CN103665131A - 棉铃虫和烟夜蛾的npf神经肽及其编码基因和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种棉铃虫和烟夜蛾的NPF神经肽及其编码基因和应用。本发明提供的蛋白质是如下（a）或（b）或（c）或（d）：（a）序列1所示的氨基酸组成的蛋白质；（b）序列3所示的氨基酸组成的蛋白质；（c）序列6所示的氨基酸组成的蛋白质；（d）将以上氨基酸经过取代和/或缺失和/或添加衍生的蛋白质。本发明还保护抑制所述基因表达的物质在如下（e）或（f）中的应用：（e）培育抗虫转基因植物；（f）制备抗虫剂。本发明发现，抑制该基因表达的物质可以用于培育转基因抗虫作物，即通过干扰害虫的取食作用，从而抑制害虫对植物的危害，无污染，不会将有害物质传递到害虫的天敌体内，与环境的相容性好，对于农业生产具有重大有益价值。

Description

棉铃虫和烟夜蛾的NPF神经肽及其编码基因和应用

技术领域

本发明涉及一种棉铃虫和烟夜蛾的NPF神经肽及其编码基因和应用。

背景技术

神经肽NPY（Neuropeptide Y）首先在高等动物中发现，之后相继在无脊椎动物中发现，在昆虫中的发现相对较晚。由于最早发现的Neuropeptide Y成熟肽C-末端为酪氨酸（Y）而被命名NPY，无脊椎动物中以苯丙氨酸（F）结尾，所以将无脊椎动物此类神经肽统称为NPF，或无脊椎动物的NPY家族。目前在昆虫中NPY命名尚未统一，以酪氨酸结尾的称NPY（如意大利蜜蜂），以苯丙氨酸结尾的称NPF（如果蝇），昆虫NPF或者NPY总称NPY类神经肽。目前，昆虫其他目的物种中，仅发现有NPF或者NPY，而在鳞翅目昆虫中发现同时含有NPF和NPY。该类基因主要分布于主要分布于脑和中肠中，在取食、酒精过敏、性行为、学习和记忆、生物节律等许多方面都起着重要的调控作用。

目前，在无脊椎动物中，对NPF基因功能的研究相对滞后，主要集中在果蝇和线虫的NPF上。在鳞翅目昆虫中，该基因还未见报道。研究棉铃虫NPF的基因及其功能，对于害虫防治新技术的开发具有广泛的前景。

烟夜蛾和棉铃虫都属于鳞翅目、夜蛾科，主要以幼虫取食幼嫩组织为害作物，以蛹越冬。烟夜蛾在全国各地均有分布，属寡食性害虫，主要为害烟草。棉铃虫是一种在全球范围内为害农作物的害虫，食性广，为害严重。另外，棉铃虫具有显著的生理生态及行为特点，例如杂食性、滞育、迁飞等，还是研究鳞翅目昆虫的代表物种。

发明内容

本发明的目的是提供一种棉铃虫和烟夜蛾的NPF神经肽及其编码基因和应用。

本发明提供的蛋白质，来自棉铃虫或烟夜蛾，命名为NPF蛋白，是如下（a）或（b）或（c）或（d）：

（a）由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

（b）由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

（c）由序列表中序列6所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

（d）将（a）或（b）或（c）氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与昆虫进食量相关的其衍生的蛋白质。

编码所述蛋白的基因（NPF基因）也属于本发明的保护范围。

所述基因可为如下1）至10）中任一所述的DNA分子：

1）序列表的序列2自5’末端第48-293位核苷酸所示的DNA分子；

2）序列表的序列4自5’末端第48-413位核苷酸所示的DNA分子；

3）序列表的序列5自5’末端第70-315位核苷酸所示的DNA分子；

4）序列表的序列7自5’末端第70-435位核苷酸所示的DNA分子；

5）序列表的序列2所示的DNA分子；

6）序列表的序列4所示的DNA分子；

7）序列表的序列5所示的DNA分子；

8）序列表的序列7所示的DNA分子；

9）在严格条件下与1）或2）或3）或4）或5）或6）或7）或8）限定的DNA序列杂交且与昆虫进食量相关蛋白的DNA分子；

10）与1）或2）或3）或4）或5）或6）或7）或8）限定的DNA序列具有90%以上同源性且编码与昆虫进食量相关蛋白的DNA分子。

含有所述NPY基因的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌均属于本发明的保护范围。

本发明还保护抑制所述NPF基因表达的物质在如下（e）或（f）中的应用：（e）培育抗虫转基因植物；（f）制备抗虫剂。所述植物为单子叶植物或双子叶植物。所述双子叶植物具体可为烟草，如烟草NC98。所述抗虫具体可为抗鳞翅目昆虫，更具体可为抗夜蛾科昆虫，进一步具体可为抗棉铃虫或抗烟夜蛾。

本发明还保护一种培育转基因植物的方法，包括如下步骤：将抑制所述NPF基因表达的物质导入出发植物，得到对昆虫抗性增强的转基因植物。所述出发植物为单子叶植物或双子叶植物。所述双子叶植物具体可为烟草，如烟草NC98。所述昆虫可为鳞翅目昆虫，更具体可为夜蛾科昆虫，进一步具体可为棉铃虫或烟夜蛾。

