CN103667039B - 一种用于基因检测的质量型传感器及其制备方法和应用 - Google Patents
一种用于基因检测的质量型传感器及其制备方法和应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及传感器制造领域,尤其涉及一种用于基因检测的质量型传感器。本发明提供一种用于基因检测的质量型传感器,包括质量型传感器本体,其特征在于,所述质量型传感器本体的非检测敏感位置表面设有聚乙二醇单分子层,所述质量型传感器本体的检测敏感位置表面设有巯基生物素单分子层,所述巯基生物素单分子层上嫁接有链亲和素层。使用本发明所提供的质量传感器,主要优点包括实时在线检测、结果准确、检测速度快、节约成本和扩展性好。
Description
技术领域
本发明涉及传感器制造领域,尤其涉及一种用于基因检测的质量型传感器。
背景技术
基因检测技术广泛应用在传染性疾病与遗传性疾病检测等方面。依赖于DNA序列特异性的基因测序技术、依赖于DNA杂交的DNA芯片技术、依赖于PCR反应的基因扩增技术以及分离不同长度DNA片段的凝胶电泳技术等技术单独或者联合应用于基因检测上。限制性内切酶能够特异地结合于一段被称为限制性酶识别序列的DNA序列之内或其附近的特异位点上,并切割双链DNA。限制性片段长度多态性分析技术,即经过特异性限制性内切酶酶切DNA基因组而产生的不同长度的DNA片段,通过高压脉冲电泳分离形成特定图谱,已经广泛应用在病原体微生物分型等方面。但是DNA测序、DNA杂交芯片、高压脉冲电泳等检测技术都需要专门的实验室、大型仪器、昂贵的试剂以及专业的操作分析人员,不仅分析时间长、通量小,而且无法满足快速、高通量基因检测的需求。
近几年发展起来的以DNA杂交技术为基础的质量型传感器在基因检测上具有高分辨率、高灵敏度、快速响应和数字式输出信号等特点,而且能够在液相环境中工作,在环境监测、医疗诊断等方面具有广阔的应用前景。但是由于生物大分子的非特异性吸附,容易造成误检。此外杂交系统复杂,待检样品的单链DNA样品制备复杂,还不能在实际检测中应用。
发明内容
鉴于以上所述现有技术的缺点,本发明的目的在于提供一种用于基因检测的质量型传感器及其制备方法和应用,用于解决现有技术中的问题。
本发明第一方面提供一种用于基因检测的质量型传感器,包括质量型传感器本体,所述质量型传感器本体的非检测敏感位置表面设有聚乙二醇单分子层,所述质量型传感器本体的检测敏感位置表面设有巯基生物素单分子层,所述巯基生物素单分子层上嫁接有链亲和素层。
本领域技术人员可根据常识确定所述质量型传感器的检测敏感位置和非检测敏感位置。
所述聚乙二醇单分子层的作用是减少因非特异性吸附对质量型传感器造成的影响。
优选的,质量型传感器本体的非检测敏感位置表面为二氧化硅表面,质量型传感器本体的敏感位置表面为镀金表面。
优选的,巯基生物素单分子层选自Sulfo-NHS-SS-Biotin、NHS-SS-Biotin或Sulfo-NHS-(PEG4-bismannose)-SS-biotin。
优选的,所述聚乙二醇单分子层为自组装的聚乙二醇单分子层,所述巯基生物素单分子层为自组装的巯基生物素单分子层。
优选的,所述质量型传感器的表面使用BSA封闭。具体是指当巯基生物素单分子层上嫁接有链亲和素层后,使用BSA封闭,以排除质量型传感器上吸附生物大分子的可能性,保证了检测的准确性。
优选的,所述的质量型传感器为微悬臂梁传感器或石英晶体微天平。
本发明第二方面提供一种用于基因检测的质量型传感器的制备方法,包括如下步骤:
(a)在质量型传感器的非敏感位置表面自组装聚乙二醇单分子层;
(b)在质量型传感器的检测敏感位置表面自组装巯基生物素单分子层;
(c)在步骤b所得的巯基生物素单分子层上嫁接链亲和素;
(d)使用BSA封闭质量型传感器表面非特异性位点。
优选的,所述步骤a中聚乙二醇单分子层的自组装方法是将质量型传感器静置在聚乙二醇硅烷溶液中自组装生成聚乙二醇单分子层。
