CN103674908A

CN103674908A - 水溶性5-磺酸钠Salen型希夫碱配体通过荧光分析法检测水溶液和细胞中的二价铜离子

Info

Publication number: CN103674908A
Application number: CN201310288638.5A
Authority: CN
Inventors: 向海峰; 程景惠; 周向葛
Original assignee: Sichuan University
Current assignee: Sichuan University
Priority date: 2013-07-11
Filing date: 2013-07-11
Publication date: 2014-03-26

Abstract

本发明针对现有技术对Cu²⁺检测存在的问题，结合荧光分析法检测的优点，提供了一种水溶性5-磺酸钠Salen型希夫碱配体检测二价铜离子的方法。这种方法具有高灵敏度，特异选择性等优点，并能实现在水溶液和细胞中检测Cu²⁺。

Description

水溶性5-磺酸钠Salen型希夫碱配体通过荧光分析法检测水溶液和细胞中的二价铜离子

技术领域

本发明属于检测技术领域，涉及重金属离子的荧光传感领域，特别涉及一种基于荧光分析法检测Cu²⁺的方法。

背景技术

金属离子荧光探针是指一类能与特定的金属离子通过键合作用或发生化学反应并改变其自身荧光发光性能的分子。通过测定分子荧光变化情况，如荧光强度、发光波长等实现对金属离子的检测。由于荧光检测相比其他检测方法而言，具有灵敏度高和检测速度快等优点，使得利用荧光探针来检测环境或生物体系中的金属离子成为近几十年来的一个研究热点[Kwon J.Y.；Jang Y. J.；Lee Y. J.，J.Am.Chem.Soc，2005，127，10107-10111；Wang X.L.；Zheng W. Y.；Lin H. Y.，Tetrahedron.Lett.，2009，50，1536-1538.]。Salen型希夫碱的结构特点决定其具有良好的光学性质，它又能比较容易的与多种金属离子进行鳌合配位，一些Salen型希夫碱已经被成功地应用到金属离子的荧光检测领域[Dong Y.；Li J.F.；Jiang X. X.；Song F. Y.；Cheng Y. X.；Zhu C.J.，Org.Lett.，2011，13，2252-2255；Gou C.；Qin S.H.；Wu H.Q.；Wang Y.；Luo J.；Liu X.Y.，Inorg.Chem.Comm.2011，14，1622-1625；Hosseini M.；Ganjali M.R.；Veismohammadi B.；Riahi S.；Norouzi P.；Salavati N.M.；Abkenar S.D.，Anal.Lett.2009，42，1029-1040.]。然而，很多Salen型荧光探针都只能在有机溶剂的体系中实现对金属离子的检测。因此，设计合成水溶性好的金属离子荧光探针，使其能真正应用到环境和生物体系中，对金属离子荧光探针的发展具有重要意义。

荧光探针在生物领域中的应用引起了人们极大的兴趣，而水溶性的好坏是评价一个荧光探针能否有效的应用于生物体系中的重要标准。5-磺酸钠Salen型希夫碱配体是一种对Cu²⁺具有高选择性，高灵敏度的荧光探针，而且5-磺酸钠Salen型希夫碱配体的水溶性非常好，还很稳定，使其具有作为Cu²⁺荧光淬灭型探针应用到生物体系中的可能，并有望应用到环境监测和生物检测领域。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术存在的上述问题，结合荧光分析法检测的优点，提供一种高灵敏度，高选择性的基于5-磺酸钠Salen型希夫碱通过荧光分析法检测Cu²⁺离子的方法。

本发明的技术方案具体如下：

一，本发明的荧光分子探针希夫碱的合成：

本发明的荧光分子探针水溶性5-磺酸钠Salen型希夫碱结构式如下：

本发明的5-磺酸钠Salen型希夫碱的合成路线，如下式所示：

N，N’-双-5-磺酸钠水杨醛缩乙二胺希夫碱(Et-1)的合成：在100mL的烧瓶中将5-磺酸钠-水杨醛(1.12g，5mmol)溶解在乙醇∶水＝4∶1(50mL)的溶液中，在搅拌下将含有乙二胺(0.16g，2.7mmol)的乙醇(10mL)溶液缓慢滴入上述溶液中，加热至80℃下反应2小时，冷却，抽滤，分别用乙醇，无水乙醚洗涤几次，干燥，得到淡黄色粉末(Et-1)。

