CN103695541B - 一种检测转基因作物外源基因对土壤线虫安全性的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种检测转基因作物外源基因对土壤线虫安全性的方法，通过生物信息学分析获得转基因植物中外源基因与秀丽隐杆线虫基因组中相同短片段，通过将短片段克隆和转化来饲喂秀丽隐杆线虫，根据秀丽隐杆线虫的表型差异来检测外源基因对线虫的安全性。以往转基因作物的安全性评价集中在取食外源蛋白对非靶标生物影响，本发明用于检测外源基因对线虫这类重要土壤生态系统组成者的安全性问题，填补了这一转基因作物安全评价领域的空白。本发明是利用饲喂的方法来进行RNAi，不需要特殊的试剂和仪器，线虫饲养容易，方法简单易行。
Description
技术领域
本发明涉及分子生物学领域，具体地说，涉及一种检测转基因作物外源基因对土壤线虫安全性的方法。
背景技术
从1996年转基因作物开始大规模的种植到现在，已经有16年的历史，转基因作物在环境中的大规模释放，使得转基因作物的安全性越来越成为人们关注的焦点，并引发了不少的争论。转基因作物的风险评估一直是伴随着转基因作物的研究而开展的，并且也一直是转基因作物获得许可的一个重要环节。根据2001年欧洲议会发布的2001/18/EC指令，转基因作物风险评估的目的是在个案分析的原则上确定和评估转基因作物可能对人类健康和环境造成的直接或间接、短期或长期的负面影响（Craig et al.2008）。转基因作物的风险评估的一项重要内容就是转基因作物的环境安全，包括对非靶标生物以及生物多样性的影响、基因漂移以及重组的风险和靶标生物的抗性演化风险等。转基因作物中转入的外源蛋白和外源基因可以通过花粉、根际分泌物以及作物残体等形式在环境中进行扩散，这可能对转基因的非靶标生物产生影响。
所有的转基因作物都有一些非靶标的物种存在，这些物种大致可以分为以下几类：a.农业害虫的天敌（比如瓢虫）和传粉者（比如蜜蜂）；b.非靶标的食草动物；c.土壤生物；d.保护物种（比如黑脉金斑蝶）；e.对地方生物多样性有贡献的物种（Snow et al.2005；Andow andHilbeck2004）。由于外源蛋白和外源基因可以通过根际分泌物以及作物残体等形式在土壤中残留，转基因作物对土壤生物的非靶标效应也成为研究者关注的一个重点。已经有不少研究者开始研究转基因作物对弹尾目昆虫（Folsomia candida）、螨类（Scheloribates praeincisus）、蚯蚓（Enchytraeus albidus）以及甲虫（Poecilus chalcites）等土壤生物的影响（袁一杨和戈峰2010）。
土壤中的线虫无论是在在自然生态系统和农业生态系统中占据着重要位置。土壤中自由生活的线虫的取食范围包括细菌、真菌、藻类、原生动物以及腐殖质等，而寄生性线虫则在动物和植物中均有发现。土壤线虫作为分解者参与环境中的氮循环和碳循环，是土壤食物链的一个关键环节。这使得线虫越来越多的被应用为土壤生态系统的指示生物。土壤线虫中属于线虫动物门胞管肾纲小杆目小杆科隐杆线虫属的秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）作为一种重要的模式生物，不仅在分子生物学以及发育生物学方面取得了很多重要的研究成果，也越来越多的应用于环境毒理学方面的研究，在环境评估中发挥着越来越重要的作用。在早期的研究中，常使用致死率作为评估的标准，而在后来的研究中，有更多反映亚致死情况的指标被应用到对环境的风险评估中来，比如生长和繁殖，取食和用计算机追踪的方法来反映运动机能等（Sochová et al.2006；Leung et al.2008；et al.2009）。
在目前研究转基因作物对土壤生物的非靶标效应中，一般考察残留在土壤中的外源蛋白（如Bt蛋白）对土壤生物的毒副作用，而不考虑外源基因的影响。对于一般的生物来说，除了基因漂移和重组以外，外源基因难以对其产生影响。但是，通过对模式生物秀丽隐杆线虫的研究，发现线虫是一种可以通过注射、浸泡和取食双链RNA等方式来影响自身基因表达，产生RNAi效应的生物。这种外源基因对土壤线虫的非靶标效应是之前研究中没有得到监测的缺失环节。