优选的,所述的聚乙二醇硅烷溶液包括聚乙二醇硅烷、无水乙醇和去离子水,所述聚乙二醇硅烷、无水乙醇和去离子水的体积比为1:100:1,浸泡温度为75℃,浸泡时间为90分钟。所述聚乙二醇硅烷溶液会选择性的与表面为二氧化硅表面的非检测敏感表面结合,形成聚乙二醇单分子层。
优选的,所述步骤b中,自组装巯基生物素单分子层的具体方法为:将质量型传感器放在巯基生物素溶液中静置生成生物素单分子层。
优选的,所述巯基生物素溶液选自Sulfo-NHS-SS-Biotin的PBS缓冲液、NHS-SS-Biotin的PBS缓冲液或Sulfo-NHS-(PEG4-bismannose)-SS-biotin的PBS缓冲液中的一种,浓度为0.1~2.5mM(mmol/L),所述质量型传感器放在巯基生物素溶液中静置的时间为8小时以上。所述巯基生物素会选择性的与表面为镀金表面的检测敏感表面结合,形成巯基生物素单分子层。
优选的,所述巯基生物素溶液为1mM Sulfo-NHS-SS-Biotin的PBS缓冲液,静置温度为4℃。
所述PBS(PBS:Phosphate Buffered Saline)缓冲液为含0.05%吐温-20的pH7.4的磷酸盐缓冲液,通过磷酸二氢钾(KH2PO4)、磷酸氢二钠(Na2HPO4·12H2O)、氯化钠(NaCl)、氯化钾(KCl)、吐温-20[聚氧乙烯(20)失水山梨醇单月桂酸酯,Tween-20,CAS No.9005-64-5]和水配置。
所述各种生物素溶液均可通过市售途径获得。
优选的,所述步骤c中嫁接链亲和素的具体方法为:将自组装巯基生物素后的质量型传感器放在1~2.5wt%链亲和素的PBS缓冲液中室温孵育0.5小时以上。
优选的,步骤d所述封闭非特异性位点的具体方法为:将嫁接链亲和素后的质量型传感器放在1~5wt%BSA的PBS缓冲液中室温孵育0.5小时以上。
本发明第三方面提供所述质量型传感器在基因分析用传感器制造领域中应用。
本发明第四方面提供一种试剂盒,包括所述的质量型传感器、目标DNA上游引物、目标DNA下游引物及限制性内切酶,所述上游引物或下游引物上偶联有生物素。
优选的,还包括PCR试剂。
优选的,所述试剂盒中还包括限制性内切酶酶切所需试剂等各种试验中可能用到的常规试剂。
本发明所提供的质量型传感器使用限制性内切酶在线酶切的基因检测的具体方法,包括如下步骤:
(a)通过PCR反应扩增目标DNA,PCR过程中所使用的上游引物预先偶联了生物素;
(b)将步骤a所得的PCR产物中的生物素化DNA特异性地吸附到质量型传感器的敏感表面,并通过质量型传感器计算出结合到质量型传感器的DNA的质量为m1;
(c)对结合到质量型传感器表面的DNA进行限制性内切酶在线切割,通过质量型传感器计算出被切割掉的DNA质量为m2,被切割前目标DNA的总长度l1,而由DNA酶切位点位置决定的理论被切掉的DNA长度l2,将m2/m1和l2/l1的值比较后得出检测结论。
若m2/m1≈l2/l1,即可判定被检测的DNA为目标DNA。
综上所述,使用本发明所提供的质量传感器进行基因检测的主要优点是:
(1)实时在线检测:DNA的结合以及DNA酶切直接由传感器显示。
(2)结果准确:生物素-链亲和素结合特异性好,减少了DNA非特异性吸附,通过特异性限制性酶切位点切割,原理上消除了假阳性结果。
(3)检测速度快:①PCR产物不需要纯化,可直接分析。②由于DNA被固定在质量型传感器上,缓冲液替换简单快速。③DNA结合与酶切都在微小空间内完成,化学反应速度更快。
(4)节约成本:使用了微型传感器,DNA样品与检测试剂等都是微量消耗。
(5)扩展性好:本发明还可以应用在石英晶体微天平(QCM)等其它质量型传感器上。
(质量型传感器包括微悬臂梁型传感器、石英晶体微天平等)
附图说明
图1为本发明实施例1的原理图。
图2为本发明实施例1的检测结果示意图。
具体实施方式
以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式,本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用,本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用,在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。
