CN103649028A - 抑制FtsZ蛋白的克利斯汀类似物 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了抗微生物的克利斯汀（chrysophaentin）化合物、包含所述克利斯汀化合物的药物组合物、使用所述克利斯汀化合物的方法以及合成所述克利斯汀化合物的方法的实施方式。所述克利斯汀化合物的某些实施方式抑制FtsZ蛋白，从而抑制包括耐药菌株在内的临床相关细菌的生长。

Description

抑制FtsZ蛋白的克利斯汀类似物
与相关申请的交叉引用
本申请要求2011年2月25日提交的美国临时申请号61/446,978的权益，所述临时申请的全部内容通过引用并入本文。
技术领域
本公开总的来说涉及抗微生物的化合物及其使用方法。
背景技术
对于鉴定具有新的作用机制以治疗由多药耐药细菌引起的感染的新的前导化合物，存在着持续的需求。在全世界，传染病是死亡的主导原因，并且据估计，在美国，死于耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）（MRSA）相关感染的人比死于HIV的人更多。此外，据报道，随着感染HIV、接受癌症疗法或使用广谱抗生素治疗的患者数量的增加，侵入性感染的流行程度上升。事实上，在美国，每年有90,000人死于医院获得性细菌感染，这部分是由于临床上重要的细菌已对最终手段的药物例如氟喹诺酮类、万古霉素和碳青霉烯类发生多抗生素耐药性这一事实造成的。发生抗微生物剂耐药性的一个原因是感染性生物体快速适应新环境条件的能力。抗微生物药物的广泛以及有时不适当的使用增强了微生物的先天适应性。
在过去数十年中新的抗微生物剂的缺乏与所报道的耐药细菌感染发生率的增加合在一起，突显出对新抗生素的迫切需求。本文公开了抑制包括耐药菌株在内的数种细菌菌株的生长的新化合物的实施方式。
发明内容
已发现一类新的克利斯汀（chrysophaentin）抗生素。在特定实施方式中，从黄色藻类Chrysophaeum taylori中分离到属于新结构类型的8种新的广谱抗生素克利斯汀1-8。通过深入的2D NMR和MS技术确定了它们的结构，其特征在于存在两个多卤代多氧合的ω,ω'-二芳基丁烯单元，所述单元由两个醚键连接以形成大环天然产物。这些抗生素中效力最强的克利斯汀1抑制临床相关的革兰氏阳性细菌的生长，包括耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）（MIC501.8±0.6μg/mL）和耐万古霉素屎肠球菌（Enterococcus faecium）（MIC502.8±0.8μg/mL）。此外，体外酶测定和透射电子显微术显示，克利斯汀1以6.7±1.7μg/mL的IC50值抑制细菌细胞骨架蛋白FtsZ的GTPase活性，并抑制GTP诱导的FtsZ原丝的形成。饱和转移差异（STD）NMR实验进一步证实了克利斯汀1结合于FtsZ，并且使用GTP-γ-S的NMR竞争实验显示克利斯汀1与GTP竞争性地结合于FtsZ。分子对接显示，克利斯汀1使用与由STD NMR确定的结合表位相一致的表面结合在FtsZ的GTP结合位点中并将其大部分堵塞。
当在本文中使用时，术语“克利斯汀”和“克利斯汀化合物”是指具有通式I、II或III（原始克利斯汀）或通式VII、VIII、IX、X或XI（克利斯汀类似物）的卤代和氧合分子。在某些实例中，所述克利斯汀化合物是抗微生物的化合物。在某些实例中，所述克利斯汀化合物是不具有通式I、II或III和/或不具有化合物1-8的结构式的类似物。
式I、II和III如下所示：
Figure BDA0000398206280000021
其中每个R1独立地是氢、羟基、硫醇、卤素、低级烷基、低级烷氧基或低级烷基酯；并且R2、R3、R4和R5独立地是氢、羟基、硫醇或卤素。在某些实施方式中，每个R1独立地是羟基或低级烷基酯；R2、R3和R4各自独立地是卤素；并且R5是氢或卤素。在特定实施方式中，R1是羟基，R2和R3独立地是氯或溴，R4是氯，并且R5是氢或溴。在某些实施方式中，所述克利斯汀化合物具有与在C.taylori中发现的这些通用结构的抗生素药剂相同的结构。
所公开的克利斯汀化合物的某些实施方式由式IV、V和VI表示，并具有下面示出的取代基组合：
Figure BDA0000398206280000031
克利斯汀1-8的具体实例如上所示。
克利斯汀（包括克利斯汀类似物）的至少某些实施方式在应用于至少一种细菌菌株时具有1至25μg/mL范围内的MIC50。某些实施方式可有效抑制金黄色葡萄球菌、屎肠球菌、枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis）、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）、多药耐药金黄色葡萄球菌（MDRSA）和/或耐万古霉素屎肠球菌的生长。所公开的化合物的实施方式包括药物组合物，其包含药学可接受的载体和治疗有效量的至少一种如本文中公开的式I、II、III、VII、VIII、IX、X和/或XI的化合物或化合物的混合物。
还公开了用于抑制细菌细胞生长的方法的实施方式，所述方法包括将细菌暴露于有效量的组合物，所述组合物包含克利斯汀（包括类似物），例如从海洋生物分离的克利斯汀化合物、克利斯汀化合物的衍生物或其组合。在其他实施方式中，所述化合物或其衍生物是具有式I、II或III的结构的克利斯汀。在其他实施方式中，所述化合物或其衍生物是具有式VII、VIII、IX、X和/或XI的结构的克利斯汀类似物。在其他实施方式中，所述方法还包括将所述细菌暴露于有效量的除了所述克利斯汀（包括类似物）之外的第二药剂，例如通过将所述第二药剂包含在含有所述克利斯汀的组合物中。所述第二药剂可以是抗微生物剂，例如有效对抗革兰氏阴性细菌细胞的抗微生物剂。在某些实施方式中，所述第二药剂提高所述克利斯汀渗透进入所述细菌，从而提高所述组合物的有效性。在某些实施方式中，通过向需要抗微生物治疗的对象施用治疗有效量的所述组合物，来将所述细菌暴露于所述组合物。在某些实施方式中，所述克利斯汀通过抑制细菌细胞分裂蛋白FtsZ来抑制细菌细胞生长。
在某些实施方式中，克利斯汀类似物是通式VII或VIII的化合物
Figure BDA0000398206280000041
其中每个R1独立地是氢、羟基、硫醇、卤素、低级烷基、低级烷氧基或低级烷基酯；R3、R4和R5独立地是氢、羟基、硫醇或卤素；并且每个R6独立地是氧或–CR7R8，其中R7和R8独立地是氢或低级烷基。在某些实施方式中，每个R1是羟基，R2和R4独立地是卤素，R5是氢或卤素，并且每个R6是=CH2。
在某些实施方式中，克利斯汀类似物是通式IX的化合物
Figure BDA0000398206280000051
其中每个R1独立地是氢、羟基、硫醇、卤素、低级烷基、低级烷氧基或低级烷基酯；R2、R4和R5独立地是氢、羟基、硫醇或卤素；并且R9、R10和R11独立地是氢、羟基、硫醇、卤素、低级烷氧基或–B(OH)2。在某些实施方式中，每个R1是羟基，R2和R4独立地是卤素，R5是氢或卤素，并且R9、R10和R11中的至少一个是氢。在特定实施方式中，每个R1是羟基，R2和R4是氯，R5、R9和R10是氢，并且R11是羟基。
在某些实施方式中，克利斯汀类似物是通式X或XI的化合物：
Figure BDA0000398206280000052
其中每个R1独立地是氢、羟基、硫醇、卤素、低级烷基、低级烷氧基或低级烷基酯；R2、R3和R4独立地是氢、羟基、硫醇或卤素；并且X1和Y1独立地是氢、羟基、硫醇、取代的脂族基团、未取代的脂族基团、取代的芳基、未取代的芳基或–OR12，其中R12是取代的脂族基团、未取代的脂族基团、取代的芳基或未取代的芳基，或者X1和Y1一起形成连接环A和C的连接基L。在某些实施方式中，X1和Y1一起形成L，并且L由以下通式表示
Figure BDA0000398206280000061
其中R5是氢、羟基、硫醇或卤素。
根据下面参考附图进行的详细描述，本发明的上述和其他目的、特征和优点将变得更加明显。
附图说明
图1是克利斯汀1的3D模型。
图2是FtsZ在GTP存在下的透射电子显微照片。
图3是FtsZ在GTP和克利斯汀1存在下的透射电子显微照片。
图4示出了与FtsZ复合的克利斯汀1的参比和STD NMR差异谱。
图5是克利斯汀1和GTPγS结合于FtsZ的竞争实验的一系列STDNMR谱。
图6A和6B示出了克利斯汀1与FtsZ的分子对接。
图7A和7B是克利斯汀1抗各种细菌菌株的剂量响应曲线。
图8是吸光度对浓度的图，证实了克利斯汀1抑制FtsZ GTPase活性。
图9是吸光度对时间的图，证实了克利斯汀1不影响微管蛋白聚合。
图10示出了在重组大肠杆菌（E.coli）FtsZ存在下，在含有克利斯汀1的样品上记录到的饱和转移差异NMR谱中观察到的提高百分数。
具体实施方式
I.缩写和术语解释
提供下面的术语解释和缩写是为了更好地描述本公开，并指导本领域普通技术人员实践本公开。当在本文中使用时，“包含”是指“包括”，并且除非上下文明确地另有叙述，否则单数形式包括复数指称物。除非上下文明确地另有指明，否则术语“或”是指所陈述的可选要素中的单个要素或两种以上要素的组合。
除非另有解释，否则在本文中使用的所有技术和科学术语具有与本公开所属领域的普通技术人员所通常理解的相同的含义。尽管与本文所描述的那些方法和材料相似或等同的方法和材料可用于本公开的实践或试验，但下面描述了适合的方法和材料。材料、方法和实施例仅仅是示例性的而不打算是限制性的。从下面的详细描述和权利要求书，本公开的其他特征将显而易见。
除非另有指明，否则在说明书或权利要求书中使用的表示组分、分子量、百分数、温度、时间等的数量的所有数字都应被理解为被术语“约”修饰。因此，除非另有隐含或明确的指示，否则提出的数值参数都是近似值，其可能取决于所寻求的希望的性质和/或在标准试验条件/方法下的检测限。当直接或明确地区分实施方式与讨论的现有技术时，除非使用单词“约”，否则实施方式的数字不是近似值。
缩写：
AcOH：乙酸
AMBER：利用能量修正的辅助建模
amu：原子质量单位
COSY：关联能谱法
DCM：二氯甲烷
EtOAc：乙酸乙酯
EtOH：乙醇
GTP：鸟苷-5'-三磷酸
GTPase：能够结合并水解GTP的酶
HMBC：异核多键相关谱
HR-ESI-MS：高分辨率电喷雾电离质谱术
HRMS：高分辨率质谱术
HSQC：异核单量子相干谱
IC50：引起生物功能或生物化学功能50%抑制的浓度
IR：红外
LC-MS：液相色谱偶联质谱术
MeOH：甲醇
MIC50：抑制50%生物体生长所需的最低浓度
NMR：核磁共振
Oac：乙酸酯
Piv：新戊酰基
ROE：旋转框Overhauser增强谱
ROESY：旋转框NOE（核Overhauser效应）波谱术
STD NMR：饱和转移差异核磁共振
TBAF：四丁基氟化铵
TEM：透射电子显微术
TFA：三氟乙酸
THF：四氢呋喃
TIC：总离子色谱图
术语解释：
提供下面的术语解释以更好地描述本公开的主题内容并指导本领域普通技术人员实践本公开。
所有化合物包括(+)和(-)立体异构体以及任何几何异构体例如Z和E异构体和顺式和反式异构体中的任一种或两者。本文中的其他化学术语按照本领域中的惯常用法使用，正如由《Hawley简明化学字典》（Hawley’s Condensed Chemical Dictionary）,Richard J.Lewis,Sr.主编，John Wiley&Sons,Inc.出版，1997（ISBN0-471-29205-2）所示例的。
脂族基团：基本上基于烃的化合物或其基团（例如C6H13，其是己烷基团），包括烷烃、烯烃、炔烃，包括其环状形式，并且还包括直链和支链排列方式以及所有立体和位置异构体。脂族基团可以是未取代的，或者被一个或多个取代基例如卤素、烷基、烷氧基、羟基、羧基、芳氧基、芳基、芳烷基、杂芳基、氨基、烷基氨基、二烷基氨基或其他官能团取代。
烷基：具有饱和碳链的烃基。链可以是环状、分支或未分支的。该术语的进一步实例是诸如甲基、乙基、正丙基、异丙基、异丁基、叔丁基、戊基和环戊基的基团。烷基可以是未取代的，或者被一个或多个取代基例如卤素、烷基、烷氧基、羟基、羧基、芳氧基、芳基、芳烷基、杂芳基、氨基、烷基氨基、二烷基氨基或其他官能团取代。术语低级烷基是指所述链包含1-10个碳原子。低级烷基也可以是未取代或取代的。
类似物、衍生物或模拟物：类似物是在化学结构上与母体化合物不同的分子，例如同系物（区别在于化学结构的增大，例如烷基链的长度不同），分子片段，区别在于一个或多个官能团、电离的变化的结构。通常利用诸如在Remington（《药学科学与实践》（The Scienceand Practice of Pharmacology），第19版（1995），第28章）中公开的技术，使用定量结构活性关系（QSAR）来发现结构类似物。衍生物是从基本结构衍生而来的生物活性分子。模拟物是模拟另一种分子例如生物活性分子的活性的分子。生物活性分子可以包括模拟化合物的生物活性的化学结构。
抗生素：抑制细菌生长（抑菌）或杀灭细菌（杀菌）的抗微生物剂。一些类型的抗生素由微生物或植物产生，或者从其他天然来源获得。
抗微生物剂：杀灭微生物或抑制其生长的任何试剂。该术语包括杀微生物剂，以及抑制靶微生物例如细菌和真菌的生长或维持其处于平衡状态的试剂。
芳香族或芳基化合物通常是具有交替的单键和双键的不饱和环状烃。苯，一种含有三个双键的6元碳环，是典型的芳香族化合物。芳基化合物和芳基（例如作为较大分子的一部分）可以是未取代的，或者被一个或多个取代基例如卤素、烷基、烷氧基、羟基、羧基、芳氧基、芳基、芳烷基、杂芳基、氨基、烷基氨基、二烷基氨基或其他官能团取代。
生物测定：通过物质对活细胞或组织的效应测量其浓度或效力。
病原体：能够在对象中引起疾病的因素。术语“病原体”通常是指感染性生物体，包括细菌、病毒和真菌。
药学可接受的载体：常规的药学可接受的载体可用于实践本文公开的方法和形成本文公开的组合物。《Remington制药学》（Remington’s Pharmaceutical Sciences），E.W.Martin，Mack PublishingCo.,Easton,PA，第15版，1975描述了适用于本文公开的克利斯汀化合物的药物递送的组合物和制剂的实例。
一般来说，载体的性质取决于所使用的具体施用方式。例如，肠胃外制剂通常包含可注射流体作为介质，所述可注射流体包括药学和生理学可接受的流体例如水、生理盐水、平衡盐溶液、右旋糖水溶液、甘油等。对于固体组合物（例如粉剂、丸剂、片剂或胶囊形式）来说，常规的无毒性固体载体可以包括例如制药级甘露糖醇、乳糖、淀粉或硬脂酸镁。除了生物中性载体之外，待施用的药物组合物可以含有少量无毒性辅助性物质，例如润湿剂或乳化剂、防腐剂和pH缓冲剂等，例如乙酸钠或失水山梨糖醇单月桂酸酯。
保护基团或保护性基团：为了合成有机化合物，某些特定官能团常常不能在所需的试剂或化学环境下幸存。这些基团必须被保护。通过官能团的化学修饰将保护基团或保护性基团引入到分子中，以便在后续化学反应中获得化学选择性。各种示例性的保护基团或保护性基团被公开在Greene的《有机合成中的保护性基团》（Protective Groups inOrganic Synthesis，Peter G.M.Wuts和Theodora W.Greene（2006年10月30日））中，在此将其通过引用并入本文。
对象：经受治疗、观察或实验的动物或人类。
取代基：作为反应的结果代替分子中的另一个原子的原子或原子团。术语“取代基”通常是指代替母体烃链或环上的氢原子的原子或原子团。
取代的：具有与其偶联的通常代替氢原子的取代基的基本化合物例如芳基或脂族化合物，或其基团。例如，取代的芳基化合物或取代基可能具有偶联于芳基基体的闭合环的脂族基团，例如甲苯。同样仅仅是示例而非限制地，长链烃可能具有与其键合的取代基例如一个或多个卤素、芳基、环状基团、杂芳基或杂环基。
治疗有效量：足以在被治疗对象中获得所需效果的特定化合物或组合物的量或浓度。例如，这可以是在对象中预防、抑制、减轻或缓解细菌感染所必需的克利斯汀化合物或组合物的量。化合物或组合物的治疗有效量理想地是足以预防、抑制、减轻或缓解细菌感染而不在非微生物细胞上引起显著的细胞毒性效应的量。然而，克利斯汀化合物或组合物的治疗有效量取决于所治疗的对象、疾病的严重性和治疗性组合物的施用方式。
治疗：对于疾病来说，该术语包括（1）预防疾病，例如在可能暴露于该疾病或易于患有该疾病但尚未经历或表现出该疾病的症状的动物中，使所述疾病的临床症状不发生；（2）抑制疾病，例如阻止疾病或其临床症状的发展；或（3）缓解疾病，例如使疾病或其临床症状消退。
II.FtsZ蛋白
抗微生物药物发现计划中一个相对新的靶点是细菌细胞分裂蛋白FtsZ。该蛋白不仅对于细菌细胞分裂来说是必不可少的，而且它在几乎所有细菌中是高度保守的，这使其成为有吸引力的抗微生物靶点。FtsZ由ftsZ基因编码，其没有在哺乳动物细胞中发现，因此代表了抗微生物剂的特异性靶点。因此，抑制FtsZ的试剂能够特异性影响微生物细胞（例如细菌），而对正进行感染治疗的哺乳动物中的细胞分裂没有不利影响。
