CN103674861B - 吸光度的测定方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种吸光度的测定方法，包括以下步骤：将变色反应用的试药加入试料中，获得测试溶液；将测试溶液导入吸光度测定部；对测试溶液进行吸光度检测，得到测试溶液的吸光度的值，其中进行吸光度检测的时间T’早于测试溶液的变色反应进行到平衡状态的时间T。

Description

吸光度的测定方法

技术领域

本发明涉及一种测定吸光度的方法，特别是涉及一种不需要转换光度计量程的情况下即可进行的吸光度的测量方法。

背景技术

分光光度计已经成为现代分子生物实验室常规仪器。分光光度计的基本结构如图1所示，包括光源、单色器、吸收池（比色皿）、检测器和测量仪表。

分光光度计采用一个可以产生多个波长的光源，通过系列分光装置，从而产生特定波长的光源，光源透过测试的样品后，部分光源被吸收，计算样品的吸光值，从而转化成样品的浓度。样品的吸光值与样品的浓度成正比。单色光辐射穿过被测物质溶液时，被该物质吸收的量与该物质的浓度和液层的厚度（光路长度）成正比，其关系如下式：

A=-log(I/I₀)=KLC

其中A为吸光度；I₀是入射光的强度；I是透射光的强度；K是物质摩尔吸收系数；L是分析物质的光程，即比色皿的边长；C为物质的浓度。上式说明了物质的吸光度与吸收物质的浓度和液层的厚度成正比，这就是光吸收的基本定律Lambert-Beer（朗伯-比耳）定律。

用比色法的氨气自动检测器的详细结构和测定条件在ISO11732，JIS（日本工业标准）K0400-42-70里已有说明。例如，ISO11732中测定吸光度的比色皿的单元长度被设定在10-50mm的范围内，这是因为在不同浓度的情况下必须进行区分使用。

在现有的市场上销售使用的装置中，若待测溶液的浓度过大，进行量程转换时必须对比色皿进行更换，或者是加入稀释剂对待测溶液进行稀释，因此量程的转换并不是很容易，这就导致测量过程较繁琐。

发明内容

本发明提供了一种在超出量程的情况下，不更换比色皿或不添加稀释剂即可进行吸光度的测量的方法。

根据本发明的测量吸光度的方法，包括以下步骤：

（1）将变色反应用的试药加入试料中，获得测试溶液；

（2）将所述测试溶液导入吸光度测定部；

（3）对所述测试溶液进行吸光度检测，得到所述测试溶液的吸光度的值，

其特征在于，其中进行所述吸光度检测的时间T’早于所述测试溶液的变色反应进行到平衡状态的时间T。

进一步的，根据本发明的测量吸光度的方法还包括在步骤（1）之前对所述变色反应进行到平衡状态的时间T进行测定的步骤。

进一步的，根据本发明的测量吸光度的方法，根据在步骤（3）中测得的吸光度的值通过计算从而得到所述变色反应进行到平衡状态的时间T的吸光度的值。

附图说明

图1是分光光度计的基本结构的示意图；

图2是吸收光谱曲线的示意图；

图3是一定波长下不同浓度的测试溶液随时间变化的吸光度的示意图；

图4是根据本发明的实施例的吸光度测试的示意图。

具体实施方式

以不同波长的单色光作为入射光，测定某一溶液的吸光度，然后以入射光的不同波长为横轴，各相应的吸光度为纵轴作图，可得到溶液的吸收光谱曲线。如图2所示，其中t0-t3分别表示不同的反应时间，t3>t2>t1>t0，随着反应时间变长，吸光度变高，由波长扫描进行光谱分析可见，不同浓度的溶液均在波长为λ处达到最大吸收，因此可以将λ设置为该显色物质的检测波长。