在进一步描述本发明具体实施方式之前,应理解,本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案;还应当理解,本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案,而不是为了限制本发明的保护范围;在本发明说明书和权利要求书中,除非文中另外明确指出,单数形式“一个”、“一”和“这个”包括复数形式。
当实施例给出数值范围时,应理解,除非本发明另有说明,每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义,本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外,根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载,还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。
除非另外说明,本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术领域常规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组DNA技术及相关领域的常规技术。这些技术在现有文献中已有完善说明,具体可参见Sambrook等MOLECULAR CLONING:ALABORATORY MANUAL,Second edition,Cold Spring HarborLaboratory Press,1989 and Third edition,2001;Ausubel等,CURRENT PROTOCOLS INMOLECULAR BIOLOGY,John Wiley & Sons,New York,1987 and periodic updates;the seriesMETHODS IN ENZYMOLOGY,Academic Press,San Diego;Wolffe,CHROMATINSTRUCTURE AND FUNCTION,Third edition,Academic Press,San Diego,1998;METHODSIN ENZYMOLOGY,Vol.304,Chromatin(P.M.Wassarman and A.P.Wolffe,eds.),AcademicPress,San Diego,1999;和METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY,Vol.119,ChromatinProtocols(P.B.Becker,ed.)Humana Press,Totowa,1999等。
悬臂梁的基态固有谐振频率可以从梁振动方程中解出,表示为
式中f0为基态固有谐振频率,meff为悬臂梁的有效质量,k弹性系数。
质量变化m与谐振频率变化f的关系为:
式中m为悬臂梁上待测物的质量变化,f为谐振频率变化,f0为基态固有谐振频率。
因此谐振频率变化正比于质量变化,本实例的微悬臂梁传感器的质量灵敏度为8.8pg/Hz。
本发明实施例中所使用的PBS缓冲液为含0.05%吐温-20的pH7.4的磷酸盐缓冲液,通过磷酸二氢钾(KH2PO4),磷酸氢二钠(Na2HPO4·12H2O),氯化钠(NaCl),氯化钾(KCl),吐温-20和水配置。具体的PBS缓冲液配置方法为:称取磷酸二氢钾(KH2PO4)、磷酸氢二钠(Na2HPO4·12H2O)、氯化钠(NaCl),氯化钾(KCl)和吐温-20,混合均匀后加水。
PBS1L配方pH7.4:
磷酸二氢钾(KH2PO4):0.27g,
磷酸氢二钠(Na2HPO4):1.42g,
氯化钠(NaCl):8g,
氯化钾(KCl)0.2g,