大多数原核生物通过二分裂方式分裂，其中一个细胞分裂成两个子代细胞。在杆状细菌（例如大肠杆菌（E.coli）和枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis））的生长期间，在分裂中的细胞的正中央形成隔膜，并随后夹断以产生两个后代细胞。隔膜通过细胞质膜和细胞壁材料在细胞的中心面处从相反方向凹入的向内生长来形成。在细胞分裂的早期阶段中，真核细胞骨架蛋白微管蛋白的结构类似物FtsZ是向分裂点移动的第一种蛋白。FtsZ经历鸟苷5-三磷酸（GTP）依赖性聚合来形成原丝，所述原丝组装成被称为Z-环的动态且能收缩的结构，标记出细胞分裂平面。据认为，Z-环形成用于募集其他关键细胞分裂蛋白的支架。抑制FtsZ的正确组装可以通过防止Z-环形成来阻断细胞分裂，最终导致细菌细胞死亡。
大多数细菌中都存在FtsZ，但是某些缺乏细胞壁的L-型细菌的分裂不需FtsZ。FtsZ也存在于古菌、叶绿体和一些线粒体中。FtsZ可能起到通用的原核分裂蛋白的作用，并且是生殖支原体（Mycoplasmagenetalium）（最小的细菌并具有最小基因组）和更复杂的细菌例如大肠杆菌两者共有的唯一细胞分裂蛋白。
FtsZ能够结合到GTP并表现出GTPase活性。在体内，FtsZ以受GTP调控的方式聚合形成细丝，所述细丝在细胞的纵向正中央或隔膜附近组装成被称为Z-环的环。尽管GTP水解对于细丝形成或分裂来说不是必不可少的，但缺少GTPase结构域的突变体形成扭曲和无序的隔膜，并且细胞分裂不正常（Bi等，Nature,354(3-5):161-164,1991）。尚不清楚FtsZ本身是否提供引起分裂的物理收缩力或者其他蛋白是否引起分裂。然而，据认为，大量辅助性蛋白（例如ZipA、FtsA、FtsW、FtsK和FtsQ）可能参与环组装和Z-环的稳定化，并可能参与分裂事件。
在体外研究中，FtsZ可以组装成原丝、二维片层和原丝环。FtsZ和FtsZ的真核类似物微管蛋白在它们的N-端GTP结合结构域中具有显著的序列同一性，尽管整体序列同一性低于20%（Burns,Nature,391:121-123,1998）。结构比对显示，FtsZ和微管蛋白的N-端结构域在结构上几乎一致（Erickson,Trends in Cell Biology,8:133-137,1998）。
在真核病原体中，细胞分裂是发现用于对抗感染或不受控制的细胞增殖的药物的富有成效的靶点。许多药物靶向微管。由于FtsZ在原核细胞分裂中发挥必不可少的作用，在细菌中广泛保守，并且在高等真核生物的线粒体中不存在，因此它是开发对抗细菌病原体的药物的有吸引力的靶点。尽管近年中鉴定FtsZ的抑制剂的工作快速增加，但该靶点仍然开发不足。据报道抑制FtsZ功能的化合物包括天然产物绿垂毒素（viriditoxin）、桃柘酚、小檗碱、血根碱和肉桂醛，以及合成抑制剂例如PC190723、zantrins和OTBA（3-{5-[4-氧代-2-硫酮基-3-(3-三氟甲基-苯基)-噻唑烷-5-亚基甲基]-呋喃-2-基}-苯甲酸）。
III.克利斯汀
已发现，由于其独特的结构和强的抗微生物活性，海洋生物是寻找新的FtsZ抑制剂的出色来源。已发现，黄色藻类Chrysophaeum taylori的甲醇提取物强烈抑制金黄色葡萄球菌、MRSA、屎肠球菌和耐万古霉素屎肠球菌（VREF）的生长。生物测定和LC-MS指导的分级导致分离到8种新的多卤代多氧合双二芳基丁烯醚大环化合物，其被称为克利斯汀A-H，在后文中分别称为克利斯汀1-8。通过包括NMR和MS在内的深入的波谱学方法确定了它们的平面结构。除了克利斯汀5之外，所述结构的特征在于存在通过两个醚键相连形成大环的两个多卤代多氧合ω,ω'-二芳基丁烯链。克利斯汀5（化合物5）是只含一个连接二芳基丁烯链的醚键的非环状类似物。
在某些实施方式中，克利斯汀是通过用己烷、氯仿和甲醇顺序提取冷冻干燥的Chrysophaeum taylori而获得的克利斯汀抗生素。提取的克利斯汀具有至少针对金黄色葡萄球菌、屎肠球菌和枯草芽孢杆菌的抗细菌活性。
克利斯汀还包括所述化合物的药学可接受的盐。
一些克利斯汀的结构由通式I、II和III表示：
Figure BDA0000398206280000141
其中每个R1独立地是氢、羟基、硫醇、卤素、低级烷基、低级烷氧基或低级烷基酯，并且R2、R3、R4和R5各自独立地是氢、羟基、硫醇或卤素。在某些实施方式中，每个R1独立地是羟基或低级烷基酯；R2、R3和R4各自独立地是卤素；并且R5是氢或卤素。在特定实施方式中，R1是羟基或乙酸酯（CH3COO-），R2和R3独立地是氯或溴，R4是氯，并且R5是氢或溴，或其任何组合或子组合。不受任何特定理论的限制，据认为，式II可能表示式I与III之间的中间体或过渡结构。
克利斯汀的某些实施方式由通式IV、V和VI表示，其中R1、R2、R3和R5独立地选自卤素、羟基或乙酸酯。在特定实施方式中，R1是羟基，R2和R3是氯或溴，并且R5是氢或溴。这类新的抗微生物剂的特定实例被作为化合物1-8示出在下面：
Figure BDA0000398206280000151
从Chrysophaeum taylori分离到具有上面示出的取代基组合的8种克利斯汀（分别为化合物1-8）。此外，通过乙酰化对化合物1进行修饰，以产生合成的克利斯汀（化合物1a，其中Ac=乙酰基-C(O)CH3）。化合物1-8和1a的结构如下所示：
Figure BDA0000398206280000161
测定了克利斯汀的抗微生物活性和结构。所公开的化合物的某些实施方式具有针对至少一些临床相关细菌的抗微生物活性。结构-活性关系表明，当R1是羟基时，化合物具有提高的抗生素活性。此外，芳香环A和C中氯的存在以及醚键相对于B环中烷基取代（即通式I中的11位）的邻位位置，也与更强的抗生素效力相关。
体外结果证实，所公开的化合物的至少一些实施方式抑制FtsZ的GTPase活性和聚合。此外，透射电子显微术、饱和转移差异（STD）NMR实验和分子对接模型表明，某些实施方式能够与GTP竞争相同结合位点而结合于FtsZ。这些结果表明克利斯汀可能通过结合在GTP口袋中来抑制GTP水解，因此干扰细菌细胞分裂的早期阶段。在工作实施方式中，至少一种新的克利斯汀，即克利斯汀1，抑制FtsZ的GTPase和聚合活性。其结合方式也已被确定。
此外，体外结果显示，克利斯汀的至少一些实施方式在抗微生物浓度下不抑制存在于真核生物细胞的微管中的微管蛋白。例如，克利斯汀1在比其抑制FtsZ的IC50值高15倍的浓度下对微管蛋白聚合没有影响。体外试验还证实，所公开的化合物的至少一些实施方式在高达50μg/mL的浓度下不抑制哺乳动物癌细胞系的生长。此外，所公开的化合物的至少一些实施方式在高达100μg/mL的浓度下对对照哺乳动物细胞（BSC-1）不表现出细胞毒性，这提高了它们作为抗细菌药物候选物的潜力。
结果证实，所公开的化合物的某些实施方式能够抑制FtsZ，从而抑制细菌细胞分裂，而不影响真核细胞分裂。因此，所公开的化合物的至少某些实施方式是在施用于需要抗微生物治疗的对象时具有病原体选择性并且无毒性的新的抗生素类型的有希望的候选物。
IV.结构确定
克利斯汀1的HR-ESI-MS给出在m/z675.0154[M-H]-处的分子离子，其与分子式C32H24Cl4O8相符，包括19个不饱和度。通过MS在源实验证实了4个氯原子的存在，在所述实验中通过将锥电压从30eV提高到125eV来诱导片段化。在m/z649[M-H-HCl]-、603[M-H-2HCl]-、567[M-H-3HCl]-和531[M-H-4HCl]-处的片段离子及其相应的同位素模式，清楚地表明不存在4个连续的氯原子。化合物1的IR光谱在3380和1680cm-1处显示出条带，分别暗示存在羟基和芳香族官能团。在MeOH-d4中的化合物1的1H NMR谱的低场区含有8个芳香族质子的信号，包括对应于四取代苯环的在δ6.18(1H,d,J=2.8Hz)和6.30(1H,d,J=2.8Hz)处的两个二重峰，表明存在两个近似等同的质子的在δ6.16(2H,br s)处的宽信号，以及在δ6.179(1H,s)、6.28(1H,s)、6.81(1H,s)和6.84(1H,s)处的4个单峰；以及在δ5.99(1H,t,J=8.7Hz)和6.07(1H,t,J=8.1Hz)处的两个烯属质子的信号。在1的13C NMR谱中观察到32个共振态，并且HSQC谱含有可归因于8个芳香族次甲基碳（δ103.8、107.9、109.1x2、116.0、116.7、117.1和177.3）、4个苯甲基亚甲基信号（δ30.6、30.4、33.7和40.6）以及两个烯属次甲基（δ127.7和127.9）的交叉峰。
化合物1的2D NMR数据（HSQC、HMBC、COSY和ROESY）分析导致鉴定到两个主要片段（I和II）：
Figure BDA0000398206280000181
来自于δ6.16-6.84处的芳香族质子的HSQC和HMBC关联导致构建了4个独立的四取代苯环A-D。环A和C各自在2位和5位处分别具有氯和烷基取代基，并且在1位和4位处具有两个氧取代基。环B和D各自含有3个氧取代基，其中环B表现出邻位耦合的AB型质子信号，环D表现出AA'型信号。然后COSY数据将δ5.99(H-8)处的烯属三重峰关联到δ3.23(2H,d,J=8.7Hz,H-7)处的苯甲基的亚甲基，进而，从这些亚甲基质子到δ116.0(C-6)、126.7(C-5)、150.4(C-4)和134.7(C-9)处的碳共振以及从δ3.39(2H,br s,H-10)处的苯甲基的亚甲基质子到δ107.9(C-12)、133.0(C-11)、135.9(C-16)和127.7(C-8)处的碳共振观察到的诊断HMBC关联，将环A和B通过2-丁烯链相连。通过将δ134.7(C-9)处的去屏蔽季碳指派到氯代烯烃，完成了部分结构I。在亚甲基质子H-7与H-10之间的强ROE的基础上，确定C8/C9双键的几何构型为E。因此，部分结构I的特征在于存在ω,ω'-连接到(E)-2-氯丁-2-烯部分的两个芳基环。
与片段II相对应的2D NMR数据与I的数据非常类似，并表明部分片段II也含有ω,ω'-二芳基烯烃单元。具体来说，从δ3.57(2H,br s,H-10')处的亚甲基质子到δ109.1(C-12'和C-16')处的芳香族碳、到δ134.4(C-9')处的氯代烯属季碳以及到δ127.9(C-8')处的烯属次甲基碳的一组长程关联，将环D如上所示连接到2-丁烯部分。从δ3.28(2H,d,J=7.9Hz,H-7')处的剩余苯甲基的亚甲基到δ116.7(C-6')和150.7(C-4')处的芳香族碳、以及到烯属碳C-8'和C-9'的附加HMBC关联，将环C连接到片段II的剩余部分，并且亚甲基质子H-7'和H-10'之间的ROE表明片段II的C-8'/C-9'双键处的E几何构型（参见表1，实施例1）。
对部分片段I和II的检查，揭示出它们合在一起含有所需的19个不饱和度中的18个，并且24个质子中仅有18个连接于碳。因此，必定存在6个羟基，并且片段I和II必须通过两个醚键相连，以满足1的不饱和指数和分子式。这得到了化合物1的乙酰化的进一步证实，所述乙酰化产生化合物1a的六乙酸酯。
在DMF-d7中记录的化合物1的1H NMR谱，对于δ9.40-10.1处可归因于6个羟基质子的共振来说，显示出出色的线型和分辨率。事实上，来自于这些羟基质子的HMBC和ROESY关联，允许明确地指派羟基和连接片段I和II的醚键的位置。从δ9.90(1H,s,OH-4)处的羟基质子到δ116.1(C-3)、125.6(C-5)和149.7(C-4)处的碳共振以及从δ10.1(1H,s,OH-4')处的羟基共振到δ116.0(C-3')、125.9(C-5')和150.4(C-4')处的碳共振的长程关联显示出，醚键必须分别出现在环A和C中的C-1和C-1'处。类似地，从δ9.41(1H,s,OH-13)和δ9.58(1H,s,OH-15)处的羟基质子到分别对应于C-12–C-14(δC106.7,155.5,103.1)和C-14–C-16(δC103.1,150.7,134.9)的碳的HMBC关联（参见表1，实施例1）提供了它们分别位于C-13和C-15处的明显证据，并将醚键定位于环B中的C-16处。芳香族质子H-12'和H-14'(δ6.25,br s)的化学等同性以及羟基质子OH-13'和OH-15'(δ9.44,s)的化学等同性表明了环D上取代基的对称排列，并将醚键定位在C-14处。这得到了质子OH-13'/OH-15'与δ151.2(C-13'/C-15')和128.6(C-14')处的碳共振之间的HMBC关联的进一步支持。最后，根据ROESY谱指派了片段I和II之间的连接。具体来说，OH-15'和H-6(δ6.39)之间的ROE要求环D的C-14'通过醚键连接到环A的C-1，而H-6'(δ6.51)与亚甲基质子H-10(δ3.57)之间的ROE表明环B和C通过分别在C-16和C-1'处的第二个醚键相连。因此，克利斯汀1的结构被确定为是由通过两个醚键以不对称方式连接的两个ω,ω'-二芳基-2-氯丁-2-烯部分构成的大环二聚体。
为了观察克利斯汀1的构象特征，通过在程序MacroModel中使用AMBER力场，在不同温度（300K、500K、700K/50ns）下进行分子动力学计算，对克利斯汀1的构象空间进行全面探查，来构建3D模型。使用Polak-Ribier共轭梯度（PRCG）算法对每个得到的构象进行最小化。整体最低能量构象异构体被示出在图1中，其中观察到的质子间距离与ROESY数据符合良好。具体来说，在质子之间测量到的距离H-6/H-10（2.5
Figure BDA0000398206280000201
）、H-10/H-12（2.8
Figure BDA0000398206280000202
）、H-6'/H-8'（2.6
Figure BDA0000398206280000203
）、H-7'/H-10'（2.3
Figure BDA0000398206280000204
）和H-7/H-10（3.2
Figure BDA0000398206280000205
）与每个这些质子对所观察到的强ROE相一致。
HR-ESI-MS和MS在源实验显示，克利斯汀2（化合物2）和克利斯汀3（化合物3）具有相同的分子式C32H24BrCl3O8（m/z718.9655[M-H]-和718.9650[M-H]-），而克利斯汀4（化合物4）的分子式被指派为C32H24Br2Cl2O8（m/z762.9168[M-H]-）。化合物2-4的2D NMR数据（HSQC、HMBC、COSY和ROESY）几乎可以与化合物1的数据重叠。1D和2D NMR数据的分析显示，化合物2和3是化合物1的2-和2'-溴代类似物，而化合物4被显示为是2,2'-二溴代类似物。
克利斯汀5（化合物5）的HR-ESI-MS显示出在m/z677.0317[M-H]-处的假分子离子峰，其对应于与分子式C32H26Cl4O8（C32H25Cl4O8的计算值为677.0304），与化合物1的差别在于添加了两个氢原子，并包括18个不饱和度，或者比化合物1低1个。在MeOH-d4中的化合物5的1H NMR谱（参见表4，实施例1）显示出对应于4个苯甲基亚甲基的在δ3.32(2H,d,J=7.9Hz)、3.41(2H,d,J=7.8Hz)、3.52(2H,br s)和3.69(2H,br s)处的信号，以及在δ5.88(1H,t,J=7.9Hz)和5.73(1H,t,J=7.9Hz)处的两个烯属三重峰，表明存在两组2-丁烯链。1H NMR谱的芳香族区域还揭示出在δ6.44(1H,s)、6.70(1H,s)、6.74(1H,s)和6.84(1H,s)处的4个低场单峰，对应于1,3,5-三取代苯环的在δ6.13(1H,d,J=1.8Hz)和6.16(2H,d,J=1.8Hz)处的属于AA'B自旋系统的3个间位耦合的质子，以及对应于对称四取代环的在δ6.41(2H,s)处的属于AA'自旋系统的两个单峰质子。化合物5的2D NMR数据与两组ω,ω'-连接到(E)-2-氯丁-2-烯链的两个芳基环相一致，并与化合物1的数据非常类似；然而，在环B和C的质子和碳的化学位移上存在一些显著差异。最显著的差异出现在C-16（环B）处，其中化合物1中的氧合取代在化合物5中不存在。此外，在DMF-d7中的化合物5的1H NMR谱显示出对应于7个羟基质子（比1多一个）的在δ9.34(2H,s)、9.52(1H,s)、9.55(1H,s)、9.60(2H,s)和9.82(1H,s)处的信号。这些数据合在一起表明，化合物5中的两个二芳基烯烃部分仅通过一个醚键相连。最后，羟基化质子的HMBC关联将7个羟基定位于C-4、C-13、C-15、C-1'、C-4'、C-13'和C-15'处，从而证明必定存在将环A中的C-1连接到环D中的C-14'的醚键，完成了克利斯汀5的结构。因此，克利斯汀5是具有1-14'醚键的非环状双二芳基丁烯。
从LC-MS获得的总离子色谱图（TIC）还含有化合物6-7，其具有与化合物1-3相同的质量，但是以明显更长的保留时间洗脱。在这组化合物中，克利斯汀6在克利斯汀1之后从C-12HPLC柱洗脱（化合物1tR=28.0min；化合物6tR=41.3min），其分子式经HR-ESI-MS测定为C32H24Cl4O8（675.0140[M-H]-，C32H23Cl4O8的计算值为675.0147），表明化合物6是化合物1的异构体。化合物6的1H NMR和HSQC谱显示出单个ω,ω'-二芳基丁烯部分的特征性信号，包括两个苯甲基亚甲基（δH3.35,δC31.0;δH3.54,δC39.8），一个烯属三重峰（δH5.89,δC127.2）和4个芳香族单峰（δH6.23，δC110.0x2；δH6.42，δC115.1；δH6.90，δC117.3）。此外，HMBC和COSY实验导致鉴定到2-氯丁-2-烯部分在1位中连接到2-氯-5-烷基苯-1,4-二醇并在4位中连接到5-烷基苯-1,2,3-三醇。总的来说，这些NMR数据仅仅解释了化合物6的分子式的一半，表明克利斯汀6是包含通过两个醚键相连的两个相同的二芳基烯烃的对称二聚体。因此，2D NMR数据清楚地确定，克利斯汀6的结构在环B中的醚键的位置方面与化合物1不同。在克利斯汀6中，醚键相对于烷基是对位的，而在克利斯汀1中它是邻位的。从显示出H-6与C-14'之间的关联的HMBC实验（4JCH=2Hz）证实了连接。最后，在亚甲基H-7与H-10之间观察到的ROE关联的基础上，确定了C-8/C-9处的双键的几何构型为E。因此，克利斯汀6的结构被确定为是对称的大环醚化合物6。