本发明还保护一种抗虫剂，它的活性成分为抑制所述NPF基因表达的物质。所述抗虫具体可为抗鳞翅目昆虫，更具体可为抗夜蛾科昆虫，进一步具体可为抗棉铃虫或抗烟夜蛾。

所述抑制NPY基因表达的物质可为针对所述NPF基因的干扰载体或抑制所述NPF基因表达的双链RNA。

所述干扰载体中具有特异DNA片段；所述特异DNA片段为双链，包括DNA片段甲、DNA片段乙和位于所述DNA片段甲和所述DNA片段乙之间的间隔序列；所述DNA片段甲的序列与所述DNA片段乙的序列反向互补；所述DNA片段乙为所述NPY基因或其片段。所述DNA片段乙具体可为序列8自5’末端第6至371位核苷酸所示的双链DNA分子或序列10自5’末端第6至371位核苷酸所示的双链DNA分子。所述干扰载体具体可为如下质粒：骨架载体为pGreen-HY104载体，在骨架载体的不同多克隆位点分别插入了所述DNA片段甲和所述DNA片段乙。所述干扰载体更具体可为如下质粒：骨架载体为pGreen-HY104载体，在所述骨架载体的HindIII和EcoRI酶切位点之间插入了所述DNA片段甲，在骨架载体的SmaI和BamHI酶切位点之间插入了所述DNA片段乙。

所述双链RNA具体可为序列表的序列12所示的双链RNA分子、序列表的序列13所示的双链RNA分子、序列表的序列9所示的双链RNA分子或序列表的序列11所示的双链RNA分子。

本发明还保护序列表的序列12所示的双链RNA分子、序列表的序列13所示的双链RNA分子、序列表的序列9所示的双链RNA分子或序列表的序列11所示的双链RNA分子。

本发明还保护具有特异DNA片段的干扰载体。所述特异DNA片段为双链，包括DNA片段甲、DNA片段乙和位于所述DNA片段甲和所述DNA片段乙之间的间隔序列；所述DNA片段甲的序列与所述DNA片段乙的序列反向互补；所述DNA片段乙为所述NPY基因或其片段。所述DNA片段乙具体可为序列8自5’末端第6至371位核苷酸所示的双链DNA分子或序列10自5’末端第6至371位核苷酸所示的双链DNA分子。所述干扰载体具体可为如下质粒：骨架载体为pGreen-HY104载体，在骨架载体的不同多克隆位点分别插入了所述DNA片段甲和所述DNA片段乙。所述干扰载体更具体可为如下质粒：骨架载体为pGreen-HY104载体，在所述骨架载体的HindIII和EcoRI酶切位点之间插入了所述DNA片段甲，在骨架载体的SmaI和BamHI酶切位点之间插入了所述DNA片段乙。

以上任一所述的pGreen-HY104载体具体可为序列表的序列14所示的质粒，结构示意图见图6。

本发明发现，抑制NPF基因表达的物质可以用于培育转基因抗虫作物（特别是烟草、棉花、玉米等棉铃虫为害的农作物），其作用机理是通过干扰害虫的取食作用，从而抑制害虫对植物的危害，无污染，不会将有害物质传递到害虫的天敌（通常为益虫）体内，与环境的相容性好，对于农业生产具有重大有益价值。

附图说明

图1为pDNR-LIB载体的结构示意图。

图2为棉铃虫脑组织cDNA文库的菌落PCR鉴定，泳道1-20分别为随机挑取的单克隆。

图3为棉铃虫神经肽NPF基因（包括NPF1和NPF2）的全长扩增产物。

图4为烟夜蛾脑组织cDNA文库的菌落PCR鉴定，泳道1-15分别为随机挑取的单克隆。

图5为烟夜蛾神经肽NPF基因（包括NPF1和NPF2）的全长扩增产物。

图6为pGreen-HY104载体的结构示意图。

图7为HindIII和BamHI双酶切鉴定棉铃虫RNAi干扰载体；泳道1对应酶切后的棉铃虫RNAi载体，泳道2对应pGreen-HY104载体。

图8为HindIII和BamHI双酶切鉴定烟夜蛾RNAi干扰载体；泳道1对应pGreen-HY104载体，泳道2对应酶切后的烟夜蛾RNAi载体。

图9为棉铃虫dsRNA和烟夜蛾dsRNA的琼脂糖凝胶电泳图；泳道1对应棉铃虫dsRNA，泳道2对应烟夜蛾dsRNA。。

图10为实施例5中，在烟草中导入棉铃虫RNAi干扰载体后dsRNA的表达情况；泳道1对应烟草植株1的原叶，泳道2对应烟草植株2的原叶，泳道3对应烟草植株1的新叶，泳道4对应烟草植株2的原叶，泳道M对应分子量标记。

图11为实施例5中棉铃虫对转基因烟草植株的危害情况（实验1）；a：实验组接种棉铃虫24小时后；b：实验组接种棉铃虫48小时后；c：实验组接种棉铃虫72小时后；d：对照组接种棉铃虫24小时后；e：对照组接种棉铃虫48小时后；f：对照组接种棉铃虫72小时后。

图12为实施例5中棉铃虫对转基因烟草的叶片的危害情况（实验2）；a为照片，b为棉铃虫取食叶片的面积。

图13为被棉铃虫进食前的饲料的照片。

图14为被棉铃虫进食后的饲料照片。

图15为实施例6中注射棉铃虫dsRNA后棉铃虫的取食量变化。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