发明内容
本发明的目的是提供一种检测转基因作物外源基因对土壤线虫安全性的方法。
为了实现本发明目的，本发明的一种检测转基因作物外源基因对土壤线虫安全性的方法，通过生物信息学分析获得转基因植物中外源基因与秀丽隐杆线虫基因组中相同短片段，通过将短片段克隆和转化来饲喂秀丽隐杆线虫，根据秀丽隐杆线虫的表型差异来检测外源基因对线虫的安全性。
通过构建含有外源基因与秀丽隐杆线虫相同短片段的表达双链RNA的载体，转入大肠杆菌中饲喂秀丽隐杆线虫，利用RNAi的方法，检测转基因作物中的外源基因是否对秀丽隐杆线虫造成影响。
具体地，所述方法包括以下步骤：
1）序列的生物信息学分析
将转基因作物外源基因的核苷酸序列与秀丽隐杆线虫的全基因组序列进行比对分析，找出完全匹配且长度≥17bp的目的基因片段，再将这些目的片段在Wormbase数据库中进行检索，找出与秀丽隐杆线虫基因组中外显子反相互补的目的基因片段；
2）重复片段表达载体的构建及宿主菌的转化
i.将找到的与秀丽隐杆线虫基因组中外显子反相互补的目的基因片段分别以5和10的倍数进行拷贝，两端加上限制性内切酶位点和保护碱基，合成5个和10个拷贝的重复目的基因片段；
ii.将目的基因片段与含有两个相反方向的T7启动子的表达载体L4440分别用相同的限制性内切酶反应，切割后的目的片段和表达载体以3:1的比例进行连接，使目的片段连入表达载体的两个T7启动子之间；
iii.将连接产物转化到大肠杆菌Trans109的感受态细胞中，将菌液涂布于LB培养基上，挑取阳性克隆，提取质粒，转化到大肠杆菌HT115的感受态细胞中，将菌液涂布于LB培养基上，37℃培养过夜；
3）对照组的选择和表达载体的构建
根据Wormbase数据库中秀丽隐杆线虫的基因信息，选择3个基因rpl-2,fem-1和hrp-1作为阳性对照；分别在这3个基因上选择长度为700bp、200bp和100bp的片段，设计引物，两端加上相应的酶切位点，按步骤2）中目的基因片段的克隆方法，连接到表达载体L4440中；
4）饲喂秀丽隐杆线虫
iv.将E.coli OP50涂布于NGM培养基上，室温培养过夜；挑取秀丽隐杆线虫于含有E.coli OP50的NGM培养基上，20℃培养；
v.将步骤2）中含有目的基因片段克隆表达载体的大肠杆菌HT115接种于含1mmol/L IPTG的NGM培养基上，室温培养过夜以诱导dsRNA的产生；将处于L3生长期的线虫放到该培养基上饲养至产卵，待线虫大量产卵后，移除成虫；
vi.每个处理组及对照组设置5个平板，每个平板中接入20条F1代线虫；在F1代线虫产卵期间，每天更换一次平板；待产卵期结束后，每两天更换一次平板；统计F1代线虫的产卵数量及存活时间，进而检测外源基因对土壤线虫的安全性。
步骤3）中分别针对3个基因rpl-2,fem-1和hrp-1的长度为700bp、200bp和100bp的片段，设计的引物如下：
更具体地，所述方法包括以下步骤：
1、序列的生物信息学分析
根据转基因作物的专利信息，获取转入外源基因的GenBank（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）序列号，在GenBank上下载外源基因的核酸序列信息。
将获取的外源基因序列与秀丽隐杆线虫的全基因组序列，利用BLAT程序（http://genome.ucsc.edu/index.html）进行比对分析，找出能够完全匹配且长度在17bp及以上的目的基因片段。
再将这些短片段在Wormbase(http://www.wormbase.org/)中进行检索分析，找出能与秀丽隐杆线虫基因组中的外显子反相互补的目的基因片段序列。
2、重复短片段的载体构建
（1）将找到的短片段序列分别以5和10的倍数进行重复，两端加上限制性内切酶位点和保护碱基，送到测序公司合成5个和10个拷贝的重复短片段。
（2）将目的基因片段与含有两个相反方向的T7启动子的表达载体L4440分别用相同的限制性内切酶反应，37℃保温2小时后，75℃加热20分钟终止反应。以3:1的比例加入切割后的目的基因和表达载体片段，加入T4连接酶，室温反应30分钟，使得目的片段连入表达载体两个T7启动子之间。