克利斯汀7（化合物7）在m/z718.9620[M-H]-处显示出主离子峰，其对应于分子式C32H24BrCl3O8，并且与化合物6的分子式的差异在于用溴原子替换氯。随后，化合物7的2D NMR数据与化合物6的数据的比较确定了，溴原子位于C-2'位置处。克利斯汀8（化合物8）是该组抗生素中最疏水的化合物，以比化合物6甚至更长的保留时间从C-12HPLC柱上洗脱（化合物6tR=41.3min；化合物8tR=50.5min）。它的分子式被指派为C32H23BrCl4O8（HR-ESI-MS m/z752.9255[M-H]-），比化合物6高78amu。化合物8的2D NMR数据分析确定了克利斯汀8是化合物6的12'-溴衍生物。
V.抗微生物活性和结构-活性关系
使用固体琼脂板扩散和微量肉汤稀释测定法来评估化合物1、六乙酸酯1a和4-8对临床相关的革兰氏阳性病原体的抗微生物活性，所述革兰氏阳性病原体包括药物敏感细菌金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）和屎肠球菌以及耐药菌株耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（S.aureus）（MRSA）、多药耐药金黄色葡萄球菌（MDRSA）和耐万古霉素屎肠球菌（VREF）（参见表7，实施例2）。初始的板稀释测定法显示，化合物1、4-6和8在2-25μg/板范围内的载量下抑制所有菌株的生长。在两种测定形式中，克利斯汀1（化合物1）是最有效的抗生素，其针对金黄色葡萄球菌、MRSA和多药耐药金黄色葡萄球菌（MDRSA）的相应的最低抑制浓度（MIC50）分别为1.8±0.6、1.5±0.7μg/mL和1.3±0.4μg/mL；在微量肉汤稀释测定法中对屎肠球菌和VREF的最低抑制浓度为3.8±1.9和2.9±0.8μg/mL；并且在2μg/板浓度下对金黄色葡萄球菌、MRSA、屎肠球菌和VREF的抑制区为10mm。克利斯汀6和8（化合物6和8）是第二有效的化合物，对金黄色葡萄球菌和MRSA的MIC50值为4-6μg/mL，对VREF的MIC50值为～9.5μg/mL（参见表7，实施例2）。
这些筛选结果为克利斯汀的结构-活性关系提供了了解。克利斯汀1的六乙酸酯衍生物（化合物1a）在高达25μg/板的载量下无活性，表明羟基在化合物1的抗微生物活性中具有显著作用。克利斯汀4与克利斯汀1相比较弱的效力表明，苯环A和C上的氯影响抗微生物活性，因为用溴替换导致对所有4种菌株的MIC50值降低约12倍。还发现非环状代谢物克利斯汀5在高达25μg/mL的浓度下对屎肠球菌和VREF无活性，并且当与氯代环状双二芳基丁烯醚化合物1和6相比时，对金黄色葡萄球菌和MRSA显示出显著更高的MIC50值，表明大环结构有助于增强抗微生物效能。在对称连接的二聚体6和7之间，四氯化合物6的效力比化合物7高至少3倍，其差异仅在于将环C上的氯原子用溴替换。对于两个二芳基丁烯醚单元的相应排列来说，四氯代大环1和6的抗细菌活性的比较显示，克利斯汀1的效力比克利斯汀6高3-5倍，表明醚键相对于2-丁烯单元的位置影响活性。具体来说，邻位连接的克利斯汀1的效力比对位连接的克利斯汀6高。
为了评估作为抗微生物剂的特异性，评估了克利斯汀1对人类结肠肿瘤细胞系HCT-116、鼠类白血病细胞系P388和对照哺乳动物细胞系BSC-1的细胞毒性。有趣的是，克利斯汀1在高达50μg/mL的浓度下不抑制任何肿瘤细胞系的生长，并且在高达100μg/mL的浓度下对对照细胞不显示出细胞毒性。这些结果表明抗微生物（例如抗细菌）活性的特异性和有益的治疗指数。
VI.FtsZ抑制剂的筛选测定法
细菌细胞骨架蛋白FtsZ是在细菌细胞分裂中发挥核心作用的GTPase。在复制时，FtsZ定位于细胞中央并经历GTP依赖性聚合，以形成被称为Z环的动态且能收缩的结构，其标记出将来细胞分裂的平面。抑制FtsZ的正确组装可以通过防止Z环形成来阻断细胞分裂，最终导致细菌细胞死亡。适用于筛选化合物的FtsZ抑制活性的测定法包括测量在FtsZ介导的GTP水解成GDP+Pi后的无机磷酸盐的产生的体外比色测定法，以及体外GTP依赖性聚合的透射电子显微术可视化。
测试了克利斯汀1在体外抑制重组FtsZ的能力。GTPase测定法证实克利斯汀1以剂量依赖性方式抑制FtsZ的GTPase活性，其IC50值为6.7±1.7μg/mL（实施例3和图8）。
利用透射电子显微术来观察化合物1对FtsZ的GTP依赖性聚合的影响（实施例3和图2-3）。在添加GTP（1mM）后，FtsZ（6μM）经历聚合以形成如图2中示出的原丝网络。相反，在50μM克利斯汀1存在下（图3），聚合被抑制。在观察整个格栅后，没有看到单一原丝；相反，观察到未聚合的FtsZ的小的蛋白聚集体。因此，在添加GTP之前将FtsZ与化合物1温育，完全抑制了聚合和原丝形成。然而，在高达150μM的浓度下，化合物1对微管蛋白聚合没有影响（实施例3和图9）。这些结果合在一起证实了克利斯汀1是一种新的FtsZ抑制剂，其对FtsZ表现出相对于微管蛋白至少15倍的选择性。
有趣的是，克利斯汀1抑制多种细菌菌株的生长，其MIC50值比在GTPase测定法中观察到的体外IC50值明显更低。这种现象已在其他FtsZ抑制剂中观察到。由于Z环的形成是细菌细胞分裂中的初始步骤，因此这种差异活性已被归因于抑制FtsZ聚合的效应的放大。在微管抑制剂中观察到类似效应，其中为了在体外抑制微管蛋白聚合需要微摩尔浓度，而在体内，纳摩尔浓度即可破坏微管组装（Jordan等，Nat.Rev.Cancer,4:253,2004）。
VII.通过STD NMR对克利斯汀1与FtsZ的结合进行表征
为了鉴定克利斯汀1参与FtsZ结合的区域，记录了在重组FtsZ存在下化合物1的饱和转移差异（STD）NMR谱。样品通常含有相对于FtsZ过量100倍的克利斯汀1，其相应浓度为15μM和1.5mM。
代表性差异谱（A）和对照谱（B）的扩展被示出在图4中，以包含化合物1的强烈增强并且不重叠的芳香族和烯属质子。差异谱A中强度最大的信号（δ6.85）向参比谱B中的相应信号的归一化，显示出芳香族质子H-3（100%）、H-14（100%）、H-12（100%）和H-3'（98%）的信号表现出最强增强，同时芳香族和烯属质子H-6'和H-8的重叠信号显示出～50%的合并增强。因此，当结合于FtsZ时，克利斯汀1的展示出质子H-3、H-14、H-12和H-3'的面（环A、B和C）与蛋白最为接近。在用于制备复合物的缓冲条件下，在1H或STD NMR谱中没有观察到位于环D上的剩余两个芳香族质子H-12’和H-14’的信号。
VIII.克利斯汀1结合在FtsZ的GTP结合位点中并与GTP竞争所述位点
在迄今为止报道的那些FtsZ抑制剂中，GTPase活性和/或聚合的抑制可以通过多种与FtsZ结合的方式来进行。为了理解克利斯汀1与FtsZ的结合方式，进行了竞争STD NMR实验。向克利斯汀1:FtsZ的100:1的复合物添加逐渐增加量的不可水解的GTP类似物鸟苷5'-O-3-硫代三磷酸（GTPγS），已知所述类似物以高亲和性结合于FtsZ的GTP结合位点。在含有1.25mM化合物1并存在12.5μM FtsZ的样品上记录波谱（图5）。监测差异谱以寻找滴定期间属于克利斯汀1或GTPγS的信号的强度变化。谱A是在FtsZ（12.5μM）存在下克利斯汀1（1.25mM）的扩展1H STD NMR谱。正如在示出了差异谱（谱B）的芳香族和烯属区域的波谱扩展中所看到的，添加0.5当量的GTPγS（625μM）导致属于化合物1的信号的强度均匀降低～50%。此外，在δ5.84（H-1'-GTPγS）处出现新的STD NMR信号，其被指派给GTPγS的核糖的异头质子（谱B）。向复合物逐步添加另外2当量GTPγS（分别为谱C和D）进一步降低化合物1的信号强度，同时GTPγS的异头和鸟苷质子H-1’GTPγS和H-8GTPγS的信号强度稳定增加。正如在谱E中看到的，在相对于化合物1添加3当量GTPγS后，天然产物的信号难以察觉，并且已被GTPγS的信号代替。因此，显示出克利斯汀1和GTPγS以竞争性方式结合FtsZ的GTP结合位点。
已经解析了与GTPγS或GDP复合的FtsZ的数种晶体结构，提供了GTP结合位点的详细视图，所述结合位点位于N-端结构域中，并包括形成大部分核苷酸结合位点的保守基序GGGTGTG。为了进一步评估化合物1与FtsZ结合的方式，使用Autodock Vina1.0.3程序进行了分子对接研究。由于大肠杆菌FtsZ的晶体结构不可用，因此使用表现出与大肠杆菌FtsZ最高度保守的铜绿假单胞菌（Pseudomonasaeruginosa）FtsZ的2.1
Figure BDA0000398206280000261
晶体结构作为模板来产生同源性模型。分两步进行对接模拟，首先将整个蛋白定义为靶点，其中所有合理的对接模型显示化合物1结合在GTP结合位点中或结合在与其非常接近的位置处，然后将格栅搜索缩小到GTP结合位点。为了充分评估这些计算的质量和观察到的结合方式，我们进行了25次对接运行，其中大部分结果显示化合物1结合到FtsZ的GTP结合位点中。此外，能量第四低的结合模型（-6.6kcal/mol，整体最低能量的结合方式为-7.0kcal/mol）所观察到的对接构象和蛋白质-配体相互作用与STD NMR结果完全一致。
如图6A和6B中所示，化合物1与FtsZ的分子对接表明克利斯汀1结合到FtsZ的GTP结合位点中。图6A示出了结合于大肠杆菌FtsZ同源性模型的化合物1的对接模型；FtsZ被显示为白色表面，其表面残基位于化合物1灰色阴影的5之内；克利斯汀1被示出为球棍图，其中氯原子（灰色）位于G19、G107附近，就在字母“D”的左边和分子的最下方左侧部分中。其余的灰色原子表示氧原子。显示出最强增强的质子用斜体字标出。
图6B示出了图6A中示出的对接模型与结合于用于产生大肠杆菌同源性模型的铜绿假单胞菌FtsZ（蛋白质数据库登记号1ofu.pdb）的GDP的重叠。GDP（深灰色并在克利斯汀1下方）显示成球棍图，并且包含FtsZ的GTP结合位点的残基表面在图6B上在重叠的虚线下方。使用Autodock Vina1.0.3程序来进行对接。在这种对接模型中，克利斯汀1占据GTP结合位点的三磷酸区域，并且也部分阻隔了鸟嘌呤结合位点。对接模型将化合物1置于Arg142、Gly20、Ala70、Asn43、Thr108和Asn24的侧链或骨架N和O原子的氢键键合距离之内。此外，表现出最强STD增强（100%）的质子H-3、H-14和H-12分别位于Arg142（2.9
Figure BDA0000398206280000272
）、Thr108（2.4
Figure BDA0000398206280000273
）和Ala48（2.2
Figure BDA0000398206280000274
）的范德华距离之内；同时环C的H-3'（98%增强）紧密相邻于Gly20（3.5
Figure BDA0000398206280000275
）和Gly21（3.7
Figure BDA0000398206280000276
）。对于烯属质子H-8与Gly71（3.5
Figure BDA0000398206280000277
）和H-8'与Ala48（2.2
Figure BDA0000398206280000278
），也观察到疏水相互作用。最后，表现出弱得多的增强（～50%）的芳香族质子H-6和H-6'位于距蛋白质表面4.5
Figure BDA0000398206280000279
或更远的位置处，表明对FtsZ结合的贡献较低。
当与x-射线结构已被解析的FtsZ序列比对时，在大肠杆菌模型中与克利斯汀1发生接触的所有残基都位于GTP结合位点内，并预计将形成GTP结合位点的一部分。例如，序列比对指示Gly20、Gly21和Asn24参与基本识别，Asn43、Ala48、Ala70和Thr108参与磷酸结合，并且Arg142有助于核糖识别。这些结果支持克利斯汀1通过以与GTP竞争的方式结合于核苷酸结合位点来抑制FtsZ的GTPase活性和聚合的理论。
IX.通式I、II和III的克利斯汀类似物
在某些实施方式中，前导化合物I、II或III的克利斯汀类似物能够有效地抑制FtsZ蛋白。例如，类似物可以具有结构VII或VIII的通式
Figure BDA0000398206280000281
其中每个R1独立地是氢、羟基、硫醇、卤素、低级烷基、低级烷氧基或低级烷基酯；R3、R4和R5独立地是氢、羟基、硫醇或卤素；并且每个R6独立地是氧或–CR7R8，其中R7和R8独立地是氢或低级烷基。在某些实施方式中，每个R1是羟基，R2和R4独立地是卤素，R5是氢或卤素，并且每个R6是=CH2。
在某些实施方式中，类似物具有结构IX的通式
Figure BDA0000398206280000291
其中每个R1独立地是氢、羟基、硫醇、卤素、低级烷基、低级烷氧基或低级烷基酯；R2、R4和R5独立地是氢、羟基、硫醇或卤素；并且R9、R10和R11独立地是氢、羟基、硫醇、卤素、低级烷氧基或–B(OH)2。在某些实施方式中，每个R1是羟基，R2和R4独立地是卤素，R5是氢或卤素，并且R9、R10和R11中的至少一个是氢。在特定实施方式中，每个R1是羟基，R2和R4是氯，R5、R9和R10是氢，并且R11是羟基。
在某些实施方式中，类似物具有结构X或XI的通式：
Figure BDA0000398206280000292
其中每个R1独立地是氢、羟基、硫醇、卤素、低级烷基、低级烷氧基或低级烷基酯；R2、R3和R4独立地是氢、羟基、硫醇或卤素；并且X1和Y1独立地是氢、羟基、硫醇、取代的脂族基团、未取代的脂族基团、取代的芳基、未取代的芳基或–OR12，其中R12是取代的脂族基团、未取代的脂族基团、取代的芳基或未取代的芳基，或者X1和Y1一起形成连接环A和C的连接基L。在某些实施方式中，每个R1是羟基，并且每个R2和R4独立地是卤素。在特定实施方式中，每个R1是羟基，每个R2和R4独立地是氯或溴，并且X1和Y1一起形成下式的连接基L
其中R5是氢、羟基、硫醇或卤素。
在某些实施方式中，通式VII、VIII、IX、X和/或XI的类似物不是化合物1-8。在其他实施方式中，通式VII、VIII、IX、X和/或XI的类似物不是由通式I、II和/或III定义的克利斯汀。
X.合成
在某些实施方式中，合成了通式I、II、III、VII、VIII、IX、X或XI的克利斯汀化合物。在某些实施方式中，可以通过制备通式VII、VIII或IX的类似物，并将所述类似物二聚化以产生式I、II或III的克利斯汀，来合成式I、II或III的克利斯汀。在某些实施方式中，所述类似物被氧化二聚化以产生式I、II或III的克利斯汀。在其他实施方式中，可以通过制备通式X或XI的类似物来合成式I、II或III的克利斯汀，其中X1和Y1一起形成如上所述的连接基L。
按照下面的通用方法合成了通式IX的克利斯汀，其中R1是羟基，R2和R4独立地是卤素，并且R9、R10和R11是氢。在工作例（实施例5）中，合成了通式IX的克利斯汀，其中R1是羟基，R2和R4是氯，并且R9、R10和R11是氢。
在某些实施方式中，从两种可商购的起始化合物来合成通式IX的克利斯汀：2-卤代-1,4-二甲氧基苯，其中卤素对应于克利斯汀中的R2，以及3,5-甲氧基苯甲酸。在第一程序中，将2-卤代-1,4-二甲氧基苯转变成1-(卤代甲基)-4-卤代-2,5-二甲氧基苯。在第二程序中，将3,5-甲氧基苯甲酸转变成(E)-5-(2-卤代-3-碘烯丙基)-1,3-亚苯基双(2,2-二甲基丙酸酯)，其中卤素对应于克利斯汀中的R4。然后将1-(卤代甲基)-4-卤代-2,5-二甲氧基苯与(E)-5-(2-卤代-3-碘烯丙基)-1,3-亚苯基双(2,2-二甲基丙酸酯)反应，以形成(E)-5-(2-卤代-4-(4-卤代-2,5-二甲氧基苯基)丁-2-烯基)-1,3-亚苯基双(2,2-二甲基丙酸酯)，其随后被去甲基化以产生克利斯汀。
如下所述将2-卤代-1,4-二甲氧基苯转变成1-(卤代甲基)-4-卤代-2,5-二甲氧基苯：首先将2-卤代-1,4-二甲氧基苯羰基化以产生4-卤代-2,5-二甲氧基苯甲醛。羰基化例如可以通过将2-卤代-1,4-二甲氧基苯与六亚甲基四胺和三氟乙酸在有效温度下加热足够长的时间来进行。在一种实施方式中，反应在95℃下加热5小时。然后将4-卤代-2,5-二甲氧基苯甲醛还原以产生(4-卤代-2,5-二甲氧基苯基)甲醇。适合的还原剂包括在乙醇中的金属氢化物例如硼氢化钠。在一种实施方式中，反应在室温下进行6小时。然后将(4-卤代-2,5-二甲氧基苯基)甲醇与无机酸（即HBr、HCl或HI）反应，以产生1-(卤代甲基)-4-卤代-2,5-二甲氧基苯。在一种实施方式中，使用HBr来产生1-(溴甲基)-4-卤代-2,5-二甲氧基苯。