棉铃虫（英文名称为cotton bollworm，拉丁名为Helicoverpa armigera）：提及棉铃虫的文献：A simple and reliable method for discriminating betweenHelicoverpa armigera and Helicoverpa assulta(Lepidoptera:Noctuidae)，Chen, J;Wu,YC;Chen,X;Ji,YJ;Zhang,DX，INSECT SCIENCE）。棉铃虫在中国农业大学昆虫生理生化分子生物学实验室饲养，饲养条件为：温度26℃，光周期为每天16小时光照、8小时黑暗，相对湿度控制在55-65%；2龄后分管单管饲养，玻璃管直径1.5cm、高10cm。

烟夜蛾（英文名称为Tobacco budworms，拉丁名为Helicoverpa assulta）：提及烟夜蛾的文献：A simple and reliable method for discriminating betweenHelicoverpa armigera and Helicoverpa assulta(Lepidoptera:Noctuidae)，Chen, J;Wu,YC;Chen,X;Ji,YJ;Zhang,DX，INSECT SCIENCE）。饲养条件：温度26℃，光周期为每天16小时光照、8小时黑暗，相对湿度控制在55-65%；2龄后分管单管饲养，玻璃管直径1.5cm、高10cm。

pGreen-HY104载体(又称pGreen-GUS-dsRNA)，结构示意图见图6，为序列表的序列14所示的质粒。以pGreen 0229（http://www.pgreen.ac.uk/JIT/JIT_fr.htm）为骨架构建得到的。在XbaI和SacI之间插入CaMV ter序列，在KpnI和XhoI之间插入35s promoter序列，在EcoRI和PstI之间插入GUS基因序列。

农杆菌C58（Agrobacterium tumefaciens C58）：参考文献：Development ofAgrobacterium tumefaciens C58-induced plant tumors and impact on host shootsare controlled by a cascade of jasmonic acid,auxin,cytokinin,ethylene andabscisic acid，Veselov,D;Langhans,M;Hartung,W;Aloni,R;Feussner,I;Gotz,C;Veselova,S;Schlomski,S;Dickler,C;Bachmann,K;Ullrich,CI，PLANTA，216(3):512-522。

烟草NC98(野生型烟草)：Distribution of solanesol in Nicotiana tabacum,ZHAO Chun-jian,ZU Yuan-gang,LI Chun-ying,TIAN Cheng-yu,Journal ofForestry Research,18(1):69–72(2007)。

实施例1、棉铃虫NPF蛋白及其编码基因的获得

一、cDNA文库构建

文库构建使用SMART cDNA Library Construction Kit试剂盒。构建流程如下：取2μL棉铃虫幼虫脑总RNA（约2μg），依次加入1μL SMART IV Oligoncleotide（5’-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTGGCCATTACGGCCGG-3），1μL CDS/3’PCR primer（ATTCTAGAGGCCGAGGCGGCCGACATG-d(T)30N-1N），然后加入2μL无RNase去离子水。轻轻混匀后离心，72℃孵育2min,冰上冷却2min后离心，每管中加入2μL 5x第一链合成Buffer，1μL DTT(20mM)，1μL dNTP混合物(10mM)，1μL MMLV反转录酶，至总体积为10μL。同时做一个阳性对照。轻轻混匀后离心后在PCR仪中42℃孵育1h，在冰上终止第一链的合成，至此第一链合成完成。

在合成第二链的反应中选用LD-PCR法，加入第一链cDNA 2μL，去离子水80μL，10X Advantage 2 PCR Buffer 10μL，50X dNTP Mix 2μL，5'PCR引物（5’-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3’）2μL，CDS III/3'PCR引物2μL，50X Advantage2 Polymerase Mix 2μL，总体积100μL。轻轻混匀后离心，使用以下程序进行反应：95℃1min；95℃15sec、68℃6min，20个循环。

反应结束后，取5μL在1.1%含有EtBr的胶上进行电泳检测。第二链产物合成后需用蛋白酶K进行消化。方法如下：在0.5mL的离心管中加入50μL ds cDNA和2μL蛋白酶K(20μg/μL)，混匀后离心，45℃孵育20min，反应结束后加入50μL去离子水，然后加入100μL酚:氯仿:异戊醇(25:24:1，体积比)进行抽提，14000rpm离心5min后取上清。在上清中加入10μL NaAC(醋酸钠，3M，PH4.8)，1.3μL Glycogen(糖原，20μg/μL)和260μL 95%ETOH（乙醇），室温下迅速14000rpm离心20min，小心弃去上清，加100μL含80%的乙醇洗涤沉淀，沉淀干燥约10min以除去残留的乙醇。加入79μL的去离子水，充分溶解沉淀。