以下用靛酚蓝分光光度法来对本发明的吸光度的测量方法做详细说明。

靛酚蓝分光光度法的着色总结如下：

（1）让铵离子和次氯酸根离子反应生成氯胺；

（2）氯胺和苯酚发生反应时会呈现相应于铵离子量的蓝色，为了加速苯酚和氯胺的反应速度可以加入催化剂硝普钠。

步骤（2）的反应产生的蓝色，在大约650nm处有峰值的光谱特性，对应图2中λ=650nm。

因为比色皿的单元长度是一定的，随着反应的进行，吸光度会变高，如果试料的浓度很高，当变色反映趋于平衡时，吸光度很大，会超出所能测量的吸光度的范围，此时就不能进行正确的测量。如图3所示，C3和C4溶液的浓度超出了能够测量的吸光度的上限，因此无法正确的测得。

在此情况下，常规方法是通过稀释或者更换比色皿以降低吸光度。本发明为了避免这个问题，在图3中的时间点T’即进行吸光度的测量，早于通常的等待反应进行到平衡状态下进行测量的时间T。通过这样，吸光度的测量在吸光度测量的范围内进行，可以对高浓度试料进行测量。

这里，反应进行到平衡状态的时间T是反应饱和之后吸光度稳定的时间。分光度稳定为止的时间，因测定对象而不同。但是，由于测定的物质和反应试药的反应时间是可以确定的，所以由预先人工分析等来测量好时间。测定时，仅将指定量的试料和试药放入分光度计的试料池中。使用具有保温功能的分光度计，制作时间-分光度图表。

在进行吸光度测定之前，还包括确定所述试料和所述试药的混合比例的步骤。同时由于抽吸试料和试药的蠕动泵因为连续变化会产生流量的变化，导致产生测量误差，还可以在测定前对蠕动泵进行校正测定，以抵消流量的变化。

反应时间和分光度的关系是指数函数关系。该指数函数关系式可以由计算求得。在本发明中，设想测定的物质为固定的情形，在时间T’测得吸光度之后，根据指数函数关系可以求得时间T即反应饱和时的吸光度的值。可以对T’和T预先用几种浓度进行确认，且求得可以计算的关系式。

图4所示为本发明使用的氨计的一个例子。

如图中所示，测试装置包括蠕动泵A，B，多个混合盘管，反应盘管，温度控制部，吸光度测定部以及控制和显示部。

通过蠕动泵A抽吸试料，同时试料也被所抽吸的气体进行分节。通过蠕动泵A和B将试药1-3利用混合盘管加入到试料中，混合盘管可以对混合液进行充分的搅拌，使其充分反应。同时，上述进行的气体分节也有搅拌的效果。同时也可以加入相应的催化剂以加速反应的进行。

将试药和试料的混合液充分搅拌后倒入反应盘管中，反应盘管再将混合液导入吸光度测定部中，进行吸光度的测定并且得到吸光度的测定值。

为了保证反应过程以及吸光度测量过程的稳定，反应盘管和吸光度测定部需要保持温度恒定的状态，控制和显示部对反应盘管和吸光度测定部的温度进行控制，并且进行信号处理和显示，控制和显示部执行整个计算过程，并将测定结果显示或是作为电信号向外部发送。

虽然本发明已以较佳实施例揭露如上，但并不是用来限定本发明，任何所属技术领域的技术人员，在不脱离本发明的精神和范围内，可以作少许的改动与润饰，因此本发明的保护范围以权利要求所界定的为准。

Claims (2)

1.一种测量吸光度的方法，该方法包括以下步骤：

(1)将变色反应用的试药加入试料中，获得测试溶液；

(2)将所述测试溶液导入吸光度测定部；

(3)在保持温度恒定的状态下，对所述测试溶液进行吸光度检测，得到所述测试溶液的吸光度的值，

其特征在于，其中进行所述吸光度检测的时间T’是，吸光度在可测定的范围内，并早于所述测试溶液的变色反应进行到平衡状态的时间T，根据在所述时间T’时测定的吸光度的值，通过计算得到所述时间T时的吸光度的值。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，还包括在步骤(1)之前对所述变色反应进行到平衡状态的时间T进行测定的步骤。