如下所述将3,5-甲氧基苯甲酸转变成(E)-5-(2-卤代-3-碘烯丙基)-1,3-亚苯基双(2,2-二甲基丙酸酯)：首先将3,5-甲氧基苯甲酸还原以产生3,5-二甲氧基苯甲醇。适合的还原剂包括金属氢化物例如氢化铝锂。在一种实施方式中，还原在四氢呋喃中进行；反应在0℃下开始，然后允许升温至室温并进行5小时。然后将醇溴化以产生3,5-二甲氧基苯甲基溴。适合的溴化剂包括三溴化磷。在一种实施方式中，使用二氯甲烷中的PBr3来进行溴化；反应在0℃下开始，然后允许升温至室温并进行3小时。通过与乙炔基三甲基硅烷反应，将3,5-二甲氧基苯甲基溴的溴用炔基替换，以形成(3-(3,5-二甲氧基苯基)丙-1-炔基)三甲基硅烷。在一种实施方式中，反应如下进行：首先将乙炔基三甲基硅烷和乙基溴化镁在四氢呋喃中合并；在室温下30分钟后，加入溴化铜(I)，然后加入3,5-二甲氧基苯甲基溴，并允许反应在回流下进行20小时。接下来，将(3-(3,5-二甲氧基苯基)丙-1-炔基)三甲基硅烷脱甲硅烷基化以产生1,3-二甲氧基-5-(丙-2-炔基)苯。适合的脱甲硅烷基化剂包括四丁基氟化铵。在一种实施方式中，使用四丁基氟化铵在四氢呋喃/乙酸中、在室温下进行反应25小时。然后通过添加保护基团来保护甲氧基，以产生5-(丙-2-炔基)-1,3-亚苯基双(2,2-二甲基丙酸酯)。在一种实施方式中，保护基团是通过将1,3-二甲氧基-5-(丙-2-炔基)苯与三溴化硼反应、然后与新戊酰氯反应而添加的新戊酰基。具体来说，将1,3-二甲氧基-5-(丙-2-炔基)苯与BBr3在二氯甲烷中反应；反应在0℃下开始，允许其在室温下进行16小时，然后用碳酸氢钠淬灭。将得到的产物干燥，溶解在二氯甲烷和三乙胺中，并与新戊酰氯在室温下反应1.5小时。最后，将5-(丙-2-炔基)-1,3-亚苯基双(2,2-二甲基丙酸酯)卤化以产生(E)-5-(2-卤代-3-碘烯丙基)-1,3-亚苯基双(2,2-二甲基丙酸酯)，其中卤素对应于克利斯汀中的R4。在一种实施方式中，通过将起始材料与一氯化碘在二氯甲烷中反应来形成2-氯代化合物；反应在0℃下开始，然后允许升温至室温并进行3小时。
为了完成合成，将1-(卤代甲基)-4-卤代-2,5-二甲氧基苯与(E)-5-(2-卤代-3-碘烯丙基)-1,3-亚苯基双(2,2-二甲基丙酸酯)反应，通过Negishi偶联产生(E)-5-(2-卤代-4-(4-卤代-2,5-二甲氧基苯基)丁-2-烯基)-1,3-亚苯基双(2,2-二甲基丙酸酯)。Negishi偶联通过有机锌化合物、有机卤化物（例如有机三氟甲磺酸酯和酰氧基也是适合的，如果有机基团是烯基、芳基、烯丙基、炔基或炔丙基的话）和镍或钯催化剂的反应，产生碳-碳共价键。钯催化剂一般是优选的。在一种实施方式中，将1-(卤代甲基)-4-卤代-2,5-二甲氧基苯与锌和催化量的碘在二甲基甲酰胺中反应，以产生有机锌化合物。通过将乙酸钯(II)与三邻甲苯基膦在二甲基甲酰胺中合并来制备催化剂。将(E)-5-(2-卤代-3-碘烯丙基)-1,3-亚苯基双(2,2-二甲基丙酸酯)与钯和膦配体合并，并加入有机锌化合物。将得到的溶液加热至120℃2分钟，加入另外的乙酸钯(II)，并将溶液再次加热。在最后步骤中，将(E)-5-(2-卤代-4-(4-卤代-2,5-二甲氧基苯基)丁-2-烯基)-1,3-亚苯基双(2,2-二甲基丙酸酯)去甲基化以产生克利斯汀。适合的去甲基化剂包括三溴化硼、氯化铝、吡啶·HCl、异丙基硫化锂（LiS(CH(CH3)2)）和氯化锂。在一种实施方式中，使用BBr3在二氯甲烷中进行去甲基化；反应在0℃下开始，然后允许升温至室温并进行18小时。
如实施例5中所述合成了两种式IX的克利斯汀化合物。
Figure BDA0000398206280000331
体外结果（实施例6）证实了两种化合物显示出针对至少一些临床相关细菌的抗微生物活性。两种化合物也显示出FtsZ的体外抑制。
XI.盐
通式I、II、III、VII、VIII、IX、X或XI的克利斯汀化合物可以是盐的形式。这样的盐包括适合于制药应用的盐（“药学可接受的盐”）、适合于兽医应用的盐等。正如本领域公知的，这样的盐可以源自于水性碱（例如水性金属氢氧化物或金属氢化物）。本文中描述的示例性盐是钠盐、钾盐、镁盐和钙盐，但是一般来说任何药学可接受的盐都可用于本文描述的方法。
在一种实施方式中，所述盐是药学可接受的盐。总的来说，药学可接受的盐是基本上保留了亲本化合物的一种或多种所需药理活性并且适合于施用到人类的那些盐。药学可接受的盐包括当亲本化合物中存在的酸性质子被金属离子（例如碱金属离子、碱土金属离子或铝离子）替换或与有机碱（例如乙醇胺、二乙醇胺、三乙醇胺、N-甲基葡萄糖胺、吗啉、哌啶、二甲胺、二乙胺、三乙胺、氨等）配位时所形成的盐。
正如本领域公知的，通式I、II、III、VII、VIII、IX、X或XI的克利斯汀化合物及其盐也可以是溶剂化物例如水合物以及N-氧化物的形式。
XII.药物组合物和治疗方法
本公开包括含有至少一种抗微生物的克利斯汀（例如通式I-XI的克利斯汀）的药物组合物。当应用于细菌时，所公开的药物组合物的某些实施方式能够抑制细菌生长（例如通过抑制FtsZ）。药物组合物可以体外应用于细菌，或者药物组合物可以被配制成用于人类和/或兽医药物，并且可以通过将治疗有效量的药物组合物施用于对象来应用于体内细菌。
药物组合物的某些实施方式包括药学可接受的载体和至少一种活性成分。有用的药学可接受的载体和赋形剂是本领域中已知的。活性成分可以包含例如至少一种本文中所述的克利斯汀，或本文中所述的克利斯汀的任何组合。此外，例如对所治疗的疾病具有相似、相关或互补效果的其他药物或药剂可以作为活性成分包含在药物组合物中。
包含所公开的克利斯汀化合物的实施方式的药物组合物，可以利用常规的混合、溶解、成粒、糖衣制造、研磨、乳化、囊封、包埋或冷冻干燥方法来制造。可以以常规方式，使用便于将活性化合物加工成可以制药使用的制剂的一种或多种生理学可接受的载体、稀释剂、赋形剂或辅助剂来配制所述组合物。
取决于例如施用方式和/或待治疗的疾病位置和类型，包含一种或多种克利斯汀的药物组合物可以以多种方式配制。例如，这样的药物组合物可以被配制成所公开的克利斯汀的药学可接受的盐（例如钠盐或钾盐）、水合物或溶剂化物。作为另一个实例，肠胃外制剂可以包含可注射流体，所述可注射流体是药学和生理学可接受的流体介质例如水、生理盐水、其他平衡盐溶液、右旋糖水溶液、甘油等。赋形剂可以包括例如非离子型增溶剂例如cremophor，或蛋白质例如人血清白蛋白或血浆制备物。如果需要，待施用的药物组合物也可以含有无毒性辅助物质，例如润湿剂或乳化剂、防腐剂和pH缓冲剂等，例如乙酸钠或失水山梨糖醇单月桂酸酯。
药物组合物的剂型由所选的施用方式来决定。所公开的药物组合物的实施方式可以采取适合于包括例如表面、眼部、口服、经颊、全身、鼻、注射、透皮、直肠、阴道等在内的事实上任何施用方式的形式，或适合于通过吸入或吹入施用的形式。
表面制剂可以包括滴眼剂、凝胶、软膏、乳膏、悬液、喷剂等，正如本领域中公知的。
有用的可注射制剂包括活性化合物在水性或油性介质中的无菌悬液、溶液或乳液。组合物还可以包含配制剂，例如悬浮剂、稳定剂和/或分散剂。注射用制剂可以以单位剂型存在于例如安瓿或多剂量容器中，并且可以含有添加的防腐剂。
或者，可注射制剂可以提供成粉末形式，用于在使用前用适合的介质重构，所述介质包括但不限于无菌无热原水、缓冲液、右旋糖溶液等。就此而言，活性化合物可以通过本领域已知的任何技术例如冷冻干燥进行干燥，并在使用前重构。
对于经粘膜施用来说，在制剂中使用适合于待透过的屏障的渗透剂。这样的渗透剂是本领域中已知的。
全身制剂包括被设计用于通过注射例如皮下、静脉内、肌内、鞘内或腹膜内注射施用的制剂，以及被设计用于透皮、经粘膜、口服或肺部施用的制剂。
口服制剂可以是液体（例如糖浆、溶液或悬液）或固体（例如粉剂、丸剂、片剂或胶囊）。通过常规手段，使用药学可寄售的赋形剂来制备固体组合物，所述赋形剂例如粘合剂（例如预明胶化玉米淀粉、聚乙烯吡咯烷酮或羟丙基甲基纤维素）、填充剂（例如乳糖、甘露糖醇、微晶纤维素或磷酸氢钙）、润滑剂（例如硬脂酸镁、滑石粉或二氧化硅）、崩解剂（例如土豆淀粉或羟基乙酸淀粉钠）或润湿剂（例如月桂基硫酸钠）。可以通过本领域公知的方法，用例如糖类、薄膜或肠溶包衣对片剂进行包衣。制备这样的剂型的实际方法，对于本领域技术人员来说是已知的或显而易见的。
用于口服施用的液体制剂可以采取例如酏剂、溶液、糖浆或悬液的形式，或者它们可以表现为在使用前用水或其他适合的介质进行重构的干燥产品。这样的液体制剂可以通过常规手段，用药学可接受的添加剂例如悬浮剂（例如山梨糖醇糖浆、纤维素衍生物或氢化可食用脂肪）、乳化剂（例如卵磷脂或阿拉伯树胶）、非水性介质（例如杏仁油、油性酯类、乙醇、cremophoreTM或分级植物油）和防腐剂（例如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯或山梨酸）来制备。在适合时，所述制剂也可以含有缓冲盐、防腐剂、调味剂、着色剂和甜味剂。正如公知的，用于口服施用的制剂可以被适合地配制以提供活性化合物的受控释放。
对于经颊施用来说，组合物可以采取以常规方式配制的片剂或含片的形式。
对于直肠和阴道施用途径来说，活性化合物可以配制成溶液（用于保留灌肠）、栓剂或软膏，其含有常规栓剂基质例如可可脂或其他甘油酯。
对于鼻施用或通过吸入或吹入施用来说，活性化合物可以从使用适合的推进剂例如二氯二氟甲烷、三氟一氯甲烷、二氯四氟乙烷、氟烃、二氧化碳或其他适合的气体的加压包或喷雾器，以气溶胶喷剂的形式方便地递送。在加压气溶胶的情形中，剂量单位可以通过提供阀门来确定，以便递送计量过的量。在吸入器或吹入器中使用的囊和柱（例如由明胶构成的囊和柱）可以被配制成含有化合物和适合的粉剂基质例如乳糖或淀粉的粉末混合物。
对于眼部施用来说，活性化合物可以被配制成适合于施用于眼的溶液、乳液、悬液等。适合于将化合物施用于眼的各种介质是本领域中已知的。具体的非限制性实例被描述在美国专利号6,261,547、6,197,934、6,056,950、5,800,807、5,776,445、5,698,219、5,521,222、5,403,841、5,077,033、4,882,150和4,738,851中。
对于延长递送来说，可以将活性化合物配制成用于通过植入或肌内注射进行施用的储库制剂。活性成分可以与适合的聚合物或疏水性材料（例如作为在可接受的油中的乳液）或离子交换树脂配制在一起，或配制成微溶衍生物例如微溶盐。或者，可以使用被制造成缓慢释放活性化合物以供经皮吸收用的作为粘附性盘或贴片的透皮递送系统。为此，可以使用渗透增强剂来促进活性化合物的透皮穿过。适合的透皮贴片被描述在例如美国专利号5,407,713、5,352,456、5,332,213、5,336,168、5,290,561、5,254,346、5,164,189、5,163,899、5,088,977、5,087,240、5,008,110和4,921,475中。
或者，可以使用其他药物递送系统。脂质体和乳液是可用于递送活性化合物或前体药物的递送介质的公知实例。也可以使用某些有机溶剂例如二甲亚砜（DMSO），尽管通常以毒性较大为代价。
包含本文所述的生物活性克利斯汀的药物组合物的某些实施方式，可以配制成适合于以精确剂量个体施用的单位剂型。如果需要，药物组合物可以存在于包装或配药装置中，其可以含有一个或多个含有活性化合物的单位剂型。包装可以例如包含金属或塑料箔，例如泡罩包装。包装或配药装置可以伴有施用说明书。施用的生物活性克利斯汀的量取决于所治疗的对象、疾病的严重性和施用方式，并且对本领域技术人员来说是已知的。在这些限制之内，待施用的制剂含有能够在所治疗对象中有效实现所需效果的量的本公开化合物的量。
所公开的克利斯汀化合物的实施方式一般以有效实现预期效果的量、例如以有效治疗或预防所治疗的特定疾病的量使用，所述疾病例如微生物或细菌感染，例如革兰氏阳性、革兰氏阴性或抗酸细菌感染。化合物可以治疗性施用以获得治疗性益处，或者预防性施用以获得预防性益处。治疗性益处是指所治疗的隐伏障碍的根治或改善和/或与隐伏障碍相关的一种或多种症状的根治或改善，使得患者报告感觉或状况改善，尽管患者可能仍受隐伏障碍的困扰。治疗性益处还包括疾病进展的暂停或减缓，无论是否实现改善。
对于预防性施用来说，可以将克利斯汀化合物施用于处于发生由细菌病原体引起的疾病的风险中的患者。也可以将化合物预防性施用于重复地暴露于已知产生疾病或感染的病原性细菌的健康个体，以预防所述疾病或感染的发生。例如，可以将化合物施用于重复地暴露于耐药细菌的健康个体。
施用的化合物的量取决于多种因素，包括例如所治疗的具体病症、施用方式、所需益处是预防性还是治疗性的、所治疗的病症的严重性、患者的年龄和体重、特定活性化合物的生物利用度等。有效剂量的确定完全在本领域技术人员的能力之内。
有效剂量最初可以从体外测定来估算。例如，可以将初始剂量配制成获得等于或高于在体外测定中测得的特定化合物的IC50的活性化合物的循环血或血清浓度。将特定化合物的生物利用度考虑在内来计算实现这样的循环血或血清浓度的剂量，完全在技术技术人员的能力之内。作为指导，读者可以参考Fingl&Woodbury“一般性原则”（General Principles），在Goodman和Gilman的《治疗学的制药基础》（Pharmaceutical Basis of Therapeutics）最新版的第1章，pp.146，Pagamonon Press，以及其中引用的参考文献。
初始剂量也可以从体内数据例如动物模型来估算。可用于测试化合物治疗或预防上述各种疾病的效能的动物模型是本领域中公知的。普通技术人员可以常规地调整这样的信息以确定适合于人类施用的剂量。
剂量可以在约0.0001或0.001或0.01mg/kg/天至约100mg/kg/天的范围内，但是取决于各种因素例如克利斯汀化合物的活性、其生物利用度、施用方式和上面讨论的各种因素等，剂量可以更高或更低。剂量和间隔时间可以个体调节，以提供足以维持治疗或预防效果的化合物的血浆水平。例如，取决于各种因素例如施用方式、所治疗的具体病症和处方医生的判断等，化合物可以每周一次、每周数次（例如隔天一次）、每天一次或每天多次施用。在局部施用或选择性摄入例如局部表面施用的情形中，活性化合物的有效局部浓度可能不与血浆浓度相关。技术人员无需过多实验就能优化有效的局部剂量。
优选地，化合物将提供治疗或预防益处而不引起显著毒性。可以使用标准制药程序来确定化合物的毒性。毒性和治疗性（或预防性）效果之间的剂量比是治疗指数。表现出高治疗指数的化合物是优选的。
制药方法和组合物的某些实施方式包括本文中所描述的生物活性克利斯汀化合物与治疗有效量的除了克利斯汀化合物之外的第二药剂的共同施用。克利斯汀和第二药剂可以分开地或在单一组合物中一起施用。如果克利斯汀化合物对特定细菌无效或未充分有效，使用增强或提高克利斯汀的有效性的第二药剂。在某些实施方式中，第二药剂是相对于仅包含克利斯汀化合物作为活性剂的药物组合物来说，提高药物组合物的有效性的抗微生物剂。
取决于在革兰氏染色方案中细菌是否保留结晶紫染料，将它们分类为革兰氏阴性细菌或革兰氏阳性细菌。使用Ziehl-Neelsen染色剂将其他生物体例如分枝杆菌（Mycobacteria）、诺卡氏菌（Nocardia）和球虫寄生虫分类为抗酸生物体。所有这些类型的生物体可能对人类有害。然而，治疗由革兰氏阴性细菌引起的障碍、病症或疾病可能是特别具有挑战性的，因为革兰氏阴性细菌具有外部脂多糖膜，其为这些细菌提供了对通常靶向细胞壁或内膜的某些抗生素的耐受性。革兰氏阴性细菌的外膜可以抑制克利斯汀化合物渗透通过外膜，使其可以有效抑制细菌细胞内的FtsZ。在这样的情况下，能够提高克利斯汀化合物渗透进入细菌的第二药剂可以被包含在药物组合物中，或者可以与药物组合物基本上同时地施用，使得细菌同时暴露于克利斯汀化合物和第二药剂两者。
适合的第二药剂包括抗生素化合物，例如氨基糖苷类、碳青霉烯类、头孢菌素类、糖肽类、林可酰胺类、脂肽类、大环内酯类、单环β-内酰胺类、硝基呋喃类、青霉素类、青霉素组合、多肽类、喹诺酮类、磺胺类、四环素类、抗分枝杆菌化合物等。示例性氨基糖苷类抗生素包括阿米卡星、庆大霉素、卡那霉素、新霉素、奈替米星、托普霉素和巴龙霉素（paromycin）。示例性的碳青霉烯类抗生素包括厄他培南、多利培南、亚胺培南、西司他丁和美罗培南。示例性的头孢菌素类抗生素包括头孢羟氨苄、头孢唑啉、头孢噻吩、头孢氨苄、头孢克洛、头孢孟多、头孢西丁、头孢丙烯、头孢呋辛、头孢克肟、头孢地尼、头孢托仑、头孢哌酮、头孢噻肟、头孢泊肟、头孢他啶、头孢布烯、头孢唑肟、头孢曲松、头孢吡肟和头孢吡普（cefobiprole）。示例性的糖肽类包括替考拉宁、万古霉素和特拉万星。示例性的林可酰胺类抗生素包括克林霉素和林可霉素。达托霉素是示例性的脂肽。示例性的大环内酯类抗生素包括阿奇霉素、克拉霉素、地红霉素、红霉素、罗红霉素、醋竹桃霉素、泰利霉素和壮观霉素。氨曲南是示例性的单环β-内酰胺。示例性的硝基呋喃类抗生素包括呋喃唑酮和呋喃妥因。示例性的青霉素类抗生素包括阿莫西林、氨比西林、阿洛西林、羧苄西林、邻氯西林、双氯西林、氟氯西林、美洛西林、甲氧西林、萘夫西林、苯唑西林、青霉素G、青霉素V、哌拉西林、替莫西林和替卡西林。示例性的青霉素组合包括阿莫西林/克拉维酸盐、氨比西林/舒巴坦、哌拉西林/他唑巴坦、和替卡西林/克拉维酸盐。示例性的多肽类抗生素包括杆菌肽、多粘菌素E和多粘菌素B。示例性的喹诺酮类抗生素包括环丙沙星、依诺沙星、加替沙星、左氧氟沙星、洛美沙星、莫西沙星、萘啶酸、诺氟沙星、氧氟沙星、曲伐沙星、格雷沙星、司帕沙星和替马沙星。示例性的磺胺类抗生素包括磺胺米隆、偶氮磺胺（sulfonamidochrysoidine）、磺胺醋酰、磺胺嘧啶、磺胺嘧啶银、磺胺甲二唑、磺胺甲