在上述79μL ds cDNA溶液中加入10μL 10X Sfi Buffer，10μL SfiI内切酶和1μL100X BSA，混匀后50℃孵育2hr进行酶切。反应结束后加入2μL 1%二甲苯青染色，然后准备进行ds cDNA片段分离。ds cDNA片段分离使用CHROMA SPIN-400柱子进行，步骤如下：l)在离心管铁架台上放置16个1.5mL离心管；2)将CHROMA SPIN-400柱从4℃冰箱中取出，按以下步骤处理柱子：a）室温放置lh，颠倒数次彻底悬浮胶体，或者打开上盖子用微量枪头轻轻混匀；b)轻轻悬浮胶体(勿产生气泡)，拔掉底盖；c)将柱子水平固定在铁架台上，打开柱子下面封口，使贮存缓冲液自然流下，待流尽后看凝胶体积是否达到1mL，如果没有1mL，在其它柱子中取凝胶补充至1mL；d)柱子流速大约为1滴/40-60s，1滴约为40μL，若流速太低（<1滴/100s）或每滴体积太小（<25μL）必须重复上述步骤进行重新悬浮；3)贮存缓冲液流完后，在柱的中心处加入700μL柱缓冲液，让其流出；4)待柱缓冲液流干后，小心将约100μL经SfiI-酶切的cDNA和二甲苯青混合物加到胶顶部中心部位；5)当样品充分进入胶内时，向柱内加入100μL的柱缓冲液，待柱内凝胶表面液体消失且没有液滴滴下时进行下一步；6)准备好17个1.5mL离心管的架子置于柱子下面，第一个管子置于柱子出口下部；加入600μL的柱缓冲液，立即开始收集，每管35μL(约1滴)，直至收集够全部17管；7)制备1.1%的琼脂糖凝胶，电泳检测17管的收集物，每管用3μL连续在点样孔加样，150V电泳10min；收集6-11管含有cDNA的组分到一个新1.5mL的离心管中；8)依次加入1/10体积NaAC(3M;pH4.8)，1.3μL Glycogen(20mg/mL)，2.5倍体积95%ETOH(-20)℃，充分混匀，-20℃过夜沉淀；9)室温14000rpm离心20min；10)小心弃上清，轻离心，用移液器小心吸去剩余的上清，干燥约10min；11)以7μL无离子水溶解沉淀，轻微混匀，即制备好酶切完成的PCR片段。

将酶切完成的PCR片段与经SfiI酶切的pDNR-LIB载体（结构示意图见图1）连接。连接体系如下：dscDNA 1.0μL、pDNR-LIB载体1.0μL、10X ligation buffer 0.5μL、ATP(10mM)0.5μL、T4 DNA连接酶0.5μL、去离子水1.5μL。

将上述反应后的重组质粒，通过电击转化仪导入大肠杆菌DH5α菌株感受态细胞中。取3份25μL感受态细胞，冰上融化，分别加入上述连接产物，混匀后加入到电转杯中进行电转转化。转化后迅速取出电转杯，加入970μL 37℃预热的SOC培养基，转移到10mL离心管中，37℃震荡培养1hr（200rpm/min）。取培养物涂布在含有30mg/mL氯霉素的平板上，37℃倒置培养过夜。根据菌落生长情况确定适合的连接体系，以此作为原始文库，4℃保存。棉铃虫脑组织cDNA文库的菌落PCR鉴定结果见图2。

二、5'RACE PCR扩增

5'RACE上游引物采用引物SMART cDNA Library Construction Kit中的5'引物（5’-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3’），下游引物采用设计的简并引物（NPF：5’-TTNCCRAANCKNGGNCKIGCIGCYTG-3’，NPY：5’-CCNCKNCCRTGNCCRTGNACNSWRTARTA-3’）。

按照试剂盒说明书操作，反应体系（25L）：LA PCR Buffer（Mg²⁺）2.5μL、dNTPmix（each 10mM）4μL、LA taq 0.25μL、Primer 1（10μmol/L）1μL、Primer 2（10μmol/L）1μL、质粒cDNA文库0.5μL、ddH₂0 11.25μL。

在PCR管中将其混合完毕后，放入PCR仪扩增，反应条件为：94℃3min；94℃30S、65℃→55℃（每个循环降低1℃）、72℃30S，10个循环；94℃30S、54℃30S、72℃30S，30个循环；72℃7min。

反应结束后记性2%琼脂糖凝胶电泳，回收连接克隆后转入大肠杆菌培养，挑菌送样测序。

三、3’RACE快速扩增3’末端

1、cDNA合成

1）将模板RNA在冰上解冻；引物、10×RT mix（其中包含RNasin和DTT）、超纯dNTP混合液、RNase-free ddH2O在室温（15-25℃）解冻，解冻后迅速置于冰上。使用前将每种溶液涡旋振荡混匀，离心以收集残留在管壁的液体。

2）按照下表的逆转录体系配制混合液，彻底混匀，涡旋振荡时间不超过5s。简短离心，并置于冰上，RNA模板请于第4）步加入。

3）如果要做多个逆转录反应，可以将配制好的混合液后分装在单个反应管中，置于冰上。

4）首先取适量的RNA 1μg进行定量，冰浴条件下按照Tiangen（Quant One StepRT-PCR Kit）说明进行以下配置反转录体系：10X RT mix、dNTP混合液（2.5mM each）、dT3AP、Quant Reverse Transcriptase、RNAse-free H₂O、模板RNA（在第4步加入），总体积20μL。

5）将模板RNA（50ng-2μg）加入到混合液中，彻底混匀，涡旋振荡时间不超过5s，离心15s。

6）37℃孵育60min，4℃保存备用。

2、3'RACE扩增

根据cDNA反转录时候3’-dT3AP引物结构，设计3'外引物：3Ap（5’-ATTCTAGAGGCCGAGGCGGCCGACATG-3’）；根据5'RACE扩增并测出的序列信息，设计出一条上游特异性引物SPF（NPF：5’-ATGCTGAACAAGAACATCG-3’，NPY：5’-TGCGTTTCCTCCTACCGGCCATG-3’）。

3'RACE扩增采用两步PCR的方法，即第一步PCR只需在反应体系中加入上游引物，在PCR管中将其混合完毕后，放入PCR仪扩增，通过10个循环的单引物反应，增加目的基因的初始拷贝数，然后再加入下游3AP引物，进行25个左右循环的扩增。

按照试剂盒说明书操作，反应体系（25μL）：LA PCR Buffer（Mg²⁺）2.5μL、dNTPmix（each 10mM）4μL、LA taq 0.25μL、Primer 1（SPF）（10μmol/L）1μL、ddH₂011.75μL。

