CN103667266A - 与北京油鸡五趾性状相关的hb9基因及应用 - Google Patents

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汤琳琳
黄启忠
孟和
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Abstract

本发明涉及与北京油鸡五趾性状相关的HB9基因，公开了HB9基因与五趾性状具有极其显著的相关性，表明HB9基因为北京油鸡五趾性状主效基因，并且公开了用于扩增HB9基因的引物，本发明提供的HB9基因可用于北京五趾油鸡的育种，为北京油鸡五趾性状的深入研究和开发应用开辟了新的途径。

Description

与北京油鸡五趾性状相关的HB9基因及应用
技术领域
本发明涉及基因工程领域，特别是涉及与北京油鸡五趾性状相关的HB9基因及应用。
背景技术
北京油鸡是我国一个珍贵的地方鸡种，原产地在北京城北侧安定门和德胜门外的近郊一带，形成于清朝中期。北京油鸡体躯中等，公鸡羽毛呈赤褐色，鲜艳光亮，头部高昂，尾羽多呈黑色。母鸡羽毛呈黄色，头尾微翘，胫部略短，体态墩实。凤头、毛腿、胡须，少量个体分生五趾是北京油鸡的主要外貌特征。它以肉味鲜美、蛋质佳良而著称。66周产蛋量125枚，90日龄体重1100克，饲料报酬3.4：1，成活率95%以上。
鸡多趾性状定位和比较基因组分析都表明鸡2号染色体短臂端与人类7q36同源区应是鸡多趾候选基因的关键区域，人和鼠PPD的候选基因也可作为鸡多趾突变的候选基因。人7q36和鼠5号染色体上，EN2、SHH、Lmbr1、C7orf3、Hlxb9等同源基因以相似的顺序排列。目前已知鸡肢体发育重要相关基因，如EN2、SHH、Lmbr1、Hlxb9、GLI3、Twist1等均落位在这个区域。因此参照人类和鼠等物种相似性状的研究进展对于进一步缩小鸡多趾性状候选区间、确定关键候选基因和进行未知基因的克隆就显得特别重要。
基因Hlxb9最初被定位到人染色体1q41，后被重新定位到7q36的微卫星标记D7S559-D7S2423之间。鸡的HB9基因位于2号染色体，mRNA全长1481bp（NCBI序列号为AF066861），OFR为1050bp，共有三个外显子(538bp，161bp，764bp)，编码一个349氨基酸的蛋白。在人、鼠、鸡等不同物种间同源性比较结果显示，同源一致性达到80.56%。
Najfeld V在1992年利用荧光原位杂交技术对于Hlxb9基因进行检测和定位，发现该基因在淋巴和胰腺组织中表达，并将其定位在1q41-q42.1内。后来Ross AJ在1998年在有爪蟾蜍的尾芽和胚胎期的荐骨（主要是脊索区）也检测到Hlxb9的表达，并发现Hlxb9的突变与荐骨发育不全有关。2000年Belloni E和Hagan DM在Currarino综合症中也都发现了HB9的特异性突变并导致了部分骶骨发育不全、便秘或肛门直肠畸形和骶前肿块的表型。此外，Harrison KA在1999年对HB9在胰腺的发育和功能上做了研究，发现该基因在胰腺的发育和功能上起着重要作用。但是没有任何研究表明HB9基因与PPD（preaxial polydactyly轴前多趾）有关。
五趾作为北京油鸡的一个显著、独特、标志性的特征，是屠宰后典型包装性状之一，因此对北京油鸡五趾性状的遗传规律和基因定位的研究结果，会为人类肢体发育异常遗传分子机理的研究提供重要的参考，并且研究五趾性状的遗传规律，选育高纯度北京油鸡五趾品系，对优质鸡产业化生产和产业品牌具有重要意义。
目前候选基因分析法是进行动物性状基因定位的一个常用方法。该方法主要是选定一些候选基因，利用分子生物学技术研究这些基因和相关的DNA标记对某种性状的遗传效应，从而筛选出对该性状有影响的主基因和DNA标记，估计出它们对性状的效应值。