Figure BDA0000398206280000411
唑、磺亚胺、柳氮磺胺吡啶、磺胺异
Figure BDA0000398206280000412
唑、甲氧苄啶和甲氧苄啶-磺胺甲
Figure BDA0000398206280000413
唑（复方新诺明）。示例性的四环素类抗生素包括地美环素、多西环素、米诺环素、土霉素和四环素。示例性的抗分枝杆菌抗生素包括氯法齐明、氨苯砜、卷曲霉素、环丝氨酸、乙胺丁醇、乙硫异烟胺、异烟肼、吡嗪酰胺、利福霉素（利福平）、利福布丁、利福喷丁和链霉素。其他示例性抗生素包括胂凡纳明、氯霉素、磷霉素、夫西地酸、利奈唑胺、甲硝哒唑、莫匹罗星、平板霉素、喹奴普丁/达福普丁、利福昔明、甲砜霉素、替加环素和替硝唑。
在某些实施方式中，第二药剂是被选择用于提高克利斯汀化合物渗透进入细菌的渗透增强剂。例如，已显示溶菌酶与EDTA的组合有效地对抗某些革兰氏阴性生物体的外膜。可用于与克利斯汀化合物组合对抗革兰氏阴性细菌的其他药物或化合物包括碳青霉烯类、某些头孢菌素类和含胺胆酸衍生物。有效对抗一些革兰氏阴性细菌的示例性第二药剂包括阿莫西林、氨比西林、羧苄西林、头孢克洛、头孢吡肟、头孢西丁、头孢匹罗、头孢罗齐、头孢呋辛、氯霉素、多粘菌素B（用于体外使用）、头孢噻肟、链霉素和萘啶酸。
XIII.治疗性应用
本公开包括在对象中治疗由微生物感染例如细菌病原体的感染引起的障碍、病症或疾病。革兰氏阴性和革兰氏阳性细菌以及抗酸细菌对人类来说可能是病原性的（即引起疾病的），并且可以用克利斯汀抗生素治疗。属于6个革兰氏阳性属的细菌菌种在人类中通常是病原性的。这些属是链球菌属（Streptococcus）、葡萄球菌属（Staphylococcus）、棒状杆菌属（Corynebacterium）、李斯特菌属（Listeria）、芽孢杆菌属（Bacillus）和梭状芽孢杆菌属（Clostridium）。其他病原性革兰氏阳性细菌包括但不限于一些分枝杆菌属（Mycobacterium）和肠球菌属（Enterococcus）菌种，例如结核分枝杆菌（M.tuberculosis）、麻风分枝杆菌（M.leprae）、粪肠球菌（E.faecalis）和屎肠球菌（E.faecium）。分枝杆菌被分类为革兰氏阳性抗酸细菌。尽管它们不保留结晶紫染色剂，但是由于它们缺乏细胞外膜，因此被分类为革兰氏阳性细菌。因此使用Ziehl-Neesen抗酸染色来鉴定它们。
许多革兰氏阴性细菌菌种是病原性的，包括但不限于流感嗜血杆菌（Haemophilus influenza）、肺炎克雷伯氏菌（Klebsiella pneumoniae）、嗜肺军团菌（Legionella pneumophila）、铜绿假单胞菌（Pseudomonasaeruginosa）、大肠杆菌（Escherichia coli）、奇异变形杆菌（Proteusmirabilis）、阴沟肠杆菌（Enterobacter cloacae）、粘质沙雷氏菌（Serratiamarcescens）、幽门螺旋杆菌（Helicobacter pylori）、肠炎沙门氏菌（Salmonella enteritidis）、伤寒沙门氏菌（Salmonella typhi）、鲍曼不动杆菌（Acinetobacter baumannii）、淋病奈瑟氏菌（Neisseriagonorrhoeae）、脑膜炎奈瑟氏菌（Neisseria meningitides）和粘膜炎莫拉菌（Moraxella catarrhalis）。在某些实例中，病原体是药物敏感性细菌例如金黄色葡萄球菌、屎肠球菌或枯草芽孢杆菌，或耐药菌株例如耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）、多药耐药金黄色葡萄球菌（MDRSA）或耐万古霉素屎肠球菌（VREF）。
治疗细菌感染的方法包括将一种或多种本公开的克利斯汀化合物例如通式I-XI的化合物，或将一种或多种克利斯汀化合物与一种或多种其他药剂（在本文中也称为“药物）的组合，在药学可接受的载体中并以有效治疗微生物感染例如由革兰氏阴性或革兰氏阳性细菌引起的感染（包括由抗酸生物体如分枝杆菌例如结核分枝杆菌引起的感染）的量，施用于对象。一种或多种其他药剂可以与一种或多种克利斯汀化合物一起或分开施用。该治疗可以被预防性用于人口统计学组中处于对这样的疾病的显著风险中的任何对象，例如处于被机会性细菌病原体感染的风险中的患者（例如患有AIDS或重症联合免疫缺陷的患者，经历化疗或放射治疗的患者，或移植患者），或者在已知或怀疑带有耐药病原体例如MRSA的环境（例如疗养院或医院住院病房）中的患者。或者，可以使用更具体的标准来选择对象，例如根据例如细菌感染的临床征兆和症状和/或实验室证据对病症做出的确定性诊断。这样的对象的实例是其中阳性血液培养物鉴定到具有屎肠球菌（例如耐万古霉素屎肠球菌）或已知对使用克利斯汀化合物的抑制敏感的另一种生物体的菌血症的人。在某些实例中，将药物施用于已从其获得（例如通过获得例如血液或痰液样品）并培养出细菌，并且已证实培养物中的所述细菌被克利斯汀抑制（即对其敏感）的对象。
药物在其中进行递送的介质可以包括例如上述的药物组合物。施用途径包括但不限于口服和肠胃外途径例如静脉内（iv）、腹膜内（ip）、直肠、表面、眼部、鼻和透皮。
药物可以在用于静脉内注射的任何常规介质例如盐水介质或在血浆介质中进行静脉内施用。介质还可以含有常规的制药辅助材料，例如用于调整渗透压的药学可接受的盐、脂类载体例如环糊精、蛋白质例如血清白蛋白、亲水剂例如甲基纤维素、去污剂、缓冲剂、防腐剂等。肠胃外药物载体的更完整的解释可以在1995年的《Remington药物学科学与实践》（Remington:The Science and Practice of Pharmacy）第19版第95章中找到。
本公开的克利斯汀化合物和/或克利斯汀类似物的治疗有效剂量可以由本领域技术人员确定，其目的是获得与本文实施例中公开的适用克利斯汀化合物和/或克利斯汀类似物的IC50至少一样高的组织浓度。
XIV.实施例
通用实验。使用Jasco P-2000旋光仪测量旋光度，在Perkin ElmerFT-IR Spectrum One光谱仪上记录IR光谱，在Agilent8453分光光度计上记录UV光谱。在Waters LCT Premier飞行时间（TOF）质谱仪上测量准确质量电喷雾电离（ESI）质谱。仪器以ω-方式在10,000的标称分辨率下运行，所有数据以负离子方式记录。电喷雾毛细管电压被设定在2KV，样品锥电压被设定在30V。去溶剂化温度被设定在275℃，并使用流速为300L/h的氮气作为去溶剂化气体。使用内部参比标准品方法获得准确质量。通过将锥电压增加至125V来诱导在源片段化。
NMR波谱术。在300K下在Bruker Avance波谱仪上记录所有NMR谱。在CD3OD或DMF-d7中，使用x,y,z-屏蔽梯度三重共振探针在600MHz下，或使用深低温冷却的z-屏蔽梯度三重共振探针在500MHz下记录天然产物的NMR谱。样品被制备在带有与溶剂匹配的柱塞的Shigemi NMR管中。所有波谱参比于与相应表中对每种化合物列出的氘化溶剂相对应的残留溶剂峰。使用带有水抑制的标准脉冲程序（Watergate）来记录DQF-COSY、2D-HOHAHA、HSQC、HMBC和ROESY实验。使用1.724ms的停留时间来记录HSQC实验（1JC-H145Hz），并且使用31.25和50ms的停留时间来记录HMBC谱（2.3JC-H=8和5Hz）。从HMBC谱指派长程1H-13C连接，并且从ROESY谱指派NOE。每个质子的关联性被包括在下面的表中。
饱和转移差异（STD）NMR实验，对于共振辐射来说使用设置在-1或12ppm处的介质来记录，对于非共振辐射来说使用设置在40ppm处的介质来记录。在相同条件下，在含有游离化合物1的样品上记录对照谱以测试人为假象。使用各自相隔1ms延迟时间的一串50ms的高斯型脉冲，在实验确定的最适功率（在我们的探针上为49dB）下实现选择性蛋白质饱和（2s）；引入T1ρ滤波器（30ms）以抑制蛋白质共振。使用最少1024次扫描和32K个点来记录实验。独立地对共振和非共振谱进行处理，并将其差减以提供差异谱。
计算详情。为了充分探索克利斯汀1的构象空间，在三种不同温度（300K、500K、700K/50ns）下使用AMBER力场（MacroModel软件包（Mohamadi等，J.Comput.Chem.,11:440,1990））进行分子动力学（MD）计算以给出100个结构，使用Polak-Ribier共轭梯度算法（PRCG，1000步，最大导数小于0.05kcal/mol）将每个结构最小化。这些计算为克利斯汀1提供了最低能量最小化的构象异构体。使用MacroModel软件包的MonteCarlo多重最小值（MCMM）方法（50K步）进行平行分析，产生与MD计算获得的结果相同的结果。使用Autodock Vina1.0.3程序来进行化合物1的最低能量结构与FtsZ的大肠杆菌同源性模型（使用SWISS-MODEL（Arnold等，Bioinformatics,22:195,2006）常规步骤，从铜绿假单胞菌FtsZ的坐标开始来建立，所述铜绿假单胞菌FtsZ的pdb登记号为1ofu.pdb（Cordell等，Proc.NatlAcad.Sci.U.S.A.,101:11821,2003））的对接。在初始对接运行显示出所有合理的模型以将化合物1置于GTP结合位点内或其附近后，将格栅缩小到比GTP结合位点略大的区域（28x20x24
Figure BDA0000398206280000451
）。使用512的穷尽性值和25个结构的最大输出来进行对接。使用与STD NMR数据和计算能量的符合度来获得最佳对接模型。这种方法提供了在该组中表现出能量第四低的模型，它在GTP结合位点中的位置与测量到的STD NMR增强完全相符。
附加的支持性信息可以通过英特网在ACS出版物网址处免费获得（Plaza等，J.Am.Chem.Soc.,132(26):9069-9077,2010），并且包括化合物1a、2-4、6-8的1H NMR和13C NMR数据和谱；复合物1/FtsZ在水性缓冲液中的1H NMR和STD NMR谱；微管蛋白聚合曲线；以及化合物1的整体能量最小化结构与大肠杆菌FtsZ的同源性模型（pdb）的对接模型的坐标。
实施例1
化合物的分离和结构测定
从圣约翰岛Round Bay的海面下20ft收集金藻门藻类Chrysophaeum taylori的样品（Lewis和Bryan，Am.J.Bot.,28:343,1941）。这种被发现在粗沙或碎珊瑚基质上生长成松软集落的藻类表现出为硫黄色颜色，并且在受到扰乱时能够在数秒内变成锈棕色。C.taylori的多细胞结构极为易碎，并且粘质细胞不能良好地保存。然而，当将新鲜收集或新鲜保存（在海水中的2.5%戊二醛）的样品通过光学显微镜进行观察时，可以看到由梨形内嵌细胞的分支粘质“彩带”构成的柄状结构。此外，藻类收集物含有已知的苯乙烯基色酮（styrylchromone）hormothamnione，并且在操作的所有阶段与Gerwick出版的野外记录（J.Nat.Prod.,52:252,1989）具有显著相似性。
通过用己烷、氯仿和甲醇连续提取，从冷冻干燥的Chrysophaeumtaylorialgae藻类样品（200g干重）分离抗微生物的化合物。将甲醇提取物（13g）在正丁醇-H2O（1:1）之间分配，并将有机层（1.1g）在Sephadex LH-20上分级。通过反相HPLC（2.5mL/min），使用JupiterProteo C12柱（250x10mm，4μ粒径）和220和280nm处的二极管阵列UV检测，对含有二芳基烯烃醚的级分（75.1mg）进行层析。将化合物在50分钟内用0.05%TFA中的50-80%MeOH的线性梯度进行洗脱，以产生化合物1（3.5mg，tR=28.0min）、2（0.4mg，tR=28.6min）、3（0.8mg，tR=29.4min）、4（1.8mg，tR=32.0min）、5（2.6mg，tR=33.3min）、6（1.5mg，tR=41.3min）、7（1.4mg，tR=41.8min）和8（0.7mg，tR=50.5min）。
通过高分辨率质谱术和NMR获得分子式：
化合物1：无色无定形粉末；无光学活性；UV(MeOH)λmax(logε)210(4.2),225(3.9),290(3.4)；IR（薄膜）νmax3384,1675,1449,1203,1143,846,802,727；1H和13C NMR数据参见表1；HR-ESI-MS675.0154[M-H]-，对应于分子式C32H24Cl4O8（C32H23Cl4O8的计算值为675.0147）。
化合物2：无色无定形粉末；无光学活性；UV(MeOH)λmax(logε)210(4.2),225(3.8),290(3.4)；IR（薄膜）νmax3381,1681,1608,1447,1207,1143,846,802,723；1H和13C NMR数据参见表3；HR-ESI-MS718.9655[M-H]-，对应于分子式C32H24BrCl3O8（C32H23BrCl3O8的计算值为718.9642）。
化合物3：无色无定形粉末；无光学活性；UV(MeOH)λmax(logε)210(4.2),225(3.9),290(3.4)；IR（薄膜）νmax3387,1680,1608,1444,1209,1145,846,802,722；1H和13C NMR数据参见表3；HR-ESI-MS718.9650[M-H]-，对应于分子式C32H24BrCl3O8（C32H23BrCl3O8的计算值为718.9642）。
化合物4：无色无定形粉末；无光学活性；UV(MeOH)λmax(logε)210(4.1),225(3.9),290(3.4)；IR（薄膜）νmax3397,1681,1608,1447,1207,1144,1016,844,802,723；1H和13C NMR数据参见表3；HR-ESI-MS762.9168[M-H]-，对应于分子式C32H24Br2Cl2O8（C32H23Br2Cl2O8的计算值为762.9137）。
化合物5：无色无定形粉末；无光学活性；UV(MeOH)λmax(logε)210(4.2),225(3.8),290(3.4)；IR（薄膜）νmax3386,1686,1608,1451,1201,1148,849,808,730；1H和13C NMR数据参见表4；HR-ESI-MS677.0317[M-H]-，对应于分子式C32H26Cl4O8（C32H25Cl4O8的计算值为677.00304）。
化合物6：无色无定形粉末；无光学活性；UV(MeOH)λmax(logε)210(4.2),225(3.8),290(3.4)；IR（薄膜）νmax3385,1675,1606,1453,1201,1144,846,802,733；1H和13C NMR数据参见表5；HR-ESI-MS675.0140[M-H]-，对应于分子式C32H24Cl4O8（C32H23Cl4O8的计算值为675.0147）。
化合物7：无色无定形粉末；无光学活性；UV(MeOH)λmax(logε)210(4.2),225(3.8),290(3.4)；IR（薄膜）νmax3381,1677,1601,1435,1210,1148,842,812,721；1H和13C NMR数据参见表6；HR-ESI-MS718.9620[M-H]-，对应于分子式C32H24BrCl3O8（C32H23BrCl3O8的计算值为718.9642）。
化合物8：无色无定形粉末；无光学活性；UV(MeOH)λmax(logε)210(4.2),225(3.8),290(3.4)；IR（薄膜）νmax3381,1678,1605,1447,1207,1144,840,802,725；1H和13C NMR数据参见表6；HR-ESI-MS752.9255[M-H]-，对应于分子式C32H23BrCl4O8（C32H22BrCl4O8的计算值为752.9252）。
表1.克利斯汀1的NMR谱数据
Figure BDA0000398206280000481
Figure BDA0000398206280000491
a在125MHz下记录；参比于δ49.1处的残留MeOH-d4。b在500MHz下记录；参比于δ3.30处的残留MeOH-d4。c与标出的碳显示出HMBC关联的质子。d与标出的碳显示出ROESY关联的质子。e在125MHz下记录；参比于δ34.89处的残留DMF-d7。f在500MHz下记录；参比于δ2.92处的残留DMF-d7。
表2.化合物1a的1H和13C NMR数据（MeOH-d4）
Figure BDA0000398206280000501
a在125MHz下记录；参比于δ49.15ppm处的残留CD3OD。
b在500MHz下记录；参比于δ3.31ppm处的残留CD3OD。
表3.化合物2-4的1H和13C NMR数据（MeOH-d4）
Figure BDA0000398206280000502
Figure BDA0000398206280000511
a在125MHz下记录；参比于δ49.1处的残留MeOH-d4。b在500MHz下记录；参比于δ3.30处的残留MeOH-d4。
表4.克利斯汀5的NMR谱数据