其他的5-磺酸钠Salen型希夫碱配体合成方法与Et-1的合成一样。

二，本发明的荧光分析法对Cu²⁺离子的检测：

(1)，荧光分析法

Ph-1、PhMe-1、CN-1配体在乙腈溶液中的荧光最大发射峰分别位于457nm、454nm、563nm，而在水溶液中的荧光最大发射峰分别位于431nm、429nm、507nm，即共轭体系的5-磺酸钠Salen型希夫碱配体在水溶液中与乙腈溶液中相比，其荧光发射光谱发生了蓝移。Et-1、Cy-1配体在乙腈溶液中的荧光最大发射峰分别位于400nm、405nm，而在水溶液中的荧光最大发射峰分别位于491nm、493nm，即非共轭体系的5-磺酸钠Salen型希夫碱配体在水溶液中与乙腈溶液中相比，其荧光发射光谱发生了明显的红移。加入Cu²⁺离子后，PhMe-4的荧光几乎完全淬灭，其他水溶性5-磺酸钠Salen型希夫碱配体的荧光也能被Cu²⁺淬灭。

(2)，选择性

在PhMe-4水溶液中分别加入两当量的不同金属离子(Li⁺、K⁺、Mg²⁺、Hg²⁺、Fe³⁺、Co²⁺、Mn²⁺、pb²⁺、Al³⁺、Ni²⁺、Ca²⁺、Zn²⁺、Cr³⁺、Cd²⁺、Ag⁺和Cu²⁺)，在相同的条件下进行荧光检测，在370nm波长的紫外灯激发下，PhMe-4的荧光最大发射峰位435nm，加入不同的金属离子以后，一些金属离子使PhMe-4的荧光强度稍微增强(Al³⁺、Mg²⁺、Ca²⁺、Zn²⁺、Co²⁺等)，另外一些使PhMe-4的荧光强度稍外减弱(K⁺、Fe³⁺、Co²⁺、Ni²⁺等)，但只有Cu²⁺使PhMe-4的荧光几乎完全淬灭，所以，PhMe-4可以作为荧光淬灭型的Cu²⁺探针。其他水溶性5-磺酸钠Salen型希夫碱配体的荧光也能被Cu²⁺淬灭。

为了进一步研究了PhMe-4对Cu²⁺荧光淬灭检测的选择性。我们考察了在其他金属离子共存在的情况下，Cu²⁺对PhMe-4荧光的淬灭情况，在PhMe-4水溶液中，同时加入Cu²⁺和其他不同的金属离子(PhMe-4与金属离子的当量比都为1∶2)我们发现，即使有其他金属离子的干扰，Cu²⁺仍然能够将PhMe-4的荧光几乎完全淬灭。实验结果表明，PhMe-4能够作为一种具有高选择性地在水溶液中检测Cu²⁺荧光探针。

(3)，灵敏度

在水溶液中PhMe-4对Cu²⁺的荧光滴定显示，PhMe-4与Cu²⁺的配位比为1∶1。在Cu²⁺与PhMe-4的当量比为0～1.0的范围内，加入Cu²⁺的浓度与荧光强度呈很好的线性关系(R²＝0.996、n＝10)，基于国际纯粹与应用化学联合会(IUPAC)对检测线的定义(C_DL＝3Sb／m)，我们计算出PhMe-4对Cu²⁺荧光检测的检测限为8.4纳摩尔每立方分米(0.54ppb)。这个检测限比美国环保署对饮用水中铜离子含量的上限(1.3ppm)还低很多。证明PhMe-4是作为一种非常灵敏的检测Cu²⁺的荧光探针。

(4)，细胞成像

空白对照：将培养好的A549细胞用PBS(磷酸盐缓冲溶液)淋洗三次，在荧光显微镜下成像，A549细胞不能观察到荧光。

荧光成像：将A549细胞用加入了PhMe-4(微摩尔每立方分米)的培养液继续培养20分钟，用PBS(磷酸盐缓冲溶液)淋洗三次，在荧光显微镜下成像，A549细胞能观察到很强的蓝色荧光，表明PhMe-4成功地进入了细胞并且实现对细胞的荧光成像。

检测Cu²⁺：将上述荧光成像的A549细胞继续用加入了Cu²⁺(40微摩尔每立方分米)的培养液培养20分钟，用PBS(磷酸盐缓冲溶液)淋洗三次，在荧光显微镜下成像，本来发出很强蓝色荧光的A549细胞几乎不能再观察到荧光，表明Cu²⁺进入细胞并且使PhMe-4的荧光淬灭。

以上实验证明了PhMe-4能作为荧光探针在细胞中对Cu²⁺进行识别。

本发明有益的技术效果在于：

1，本发明提供了一种全新的、简便的检测pt²⁺的方法，这种方法的特点在于检测主体的配体本身是一种发荧光的物质，而与Cu²⁺这样的金属离子配位以后，生成的配合物是一种不发荧光的物质，从而实现了荧光淬灭检测Cu²⁺方法，这种方法对以后检测其他的金属离子也有启示作用。