实时荧光定量PCR技术为在候选基因分析法中进行基因定量表达研究提供了有力的解决办法，荧光定量PCR技术是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。其常用机制包括荧光染料检测和水解探针检测。
发明内容
本发明的目的是提供与北京油鸡五趾性状相关的HB9基因及应用。
为了实现本发明的目的，本发明通过以五趾油鸡和石岐杂鸡趾为材料，采用荧光定量PCR方法，检测了HB9基因在胚胎发育第6～10天的表达，发现了HB9基因与五趾性状具有极其显著的相关性，由此表明HB9基因为北京油鸡五趾性状主效基因。
本发明提供了一种HB9基因，所述的HB9基因与北京油鸡五趾性状相关，且具有如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。
优选地，所述的HB9基因为北京油鸡五趾性状主效基因。
本发明还提供了如前所述的HB9基因在选育具有五趾性状的北京油鸡中的应用。
本发明还提供了用于扩增与北京油鸡五趾性状相关的HB9基因的引物，所述引物包括：
上游引物F：5'-CCTTTCAGCTGGACCAGTGG-3'；和
下游引物R：5'-GCACTTCCCCAGCAGGTTG-3'。
本发明还提供了含有上述上游引物和下游引物的检测试剂盒。
本发明进一步提供了所述的试剂盒在检测北京油鸡五趾性状中的应用。
具体方法包括：以北京油鸡cDNA为模板，采用含有上述上游引物和下游引物的检测试剂盒，进行PCR扩增反应，检测扩增产物。
优选地，所述的PCR反应的退火温度为61℃。
优选地，所述PCR反应为荧光定量PCR反应，其条件包括：95℃预变性30s，95℃变性3s，61℃退火30s，72℃延伸20s，扩增35个循环，72℃后延伸10min；4℃终止反应。
本发明具有以下优点：
1.本发明首次选用多趾性状突出并且遗传表现稳定的经5个世代杂交测验和纯繁选育的五趾北京油鸡和石岐杂鸡的胚蛋胚胎作为材料，通过荧光定量PCR方法，发现了HB9基因与五趾性状具有极其显著的相关性，表明HB9基因为北京油鸡五趾性状主效基因。
2.本发明提供的与北京油鸡五趾性状相关的HB9基因为北京油鸡五趾性状的深入研究和开发应用开辟了新的途径。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
以下实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法：所用的实验材料，如无特殊说明，均为市售商品；下述实施例中的%，如无特殊说明，均为质量百分含量。
实施例1HB9基因在北京油鸡和石岐杂鸡的趾部组织中的表达差异
1、实验材料
选用的五趾纯系北京油鸡和石岐杂鸡受精蛋由上海市农业科学院畜牧兽医研究所庄行试验站提供。本方法所用的五趾纯系北京油鸡，是经过5个世代杂交测验和纯繁选育，后代100%表现多趾性状并表现稳定遗传。选取五趾纯系北京油鸡和石岐杂鸡受精蛋各40枚。
2、实验仪器设备
小型孵化器ELYE-3型，无锡市万利畜牧机械有限公司。
电热恒温鼓风干燥箱，YLD-2000型，黄矿恒丰医疗器械有限公司。
MLS-3750型高压灭菌锅，日本三洋。
-70℃超低温冰箱，美国热电集团。
电冰箱，BCD-196F型，青岛海尔股份有限公司。
T-18型匀浆器，广州IKA公司。
电热恒温水浴锅，DK-S24型，上海精宏实验设备有限公司。
电子天平（BL-220H），日本Shimadzu公司。
离心机5417C，德国Eppendorf公司。
5417R冷冻离心机，德国Eppendorf公司。
生物分光光度计，德国Eppendorf公司。
定量PCR仪，德国Eppendorf公司。
PTC-200梯度PCR仪，美国MJ RESEARCH公司。
净化工作台YJ-875S，苏州净化设备公司。
DYY-6C电泳仪，北京六一仪器厂。
DYCP-33A型水平电泳槽，北京六一仪器厂。