Figure BDA0000398206280000522
a在125MHz下记录；参比于δ49.1处的残留MeOH-d4。b在500MHz下记录；参比于δ3.30处的残留MeOH-d4。c与标出的碳显示出HMBC关联的质子。d与标出的碳显示出ROESY关联的质子。e在125MHz下记录；参比于δ34.89处的残留DMF-d7。f在500MHz下记录；参比于δ2.92处的残留DMF-d7。
表5.化合物6在MeOH-d4和DMF-d7中的NMR谱数据
Figure BDA0000398206280000532
a在125MHz下记录；参比于δ49.1处的残留MeOH-d4。b在500MHz下记录；参比于δ3.30处的残留MeOH-d4。c与标出的碳显示出HMBC关联的质子。d与标出的碳显示出ROESY关联的质子。e在125MHz下记录；参比于δ34.89处的残留DMF-d7。f在500MHz下记录；参比于δ2.92处的残留DMF-d7。
表6.化合物7和8的1H和13C NMR数据（MeOH-d4）
Figure BDA0000398206280000541
Figure BDA0000398206280000551
a在125MHz下记录；参比于δ49.1处的残留MeOH-d4。
b在500MHz下记录；参比于δ3.30处的残留MeOH-d4。
实施例2
化合物1、1a、4-8的抗微生物测试
使用改良的板扩散测定法和微量肉汤液体稀释测定法，测试了化合物1-8针对金黄色葡萄球菌（SA，ATCC25923）、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA，ATCC BAA-41）、多药耐药金黄色葡萄球菌（MDRSA，ATCC BAA-44）、屎肠球菌（EF，ATCC49032）、耐万古霉素屎肠球菌（VRE，ATCC700221）和枯草芽孢杆菌（ATCC49343）的抗微生物活性。对于板扩散测定法来说，通过向100mL压热灭菌并冷却至55℃的Mueller Hinton II琼脂添加500μL培养24h的细菌培养物，来制备接种有细菌悬液的琼脂板。将接种的液体琼脂（10mL）立即转移至正方形皮氏培养皿，并允许其冷却1h。用于每种微生物的对照药物包括用于金黄色葡萄球菌的卡那霉素（50μg）和用于MRSA的呋喃妥因（25μg）。在37℃温育18h后，测量抑制区。使用在临床和实验室标准研究所（Clinical and Laboratory Standards Institute）好氧生长细菌的易感性试验方法中概述的微量肉汤稀释测定法，来测定化合物1和4-8的MICso值。简单来说，使用细菌单菌落接种4mL胰蛋白胨大豆肉汤（BD）以生长过夜，并使用0.5McFarland标准培养基将每种接种物稀释至5x105CFU/mL。在96孔板（Costar，圆底）中，向孔板的第一列中的Mueller Hinton II肉汤（用于金黄色葡萄球菌、MRSA和枯草芽孢杆菌）或10%脑心浸液肉汤（用于屎肠球菌和VRE）加入对照抗生素（用于SA和MRSA的苯唑西林，用于EF和VRE的万古霉素，用于枯草芽孢杆菌的氯霉素）或天然产物抑制剂，并横跨整个板连续稀释，保留用作阳性生长对照的孔（未处理）。向除了被保留用于肉汤空白（仅仅MHII或脑心浸液肉汤）的孔之外的所有孔加入10μL稀释的细菌。将板在37℃温育过夜，并在Molecular Devices酶标仪上读取600nm处的吸光度。对生长曲线进行作图，并使用Kalidagraph软件获得ICso值。
结果示出在表7和图7A和7B中。图7A是在微量肉汤稀释测定法中化合物1针对金黄色葡萄球菌（白色圆圈）和枯草芽孢杆菌（黑色圆圈）的剂量响应曲线。图7B是在微量肉汤稀释测定法中化合物1针对MRSA（黑色圆圈）和MDRSA（白色圆圈）的剂量响应曲线。使用Kaleidagraph4.0，使用方程y=100/[1+(浓度/MIC50)]将曲线拟合于单点模型（one-site model），其中MIC50是细菌培养物的生长减少50%时的浓度。MIC50值对于SA来说是1.8±0.6μg/mL，对于MRSA来说是1.5±0.7μg/mL，对于枯草芽孢杆菌来说是7.3±3.7μg/mL。所有测试的化合物的值被示出在表7中。
表7
化合物1、1a、4-8的抗微生物数据
Figure BDA0000398206280000561
a产生8-10mm抑制区的最低浓度；bNA，在25μg/板下没有观察到抑制区；c—，未测试。
在两种测定形式中，克利斯汀1（化合物1）是最有效的抗生素，其针对SA、MRSA和多药耐药SA（MDRSA）的最低抑制浓度（MIC50）分别为1.8±0.6、1.5±0.7和1.3±0.4μg/mL，针对屎肠球菌和VREF的最低抑制浓度为3.8±1.9和2.9±0.8μg/mL。克利斯汀6和8（化合物6和8）是第二有效的化合物，其针对金黄色葡萄球菌和MRSA的MIC50值为4-6μg/mL，针对VREF的MIC50值为～9.5μg/mL。
实施例3
GTPase活性和FtsZ聚合
细菌细胞骨架蛋白FtsZ是GTPase，并与真核生物细胞骨架蛋白微管蛋白具有结构同源性，但是缺乏显著的序列相似性。FtsZ对于细菌细胞分裂来说是必需的。已报道，不可切开的GTP类似物在体外抑制FtsZ，正如数种小分子那样。FtsZ的抑制终止细菌细胞分裂，并且是新的抗微生物剂的有效靶点。使用比色测定法测试化合物1抑制重组大肠杆菌FtsZ的GTPase活性的能力，所述比色测定法通过与钼酸盐（也称为孔雀绿）的络合来检测GTP水解成GDP后释放的无机磷酸盐（Pi）。GTPase测定法在50mM MES，pH6.5，50mM KCI，5mMMgCl2中，在2μM FtsZ和不同浓度的化合物1存在下进行。将溶液在室温温育5min，然后添加0.25mM GTP。在20-min温育期结束时，通过加入50μL孔雀绿溶液来淬灭酶活性，并在酶标仪上读取孔的A625吸光度。如图8中所示，发现化合物1抑制FtsZ，其IC50值为6.7±1.7μg/mL（9.9μM）。
在体外测试了化合物1抑制FtsZ聚合的能力。通过聚合测定法评估大肠杆菌FtsZ的原丝形成。将在MES缓冲液中含有重组大肠杆菌FtsZ（6μM）的溶液用5%DMSO或5%DMSO中的50μM化合物1在室温下处理2分钟，然后加入GTP。在室温下另外孵育5min时间后，将等分试样（5μL）吸附到在400目铜格栅上的花边碳支撑物上的碳薄膜上，用H2O漂洗，并暴露于3%乙酸双氧铀5分钟进行负染色。使用在80kV下运行并装备有AMT Advantage相机的FEI Morgani透射电子显微镜以44,000X放大倍数获取图像。如图2中所示，当向重组大肠杆菌FtsZ添加GTP时，诱导FtsZ聚合。然而，在存在化合物1的情况下，聚合和原丝形成被抑制，并且在整个格栅上没有观察到细丝（图3）。
还测试了化合物1影响微管蛋白聚合的能力。将已知的微管稳定剂（紫杉醇）和破坏剂（诺考达唑）在标准化浓度下进行测试，同时对150μM的克利斯汀1进行测试，该浓度比其抑制FtsZ的IC50值高15倍。使用DMSO（2.5%）作为对照。如图9中所示，发现克利斯汀1对微管蛋白聚合没有影响。速度被示出在表8中。
表8
化合物 v(min-1)
紫杉醇 80
诺考达唑 12
克利斯汀1 49
DMSO（对照） 46
实施例4
通过饱和转移差异NMR研究FtsZ的抑制方式
饱和转移差异（STD）NMR是提供被小分子配体用来结合其大分子（蛋白质）受体的表位的原子水平详情的NMR技术。使用STD NMR对与重组FtsZ复合的化合物1的结合表位进行作图。使用含有10μMFtsZ的NMR样品，在存在80-100倍过量的化合物1、20mM NaPO4、50mM NaCl、pH6.8的条件下进行测量。对于共振辐射来说使用设定在–1或12ppm处的介质，对于非共振辐射来说使用设定在50ppm处的介质，在298K下记录波谱。使用各自相隔1ms延迟时间的一串50ms的高斯型脉冲，在实验确定的最适功率（49dB）下实现选择性蛋白质饱和（持续时间在1至5s范围内）；引入T1ρ滤波器（30ms）以抑制蛋白质共振。使用最少512次扫描和4000个点以确保具有良好信噪比的高质量数据。独立地对共振和非共振谱进行处理，并将其差减以提供差异谱。将叠加谱向给出最强增强（图4）的H-3（δ6.85）的信号归一化。STD增强通过对差异谱进行积分来测量，在所述差异谱中，使用相对于对照谱来说显示出最强增强的峰来归一化差异谱中所有不重叠的峰。化合物1结合于FtsZ的STD增强被示出在图10中。有阴影的圆圈指示与FtsZ紧密相邻的质子，其中圆圈的大小与增强百分数成正比。
在独立的实验中，将一种由x-射线结构已知结合在FtsZ的GTP结合位点中的不可切开的GTP类似物鸟苷5'-(γ-硫代)三磷酸（GTPγS）滴定在含有FtsZ和化合物1的复合物的样品中，如上所述记录STDNMR实验。波谱示出在图5中，其中谱A是克利斯汀1（1.25mM）在存在FtsZ（12.5μM）并且没有GTPγS的情况下的扩展的1H STD NMR谱，谱B-E从分别包括0.5、1.0、2.0和3.0当量的GTPγS的样品获得。在添加硫代GTP后，对应于属于化合物1的信号的增强在强度上减小，而被指派给硫代GTP的关键信号强度增加。因此，化合物1是GTP结合于FtsZ的竞争性抑制剂，并且结合在FtsZ的GTP结合位点中。
为了支持这些实验发现，使用多种细菌FtsZ结构和化合物1的坐标进行分子对接。在所有情形中，最低能量对接造型对应于其中抑制剂对接在FtsZ的GTP结合位点中的复合物（图6A和6B）。此外，在这些模型中结合的取向与STD NMR实验相一致，其中表现出最大增强的质子位于与蛋白质最接近的位置处。这一信息揭示出化合物1的作用方式和结合表位，利用从这些实验提供的信息，这两者可用于进一步药物化学优化或计算机模拟筛选（in silico screening）。
实施例5
(E)-5-(2-氯-4-(4-氯-2,5-二羟基苯基)丁-2-烯基)-苯-1,3-二醇的合成
合成了具有下列结构的通式IX的化合物。
Figure BDA0000398206280000601
通述。除非另有注明，否则所有对水分敏感的反应使用注射器-隔膜技术，在无水N2或无水氩气气氛下进行。所有玻璃器皿在使用前在140℃烘箱中干燥至少6h，或在无水氮气气氛下火焰干燥。使用CO2/丙酮浴，在-78℃下进行反应。将Et2O和四氢呋喃在氩气气氛下，在钠/二苯甲酮上通过蒸馏进行干燥。无水二氯甲烷通过活性氧化铝柱进行过滤来纯化。使用冷冻/泵浦/融化方法（3x）来制备所有脱气溶剂。甲醇、乙腈和N,N-二甲基甲酰胺被储存在分子筛（3
Figure BDA0000398206280000602
）上。氘化氯仿被储存在无水碳酸钾上。反应通过TLC分析（预涂覆硅胶60F254板，层厚度为250μm）来监测，并通过使用UV灯（254nm）或通过用Vaughn试剂（4.8g(NH4)6Mo7O24·4H2O和0.2g Ce(SO4)2在100mL3.5NH2SO4中）或高锰酸钾溶液（1.5g KMnO4和1.5g K2CO3在100mL0.1%NaOH溶液中）染色进行可视化。使用40-63μm硅胶（Silicycle）进行快速柱层析。微波反应在Biotage Initiator微波反应器上进行。红外光谱在Smiths Detection Identify IR FT-IR光谱仪（ATR）上测得。除非另有指明，否则所有NMR数据在室温下，在CDCl3或(CD3)2CO中，在300、400、500、600或700MHz Bruker仪器上收集。化学位移（δ）以百万分之几（ppm）为单位报告，使用内部CHCl3（1H为δ7.26ppm，13C为77.00ppm）、内部丙酮（1H为δ2.05ppm，13C为29.85ppm）或内部DMSO（1H为δ2.50ppm，13C为39.52）作为参比。1H NMR数据如下报告：化学位移，多重性（s=单峰，bs=宽的单峰，d=二重峰，t=三重峰，q=四重峰，m=多重峰，dd=两个二重峰，dt=两个三重峰，td=三个二重峰，qd=四个二重峰，sep=七重峰)，积分，和以赫兹（Hz）为单位的耦合常数（J）。
Figure BDA0000398206280000611
路线1–化合物3和9的多克级合成
4-氯-2,5-二甲氧基苯甲醛。（Wright等，J.Am.Chem.Soc.2008,130,16786-16790；Bloomer等；J.Org.Chem.1993,58,7906-7912）。在室温下，向2-氯-1,4-二甲氧基苯（25.0g，0.145mol，1当量）和六亚甲基四胺（20.5g，0.145mol，1当量）的搅拌的溶液小心地加入TFA（250mL）。将得到的黄色悬液加热至95℃并将其搅拌5h。5h后，将热的棕色溶液倒入含有约250g碎冰的2L Erlenmeyer烧瓶中。以5-10g的部分经2小时向剧烈搅拌的混合物小心地加入固体NaHCO3（243g，2.90mol，20当量）。将得到的黄色沉淀物通过硅藻土过滤，用水洗涤并溶解在Et2O中。将有机层用水、盐水洗涤，干燥（MgSO4），过滤，并在减压下浓缩，得到29.0g（得率100%）作为灰白色固体的所需产物：Mp109-109℃；Rf0.70（EtOAc/己烷，3:7）；IR（纯净）2941,2874,1664,1601,1575,1497,1478,1461,1389,1269,1213,1023,977cm-1；1HNMR(400MHz,CDCl3)δ10.35(s,1H),7.33(s,1H),3.87(s,6H)；13CNMR(100MHz,CDCl3)δ188.4,156.1,149.4,130.4,123.4,114.5,109.9,56.5,56.3；HRMS(EI+)m/z对C9H9O3Cl的计算值为200.0240，实测值为200.02377。特性与Bloomer等所报道的（J.Org.Chem.1993,58,7906-7912）相匹配。
(4-氯-2,5-二甲氧基苯基)甲醇（2）。向4-氯-2,5-二甲氧基苯甲醛（29.0g，145mmol，1当量）在无水乙醇（550mL）中的搅拌的溶液加入硼氢化钠（27.3g，723mmol，5当量）。允许反应在室温下搅拌6h，并通过逐滴加入丙酮来缓慢淬灭。将反应混合物用EtOAc稀释，用盐水洗涤（x2），干燥（MgSO4），过滤，并在减压下浓缩。将粗残留物在SiO2上通过层析进行纯化（EtOAc/己烷，1:1），得到28.0g（得率96%）作为白色固体的2：Mp89-90℃；Rf0.53（EtOAc/己烷，1:1）；IR（纯净）3258,2958,2915,1495,1461,1392,1204,1061,719cm-1；1H NMR(300MHz,CDCl3)δ6.90(s,1H),6.80(s,1H),4.55(d,2H,J=4.2Hz),3.77(s,3H),3.71(s,3H),3.10(bs,1H)；13C NMR(75MHz,CDCl3)δ150.6,148.7,128.4,120.8,112.5,112.4,60.3,56.5,55.6；HRMS(ESI+)m/z对C9H12O3Cl的计算值为203.0475，实测值为203.0465。
1-(溴甲基)-4-氯-2,5-二甲氧基苯（3）。（Bloomer等，TetrahedronLett.1989,30,1201-1204）。在0℃下，向2（5.00g，24.7mmol，1当量）在CH2Cl2（125mL）中的搅拌的溶液逐滴加入HBr（47-49%溶液；4.13mL，74.0mmol，3当量）。允许得到的溶液缓慢升温至室温并搅拌过夜（～16h）。第二天早上，向反应混合物加入第二批HBr（47-49%溶液；4.13mL，74.0mmol，3当量），允许其继续搅拌4h。将粗混合物用Et2O提取（x2），用水、饱和NaHCO3水溶液、盐水洗涤，干燥（MgSO4），过滤，并在减压下浓缩，得到6.55g（得率100%）作为白色固体的3：Mp85-88℃；Rf0.31（EtOAc/己烷，3:7）；IR（纯净）2962,2947,2844,1732,1582,1495,1458,1443,1389,1301,1204,1182,1033,882cm-1；1H NMR(400MHz,CDCl3)δ6.91-6.90(m,2H),4.50(s,2H),3.84(s,3H),3.82(s,3H)；13C NMR(75MHz,CDCl3)δ151.3,148.9,125.1,123.2,114.6,113.6,56.6,56.2,28.2。
3,5-二甲氧基苯甲醇（5）。将氢化锂铝（13.1g，329mmol，2当量）在无水THF（400mL）中的搅拌的悬液在0℃冷却。通过加液漏斗经45min加入3,5-二甲氧基苯甲酸（30.0g，164mmol，1当量）在无水THF（400mL）中的溶液。在添加完成后，反应变成灰色非均质混合物，因此再加入300mL THF。允许反应混合物升温至室温并搅拌5h。使用添加的酒石酸Na/K饱和水溶液将反应混合物淬灭。允许得到的混合物在室温下搅拌1h并分离有机层。将剩余的水性层用EtOAc提取（x2）。将合并的有机层干燥（MgSO4），过滤，并在减压下浓缩，以得到27.0g（得率97%）作为无色油状物的产物5：Rf0.33（EtOAc/己烷，1:2）；IR(CDCl3)3390,2937,1594,1456,1428,1318,1294,1202,1146,1057,829cm-1；1H NMR(600MHz,CDCl3)δ6.45(d,2H,J=2.4Hz),6.32(d,1H,J=2.4Hz),4.50(d,2H,J=5.4Hz),3.71(s,6H),3.49(t,1H,J=5.4Hz)；13C NMR(150MHz,CDCl3)δ160.5,143.3,104.2,99.2,64.5,55.0。