反应条件：94℃3min；94℃30S、56℃30S、72℃30S，10个循环；4℃温浴，加入下游接头引物3AP；94℃30S、56℃30S、72℃30S，25个循环；72℃7min。

反应结束后进行2%琼脂糖凝胶电泳，回收连接克隆后转入大肠杆菌培养，挑菌送样测序。

四、cDNA全长的扩增

根据NPF5'和3'RACE测序结果设计扩增棉铃虫NPF全长基因序列，上游命名为P1F，下游命名为P1R。

按照试剂盒说明书操作，反应体系（25μL）：LA PCR Buffer（Mg²⁺）2.5μL、dNTPmix（each 10mM）4μL、LA taq 0.25μL、引物P1F（10μmol/L）1μL、引物P1R（10μmol/L）1μL、棉铃虫质粒cDNA文库0.5μL、ddH₂0 11.25μL。

引物P1F：5’-ATGCTGAACAAGAACATCG-3’；

引物P1R：5’-CTGTTGCACTCCTCATCTCCTTCTGG-3’。

反应条件为：94℃3min；94℃30s、65℃→55℃（每个循环降低1℃）30s、72℃30s，10个循环；94℃30s、54℃30s、72℃30s，30个循环；72℃7min。

反应结束进行2%琼脂糖凝胶电泳，回收连接克隆后转入大肠杆菌培养，挑菌送样测序。棉铃虫神经肽NPF基因的全长扩增产物的电泳图见图3。

通过上述实验，发现一个来源于棉铃虫的新基因，该新基因的一种剪辑形式可以编码得到序列表的序列1所示的蛋白质（命名为棉铃虫NPF1蛋白，如序列表的序列1所示），该新基因的另一种剪辑形式可以编码得到序列表的序列3所示的蛋白质（命名为棉铃虫NPF2蛋白，如序列表的序列3所示）。相应的发现了来源于棉铃虫的编码NPF1蛋白的基因，命名为棉铃虫NPF1基因，如序列表的序列2所示（其开放阅读框为序列表的序列2自5’末端第48-293位核苷酸）。相应的发现了来源于棉铃虫的编码NPF2蛋白的基因，命名为棉铃虫NPF2基因，如序列表的序列4所示（其开放阅读框为序列表的序列4自5’末端第48-413位核苷酸）。

实施例2、烟夜蛾NPF蛋白及其编码基因的获得

将烟夜蛾代替棉铃虫进行实施例1，发现一个来源于烟夜蛾的新基因，该新基因的一种剪辑形式同样可以编码得到序列表的序列1所示的蛋白质（将其命名为烟夜蛾NPF1蛋白，序列与棉铃虫NPF1蛋白完全一致），该新基因的另一种剪辑形式可以编码得到序列表的序列6所示的蛋白质（命名为烟夜蛾NPF2蛋白，如序列表的序列6所示）。相应的发现了来源于烟夜蛾的编码NPF1蛋白的基因，命名为烟夜蛾NPF1基因，如序列表的序列5所示（其开放阅读框为序列表的序列5自5’末端第70-315位核苷酸）。相应的发现了来源于烟夜蛾的编码NPF2蛋白的基因，命名为烟夜蛾NPF2基因，如序列表的序列7所示（其开放阅读框为序列表的序列7自5’末端第70-435位核苷酸）。

烟夜蛾脑组织cDNA文库的菌落PCR鉴定结果见图4。

烟夜蛾神经肽NPY基因的全长扩增产物的电泳图见图5。

实施例3、RNAi干扰载体的构建

一、棉铃虫RNAi干扰载体的构建

1、提取5龄棉铃虫幼虫的总RNA并反转录为cDNA，以cDNA为模板，采用NPFFor和NPFRev为模板，采用LA taq作为DNA聚合酶，进行PCR扩增，回收PCR扩增产物。

NPFFor:5’-GCCCGG

ATGCTGAACAAGAACATCG-3’；

NPFRev:5’-CGGATCC

TCATCTCCTTCTGGCGTAC-3’。

NPFFor中，下划线标注限制性内切酶SmaI的酶切识别序列，方框标注限制性内切酶EcoRI的酶切识别序列。NPFRev下划线标注限制性内切酶BamHI的酶切识别序列，方框标注限制性内切酶HindIII的酶切识别序列。

PCR扩增体系：LA PCR Buffer（Mg²⁺）2.5μL、dNTP mix（each 10mM）4μL、LAtaq 0.25μL、NPFFor（10μmol/L）1μL、NPFRev（10μmol/L）1μL、cDNA 1.0μL、ddH₂0 10.75μL。

PCR扩增条件：94℃3min；94℃30s、56℃30s、72℃30s，35个循环；72℃7min；4℃保存。

2、用限制性内切酶SmaI和BamHI双酶切步骤1得到的PCR扩增产物，回收酶切产物。

3、用限制性内切酶SmaI和BamHI双酶切pGreen-HY104载体，回收载体骨架（约6kb）。

4、将步骤2的酶切产物和步骤3的载体骨架连接，得到重组质粒甲。

5、用限制性内切酶HindIII和EcoRI双酶切步骤1得到的的PCR扩增产物，得到酶切产物。

6、用限制性内切酶HindIII和EcoRI双酶切重组质粒甲，回收载体骨架（约6.4kb）。

7、将步骤5的酶切产物和步骤6的载体骨架连接，得到重组质粒乙（又称棉铃虫RNAi干扰载体）。根据测序结果，对重组质粒乙进行结构描述如下：骨架载体为pGreen-HY104载体，在骨架载体的的HindIII和EcoRI酶切位点之间插入了DNA片段甲（即与序列表的序列8自5’末端第6至371位核苷酸反向互补的双链DNA分子），在骨架载体的SmaI和BamHI酶切位点之间插入了DNA片段乙（即序列表的序列8所示的双链DNA分子）。重组质粒乙在宿主内表达后，得到序列表的序列9所示的双链RNA分子。