2，本发明提供的荧光分析检测方法灵敏度高、选择性好、检测线低。

3，本发明对Cu²⁺的检测不需要大型仪器，通过荧光-磷光光谱或裸眼观察，即可识别检测结果。

附图说明

图1为本发明的5-磺酸钠Salen型希夫碱配体荧光分子探针的结构式；

图2为本发明的PhMe-4的水溶液中逐渐加入Cu²⁺的荧光发射光谱变化图(激发波长为370nm)。插图：紫外灯下PhMe-4与PhMe-4+Cu²⁺(当量比1：2)；

图3为本发明的在细胞中PhMe-4对Cu²⁺的荧光响应。

图4，5为本发明的5-磺酸钠Salen型希夫碱配体的光学性质；

图6为本发明的PhMe-1、PhMe-2、PhMe-3和PhMe-4在水溶液中的紫外-可见吸收光谱图；

图7为本发明的水溶液中PhMe-4对不同当量比Cu²⁺的紫外-可见吸收响应；

图8为本发明的Et-1，Cy-1，Ph-1，and PhMe-1在水溶液和乙腈中的荧光光谱图；

图9为本发明的PhMe-1、PhMe-2、PhMe-3和PhMe-4在水溶液中的荧光光谱图；

图10为本发明的PhMe-4与两当量不同金属离子的荧光相应(激发波长为370nm)；

图11为本发明的不同金属离子对Cu²⁺淬灭PhMe-4荧光的干扰检测(1：PhMe-4，2：Cu²⁺，3：Li⁺，4：K⁺，5：Mn²⁺，6：Ag⁺，7：Hg²⁺，8：Fe³⁺，9：Co²⁺，10：Mg²⁺，11：pb²⁺，12：Al³⁺，13：Cd²⁺，14：Ni²⁺，15：Ca²⁺，16：Zn²⁺，17：Cr³⁺，激发波长为370nm，取435nm处的荧光强度)。

具体实施方式

实施例1：3-叔丁基水杨醛的制备

在500mL的圆底烧瓶里加入镁屑(1.6g)，四氢呋喃(20mL)，在氮气保护下将溴乙烷(6mL)缓慢的滴加进圆底烧瓶中。搅拌加热使溶液回流至镁屑完全反应，冷却到室温，将2-叔丁基苯酚(10g)的四氢呋喃(27mL)溶液缓慢的滴加到烧瓶里直至生成白色沉淀，将甲苯(134mL)，三乙胺(10g)，多聚甲醛(15g)加入烧瓶，升温至100℃反应3小时。冷却，加入盐酸水溶液(质量分数10％，334mL)，乙醚萃取，饱和食盐水洗，无水硫酸钠干燥，过滤，旋干溶剂得到粗品。将粗品以石油醚作为展开剂通过柱层析得到3-叔丁基水杨醛。

实施例2：5-磺酸钠水杨醛的制备

在500毫升的烧瓶中加入水杨醛(12.2g，0.1mol)和乙醇(100mL)，在搅拌下慢慢加入苯胺(9.3g，0.1mol)。加热回流反应2小时，然后旋出溶剂乙醇，得到黄色透明液体N-苯基-水杨醛亚胺20g(>99％)。将反应瓶放置在冰浴中，在搅拌下用滴液漏斗慢慢滴加4倍体积的浓硫酸到20克上述反应液中，慢慢升温到105℃下反应2小时。反应完后冷却到0℃，加入冰片慢慢析出沉淀，过滤，用少许冰水洗去多余的硫酸，干燥得到黄色固体N-苯基-5-磺酸-水杨醛亚胺。

在500mL的烧杯中加入上述固体(15g)和蒸馏水(200mL)，多次少量地加入无水碳酸钠直到没有CO₂气体冒出为止。通入空气加热煮沸2小时，脱去苯胺保护基。反应完后蒸去水份，加入乙醇，冷却，用冰醋酸调节溶液pH＝5，析出沉淀。过滤，干燥得到粗品。用水重结晶得到浅黄色固体5-磺酸钠-水杨醛。

实施例3：N，N’-双-5-磺酸钠水杨醛缩乙二胺希夫碱(Et-1)的合成。

在100mL的烧瓶中将5-磺酸钠-水杨醛(1.12g，5mmol)溶解在乙醇∶水＝4∶1(50mL)的溶液中，在搅拌下将含有乙二胺(0.16g，2.7mmol)的乙醇(10mL)溶液缓慢滴入上述溶液中，加热至80℃反应2小时，冷却，抽滤，分别用乙醇，无水乙醚洗涤几次，干燥，得到淡黄色粉末(Et-1)。

实施例4：希夫碱PhMe-4水溶液对Cu²⁺的紫外-可见分析。

在3mL1.0×10^-6mol dm^-3的PhMe-4水溶液中，分别加入两当量的不同金属离子(Li⁺、K⁺、Mg²⁺、Hg²⁺、Fe³⁺、Co²⁺、Mn²⁺、pb²⁺、Al³⁺、Ni²⁺、Ca²⁺、Zn²⁺、Cr³⁺、Cd²⁺、Ag⁺和Cu²⁺)，肉眼观察溶液颜色，没有明显变化。