凝胶成像系统，GIS-2008型，天能科技（上海）有限公司。
紫外分析仪，JY03型，北京君意东方电泳设备有限公司。
XHF-1高速分散器，上海金达生化仪器厂。
电泳仪，JY600C型，北京君意东方电泳设备有限公司。
3、实验试剂及试剂盒
（1）TRIzol总RNA提取试剂盒，Invitroge公司。
（2）mRNA纯化试剂盒OligotexTMmRNA Kit，荷兰Qiagen公司；
（3）PCR-SelectTMcDNA Subtraction Kit，美国Clontech公司；
（4）AdvantageTMcDNA Polymerase Mix，美国Clontech公司；
（5）DEPC（焦碳酸二乙酯）、丙烯酰胺、N,N′-亚甲双丙烯酰胺，上海博彩生物公司；
（6）rTaq DNA聚合酶；dNTP Mixture（2.5mM）；AMV反转录试剂盒，包括反转录酶（5U/ul）、Rnase Inhibitor（40U/ul）、dNTP Mixture（10mM）、10×RT Buffer、Mgcl2（25mM）、Rnase free H2O、荧光定量试剂盒PremixEx TaqTM等，TaKaRa公司（大连宝生物工程公司）；
（7）氯仿、异丙醇等其它试剂均为国产分析纯；0.1MNaOH；0.5MEDTA(PH8.0)；10％SDS；灭菌双蒸水；3%H2O2；0.5%SDS；0.1％的DEPC处理水；75％乙醇；50×TAE；1%的琼脂糖凝胶，按实验室常规标准方法配制。
4、实验步骤
（1）鸡胚孵化和样品采集
保证两种胚胎能正常孵化并同期发育，使实验结果具有可比性。将五趾纯系北京油鸡和石岐杂鸡受精蛋各40枚放入孵化箱中，设定温度37.8℃，湿度66%，每2小时翻蛋一次。
选取同期发育的两种胚胎，尽快分割。从孵化后第6天开始至第10天，每隔24h取出胚蛋，将胚蛋内容物倒在铺有一次性塑料手套的表面皿中，用处理好的小镊子和剪刀小心取出胚胎，在DEPC水中洗去蛋黄，10分钟之内切下趾部组织（骨骼肌肉）放入离心管中，液氮速冻后置于-70℃冰箱保存。每个时间点采集五趾北京油鸡和石岐杂样品各5个。
（2）总RNA提取和保存
采用TRIzol法提取趾部组织总RNA，步骤如下：
1）用已处理的镊子取100mg液氮冻存趾部组织样，加入倒有1ml TRIzol的匀浆管中高速匀浆30s左右，样品量不能超过TRIzol的10%；
2）4℃12000×g离心10min；
3）吸取上清液，15～30℃温育5min。加0.2ml氯仿，盖紧盖子，用手剧烈震荡15s，15～30℃温育2～3min；
4）4℃12000转离心15min；
5）吸取上清液，加0.5ml异丙醇，混合均匀，15～30℃温育10min；
6）4℃12000转离心10min，离心管底部白色沉淀即为RNA；
7）倒掉上清，加1ml 75%乙醇（DEPC处理水配制）洗涤RNA；
8）4℃7500×g离心5min；
9）自然干燥或真空干燥RNA，溶于0.1%DEPC处理水，取1μl总RNA在1%琼脂糖凝胶上电泳，检测所提总RNA的完整性；
10）取1μl总RNA溶于79μl0.1%DEPC处理水中，用生物分光光度计测定总RNA浓度和OD值，以OD值处于1.85～2.0之间为高纯度总RNA。将部分总RNA稀释成1μg/μl工作液，于-20℃保存，剩余总RNA原液保存于-70℃冰箱。
（3）荧光定量PCR
在NCBI网站上进行检索，得出五趾性状HB9基因cds序列，并保存为序列文件（*.seq）。引物设计采用Primer 5.0从cds序列跨外显子设计上游引物（5'→3'）和下游引物（5'→3'），长度20bp左右，尽量避免错配及引物二聚体，退火温度50℃～65℃之间，并尽量在60℃以下，引物见表1。
表1荧光定量PCR引物设计
Figure BDA00002140750700061
cDNA的获得