3,5-二甲氧基苯甲基溴（6）。（Snyder等，Angewandte ChemieInternational Edition2007,46,8186-8191）。在0℃下向5（17.5g，104mmol，1当量）在CH2Cl2（500mL）中的搅拌的溶液逐滴加入PBr3（12.1mL，125mmol，1.2当量）。允许反应混合物缓慢升温至室温并搅拌3h。将粗混合物用饱和NaHCO3水溶液淬灭，并允许其在室温下搅拌1h。分离有机层，并将水性层用Et2O提取。将有机层合并，干燥（MgSO4），过滤，并在减压下浓缩，以得到22.2g（得率92%）作为白色固体的6：Mp70-72℃；Rf0.75（EtOAc/己烷，1:2）；IR(CDCl3)2999,2954,1596,1458,1428,1345,1323,1297,1204,1152,1062,930cm-1；1H NMR(400MHz,CDCl3)δ6.54(d,2H,J=2.0Hz),6.39(d,1H,J=2.4Hz),4.42(s,2H),3.79(s,6H)；13C NMR(150MHz,CDCl3)δ160.9,139.7,106.9,100.6,55.4,33.6。特性与Snyder等所报道的（Angewandte ChemieInternational Edition2007,46,8186-8191）相匹配。
(3-(3,5-二甲氧基苯基)丙-1-炔基)三甲基硅烷（7）。在0℃下向乙炔基三甲基硅烷（39.1mL，277mmol，4当量）在THF（120mL）中的搅拌的溶液加入乙基溴化镁（3.16M，在Et2O中；87.6mL，277mmol，4当量）。允许反应升温至室温并搅拌30min。在室温下30min后，加入CuBr（9.93g，69.2mmol，1当量），并允许反应在室温下继续搅拌15min，然后加入3,5-二甲氧基苯甲基溴（16.0g，69.2mmol，1当量）。将得到的混合物加热回流过夜（20h）。将反应用Et2O稀释，小心地用盐水淬灭，并用Et2O提取（x2）。将合并的有机层用饱和NH4Cl水溶液、盐水洗涤，干燥（MgSO4），过滤并在减压下浓缩。将粗混合物在SiO2上通过层析进行纯化（EtOAc/己烷，1:10），得到17.2g（得率100%）作为浅黄色油状物的7：Rf0.41（EtOAc/己烷，1:20）；IR（纯净）2956,2898,2175,1754,1596,1459,1428,1204,1156,1122,1101,839cm-1；1H NMR(400MHz,CDCl3)δ6.53(d,2H,J=2.4Hz),6.34(t,1H,J=2.4Hz),3.79(s,6H),3.60(s,2H),0.19(s,9H)；13CNMR(100MHz,CDCl3)δ160.8,138.7,105.9,104.0,98.7,87.1,55.3,26.3,0.1；HRMS(ESI+)m/z对C14H21O2Si的计算值为249.1311，实测值为249.1287。
1,3-二甲氧基-5-(丙-2-炔基)苯。将7（5.37g，21.6mmol，1当量）溶解在THF（100mL）中并加入AcOH（4.99mL，86.5mmol，4当量），然后逐滴加入TBAF（1M，在THF中；86.5mL，86.5mmol，4当量）。允许得到的反应在室温下搅拌24h。将反应用Et2O稀释，用盐水洗涤（x2），干燥（MgSO4），过滤并在减压下浓缩。将粗混合物在SiO2上通过层析进行纯化（EtOAc/己烷，1:10），以得到3.85g（得率100%）作为无色油状物的所需产物：Rf0.36（EtOAc/己烷，1:10）；IR(CDCl3)3286,2999,2954,1593,1457,1428,1344,1323,1288,1204,1154,1064,827；1H NMR(400MHz,CDCl3)δ6.53(d,2H,J=2.4Hz),6.35(t,1H,J=2.4Hz),3.79(s,6H),3.56(d,2H,J=2.8Hz),2.20(t,1H,J=2.8Hz)；13C NMR(100MHz,CDCl3)δ160.9,138.3,105.9,98.7,81.7,70.6,55.3,25.0；HRMS(EI+)m/z对C11H12O2的计算值为176.0837，实测值为176.0834。
5-(丙-2-炔基)-1,3-亚苯基双(2,2-二甲基丙酸酯)（8）。在0℃下，通过加液漏斗经1h向1,3-二甲氧基-5-(丙-2-炔基)苯（6.50g，36.9mmol，1当量）在CH2Cl2（1200mL）中的搅拌的溶液加入BBr3（1M，在CH2Cl2中；92.2mL，92.2mmol，5当量）。允许反应升温至室温并搅拌过夜（～16h）。将反应混合物用饱和NaHCO3水溶液（500mL）小心地淬灭，并允许淬灭混合物在室温下搅拌4h。将溶液用HCl重新酸化，并用CH2Cl2提取。分离有机层，并将水性层用EtOAc提取。将合并的有机层干燥（MgSO4），过滤并在减压下浓缩。将粗混合物溶解在CH2Cl2（180mL）中，并加入三乙胺（20.9mL，148mmol，4当量）和PivCl（11.6mL，92.2mmol，2.5当量）。允许得到的溶液在室温下搅拌1.5h。将反应混合物用盐水稀释并分离有机层。将水性层用EtOAc提取。将合并的有机层干燥（MgSO4），过滤并在减压下浓缩。将粗混合物在SiO2上通过层析进行纯化（EtOAc/己烷，1:10），以得到9.6g（得率82%）作为无色油状物的8：Rf0.85（EtOAc/己烷，3:7）；IR（纯净）3293,2973,1806,1750,1414,1452,1396,1366,1269,1118,1098,1031,1003cm-1；1H NMR(300MHz,CDCl3)δ6.95(d,2H,J=1.8Hz),6.76(t,1H,J=1.8Hz),3.61(d,2H,J=2.4Hz),2.21(t,1H,J=2.4Hz)；13C NMR(75MHz,CDCl3)δ176.6,151.5,138.3,118.3,113.8,80.7,71.2,39.1,27.1,24.5；HRMS(EI+)m/z对C19H24O4的计算值为316.1675，实测值为316.1670。
(E)-5-(2-氯-3-碘烯丙基)-1,3-亚苯基双(2,2-二甲基丙酸酯)（9）。在0℃下向8（9.50g，30.0mmol，1当量）在无水CH2Cl2（150mL）中的搅拌的溶液加入ICl（1M，在CH2Cl2中；30.0mL，30.0mmol，1当量）。允许反应混合物升温至室温，并在室温下避光（包封在铝箔中）搅拌3h。将反应混合物用Et2O稀释，用Na2SO4（x2）、盐水洗涤，干燥（MgSO4），过滤并在减压下浓缩。将粗混合物在SiO2上通过层析进行纯化（EtOAc/己烷，1:10），以得到13.7g（得率95%）作为烯烃几何异构体的2:1混合物的无色油状物9：Rf0.54（EtOAc/己烷，1:10）；IR（纯净）3277,2934,2872,1746,1592,1497,1461,1409,1269,1207,1122,1103,1032,975,723cm-1；1H NMR(300MHz,CDCl3)δ6.87(d,2H,J=1.5Hz),6.80(t,1H,J=2.1Hz),6.62(s,1H),3.90(s,2H),1.35(s,18H)；13C NMR(100MHz,CDCl3)δ176.6,151.6,137.9,135.6,119.0,114.2,74.8,44.2,39.1,27.1；HRMS(ESI+)m/z对C19H24O4NaClI的计算值为501.0306，实测值为501.0308。注：上面只示出了主要烯烃几何异构体的1H和13C数据。
Figure BDA0000398206280000661
路线2–Negishi偶联的优化
(E)-5-(2-氯-4-(4-氯-2,5-二甲氧基苯基)丁-2-烯基)-1,3-亚苯基双(2,2-二甲基丙酸酯)（10）。在火焰干燥的烧瓶中装入催化量的碘和活性锌（0.513g，7.69mmol，8当量）。将烧瓶加热（本生燃烧器）直至紫色气体覆盖烧瓶的内部。允许烧瓶冷却至室温，并加入无水脱气DMF（1mL），然后加入3（1.02g，3.84mmol，4当量），然后加入第二催化量的碘，允许反应在室温下搅拌15min。在独立的干燥烧瓶中装入9（0.460g，0.961mmol，1当量）、Pd(OAc)2（0.0108g，0.0480mmol，0.05当量）、无水脱氧DMF（0.8mL）和P(o-tol)3（0.0301g，0.0961mmol，0.1当量）。允许混合物在室温下搅拌10min。然后将活性有机锌试剂注射去除过量的Zn，过滤以去除任何残留的固体锌，并插管到碘乙烯溶液混合物上。将得到的溶液在微波中加热（80℃25min）。允许得到的溶液冷却至室温，并在SiO2上通过层析进行直接纯化（EtOAc/己烷，1:20至1:10），以得到0.16g（得率33%）作为无色油状物以及与Wurtz偶联产物的不可分离的混合物的10：Rf0.37（EtOAc/己烷，1:10）；1H NMR(600MHz,CDCl3)δ6.89(s,1H),6.87(s,1H),6.80(d,2H,J=2.4Hz),6.76(t,1H,J=2.4Hz),5.94(t,1H,J=7.8Hz),3.80(s,3H),3.78(s,3H),3.74(s,2H),3.43(d,2H,J=14.4Hz),1.33(s,18H)。
路线3–串联的Negishi偶联和去保护的最终优化
(E)-5-(2-氯-4-(4-氯-2,5-二甲氧基苯基)丁-2-烯基)苯-1,3-二醇（13）。在火焰干燥的微波管中装入9（0.520g，1.08mmol，1当量）、Pd(OAc)2（0.0122g，0.0543mmol，0.05当量）、P(o-tol)3（0.0341g，0.109mmol，0.1当量）和蒸馏并脱气的DMF（0.8mL）。允许反应混合物在室温下搅拌10min。在独立的干燥烧瓶中，将催化量的碘（～20mg）和锌（0.362g，5.43mmol，5当量）加热（本生燃烧器）直至紫色气体覆盖烧瓶的内部。允许烧瓶冷却至室温，并加入蒸馏且脱气的DMF（1mL），然后加入3（1.15g，4.34mmol，4当量）。允许混合物在氩气下在室温搅拌6分钟。将活性有机锌通过干燥烧结过滤器过滤，并插管到9、钯和膦配体的搅拌的溶液中。将得到的溶液在微波中加热（2min，120℃）。接下来，将溶液从微波中取出，并加入第二批Pd(OAc)2（0.0122g，0.0543mmol，0.05当量）。使得到的黑色混合物重新经历微波条件（2min，120℃）。将粗反应混合物在SiO2上通过层析进行直接纯化（EtOAc/己烷，1:20），以得到粗品黄色油状物。将粗品油状物立即溶解在MeOH/CH2Cl2（4mL，2:1）中，并加入Cs2CO3（1.67g，5.08mmol，5当量）。允许反应混合物在室温下搅拌6h，然后用EtOAc稀释并用HCl酸化。分离有机层，并将酸化的水溶液用EtOAc提取（x2）。将合并的有机层用盐水洗涤，干燥（MgSO4），过滤并在减压下浓缩。将粗品混合物在SiO2上通过层析进行纯化（氯仿/丙酮，8:2），以得到0.192g（得率51%）作为黄色油状物的13。使用半制备（250x10mm）硅胶柱通过SFC层析获得分析纯样品（RT=5.80min，10mL/min，15%甲醇，220nm检测）：Rf0.48（丙酮/氯仿，2:8）；IR（丙酮）3375,3001,2952,1696,1599,1495,1463,1387,1212,1156,1034,1010cm-1；1H NMR(600MHz(CD3)2CO)δ8.18(bs,2H),7.02(s,1H),6.99(s,1H),6.30(s,2H),6.25(s,1H),5.88(t,1H,J=7.8Hz),3.84(s,3H),3.81(s,3H),3.73(s,2H),3.51(d,2H,J=7.8Hz)；13C NMR(150MHz,CDCl3)δ159.5,152.3,150.0,140.6,133.7,128.1,128.1,120.8,115.5,113.8,108.0,101.8,56.9,56.5,40.2,29.5；HRMS(ES-)[M+Cl]-m/z对C18H18O4Cl3的计算值为403.0271，实测值为403.0295。
Figure BDA0000398206280000691
路线4–用于13的去甲基化的去保护条件的筛选
(E)-5-(2-氯-4-(4-氯-2,5-二羟基苯基)丁-2-烯基)苯-1,3-二醇（14）。将13（0.0500g，0.135mmol，1当量）在CH2Cl2（7mL）中的搅拌的溶液包封在铝箔中并冷却至0℃。向搅拌的溶液逐滴加入BBr3（1M，在CH2Cl2中；0.677mL，0.677mmol，5当量）。允许得到的溶液缓慢升温至室温并搅拌18h。将反应混合物用饱和NaHCO3水溶液（8mL）淬灭，并允许其在室温下继续搅拌1小时。将溶液用HCl酸化，用EtOAc提取（x2），并将合并的有机层干燥（MgSO4），过滤，在减压下浓缩。将粗产物在SiO2上通过层析进行纯化（氯仿/丙酮，3:1），以得到0.0462g（得率96%）作为浅黄色薄膜的14。使用半制备（250x10mm）硅胶柱通过SFC层析获得分析纯样品（RT=4.68min，8mL/min，25%甲醇，220nm检测）：Rf0.15（丙酮/氯仿，2:8）；IR（纯净）3343,1692,1599,1495,1417,1329,1184,1143,1005,822cm-1；1H NMR(600MHz(CD3)2CO)δ8.17(bs,4H),6.86(s,1H),6.84(s,1H),6.29(d,2H,J=2.4Hz),6.32(t,1H,J=7.8Hz),3.69(s,2H),3.47(d,2H,J=7.8Hz)；13C NMR(150MHz,CDCl3)δ159.5,149.0,146.9,140.5,133.7,128.0,127.0,118.5,118.5,116.7,108.0,101.8,40.2,29.5；HRMS(ES-)[2M-H]-m/z对C32H27O8Cl4的计算值为679.0460，实测值为679.0482。
实施例6
克利斯汀类似物的抗微生物测试和GTPase活性
如实施例5中所述合成了两种克利斯汀类似物(E)-5-(2-氯-4-(4-氯-2,5-二甲氧基苯基)丁-2-烯基)苯-1,3-二醇（J23）和(E)-5-(2-氯-4-(4-氯-2,5-二羟基苯基)丁-2-烯基)-苯-1,3-二醇（J24）。
Figure BDA0000398206280000701
测试了化合物J23和J24针对枯草芽孢杆菌（BS，ATCC49343）、金黄色葡萄球菌（SA，ATCC25923）、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA，ATCC BAA-41）、多药耐药金黄色葡萄球菌（MDRSA，ATCCBAA-44）、大肠杆菌（EC，ATCC8739）、包膜缺陷型大肠杆菌（envA-EC；可渗透（envA-）BL21(DE3)pLysS大肠杆菌[使用标准的P1转导方法，利用与envA1基因相连的Tn10转座子构建]；Wang等，J.Biol.Chem.2003,278(45):44424-44428）、金黄色葡萄球菌的临床分离株（UAMS-1；临床骨髓炎分离株；Olson等，PLoS Pathogens2011,7(2):e1001287，www.plospathogens.org）和MRSA的临床分离株（USA300；菌株USA300-0114是美国社区相关的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌感染的主要原因）的抗微生物活性。按照实施例2中所述使用微量肉汤稀释测定法测定MIC50值。将大肠杆菌生长在Mueller Hinton II肉汤中。两种化合物表现出相似的抗微生物活性。结果示出在表9中。
表9
化合物J23和J24的抗微生物数据
Figure BDA0000398206280000711
还使用如实施例3中所描述的GTPase测定法，测试了化合物J23和J24对FtsZ的体外抑制。结果示出在表10中。
表10
Figure BDA0000398206280000712
两种化合物表现出FtsZ的体外抑制。然而，化合物J23的效力显著高于化合物J24。
实施例7
使用所公开的化合物的治疗
选择患有细菌感染的患者进行治疗。患者可能具有表明感染有对疗法具有响应性的生物体的临床表现。所述临床表现可以包括例如发热，咳嗽，泌尿道感染，胃肠不适例如恶心、呕吐和/或腹泻，和/或皮肤感染的证据例如化脓、溃烂或溃疡的伤口、疡肿、脓疱，或表明蜂窝组织炎的皮肤炎症。可以根据临床判断，或在开始治疗之前进行抗微生物敏感性体外测定来选择用于治疗的患者。例如，患者可能具有表明金黄色葡萄球菌感染的明显的蜂窝组织炎。在其他情形中，根据培养物证实的生物体对克利斯汀化合物的敏感性或检测克利斯汀治疗可能对其有益的生物体例如金黄色葡萄球菌或屎肠球菌感染的其他实验室测试（例如DNA分析），来选择患者（参见例如实施例6）。在某些情况下，患者可能被耐药细菌例如耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）、多药耐药金黄色葡萄球菌（MDRSA）或耐万古霉素屎肠球菌感染。或者，可以选择在使用甲氧西林、万古霉素或其他抗生素的治疗失败后的患者。
