虫夏草子座红外光谱的必备特征峰有7个。
其中，上述方法的步骤b中，所述的冬虫夏草子座红外光谱常见特征峰是指所有样品的红外光谱吸收峰中，除必备特征峰以外，将出现概率不低于80%的吸收峰，作为冬虫夏草子座红外光谱的常见特征峰。
进一步的，上述方法的步骤b中，冬虫夏草子座红外光谱的常见特征峰有4个。
其中，上述方法的步骤c中，所述的相关系数由以下公式计算得到：
R ij = R ji = Σ k = 1 n x ik · x jk Σ k = 1 n x ik 2 · Σ k = 1 n x jk 2 （式1）
式1中，Rij代表红外光谱i和红外光谱j的相关系数，xik和xjk分别代表样品i和样品j在波数k处的吸光度值。
步骤b中冬虫夏草子座的外光谱必备特征峰见表3。
表3冬虫夏草子座的外光谱必备特征峰
步骤b中冬虫夏草子座红外光谱常见特征峰见表4。
表4冬虫夏草子座的外光谱常见特征峰
本发明使用AssureID软件计算1800～800cm-1范围内各个样品红外光谱与标准光谱的相关系数，统计各个样品红外光谱与标准光谱的相关系数的分布区间，确定显著性水平为0.01时的相关系数下限阈值。
特征峰鉴别只考虑了共有特征峰的位置，没有涉及共有特征峰的强度和形状信息，也没有涉及出现频率较高的共有特征峰之外其他吸收峰的信息，而且需要比较的特征峰个数较多。因此，除了上述根据共有特征峰进行鉴别之外，还需要根据红外光谱相似度进行鉴别，也就是用相关系数法对样品光谱与标准光谱之间的整体相似程度进行单一量化比较。
本发明中所用标准光谱即为所有样品光谱的平均谱，由于不同样品中一些吸收峰的位置和强度变动较大，在进行红外光谱相似度鉴别时，只选取了1800～800cm-1范围内的光谱，该区域包含了样品最主要的特征峰，且光谱变动受外界影响较小。对样品光谱与冬虫夏草子座标准光谱之间的相关系数进行统计分析，确定显著性水平为0.01时的相关系数下限阈值为0.95。也就是说，在99%的情况下，如果待测样品为真品冬虫夏草子座，其红外光谱与标准光谱的相关系数不低于0.95。
实施例1冬虫夏草子座标准光谱绘制、冬虫夏草子座红外光谱必备特征峰和冬虫夏草子座红外光谱常见特征峰的采集以及相关系数下限阈值的确定
1）样品来源与处理
选取15份青海玉树州|、15份果洛州、15份海南州、15份西藏、15份四川和8份甘肃的冬虫夏草样品，每个产地选择大小均一的样品。
样品处理参照中华人民共和国药典相关规定，将样品虫体部分自然干燥后粉碎，取过200目筛后的细粉用于红外光谱测试。
2）红外光谱仪器
本发明中所有样品测试均使用美国PerkinElmer（铂金埃尔默）公司的SpectrumOne傅立叶变换红外光谱仪。
样品测试参数：光谱扫描范围4000～400cm-1，光谱分辨率4cm-1，每张光谱累加扫描16次或32次，实时扣除二氧化碳和水蒸气干扰。
3）红外光谱测试方法
样品测试采用溴化钾（KBr）压片法。取1～2毫克样品粉末与100毫克光谱纯溴化钾碎晶在玛瑙研钵中研磨混合均匀，用压片机将混合粉末压成圆形薄片，放入红外光谱仪样品架进行透射测试。用未加任何样品的纯溴化钾在相同条件下进行压片测试，作为光谱背景。
每张样品红外光谱的透过率最大值与最小值相差应当不低于60%。
每个样品重复测定3～5次，取其平均光谱作为该样品的光谱。
4）红外光谱数据处理
本研究中红外光谱的数据处理与分析使用美国PerkinElmer公司的Spectrum(v6)和AssureID(v4)软件。
初始测得的样品红外光谱为透过率图，包含散射造成的光谱基线漂移、样品用量导致的光谱强度差异等误差因素，需要通过基线校正、归一化等谱图预处理措施加以消除。因此，依次使用Spectrum软件的纵坐标转换（透过率转换为吸光度）、自动基线校正、归一化（全光谱范围内最高吸光度为1，最低吸光度为0）功能对原始透过率谱图进行处理。
5）标准光谱绘制
使用Spectrum软件的光谱计算功能得到每个样品3～5次重复测定光谱的平均光谱，作为该样品的光谱。根据所有30个样品的红外光谱可以计算其平均光谱，作为冬虫夏草子座的标准光谱。
6）冬虫夏草子座红外光谱必备特征峰和冬虫夏草子座红外光谱常见特征峰的采集
使用Spectrum软件读出实施例1中各个样品红外光谱特征峰位置，峰强度阈值为0.01吸光度（与两侧相邻峰谷的强度差异最小值），峰位置确定使用最大值法（InterpolatedPeak）。使用Excel或其他软件分析所有30个样品的特征峰位置。
比较所有样品的红外光谱特征峰位置，有7个吸收峰是在所有样品中都出现的，可以作为真品冬虫夏草子座红外光谱的必备特征峰，如表1所示。
所有样品的红外光谱特征峰中，有4个吸收峰出现概率不低于80%（30个样品里的24～29个样品红外光谱中出现），可以作为真品冬虫夏草子座红外光谱的常见特征峰，如表2所示。
7）相关系数下限阈值的确定
使用AssureID软件计算1800～800cm-1范围内各个样品红外光谱与标准光谱的相关系数，公式如下：