加去离子水约800mL充分搅拌溶解,然后加入浓盐酸调pH至7.4,最后定容到1L。高温高压灭菌后室温保存。
PBS缓冲液(pH7.2~7.4):NaCl137mmol/L,KCl2.7mmol/L,Na2HPO410mmol/L,KH2PO42mmol/L。
实施例1
E.coliO157:H7的快速检测(原理如图1所示,左为EcoRV酶切前,右为EcoRV酶切后)
a)封闭微悬臂梁传感器上非敏感位置的二氧化硅表面,在二氧化硅表面自组装一层聚乙二醇硅烷(PEG-silane)单分子层,以减少因非特异性吸附对传感器造成的影响,聚乙二醇硅烷溶液的配方是聚乙二醇硅烷、无水乙醇和去离子水,体积比为1:100:1,反应温度为75℃,浸泡时间为90分钟。
b)在微悬臂梁传感器敏感位置的镀金表面自组装巯基生物素单分子层。将微悬臂梁传感器浸泡在1mM Sulfo-NHS-SS-Biotin的PBS缓冲液中8小时,Sulfo-NHS-SS-Biotin分子中的NHS基团很容易被水解,形成巯基生物素和巯基丙酸,进而形成微悬臂梁传感器金表面巯基生物素单分子层。
c)在微悬臂梁传感器上生物素敏感层末端嫁接链亲和素,在2.5wt%链亲和素的PBS缓冲液中孵育1小时。
d)用1wt%BSA的PBS缓冲液封闭非特异性位点即得用于基因检测的质量型传感器。
e)将步骤d所得的质量型传感器、EcoRV限制性内切酶、stx2基因(NC008464.1)所对应的PCR上游引物和下游引物组成试剂盒,所述PCR反应的上游引物序列为:Biotin-5′-ACACTTGTTACCCACATACC-3′(Seq.ID No.1);下游引物序列为:5′-ATCGTTCACCACAAAAATCA-3′(Seq.ID No.2)。通过PCR反应扩增被测致病菌中特异性基因stx2片段,其中上游引物预先偶联了生物素,PCR片段理论大小为3776bp,其中距生物素末端1141bp有一个EcoRV酶切位点。反应体系和反应程序如表1和表2所示:
表1PCR反应体系
试剂 | 体积(μl) |
上游引物 | 5 |
下游引物 | 5 |
Taq DNA聚合酶 | 1 |
10×PCR反应缓冲液 | 5 |
DNA模版 | 1 |
2.5mM dNTP | 4 |
去离子水 | 29 |
Total | 50 |
表2PCR反应程序设定
f)通过目标DNA的上游引物中所偶联的生物素与微悬臂梁传感器表面的链亲和素结合,使步骤e所得的PCR产物特异性地吸附到微悬臂梁传感器表面,通过微悬臂梁传感器计算出结合的DNA质量m1=1.81ng。
g)确定目标DNA。对目标DNA片段实行限制性内切酶在线切割,通过微悬臂梁传感器计算出被切割掉的DNA质量m2=1.16ng,计算m2/m1=0.642。切割前DNA总长度l1=3776bp,EcoRV决定的被切掉的DNA长度l2=2635bp,计算l2/l1=0.698,可知m2/m1≈l2/l1,可判定被检测的DNA为目标DNA。
实施例1的实验原理如图1所示。其具体的微悬臂梁传感器的检测结果示意图如图2所示。
实施例2
乙肝病毒的快速检测:
a)封闭微悬臂梁传感器上非敏感位置的二氧化硅表面,在二氧化硅表面自组装一层聚乙二醇硅烷(PEG-silane)单分子层,以减少因非特异性吸附对微悬臂梁传感器造成的影响,聚乙二醇硅烷溶液的配方是聚乙二醇硅烷、无水乙醇和去离子水,体积比为1:100:1,反应温度为75℃,浸泡时间为90分钟。
b)在微悬臂梁传感器敏感位置的镀金表面自组装巯基生物素单分子层。将微悬臂梁浸泡在1mM Sulfo-NHS-SS-Biotin的PBS缓冲液中8小时,Sulfo-NHS-SS-Biotin分子中的NHS基团很容易被水解,形成巯基生物素和巯基丙酸,进而形成微悬臂梁传感器金表面巯基生物素单分子层。在微悬臂梁传感器上生物素敏感层末端嫁接链亲和素。
c)在微悬臂梁传感器上生物素敏感层末端嫁接链亲和素,在2.5wt%链亲和素的PBS缓冲液中孵育1小时。
d)用1wt%BSA的PBS缓冲液封闭非特异性位点。