（3）将连接产物加入50μL大肠杆菌Trans109菌株的感受态细胞中，42℃热激30秒，迅速置冰上2分钟，加入250μL LB培养基，37℃摇床培养1小时后，将菌液涂布于LB培养基上，37℃培养过夜。
（4）挑取阳性克隆，加入4mL LB培养基，37℃摇床培养过夜，提取质粒，测序验证载体构建成功。
（5）将构建成功的质粒加入50μL大肠杆菌HT115菌株的感受态细胞中，42℃热激30秒，迅速置冰上2分钟，加入250μL LB培养基，37℃摇床培养1小时后，将菌液涂布于LB培养基上，37℃培养过夜。
3、对照组的选择和载体构建
（1）根据Wormbase上秀丽隐杆线虫的基因信息以及实验结果，选择了3个基因rpl-2,fem-1和hrp-1。rpl-2（GenBank编号NM_075539）编码的是一个核糖体大亚基L8蛋白，fem-1（GenBank编号NM_068423）编码的是一个锚定蛋白，敲除可导致线虫不育，hrp-1（GenBank编号NM_067925）编码的是一个核不均一核糖核蛋白（heterogeneous nuclear ribonucleoprotein,hnRNPs），敲除可以影响线虫的生长发育。这三个基因作为正对照，用以比较说明线虫的各种非正常表型。
（2）分别在这三个基因上选择了长度为700bp、200bp和100bp的片段，设计引物，两端加上相应的酶切位点，按上面目的基因片段的克隆方法，连接到载体L4440上，并测序验证。
4、饲喂秀丽隐杆线虫
（1）挑取E.coli OP50于LB培养基，37℃振荡培养过夜，置于4℃保存。吸取100μL OP50涂布于NGM培养基，室温培养过夜。挑取秀丽隐杆线虫于含有OP50的NGM培养基上，20℃培养，用于下一步实验。
（2）将含有目的基因片段克隆表达载体的大肠杆菌HT115菌株接种到含有1mmol/L IPTG的NGM培养基上，室温培养过夜以诱导dsRNA的产生。将处在L3生长期的线虫放到此培养基上饲养至产卵，待线虫大量产卵后，移除成虫。
（3）每个处理组以及对照组需要5个平板，每个平板中转入20条F1代线虫。在F1代线虫产卵期间，每天更换一次平板；待产卵期结束后，每两天更换一次。统计F1代的产卵数量及F1代线虫的存活时间。
由于以往转基因作物的安全性研究主要集中在转基因作物中所使用的外源蛋白是否对非靶标生物具有毒副作用，而没有检测外源基因对线虫这一类特殊非靶标生物的非预期效应。本发明通过构建含有外源基因与秀丽隐杆线虫相同短片段的表达双链RNA的载体，转入大肠杆菌中饲喂秀丽隐杆线虫，利用RNAi的方法，检测转基因作物中的外源基因是否对秀丽隐杆线虫安全。
本发明具有以下优点：
（一）简易性
本发明是利用饲喂的方法来进行RNAi，不需要特殊的试剂和仪器，线虫饲养容易，方法简单易行。
（二）独特性
以往转基因作物的安全性评价集中在取食外源蛋白对非靶标生物影响，本发明用于检测外源基因对线虫这类重要土壤生态系统组成者的安全性问题，填补了这一转基因作物安全评价领域的空白。
（三）实用性
本发明提供了三个基因作为正对照，这三个基因所产生的RNAi效应包括：胚胎致死（rpl-2）、不育（fem-1）、产卵减少（hrp-1）以及存活时间缩短（rpl-2和hrp-1）等。作为正对照，不仅可以用于证明方法的可靠性，当外源基因证实对线虫的毒副作用时，还可以用于对照说明不同的危害程度。
附图说明
图1为本发明实施例1中C06B8.7、Y40D12A.2、B0041.7(xnp-1)和F33G12.5.2四个基因的RNAi效应：其中，A：饲喂不同样品的线虫F1代产卵量差异；B：饲喂不同样品的线虫F1代存活率变化曲线。
图2为本发明实施例1中短片段序列Cry1A-20、CpTI-18和Cry1A-17的RNAi效应：其中，A：饲喂10个拷贝重复短片段的线虫F1代产卵量差异；B：饲喂10个拷贝重复短片段的线虫F1代存活率差异；C：饲喂5个拷贝重复短片段的线虫F1代产卵量差异；D：饲喂5个拷贝重复短片段的线虫F1代存活率差异；E.饲喂单拷贝短片段的线虫F1代产卵量差异；F：饲喂单拷贝短片段的线虫F1代存活率差异。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册（Sambrook J&Russell DW,Molecular cloning:a laboratory manual,2001），或按照制造厂商说明书建议的条件。