挑选纯化效果好的RNA进行反转录。每个品种每个时间点选取3个样品。
1）取出总RNA工作液，按照Prime ScriptTM RT反转录试剂盒说明建立10μl总RNA反转录反应体系：
Figure BDA00002140750700062
2）轻轻混匀，离心3～5s。反应混合物在PCR仪中37℃反应15min，85℃反应5s，立即冰浴2min。
3）将得到的cDNA混合液进行后续实验或-20℃保存。
引物退火温度的确定
使用PCT-200梯度PCR仪确定引物的退火温度。
1）反应体系：
Figure BDA00002140750700071
2）PCR反应条件：94℃预变性5min，94℃变性30S，55℃～65℃退火30s，72℃延伸20s，扩增35个循环。
3）1%琼脂糖凝胶电泳检测结果，确定引物退火温度为61℃。
使用
Figure BDA00002140750700072
Premix Ex TaqTM试剂盒进行荧光定量PCR。每个样品重复3次，以确保结果的可信度。
1）反应体系如下：
Figure BDA00002140750700073
2）反应条件
95℃预变性30s，95℃变性3S，61℃退火30s，72℃延伸20s，扩增35个循环，72℃后延伸10min；4℃终止反应。
（4）采用2-ΔΔCt法对有效性数据进行统计分析。
定量PCR所得到的是每一个反应的Ct值，以各时期石岐杂的倍数做图，试验结果表示为X±SD。
具体方法是：计算HB9基因和看家基因（GAPDH）Ct的平均值
ΔCt（1）＝Ct五趾油鸡-CtGapdh
（五趾油鸡HB9基因Ct的平均值-相对应的看家基因Ct的平均值）
ΔCt（2）＝Ct石岐杂-CtGapdh
（石岐杂鸡HB9基因Ct的平均值-相对应的看家基因Ct的平均值）
ΔΔCt＝ΔCt（1）-ΔCt（2）
公式2-ΔΔCt，得到五趾油鸡HB9基因相对于石岐杂鸡HB9基因的表达量
按照上述步骤得到胚胎发育不同时期五趾油鸡和石岐杂鸡HB9基因的相对表达量，见表2。
表2胚胎发育不同时期五趾油鸡和石岐杂鸡HB9基因的相对表达量
由表2可见，第6天、第8天和第10天的表达倍数分别高达241.52、282.44、213.68；第7天和第9天相对较低，但表达倍数仍为93.02和92.15。因此在胚胎发育的第6天至第10天五趾油鸡的HB9基因的表达量极显著高于石岐杂鸡，且参照多趾遗传连锁图谱发现，HB9基因的物理位置（Position：8487360-8490376）在所有侯选基因中最接近于鸡2号染色体ADL270位点附近。
该结果表明HB9基因与五趾性状具有极其显著的相关性，由此推测HB9基因可能是调控北京油鸡五趾性状的主效基因，因此HB9基因可应用于针对五趾性状的北京油鸡品种的选育。
以上所述，仅为本发明较佳具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限与此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
Figure IDA00002140751300021

Claims (4)

1.与北京油鸡五趾性状相关的HB9基因，其特征在于，所述HB9基因具有如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。
2.如权利要求1所述的HB9基因，其特征在于，所述HB9基因为北京油鸡五趾性状主效基因。
3.用于扩增如权利要求1或2所述的HB9基因的引物，其特征在于，包括：
上游引物F：5'-CCTTTCAGCTGGACCAGTGG-3'；和
下游引物R：5'-GCACTTCCCCAGCAGGTTG-3'。
4.如权利要求1所述的HB9基因在选育具有五趾性状的北京油鸡中的应用。
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