二、烟夜蛾RNAi干扰载体的构建

1、提取烟夜蛾的总RNA并反转录为cDNA，以cDNA为模板，采用NPFFor和NPFRev为模板，采用LA taq作为DNA聚合酶，进行PCR扩增，回收PCR扩增产物。

NPFFor和NPFRev序列、PCR扩增体系和PCR扩增条件同步骤一的1。

2、用限制性内切酶SmaI和BamHI双酶切步骤1得到的PCR扩增产物，回收酶切产物。

3、用限制性内切酶SmaI和BamHI双酶切pGreen-HY104载体，回收载体骨架（约6kb）。

4、将步骤2的酶切产物和步骤3的载体骨架连接，得到重组质粒丙。

5、用限制性内切酶HindIII和EcoRI双酶切步骤1得到的的PCR扩增产物，得到酶切产物。

6、用限制性内切酶HindIII和EcoRI双酶切重组质粒丙，回收载体骨架（约6.4kb）。

7、将步骤5的酶切产物和步骤6的载体骨架连接，得到重组质粒丁（又称烟夜蛾RNAi干扰载体）。根据测序结果，对重组质粒丁进行结构描述如下：骨架载体为pGreen-HY104载体，在骨架载体的的HindIII和EcoRI酶切位点之间插入了DNA片段丙（即与序列表的序列10自5’末端第6至371位核苷酸反向互补的双链DNA分子），在骨架载体的SmaI和BamHI酶切位点之间插入了DNA片段丁（即序列表的序列10所示的双链DNA分子）。重组质粒丁在宿主内表达后，得到序列表的序列11所示的双链RNA分子。

用限制性内切酶HindIII和BamHI双酶切棉铃虫RNAi干扰载体后的琼脂糖凝胶电泳图见图7，目标序列为约1750bp。用限制性内切酶HindIII和BamHI双酶切烟夜蛾RNAi干扰载体后的琼脂糖凝胶电泳图见图8，目标序列为约1750bp。

实施例4、dsRNA的体外合成

一、设计引物

设计并合成如下引物：

dsNPFtF：5’-TAATACGACTCACTATAGGGAGAATGCTGAACAAGAACATCG-3’；

dsNPFtR：5’-TAATACGACTCACTATAGGGAGACTGTTGCACTCCTCATCTCCTTCTGG-3’；

dsNPFF：5’-ATGCTGAACAAGAACATCG-3’；

dsNPFR：5’-CTGTTGCACTCCTCATCTCCTTCTGG-3’。

dsNPFtF和dsNPFtR中，下划线标注23bp的T7启动子序列。

二、棉铃虫dsRNA的体外合成

1、以实施例3构建的棉铃虫RNAi干扰载体为模板，用dsNPFtF和dsNPFR组成的引物对进行PCR扩增，回收PCR扩增产物。

2、以实施例3构建的棉铃虫RNAi干扰载体为模板，用dsNPFF和dsNPFtR组成的引物对进行PCR扩增，回收PCR扩增产物。

3、采用T7 RiboMAX expression RNAisystem(promega，P1700)，将步骤1的PCR扩增产物和步骤2的PCR扩增产物共同进行体外转录，得到棉铃虫dsRNA（即序列表的序列12所示的双链RNA）。

体外转录体系(T7RiboMax反应体系):RiboMaxTM Express T7 2×buffer10μl，步骤1的PCR扩增产物（正义DNA模板）1μg、步骤2的PCR扩增产物（反义DNA模板）1μg、Enzyme Mix 2μl，用RNase Free水定容至20μl。

RiboMaxTM Express T7 2×buffer、Enzyme Mix、RNase Solution都是T7 RiboMAXexpression RNAisystem的组分。

体外转录过程如下：

（1）将体外转录体系轻轻混匀，置于37℃中温浴2hr-6hr；

（2）温浴结束后将反应液于70℃水浴10min，缓慢降至室温，约20min；

（3）向冷却至室温的反应液中加入1μl RNase Solution(RNase Solution稀释200倍)和1μl RQI RNase-Free DNase，37℃温浴30min；

（4）加入20μl 3M醋酸钠水溶液，50μl 95%乙醇水溶液，冰浴5min；

（5）16，000g离心l0min；

（6）弃上清，用500μl 70%乙醇水溶液洗两次，弃上清，空气中干燥15min，加100μlRNase Free水溶解，置于-70℃超低温冰箱中保存。

三、烟夜蛾dsRNA的体外合成

1、以实施例3构建的烟夜蛾RNAi干扰载体为模板，用dsNPFtF和dsNPFR组成的引物对进行PCR扩增，回收PCR扩增产物。

2、以实施例3构建的烟夜蛾RNAi干扰载体为模板，用dsNPFF和dsNPFtR组成的引物对进行PCR扩增，回收PCR扩增产物。

3、采用T7 RiboMAX expression RNAisystem，将步骤1的PCR扩增产物和步骤2的PCR扩增产物共同进行体外转录，得到烟夜蛾dsRNA（即序列表的序列13所示的双链RNA）。