实施例1双价转基因棉中外源基因cry1A和cpti对秀丽隐杆线虫的影响
1、序列的生物信息学分析
根据双价转基因棉的专利信息（郭三堆等，1999），获取转入外源基因cry1A和cpti的序列信息。
将获取的外源基因cry1A和cpti的序列与秀丽隐杆线虫的全基因组序列，利用BLAT程序（http://genome.ucsc.edu/index.html）进行比对分析，找出能够完全匹配且长度在17bp及以上的目的基因片段。
将这些短片段在Wormbase(http://www.wormbase.org/)中进行检索分析，找出能与秀丽隐杆线虫基因组中的外显子反相互补的目的基因片段序列。序列的生物信息学分析结果见表1。
表1外源基因与秀丽隐杆线虫基因组比对结果
2、重复短片段的克隆和载体构建
（1）将找到的短片段序列Cry1A-20、CpTI-18和Cry1A-17分别以5和10的倍数进行重复，两端加上限制性内切酶位点SacI/HindIIII和保护碱基，送到测序公司上海生工合成5个和10个拷贝的重复短片段。
（2）将重复短片段与含有两个相反方向的T7启动子的表达载体L4440分别用相同的限制性内切酶SacI/HindIIII反应，37℃保温2小时后，75℃加热20分钟终止反应。以3:1的比例加入切割后的目的基因和表达载体片段，加入T4连接酶，室温反应30分钟，使得目的片段连入表达载体两个T7启动子之间。
（3）将连接产物加入50μL大肠杆菌Trans109菌株的感受态细胞中，42℃热激30秒，迅速置冰上2分钟，加入250μL LB培养基，37℃摇床培养1小时后，将菌液涂布于LB培养基上，37℃培养过夜。
（4）挑取阳性克隆，加入4mL LB培养基，37℃摇床培养过夜，提取质粒，测序验证载体构建成功。
3、单拷贝短片段的载体构建
短片段序列Cry1A-20、CpTI-18和Cry1A-17的表达载体构建是利用TOYOBO公司的位点特异性突变导入试剂盒KOD-Plus-Mutagenesis Kit。
（1）按照试剂盒要求合成插入短片段序列Cry1A-20、CpTI-18和Cry1A-17的引物。引物信息见表2。
表2插入短片段序列Cry1A-20、CpTI-18和Cry1A-17的引物
（2）利用反向PCR的方法在载体L4440中插入短片段。
25μL PCR体系：10pmol/μL5’端引物1μL，10pmol/μL，3’端引物1μL，10×iPCR反应缓冲液(TOYOBO）2.5μL，2mM dNTP2.5μL，KOD plus Taq DNA聚合酶（TOYOBO）0.5μL，载体L44400.5μL，ddH2O17μL。
PCR条件：94℃预变性2min；98℃10s，68℃3min，8个循环；反应结束4℃保存。
（3）用Dpn I对模板质粒DNA进行消化。PCR反应结束后，在PCR反应液中加入1μL Dpn I，轻轻混匀，37℃反应1小时。
（4）PCR产物自身环化。15μL连接反应体系：Dpn I处理后PCR产物2μL，ddH2O7μL，Ligation high5μL，T4多聚核苷酸激酶1μL。轻轻混匀，16℃反应1小时。
（5）将连接产物加入50μL大肠杆菌Trans109菌株的感受态细胞中，42℃热激30秒，迅速置冰上2分钟，加入250μL LB培养基，37℃摇床培养1小时后，将菌液涂布于LB培养基上，37℃培养过夜。
（6）挑取阳性克隆，加入4mL LB培养基，37℃摇床培养过夜，提取质粒，测序验证载体构建成功。
4、线虫匹配基因的载体构建
由上述序列生物信息学分析可知，与外源基因短片段匹配的秀丽隐杆线虫的基因为C06B8.7、Y40D12A.2、B0041.7(xnp-1)和F33G12.5.2。除了基因B0041.7(xnp-1)以外，其他三个基因均没有详细注释，功能未知。因此，需要构建这几个基因的表达载体，验证线虫对这几个基因的RNAi效应。
（1）设计引物，克隆线虫C06B8.7、Y40D12A.2、B0041.7(xnp-1)和F33G12.5.2基因中包含相应短片段的700-800bp长度的序列。克隆引物信息见表3。