我们用紫外-可见分光光度计检测了加入不同金属离子后的PhMe-4水溶液，发现PhMe-4配体的紫外-可见吸收光谱发生变化。其中，加入Cu²⁺后的变化十分明显。随着Cu²⁺的增加，PhMe-4在370nm处的吸收峰逐渐减小，同时在350nm处形成一个新的吸收峰。

实施例5：希夫碱PhMe-4水溶液对Cu²⁺的荧光检测。

在3mL1.0×10^-6mol／L的PhMe-4水溶液中，分别加入两当量的不同金属离子(Li⁺、K⁺、Mg²⁺、Hg²⁺、Fe³⁺、Co²⁺、Mn²⁺、pb²⁺、Al³⁺、Ni²⁺、Ca²⁺、Zn²⁺、Cr³⁺、Cd²⁺、Ag⁺和Cu²⁺)，在370nm波长的紫外灯激发下，在相同的条件下进行荧光检测，只有在加入Cu²⁺时PhMe-4的荧光几乎完全淬灭，而其他金属离子的变化不明显。

Claims

1.水溶性5-磺酸钠Salen型希夫碱配体通过荧光分析法检析法检测水溶液和细胞中的二价铜离子，其包括下列步骤：

（1），合成了一系列5-磺酸钠Salen型希夫碱配体；

（2），将希夫碱配体分别与不同浓度的Cu²⁺反应；

（3），测定紫外-可见吸收变化情况；

（4），测定荧光-磷光变化情况；

如权利要求1所述的利用水溶性5-磺酸钠Salen型希夫碱配体通过荧光分析法检测水溶液和细胞中的Cu²⁺离子，其特征是5-磺酸钠Salen型希夫碱配体可应用于在水溶液中检测Cu²⁺离子，也可应用于在细胞中中检测Cu²⁺离子。

2.如权利要求1所述的利用水溶性5-磺酸钠Salen型希夫碱配体通过荧光分析法检测水溶液和细胞中的Cu²⁺离子，其特征是，反应条件为在室温下，加入金属离子10分钟后进行荧光检测。

3.如权利要求1所述的利用水溶性5-磺酸钠Salen型希夫碱配体通过荧光分析法检测水溶液和细胞中的Cu²⁺离子，其特征是可以检测很微量的Cu²⁺离子，其中，PhMe-4在水溶液中对Cu²⁺荧光检测的检测限为8.4 nmol dm⁻³ (0.54 ppb)。

4.这个检测限比美国环保署对饮用水中铜离子含量的上限（1.3ppm）还低很多。

5.如权利要求1所述的利用水溶性5-磺酸钠Salen型希夫碱配体通过荧光分析法检测水溶液和细胞中的Cu²⁺离子，其特征是测试紫外-可见光谱时，分别与不带磺酸钠的配体Salen、CySalen、SalPhen进行比较，Et-1、Cy-1和Ph-1的紫外-可见吸收光谱只有很小的变化，说明引入磺酸钠基团对配体的吸收影响很小，加入Cu²⁺离子后发现PhMe-4配体的紫外-可见吸收光谱发生明显变化，随着Cu²⁺的增加，PhMe-4在370 nm处的吸收峰逐渐减小，同时在350 nm处形成一个新的吸收峰。

6.如权利要求1所述的利用水溶性5-磺酸钠Salen型希夫碱配体通过荧光分析法检测水溶液和细胞中的Cu²⁺离子，其特征是在乙腈溶液中，Et-1、Cy-1和Ph-1三种配体之间荧光发射光谱的关系与Salen、CySalen和Salphen间的荧光发射光谱类似，从而说明，引入磺酸钠基团，对配体的发光性质产生的影响很小。

7.在3 mL 1.0×10⁻⁶ mol dm⁻³的PhMe-4水溶液中，分别加入两当量的不同金属离子，在相同的条件下进行荧光检测，在370 nm波长的紫外灯激发下，PhMe-4的荧光最大发射峰位435 nm，加入不同的金属离子以后，一些金属离子使PhMe-4的荧光强度稍微增强（Al³⁺、Mg²⁺、Ca²⁺、Zn²⁺和Co²⁺等），另外一些使PhMe-4的荧光强度稍外减弱（K⁺、Fe³⁺、Co²⁺和Ni²⁺等），但只有Cu²⁺使PhMe-4 的荧光几乎完全淬灭，所以，PhMe-4可以作为荧光淬灭型的Cu²⁺探针。

8.其他水溶性5-磺酸钠Salen型希夫碱配体的荧光也能被Cu²⁺淬灭。