体外转录体系和体外转录过程同步骤二的3。

棉铃虫dsRNA和烟夜蛾dsRNA的琼脂糖凝胶电泳图见图9。

实施例5、棉铃虫RNAi干扰载体在烟草体内瞬时表达

一、棉铃虫RNAi干扰载体在烟草体内瞬时表达

1、将实施例3构建的棉铃虫RNAi干扰载体导入农杆菌C58，得到重组农杆菌。

2、棉铃虫RNAi干扰载体在烟草体内瞬时表达

（1）将烟草NC98种子播种在灭菌MS基本培养基上，7天后将无菌苗移栽到营养钵中，培养至4-5叶期(培养条件：16小时光照、25℃，8小时黑暗、20℃，培养时间约1个月)。

（2）挑取单个农杆菌菌落，接种至3-5mL YEB液体培养基（含50mg/l卡那霉素），于摇床中28℃、200rpm振荡培养过夜。

（3）取2mL步骤（2）得到的菌液，接种至50mL YEB液体培养基（含50mg/l卡那霉素、50mg/l利福平、10mmol/L MES和20μmol/L乙酰丁香酮），于摇床中28℃、200rpm振荡培养过夜。

（4）取步骤（3）得到的菌液，4℃、4000g离心6min，收集菌体细胞。

（5）用渗透培养液（含10mmol/L MES、200μmol/L乙酰丁香酮、10mM MgCl₂，溶剂为水）重新悬浮步骤（4）得到的菌体细胞，使菌体浓度为OD600=0.5-1.0。

（6）将步骤（5）得到的菌液25℃静置培养3h，即为重组农杆菌菌悬液。

（7）取步骤（1）得到的植株，对顶部叶片以下的两片叶片进行注射，每片叶片的注射方法为：用针头在叶片上背面非常轻微的扎一细小的浅微孔，然后用无针头的注射器吸取2-3mL步骤（6）得到的重组农杆菌菌悬液，从针孔处轻微的注入叶片内。

（8）将完成步骤（7）的植株放回温室，继续进行常规培养(培养条件：16小时光照、25℃，8小时黑暗、20℃)。

二、棉铃虫RNAi干扰载体在烟草体内瞬时表达效果的验证

步骤一的（8）中，于刚完成注射后取用于注射的原叶片部分组织，于完成注射1周后取新长出的叶片，分别提取总RNA并反转录为cDNA，将cDNA作为模板进行PCR鉴定（引物：5’-ATGCTGAACAAGAACATCG-3’；5’-CTGTTGCACTCCTCATCTCCTTCTGG-3’），结果见图10（目标序列为约370bp）。结果表明，步骤（8）的植株均为导入棉铃虫RNAi干扰载体的转基因植株。

三、导入棉铃虫RNAi干扰载体的烟草对棉铃虫的抗性

1、实验1

分别进行实验组和对照组的平行实验：

实验组：步骤一的（8）中，于完成注射2周后取烟草植株（20株），每株烟草上接种一头蜕皮当天的棉铃虫5龄幼虫。

对照组：取野生型烟草植株（20株），每株烟草上接种一头蜕皮当天的棉铃虫5龄幼虫。

每天观察植株上的幼虫为害情况并拍照记录。照片见图11。对于野生型植株来说，接种棉铃虫1至3天后，植株叶片上可见大量因棉铃虫进食造成的虫孔。在植株中导入棉铃虫RNAi干扰载体后，棉铃虫对该植株的为害能力显著降低（植株上基本观察不到棉铃虫进食而呈现的虫孔）。即导入棉铃虫RNAi干扰载体后，植株对棉铃虫的抗性显著增加。

2、实验2

分别进行实验组和对照组的平行实验：

实验组：在每个培养皿中放置1头蜕皮当天的棉铃虫5龄幼虫，每24小时更换放入一片刚采摘的转基因烟草植株的叶片（其中，第一次放入培养皿中的叶片命名为叶片1，24小时后更换的叶片命名为叶片2，依次类推）；转基因烟草植株即步骤一的（8）中，完成注射7天至30天的烟草植株；

对照组：在每个培养皿中放置1头蜕皮当天的棉铃虫5龄幼虫，每24小时更换放入一片刚采摘的野生型烟草植株的叶片（其中，第一次放入培养皿中的叶片命名为叶片1，24小时后更换的叶片命名为叶片2，依次类推）。

叶片分别于放入培养皿前和取出培养皿后用扫描仪扫描叶片大小（分辨率设定为200），用ImageJ软件计算扫描到的叶片面积，并计算幼虫取食叶片的面积。

实验组和对照组的叶片2取出培养皿前的照片见图12a，左图为实验组，右图为对照组。

实验组和对照组棉铃虫取食叶片的面积（单位为cm²）见图12b（进行三次重复实验，每次重复实验中，实验组和对照组各设置5个培养皿进行试验，结果取所有重复实验和重复样本的平均值）。结果表明，接种棉铃虫后，野生型植株叶片被进食的面积显著大于转基因植株叶片被进食的面积，即导入棉铃虫RNAi干扰载体后，植株对棉铃虫的抗性显著增加。

将pGreen-HY104载体代替棉铃虫RNAi干扰载体进行步骤一，然后作为步骤一得到的烟草的平行对照进行步骤三的实验1和实验2，结果均与野生型烟草的结果一致，即导入pGreen-HY104载体不能增加植物对棉铃虫的抗性。