表3克隆C06B8.7、Y40D12A.2、B0041.7(xnp-1)和F33G12.5.2基因部分片段的引物
（2）50μL PCR反应体系：10pmol/μL5’端引物1.5μL，10pmol/μL，3’端引物1.5μL，10×KOD-plus缓冲液(TOYOBO）5μL，2mM dNTP5μL，KOD plus Taq DNA聚合酶（TOYOBO）1μL，25mM MgSO42μL，线虫cDNA2μL，ddH2O32μL。
PCR反应条件：94℃预变性2min；98℃10s，63℃20s，72℃1min，35个循环；最终延伸72℃10min。
（3）PCR产物利用全式金公司PCR产物回收试剂盒要求回收，产物的酶切、连接和转化同上述重复短基因片段的克隆方法。
5、对照组的选择和载体构建
（1）根据Wormbase上秀丽隐杆线虫的基因信息以及实验结果，选择了3个基因rpl-2,fem-1和hrp-1。rpl-2（GenBank编号NM_075539）编码的是一个核糖体大亚基L8蛋白，fem-1（GenBank编号NM_068423）编码的是一个锚定蛋白，敲除可导致线虫不育，hrp-1（GenBank编号NM_067925）编码的是一个核不均一核糖核蛋白（heterogeneous nuclear ribonucleoprotein,hnRNPs），敲除可以影响线虫的生长发育。这三个基因作为正对照，用以比较说明线虫的各种非正常表型。
（2）分别在这三个基因上选择了长度为700bp、200bp和100bp的片段，设计引物，两端加上相应的酶切位点，按上面重复短基因片段的克隆方法，连接到载体L4440上，并测序验证。克隆引物信息见表4。
表4克隆rpl-2,fem-1,和hrp-1基因部分片段引物
6、饲喂秀丽隐杆线虫
（1）挑取E.coli OP50于LB培养基，37℃振荡培养过夜，置于4℃保存。吸取100μL OP50涂布于NGM培养基，室温培养过夜。挑取秀丽隐杆线虫于含有OP50的NGM培养基上，20℃培养，用于下一步实验。
（2）上述所有构建成功的质粒以及空载体L4440加入50μL大肠杆菌HT115菌株的感受态细胞中，42℃热激30秒，迅速置冰上2分钟，加入250μL LB培养基，37℃摇床培养1小时后，将菌液涂布于LB培养基上，37℃培养过夜。
（3）将含有目的基因片段克隆表达载体的大肠杆菌HT115菌株接种到含有1mmol/L IPTG的NGM培养基上，室温培养过夜以诱导dsRNA的产生。将处在L3生长期的线虫放到此培养基上饲养至产卵，待线虫大量产卵后，移除成虫。
（4）每个处理组以及对照组需要5个平板，每个平板中转入20条F1代线虫，共100条。在F1代线虫产卵期间，每天更换一次平板；待产卵期结束后，每两天更换一次。整个实验共重复三次。统计F1代的产卵数量以及F1代线虫的存活时间。
7、统计结果分析
使用Graphpad Prism5软件来统计分析线虫的产卵量和存活率。实验中所使用的负对照、正对照以及处理组样品说明见表5。
表5样品说明
C06B8.7、Y40D12A.2、B0041.7(xnp-1)和F33G12.5.2四个基因的RNAi效应。在本实施例中，除了基因B0041.7(xnp-1)以外，其他三个基因没有详细注释，功能未知，需要构建这几个基因的表达载体，来验证线虫对这几个基因的RNAi效应。由图1可知，本发明中使用的三个正对照F1代的产卵量都发生了显著的下降，饲喂700Rpl样品的完全没有产卵。此外，饲喂700Rpl样品的线虫亲本不能产生足够多的F1代（不足100条），因此在分析存活率时去掉了这个样品。对线虫B0041.7(xnp-1)和F33G12.5.2这两个基因进行RNA干扰后，与负对照相比，产卵量也下降了，差异达到了极显著水平。在存活率上，除了正对照700Fem样品的存活率明显较高以外，其他样品的存活率与负对照L4440样品相比没有明显差异。