e)将步骤d所得的质量型传感器、BamHI限制性内切酶、乙肝病毒的特异性基因(X04615.1)所对应的PCR上游引物和下游引物组成试剂盒,所述PCR反应的上游引物序列为Biotin-5’-TGCGGAACTCCTAGCAGCTTGTTTTGC-3’(Seq.ID No.3);下游引物序列为:5’-TTCTTGGGAACAAGAGCTACAGC-3’(Seq.ID No.4)。通过PCR反应扩增患者血液中乙肝病毒的特异性基因,其中上游引物预先偶联了生物素,PCR片段理论大小为1722bp,其中距生物素末端108bp有一个BamHI酶切位点。反应体系和反应程序如表3和表4所示:
表3PCR反应体系
试剂 | 体积(μl) |
上游引物 | 5 |
下游引物 | 5 |
Taq DNA聚合酶 | 1 |
10×PCR反应缓冲液 | 5 |
DNA模版 | 1 |
2.5mM dNTP | 4 |
去离子水 | 29 |
Total | 50 |
表4PCR反应程序设定
f)通过目标DNA的上游引物中所偶联的生物素与微悬臂梁传感器表面的链亲和素结合,使步骤e所得的PCR产物特异性地吸附到微悬臂梁传感器表面,通过微悬臂梁传感器计算出结合的DNA质量m1=1.45ng。
g)确定目标DNA。对目标DNA片段实行限制性内切酶在线切割,通过微悬臂梁传感器计算出被切割掉的DNA质量m2=1.24ng,计算m2/m1=0.865。切割前DNA总长度l1=1722bp,BamHI决定的被切掉的DNA长度l2=1614bp,计算l2/l1=0.937,可知m2/m1≈l2/l1,可判定被检测的样品为乙肝患者。
综上所述,本发明有效的克服了现有技术中的种种缺点,而且具有高度产业利用价值。
上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效,而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下,对上述实施例进行修饰或改变。因此,举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变,仍应由本发明的权利要求所涵盖。
Claims (4)
1.一种非诊断和治疗目的的限制性内切酶在线酶切的基因检测的方法,包括如下步骤:
(a)通过PCR反应扩增目标DNA,PCR过程中所使用的上游引物预先偶联了生物素;
(b)将步骤a所得的PCR产物中的生物素化DNA特异性地吸附到质量型传感器的敏感表面,并通过质量型传感器计算出结合到质量型传感器的DNA的质量为m1;
(c)对结合到质量型传感器表面的DNA进行限制性内切酶在线切割,通过质量型传感器计算出被切割掉的DNA质量为m2,被切割前目标DNA的总长度l1,而由DNA酶切位点位置决定的理论被切掉的DNA长度l2,将m2/m1和l2/l1的值比较后得出检测结论,若m2/m1≈l2/l1,即可判定被检测的DNA为目标DNA;
所述质量型传感器包括质量型传感器本体,所述质量型传感器本体的非检测敏感位置表面设有聚乙二醇单分子层,所述质量型传感器本体的检测敏感位置表面设有巯基生物素单分子层,所述巯基生物素单分子层上嫁接有链亲和素层,所述质量型传感器的表面使用BSA封闭,所述的质量型传感器为微悬臂梁传感器或石英晶体微天平。
2.如权利要求1所述的一种限制性内切酶在线酶切的基因检测的方法,其特征在于,质量型传感器本体的非检测敏感位置表面为二氧化硅表面,质量型传感器本体的敏感位置表面为镀金表面。
3.如权利要求1所述的一种限制性内切酶在线酶切的基因检测的方法,其特征在于,巯基生物素单分子层选自Sulfo-NHS-SS-Biotin、NHS-SS-Biotin或Sulfo-NHS-(PEG4-bismannose)-SS-biotin。
4.如权利要求1所述的一种限制性内切酶在线酶切的基因检测的方法,其特征在于,所述聚乙二醇单分子层为自组装的聚乙二醇单分子层,所述巯基生物素单分子层为自组装的巯基生物素单分子层。
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