通过以被临床医生确定为治疗有效的剂量施用包含至少一种克利斯汀的组合物，来治疗患者。克利斯汀可以是如上所述的任一种结构I-XI的化合物，例如克利斯汀1-8中的一种或多种。组合物还可以包括一种或多种如上所述的第二药剂。在某些情况下，第二药剂与克利斯汀分开施用，或者甚至可以通过不同途径施用。可以通过静脉内、口服、表面或通过栓剂直肠施用组合物来治疗患者。对于严重感染来说，施用途径通常是静脉内施用，并且治疗持续时间为足以治愈感染或以其他方式改善患者的临床状况的时间长度。
实施例8
鉴定需要使用所公开的化合物治疗的对象
选择被怀疑患有细菌感染的患者进行评估。可以根据表明感染有对疗法有响应的生物体的临床表现（如实施例5中所述）来选择患者。在使用包含至少一种克利斯汀的组合物开始治疗之前，从患者获得样本。取决于患者的临床表现和临床医生的评估，样本可以是血液样品、尿液样品、痰液样品、粪便样品、伤口培养物、咽拭子、鼻拭子或任何其他适合的样本。
样本可以在任何适合的培养基中培养。例如，样本可以铺展在营养物质（例如琼脂）板上，并允许其生长有效的时间长度以产生细菌菌苔。可以通过检查菌苔特性（颜色、质地、生长模式等）、革兰氏染色、Ziehl-Neelsen染色、显微镜检查、代谢/营养需求以及甚至DNA测序来鉴定细菌菌种。也可以通过将浸渍有包括克利斯汀化合物在内的各种类型抗生素的滤纸和/或琼脂小圆片放置在细菌菌苔上，来确定细菌对各种抗生素的敏感性。然后可以将细菌温育有效的时间段（例如1至2天），然后可以对板进行检查，以观察细菌生长是否被一种或多种抗生素圆片抑制。对抗生素的敏感性可以通过抗生素圆片周围的透明“晕”或抑制区来确定，所述透明“晕”或抑制区表明抗生素抑制细菌生长和/或杀死细菌。圆片周围略微云雾状的区域可能表明样品中的一些细菌菌种对抗生素敏感，而其他细菌菌种对这种抗生素耐受。
如果样本包含已知对克利斯汀敏感的细菌，和/或如果样本中的细菌菌种显示出对一种或多种克利斯汀的敏感性，则可以如上面实施例5中所述用克利斯汀对患者进行治疗。如果临床医生强烈怀疑患者可能患有克利斯汀治疗对其有效的细菌感染，临床医生可以开始以被临床医生确定为治疗有效的剂量，用包含至少一种克利斯汀的组合物治疗患者，并在同时等待培养物和敏感性测试的结果。
所公开的化合物的实施方式可以具有如本文中所述的式VII、VIII、IX、X或XI的结构。在一种实施方式中，化合物具有式IX的结构，并且每个R1是羟基，R2和R4独立地是卤素，R5是氢或卤素，并且R9、R10和R11中的至少一个是氢。在另一种实施方式中，化合物具有式VII或VIII的结构，并且每个R1是羟基，R2和R4独立地是卤素，R5是氢或卤素，并且每个R6是=CH2。在另一种实施方式中，化合物具有式X或XI的结构，X1和Y1一起形成L，并且L由以下通式表示
Figure BDA0000398206280000741
其中R5是氢、羟基、硫醇或卤素。在另一种实施方式中，化合物是下式的化合物
Figure BDA0000398206280000742
药物组合物的实施方式包含药学可接受的载体以及治疗有效量的至少一种本文中所描述的式VII、VIII、IX、X或XI的化合物或其药学可接受的盐、水合物或溶剂化物，其中所述药物组合物在应用于细菌时能够抑制细菌细胞生长。在某些实施方式中，药物组合物还包含治疗有效量的除了所述化合物之外的第二药剂。在某些实施方式中，所述第二药剂是抗微生物剂。在某些实施方式中，所述第二药剂有效对抗革兰氏阴性细菌细胞。在任何或所有上述实施方式中，第二药剂可以提高所述化合物渗透进入细菌。
用于抑制细菌细胞生长的方法的实施方式包括将细菌暴露于有效量的组合物，所述组合物包含本文中所描述的式VII、VIII、IX、X或XI的化合物或其药学可接受的盐、水合物或溶剂化物。在某些实施方式中，所述细菌是耐药细菌。在某些实施方式中，所述耐药细菌是耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、多药耐药金黄色葡萄球菌或耐万古霉素屎肠球菌。
在任何或所有上述实施方式中，所述方法还可以包括将细菌暴露于有效量的除了所述化合物之外的第二药剂。在某些实施方式中，所述第二药剂被包含在组合物中。在任何或所有上述实施方式中，所述第二药剂可以是抗微生物剂。在某些实施方式中，所述抗微生物剂有效对抗革兰氏阴性细菌细胞。在任何或所有上述实施方式中，第二药剂可以提高所述化合物渗透进入细菌。
在任何或所有上述实施方式中，将细菌暴露于有效量的组合物可以包括向被鉴定为需要对已知或怀疑的细菌感染进行抗微生物治疗的对象施用治疗有效量的组合物。在某些实施方式中，在向对象施用组合物之前，所述对象被鉴定为具有对使用所述化合物的治疗敏感的细菌。在某些实施方式中，将除了所述化合物之外的第二药剂独立地施用于对象。
用于制造其中R1是羟基，R2和R4独立地是卤素并且R9、R10和R11是氢的式IX的化合物的方法的实施方式包括（1）将2-卤代-1,4-二甲氧基苯转变成1-(卤代甲基)-4-卤代-2,5-二甲氧基苯，其中2-卤代-1,4-二甲氧基苯的卤素和1-(卤代甲基)-4-卤代-2,5-二甲氧基苯的4-卤代对应于化合物的R2，（2）将3,5-甲氧基苯甲酸转变成(E)-5-(2-卤代-3-碘烯丙基)-1,3-亚苯基双(2,2-二甲基丙酸酯)，其中(E)-5-(2-卤代-3-碘烯丙基)-1,3-亚苯基双(2,2-二甲基丙酸酯)的卤素对应于化合物的R4，（3）将1-(卤代甲基)-4-卤代-2,5-二甲氧基苯与(E)-5-(2-卤代-3-碘烯丙基)-1,3-亚苯基双(2,2-二甲基丙酸酯)反应以产生(E)-5-(2-卤代-4-(4-卤代-2,5-二甲氧基苯基)丁-2-烯基)-1,3-亚苯基双(2,2-二甲基丙酸酯)，以及（4）将(E)-5-(2-卤代-4-(4-卤代-2,5-二甲氧基苯基)丁-2-烯基)-1,3-亚苯基双(2,2-二甲基丙酸酯)去甲基化以产生所述化合物。
在某些实施方式中，将2-卤代-1,4-二甲氧基苯转变成1-(溴甲基)-4-卤代-2,5-二甲氧基苯包括（1）将2-卤代-1,4-二甲氧基苯羰基化以产生4-卤代-2,5-二甲氧基苯甲醛，（2）将4-卤代-2,5-二甲氧基苯甲醛还原以产生(4-卤代-2,5-二甲氧基苯基)甲醇，以及（3）将(4-卤代-2,5-二甲氧基苯基)-甲醇与选自氢溴酸、盐酸或氢碘酸的无机酸进行反应以产生1-(卤代甲基)-4-卤代-2,5-二甲氧基苯。
在任何或所有上述实施方式中，将3,5-甲氧基苯甲酸转变成(E)-5-(2-卤代-3-碘烯丙基)-1,3-亚苯基双(2,2-二甲基丙酸酯)可以包括（1）将3,5-甲氧基苯甲酸还原以产生3,5-二甲氧基苯甲醇，（2）将3,5-二甲氧基苯甲醇溴化以产生3,5-二甲氧基苯甲基溴，（3）将3,5-二甲氧基苯甲基溴与乙炔基三甲基硅烷反应以产生(3-(3,5-二甲氧基苯基)丙-1-炔基)三甲基硅烷，（4）将(3-(3,5-二甲氧基苯基)丙-1-炔基)三甲基硅烷脱甲硅烷基化以产生1,3-二甲氧基-5-(丙-2-炔基)苯，（5）向1,3-二甲氧基-5-(丙-2-炔基)苯添加保护基团以生产5-(丙-2-炔基)-1,3-亚苯基双(2,2-二甲基丙酸酯)，其中所述保护基团是通过将1,3-二甲氧基-5-(丙-2-炔基)苯与三溴化硼反应、然后与新戊酰氯反应而添加的新戊酰基，以及（6）将5-(丙-2-炔基)-1,3-亚苯基双(2,2-二甲基丙酸酯)卤化以产生(E)-5-(2-卤代-3-碘烯丙基)-1,3-亚苯基双(2,2-二甲基丙酸酯)，其中2-卤素对应于R4。
在任何或所有上述实施方式中，将1-(溴甲基)-4-卤代-2,5-二甲氧基苯与(E)-5-(2-卤代-3-碘烯丙基)-1,3-亚苯基双(2,2-二甲基丙酸酯)反应以产生(E)-5-(2-卤代-4-(4-卤代-2,5-二甲氧基苯基)丁-2-烯基)-1,3-亚苯基双(2,2-二甲基丙酸酯)可以包括（1）将1-(溴甲基)-4-卤代-2,5-二甲氧基苯与催化量的碘和活性锌反应以产生活性有机锌试剂，（2）从活性有机锌试剂去除未反应的锌，（3）将活性有机锌试剂与(E)-5-(2-卤代-3-碘烯丙基)-1,3-亚苯基双(2,2-二甲基丙酸酯)合并以产生混合物，以及（4）将混合物加热以产生(E)-5-(2-卤代-4-(4-卤代-2,5-二甲氧基苯基)丁-2-烯基)-1,3-亚苯基双(2,2-二甲基丙酸酯)。
在任何或所有上述实施方式中，将(E)-5-(2-卤代-4-(4-卤代-2,5-二甲氧基苯基)丁-2-烯基)-1,3-亚苯基双(2,2-二甲基-丙酸酯)去甲基化以产生所述化合物可以包括将(E)-5-(2-卤代-4-(4-卤代-2,5-二甲氧基苯基)丁-2-烯基)-1,3-亚苯基双(2,2-二甲基丙酸酯)与选自BBr3、AlCl3、吡啶·HCl、LiS(CH(CH3)2)或LiCl的去甲基化试剂进行反应。
鉴于所公开的发明的原理可以适用于许多可能的实施方式，因此应该认识到，示出的实施方式仅仅是本发明的优选实施例，而不应被当作限制本发明的范围。相反，本发明的范围由权利要求书限定。因此，我们要求在权利要求书的范围和精神之内的所有内容作为我们的发明。

Claims (27)

1.化合物，其为式IX、VII、VIII、X或XI的化合物
Figure FDA0000398206270000011
其中每个R1独立地是氢、羟基、硫醇、卤素、低级烷基、低级烷氧基或低级烷基酯；R2、R3、R4和R5独立地是氢、羟基、硫醇或卤素；每个R6独立地是氧或–CR7R8，其中R7和R8独立地是氢或低级烷基；R9、R10和R11独立地是氢、羟基、硫醇、卤素、低级烷氧基或–B(OH)2；并且X1和Y1独立地是氢、羟基、硫醇、取代的脂族基团、未取代的脂族基团、取代的芳基、未取代的芳基或–OR12，其中R12是取代的脂族基团、未取代的脂族基团、取代的芳基或未取代的芳基，或者X1与Y1一起形成连接环A和C的连接基L。
2.权利要求1的化合物，其中所述化合物是式IX的化合物，并且其中每个R1是羟基，R2和R4独立地是卤素，R5是氢或卤素，并且R9、R10和R11中的至少一个是氢。
3.权利要求1的化合物，其中所述化合物是式VII或VIII的化合物，并且其中每个R1是羟基，R2和R4独立地是卤素，R5是氢或卤素，并且每个R6是=CH2。
4.权利要求1的化合物，其中所述化合物是式X或XI的化合物，并且其中X1与Y1一起形成L，并且L由以下通式表示：
Figure FDA0000398206270000021
其中R5是氢、羟基、硫醇或卤素。
5.权利要求1的化合物，其中所述化合物是下式的化合物
Figure FDA0000398206270000022
6.药物组合物，其包含药学可接受的载体和治疗有效量的至少一种权利要求1-5任一项的化合物或其药学可接受的盐、水合物或溶剂化物，其中所述药物组合物在应用于细菌时能够抑制细菌细胞生长。
7.权利要求6的药物组合物，其还包含治疗有效量的除了所述化合物之外的第二药剂。
8.权利要求7的药物组合物，其中所述第二药剂是抗微生物剂。
9.权利要求8的药物组合物，其中所述第二药剂有效对抗革兰氏阴性细菌细胞。
10.权利要求7-9任一项的药物组合物，其中所述第二药剂提高所述化合物渗透进入所述细菌。
11.抑制细菌细胞生长的方法，所述方法包括将细菌暴露于有效量的组合物下，所述组合物包含权利要求1-5任一项的化合物或其药学可接受的盐、水合物或溶剂化物。
12.权利要求11的方法，其中所述细菌是革兰氏阳性细菌。
13.权利要求12的方法，其中所述细菌是耐药细菌。
14.权利要求13的方法，其中所述耐药细菌是耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、多药耐药金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）或耐万古霉素屎肠球菌（Enterococcusfaecium）。
15.权利要求11-14任一项的方法，其还包括将所述细菌暴露于有效量的除了所述化合物之外的第二药剂下。
16.权利要求15的方法，其中所述第二药剂被包含在所述组合物中。
17.权利要求15或16的方法，其中所述第二药剂是抗微生物剂。
18.权利要求17的方法，其中所述抗微生物剂有效对抗革兰氏阴性细菌细胞。
19.权利要求15-17任一项的方法，其中所述第二药剂提高所述化合物渗透进入所述细菌。
20.权利要求11至19任一项的方法，其中将所述细菌暴露于有效量的所述组合物下包括向被鉴定为需要对已知或怀疑的细菌感染进行抗微生物治疗的对象施用治疗有效量的所述组合物。
21.权利要求20的方法，其中所述第二药剂不被包含在所述组合物中，并且将所述第二药剂独立地施用于所述对象。
22.权利要求20或21的方法，其还包括在将所述组合物施用于所述对象之前，将所述对象鉴定为已感染有对使用所述化合物的治疗敏感的细菌。
23.制造下式的化合物的方法
Figure FDA0000398206270000041
其中R1是羟基，R2和R4独立地是卤素，并且R9、R10和R11是氢，所述方法包括：
将2-卤代-1,4-二甲氧基苯转变成1-(卤代甲基)-4-卤代-2,5-二甲氧基苯，其中所述2-卤代-1,4-二甲氧基苯的卤素和所述1-(卤代甲基)-4-卤代-2,5-二甲氧基苯的4-卤代对应于所述化合物的R2；
将3,5-甲氧基苯甲酸转变成(E)-5-(2-卤代-3-碘烯丙基)-1,3-亚苯基双(2,2-二甲基丙酸酯)，其中所述(E)-5-(2-卤代-3-碘烯丙基)-1,3-亚苯基双(2,2-二甲基丙酸酯)的卤素对应于所述化合物的R4；
将所述1-(卤代甲基)-4-卤代-2,5-二甲氧基苯与所述(E)-5-(2-卤代-3-碘烯丙基)-1,3-亚苯基双(2,2-二甲基丙酸酯)反应以产生(E)-5-(2-卤代-4-(4-卤代-2,5-二甲氧基苯基)丁-2-烯基)-1,3-亚苯基双(2,2-二甲基丙酸酯)；以及
将所述(E)-5-(2-卤代-4-(4-卤代-2,5-二甲氧基苯基)丁-2-烯基)-1,3-亚苯基双(2,2-二甲基丙酸酯)去甲基化以产生所述化合物。
24.权利要求23的方法，其中将所述2-卤代-1,4-二甲氧基苯转变成1-(溴甲基)-4-卤代-2,5-二甲氧基苯包括：
将所述2-卤代-1,4-二甲氧基苯羰基化以产生4-卤代-2,5-二甲氧基苯甲醛；
将所述4-卤代-2,5-二甲氧基苯甲醛还原以产生(4-卤代-2,5-二甲氧基苯基)甲醇；以及
将所述(4-卤代-2,5-二甲氧基苯基)甲醇与选自氢溴酸、盐酸或氢碘酸的无机酸反应以产生1-(卤代甲基)-4-卤代-2,5-二甲氧基苯。
25.权利要求23或24的方法，其中将3,5-甲氧基苯甲酸转变成(E)-5-(2-卤代-3-碘烯丙基)-1,3-亚苯基双(2,2-二甲基丙酸酯)包括：
将所述3,5-甲氧基苯甲酸还原以产生3,5-二甲氧基苯甲醇；
将所述3,5-二甲氧基苯甲醇溴化以产生3,5-二甲氧基苯甲基溴；
将所述3,5-二甲氧基苯甲基溴与乙炔基三甲基硅烷反应以产生(3-(3,5-二甲氧基苯基)丙-1-炔基)三甲基硅烷；
将所述(3-(3,5-二甲氧基苯基)丙-1-炔基)三甲基硅烷脱甲硅烷基化以产生1,3-二甲氧基-5-(丙-2-炔基)苯；
向所述1,3-二甲氧基-5-(丙-2-炔基)苯添加保护基团以产生5-(丙-2-炔基)-1,3-亚苯基双(2,2-二甲基丙酸酯)，其中所述保护基团是通过将所述1,3-二甲氧基-5-(丙-2-炔基)苯与三溴化硼反应、然后与新戊酰氯反应而添加的新戊酰基；以及
将所述5-(丙-2-炔基)-1,3-亚苯基双(2,2-二甲基丙酸酯)卤化以产生(E)-5-(2-卤代-3-碘烯丙基)-1,3-亚苯基双(2,2-二甲基丙酸酯)，其中所述2-卤代对应于R4。
26.权利要求23-25任一项的方法，其中将所述1-(溴甲基)-4-卤代-2,5-二甲氧基苯与所述(E)-5-(2-卤代-3-碘烯丙基)-1,3-亚苯基双(2,2-二甲基丙酸酯)反应以产生(E)-5-(2-卤代-4-(4-卤代-2,5-二甲氧基苯基)丁-2-烯基)-1,3-亚苯基双(2,2-二甲基丙酸酯)包括：
将所述1-(溴甲基)-4-卤代-2,5-二甲氧基苯与催化量的碘和活性锌反应以产生活性有机锌试剂；
从所述活性有机锌试剂去除未反应的锌；
将所述活性有机锌试剂与所述(E)-5-(2-卤代-3-碘烯丙基)-1,3-亚苯基双(2,2-二甲基丙酸酯)合并以产生混合物；以及
将所述混合物加热以产生所述(E)-5-(2-卤代-4-(4-卤代-2,5-二甲氧基苯基)丁-2-烯基)-1,3-亚苯基双(2,2-二甲基丙酸酯)。
27.权利要求23-26任一项的方法，其中将所述(E)-5-(2-卤代-4-(4-卤代-2,5-二甲氧基苯基)丁-2-烯基)-1,3-亚苯基双(2,2-二甲基丙酸酯)去甲基化以产生所述化合物包括将所述(E)-5-(2-卤代-4-(4-卤代-2,5-二甲氧基苯基)丁-2-烯基)-1,3-亚苯基双(2,2-二甲基丙酸酯)与选自BBr3、AlCl3、吡啶·HCl、LiS(CH(CH3)2)或LiCl的去甲基化试剂反应。
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