短片段序列Cry1A-20、CpTI-18和Cry1A-17的RNAi效应。为了研究找到的外源基因与线虫基因组完全匹配的短片段的RNAi效应，除了在表达载体中插入单拷贝的短片段序列以外，本发明中还合成了5个拷贝和10个拷贝的重复短片段序列来构建表达载体。考虑到干扰序列的长度差异可能造成的影响（5个拷贝和10个拷贝的重复短片段序列长度约100bp和200bp），重新构建了插入片段为100bp和200bp长度的正对照。由实验结果（图2）可知，在缩短了插入片段的长度后，正对照样品的产卵量还是显著低于负对照L4440样品。在存活率方面，正对照100Fem样品存活率稍高，200Hrp、200Rpl和100Hrp样品出现了明显的存活率下降。处理组中，只有5个拷贝的5Cry1A-17样品的产卵量下降，达到了极显著水平；其他样品无论在产卵量和存活率上，与负对照都没有显著差异。
综合上述实验结果可知，转基因作物中使用的外源基因中与秀丽隐杆线虫基因组完全匹配的短片段Cry1A-17的5拷贝片段能够通过RNAi这样的作用方式，造成线虫产卵量的下降，而其它片段都不影响线虫的产卵量；所有匹配的短片段无论拷贝数多少对线虫的存活率都没有影响。实验中使用的不同长度插入片段的正对照，无论是在线虫产卵量还是线虫存活率分析时，都与负对照有显著差异。做为正对照，可以证明本方法的可靠性；当外源基因证实对线虫的毒副作用时，可以有效的用于对照说明不同的危害程度。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
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Claims (1)
1.一种检测转基因作物外源基因对土壤线虫安全性的方法，其特征在于，通过生物信息学分析获得转基因植物中外源基因与秀丽隐杆线虫基因组中相同短片段，通过将短片段克隆和转化来饲喂秀丽隐杆线虫，根据秀丽隐杆线虫的表型差异来检测外源基因对线虫的安全性；具体包括以下步骤：
1)序列的生物信息学分析
将转基因作物外源基因的核苷酸序列与秀丽隐杆线虫的全基因组序列进行比对分析，找出完全匹配且长度≥17bp的目的基因片段，再将这些目的片段在Wormbase数据库中进行检索，找出与秀丽隐杆线虫基因组中外显子反向互补的目的基因片段；
2)重复片段表达载体的构建及宿主菌的转化
i.将找到的与秀丽隐杆线虫基因组中外显子反向互补的目的基因片段分别以5和10的倍数进行拷贝，两端加上限制性内切酶位点和保护碱基，合成5个和10个拷贝的重复目的基因片段；
ii.将目的基因片段与含有两个相反方向的T7启动子的表达载体L4440分别用相同的限制性内切酶反应，切割后的目的片段和表达载体以3:1的比例进行连接，使目的片段连入表达载体的两个T7启动子之间；
iii.将连接产物转化到大肠杆菌Trans109的感受态细胞中，将菌液涂布于LB培养基上，挑取阳性克隆，提取质粒，转化到大肠杆菌HT115的感受态细胞中，将菌液涂布于LB培养基上，37℃培养过夜；
3)对照组的选择和表达载体的构建
根据Wormbase数据库中秀丽隐杆线虫的基因信息，选择3个基因rpl-2,fem-1和hrp-1作为阳性对照；分别在这3个基因上选择长度为700bp、200bp和100bp的片段，设计引物，两端加上相应的酶切位点，按步骤2)中目的基因片段的克隆方法，连接到表达载体L4440中；
4)饲喂秀丽隐杆线虫
iv.将E.coli OP50涂布于NGM培养基上，室温培养过夜；挑取秀丽隐杆线虫于含有E.coli OP50的NGM培养基上，20℃培养；
v.将步骤2)中含有目的基因片段克隆表达载体的大肠杆菌HT115接种于含1mmol/L IPTG的NGM培养基上，室温培养过夜以诱导dsRNA的产生；将处于L3生长期的线虫放到该培养基上饲养至产卵，待线虫大量产卵后，移除成虫；
vi.每个处理组及对照组设置5个平板，每个平板中接入20条F1代线虫；在F1代线虫产卵期间，每天更换一次平板；待产卵期结束后，每两天更换一次平板；统计F1代线虫的产卵数量及存活时间，进而检测外源基因对土壤线虫的安全性；
其中，步骤3)中分别针对3个基因rpl-2,fem-1和hrp-1的长度为700bp、200bp和100bp的片段，设计的引物如下：
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