实施例6、注射dsRNA对幼虫取食的影响

饲料的组成：玉米粉300克、大豆粉100g、酵母粉100g、琼脂25g、维生素C 2.5g、维生素B 1.5g、山梨酸2g、柠檬酸2.5g、红霉素半片、水1300ml和丙酸5ml；饲料的照片见图13。

取蜕皮当天的棉铃虫5龄幼虫，应用10μl微量进样器通过体腔注射的方法（先将棉铃虫用CO₂麻醉，然后从腹部倒数第二第三节的节间膜进行注射）将实施例4制备的棉铃虫dsRNA（每头棉铃虫注射10μg棉铃虫dsRNA）导入棉铃虫体内。

实验组的处理方法：体腔注射后将棉铃虫放入装有新鲜饲料的养虫管中进行饲养（每支养虫管加入4g长方形饼状的饲料），每24小时取出饲料，去除饲料中的粪便（粪便为颗粒状，可以较为容易的从饼状饲料中去除，见图14，其中饼状的为饲料，颗粒状的为粪便），然后将饲料称重后放回养虫管。

具体实验方法如下：

1、体重测定

每天定点用电子天平称量并记录每只虫子的体重，记为Ln（以注射当天为第一天，n为注射后的天数），L(n-1)-L(n)，作为一天的体重增长量。

2、幼虫取食量测定

测量试验期间饲料因含水量改变而发生的重量变化，因此设对照组，取相同大小的饲料3块分别放到3个相同的养虫管里，放在与实验中的养虫管相同的环境下；对照组放置和取出饲料的时间与实验组相同；首先称量对照组最初的饲料重量，每24小时后取出饲料并称取重量。

幼虫取食量的计算公式如下：

W为实验组试验开始时加入的饲料的初始重量；

L为实验组某一阶段（如24小时）结束时的饲料重量；

实验第1天（即实验24小时后）棉铃虫的取食量结果见图15（单位为克）。结果表明，注射棉铃虫dsRNA后，棉铃虫取食量显著减少。

Claims (10)

1.一种蛋白质，是如下（a）或（b）或（c）或（d）：

（a）由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

（b）由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

（c）由序列表中序列6所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

（d）将（a）或（b）或（c）氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与昆虫进食量相关的其衍生的蛋白质。

2.编码权利要求1所述蛋白的基因。

3.如权利要求2所述的基因，其特征在于：所述基因是如下1）至10）中任一所述的DNA分子：

1）序列表的序列2自5’末端第48-293位核苷酸所示的DNA分子；

2）序列表的序列4自5’末端第48-413位核苷酸所示的DNA分子；

3）序列表的序列5自5’末端第70-315位核苷酸所示的DNA分子；

4）序列表的序列7自5’末端第70-435位核苷酸所示的DNA分子；

5）序列表的序列2所示的DNA分子；

6）序列表的序列4所示的DNA分子；

7）序列表的序列5所示的DNA分子；

8）序列表的序列7所示的DNA分子；

9）在严格条件下与1）或2）或3）或4）或5）或6）或7）或8）限定的DNA序列杂交且与昆虫进食量相关蛋白的DNA分子；

10）与1）或2）或3）或4）或5）或6）或7）或8）限定的DNA序列具有90%以上同源性且编码与昆虫进食量相关蛋白的DNA分子。

4.含有权利要求2或3所述基因的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。

5.抑制NPF基因表达的物质在如下（e）或（f）中的应用：

（e）培育抗虫转基因植物；

（f）制备抗虫剂；

所述NPF基因为编码如下（a）或（b）或（c）或（d）所述蛋白质的基因：

（a）由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

（b）由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

（c）由序列表中序列6所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

（d）将（a）或（b）或（c）氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与昆虫进食量相关的其衍生的蛋白质。

6.一种培育转基因植物的方法，包括如下步骤：将抑制NPF基因表达的物质导入出发植物，得到对昆虫抗性增强的转基因植物；

所述NPF基因为编码如下（a）或（b）或（c）或（d）所述蛋白质的基因：

（a）由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

（b）由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

（c）由序列表中序列6所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

（d）将（a）或（b）或（c）氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与昆虫进食量相关的其衍生的蛋白质。

7.如权利要求5所述的应用或如权利要求6所述的方法，其特征在于：权利要求5中的所述植物为单子叶植物或双子叶植物，所述抗虫为抗鳞翅目昆虫；权利要求6中的所述出发植物为单子叶植物或双子叶植物，所述昆虫为鳞翅目昆虫。

8.一种抗虫剂，它的活性成分为抑制NPF基因表达的物质；

所述NPF基因为编码如下（a）或（b）或（c）或（d）所述蛋白质的基因：

（a）由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

（b）由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

（c）由序列表中序列6所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

（d）将（a）或（b）或（c）氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与昆虫进食量相关的其衍生的蛋白质。

9.序列表的序列12所示的双链RNA分子、序列表的序列13所示的双链RNA分子、序列表的序列9所示的双链RNA分子或序列表的序列11所示的双链RNA分子。

10.具有特异DNA片段的干扰载体，所述特异DNA片段包括DNA片段甲、DNA片段乙和位于所述DNA片段甲和所述DNA片段乙之间的间隔序列；所述DNA片段甲的序列与所述DNA片段乙的序列反向互补；所述DNA片段乙为NPF基因或其片段；

所述NPF基因为编码如下（a）或（b）或（c）或（d）所述蛋白质的基因：

（a）由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

（b）由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

（c）由序列表中序列6所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

（d）将（a）或（b）或（c）氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与昆虫进食量相关的其衍生的蛋白质。

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