R ij = R ji = Σ k = 1 n x ik · x jk Σ k = 1 n x ik 2 · Σ k = 1 n x jk 2 （式1）
式中，Rij代表红外光谱i和红外光谱j的相关系数，xik和xjk分别代表样品i和样品j在波数k处的吸光度值，
统计各个样品红外光谱与平均光谱的相关系数的分布区间，确定显著性水平为0.01时的相关系数下限阈值。
对样品光谱与冬虫夏草子座标准光谱之间的相关系数进行统计分析，确定显著性水平为0.01时的相关系数下限阈值为0.95。也就是说，在99%的情况下，如果待测样品为真品冬虫夏草虫体全草，其红外光谱与标准光谱的相关系数不低于0.95。
实施例2鉴别真伪具体的实施例——古尼虫草与冬虫夏草的子座
1）样品来源与处理
市售的古尼虫草，编号为G1、G2、G3、G4。
样品处理参照中华人民共和国药典相关规定，将样品子座部分自然干燥后粉碎，取过200目筛后的细粉用于红外光谱测试。
2）红外光谱仪器
所有样品测试均使用美国PerkinElmer公司的SpectrumOne傅立叶变换红外光谱仪。
样品测试参数：光谱扫描范围4000～400cm-1，光谱分辨率4cm-1，每张光谱累加扫描16次，实时扣除二氧化碳和水蒸气干扰。
3）红外光谱测试方法
样品测试采用溴化钾（KBr）压片法。取1～2毫克样品粉末与100毫克光谱纯溴化钾碎晶在玛瑙研钵中研磨混合均匀，用压片机将混合粉末压成圆形薄片，放入红外光谱仪样品架进行透射测试。用未加任何样品的纯溴化钾在相同条件下进行压片测试，作为光谱背景。
每张样品红外光谱的透过率最大值与最小值相差应当不低于60%。
每个样品重复测定3～5次，取其平均光谱作为该样品的光谱。
4）红外光谱数据处理
本研究中红外光谱的数据处理与分析使用美国PerkinElmer公司的Spectrum(v6)软件。
初始测得的样品红外光谱为透过率图，包含散射造成的光谱基线漂移、样品用量导致的光谱强度差异等误差因素，需要通过基线校正、归一化等谱图预处理措施加以消除。因此，依次使用Spectrum软件的纵坐标转换（透过率转换为吸光度）、自动基线校正、归一化（全光谱范围内最高吸光度为1，最低吸光度为0）功能对原始透过率谱图进行处理。
5）古尼虫草子座红外光谱特征峰采集、与冬虫夏草子座标准光谱特征峰比较
使用Spectrum软件读出实施例2中各个样品红外光谱特征峰位置，峰强度阈值为0.01吸光度（与两侧相邻峰谷的强度差异最小值），峰位置确定使用最大值法（InterpolatedPeak），结果如表5所示。
表5古尼虫草子座红外光谱特征峰
6）古尼虫草与冬虫夏草子座标准光谱特征峰比较
表6古尼虫草与冬虫夏草子座红外光谱特征峰比较
表6所示为古尼虫草子座红外光谱特征峰中与冬虫夏草子座标准光谱特征峰相符（表1和表2特征峰99%置信区间内）的部分。四个古尼虫草子座均未出现全部的冬虫夏草子座必备特征峰，说明该方法可以有效进行真伪鉴别。

Claims (2)

1.冬虫夏草子座的红外光谱分析鉴定方法，包括以下步骤：
a、冬虫夏草子座标准光谱绘制：多个不同产地的标准冬虫夏草子座样品分别压成薄片进行透射测试，所有样品的平均光谱即为冬虫夏草子座标准光谱；
b、冬虫夏草子座红外光谱必备特征峰和冬虫夏草子座红外光谱常见特征峰的采集；所述的冬虫夏草子座红外光谱必备特征峰是指比较所有样品的红外光谱吸收峰位置，将在所有样品中都出现的吸收峰作为冬虫夏草子座红外光谱的必备特征峰；所述冬虫夏草子座红外光谱的必备特征峰如表1所示：
表1冬虫夏草子座红外光谱的必备特征峰
峰编号 峰位置平均值(cm-1) 99％置信度下峰位置偏差(cm-1) A01 3299 17.0 A02 2935 2.8 A03 1656 2.6 A04 1549 3.6 A05 1254 10.8 A06 1080 2.8 A07 628 7.2
；
所述的冬虫夏草子座红外光谱常见特征峰是指所有样品的红外光谱吸收峰中，除必备特征峰以外，将出现概率不低于80％的吸收峰，作为冬虫夏草子座红外光谱的常见特征峰；所述冬虫夏草子座红外光谱的常见特征峰如表2所示：
表2冬虫夏草子座红外光谱的常见特征峰
峰编号 峰位置平均值(cm-1) 99％置信度下峰位置偏差(cm-1) B01 1401 4.1 B02 929 3.9 B03 886 5.7 B04 531 3.4
；
c、被测冬虫夏草子座样品的红外光谱特征峰比对以及红外光谱相似度比对：被测样品的红外光谱中包含全部冬虫夏草子座红外光谱必备特征峰以及冬虫夏草子座红外光谱常见特征峰的60％以上，并且，被测样品光谱与冬虫夏草子座标准光谱之间的显著性水平为0.01时它们的相关系数在下限阈值0.95以上，则该被测样品是真品冬虫夏草子座。
2.根据权利要求1所述的冬虫夏草子座的红外光谱分析鉴定方法，其特征在于：步骤c中，所述的相关系数的计算公式为：其中，Rij代表红外光谱i和红外光谱j的相关系数，xik和xjk分别代表样品i和样品j在波数k处的吸光度值。
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