CN103648523A - 用于治疗癌症的组合物和方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了可用于治疗癌症(特别是乳腺癌)的联合疗法。在多个实施方案中，本发明提供了治疗癌症的方法，其包括向患有癌症的患者施用有效量的免疫缀合物，所述免疫缀合物包含单克隆抗体部分和与之相连的第一促凋亡药部分；以及向所述患者施用有效量的第二促凋亡药。所述免疫缀合物的单克隆抗体部分可以起到靶向激素抗性乳腺癌细胞之受体(例如HER2)的作用。当向患有乳腺癌(例如激素抗性乳腺癌)的患者施用两种促凋亡药时，可以观察到协同作用，所述两种促凋亡药通过共同的分子机制(纵向调节)或不同的分子机制(横向调节)起作用。

Description

用于治疗癌症的组合物和方法
关于联邦资助研究或开发的声明
本发明在国防部授予的授权No.GG11284的政府支持下作出。政府享有本发明的某些权利。
相关申请的交叉引用
本申请要求2011年5月9日提交的美国序列号No.61/483,821的优先权，其公开内容通过引用整体并入本文。
背景技术
估计2011年，欧盟乳腺癌的预测死亡率为75,688例死亡[1]。至于美国，预测2010年的乳腺癌死亡数为39,840[2]。在约70％的乳腺癌中，雌激素受体(ER)是肿瘤增殖的关键促进剂，因此一线治疗是通过使用阻碍雌激素产生的他莫昔芬或芳香酶(aromatase)抑制剂来抑制ER信号传导[3]。但是，对于许多患者而言，癌细胞对这些抑制剂之作用的初始(从头)或后续(获得的)抗性可以限制雌激素降低剂的治疗益处，所述抗性据信是癌细胞通过生物重编程对雌激素产生提高的敏感性而发生的。
三分之二的患有雌激素受体(ER)阳性乳腺癌的女性应答于激素治疗，其可以通过摘除卵巢、通过施用他莫昔芬或芳香酶(雌激素合成)抑制剂以及通过使用被称为GnRH超激动剂类似物的化合物来完成。但是，临床观察结果披露，乳腺癌细胞可以通过对雌二醇产生提高的敏感性来适应低雌二醇的条件。具体地，在急性剥夺雌二醇之前，刺激肿瘤生长需要200pg/ml的雌二醇，而在适应12至18个月之后，10pg/ml至15pg/ml的水平就足以导致肿瘤增殖。因此，这样的激素抗性乳腺癌(hormone-resistant breast cancers)不应答接下来的芳香酶治疗，并且包含这些激素抗性细胞的癌可以变得不可控。
对培养中的乳腺细胞之生长的研究表明，当在不含雌激素的介质中长时间培养野生型MCF-7细胞时，细胞在开始时停止生长，但然后，在数月之后，细胞适应并且与用雌二醇最大化地刺激的野生型MCF-7细胞一样迅速地生长。这些适应的培养细胞已被用于研究与激素适应相关的过程，并命名为LTED(长期雌激素剥夺)细胞，它们是“激素抗性”或“激素难治性”细胞的模型，因为它们是乳腺癌失去对芳香酶抑制剂之响应的原因。当在患者中这样的细胞产生突变时，其为这些患者生存前景的重大负面进展。
在激素治疗之后，观察到了雌激素受体HER2的上调。曲妥珠单抗(trastuzumab)-美登木素生物碱(maytansinoid)缀合物T-DM1是抗体-药物缀合物，其包含与微管抑制剂DM1(美登木素的类似物)共价相连的HER-2-特异性人源化抗体曲妥珠单抗。已表明，该缀合物靶向HER-2阳性乳腺癌细胞。参见，例如，Lewis Phillips GD，Li G，Dugger DL，Crocker LM，Parsons KL，Mai E，Blattler WA，Lambert JM，Chari RV,Lutz RJ，Wong WL，Jacobson FS，Koeppen H，Schwall RH，Kenkare-Mitra SR，Spencer SD，Sliwkowski MX.TargetingHER2-positive breast cancer with trastuzumab-DM1，anantibody-cytotoxic drug conjugate，Cancer Res2008；68：9280-90；JunttilaTT，Li G，Parsons K，Phillips GL，Sliwkowski MX.Trastuzumab-DM1(T-DM1)retains allthe mechanisms of action of trastuzumab andefficiently inhibits growth of lapatinib insensitive breast cancer,BreastCancer Res Treat(2010)128(2)：347-56；以及Lin C和Chari R，Thedevelopment of antibody delivery systems to target cancer with highlypotent maytansinoids，Exp.Opin.Invest.Drugs(1997)6(2)：169-172。
亟需对抗抗性并且获得更持久缓解的新治疗策略。
发明概述
在多个实施方案中，本发明涉及用于治疗癌症的联合疗法，所述癌症包括但不限于激素抗性(激素难治性)乳腺癌，例如不再响应于一线治疗的那些，所述一线治疗例如向患者施用芳香酶抑制剂(例如阿那曲唑)、雌激素受体调节剂(例如他莫昔芬)等。在许多实施方案中，本发明提供治疗癌症的方法，其包括向患有癌症之患者施用有效量的免疫缀合物，所述免疫缀合物包含单克隆抗体部分和与之相连的第一促凋亡药部分；以及向患者施用有效量的第二促凋亡药。例如，所述癌症可以是乳腺癌，例如芳香酶抗性乳腺癌、他莫昔芬抗性乳腺癌、ER+激素难治性乳腺癌(ER+hormone refractory breast cancer)或包含其中HER2表达上调之癌细胞的乳腺癌、或其任意组合。
在某些实施方案中，所述免疫缀合物包含通过接头(linker)与第一促凋亡药部分偶联的单克隆抗体部分。在许多实施方案中，所述第一促凋亡药部分是微管解聚剂，例如美登木素生物碱或奥瑞斯他汀(auristatin)。例如，所述第一促凋亡药部分可以是美登木素类似物(美登木素生物碱)，其通过接头部分与单克隆抗体部分结合。更具体地，所述免疫缀合物可以是曲妥珠单抗-美登木素生物碱缀合物，其包含通过非还原性接头部分与美登木素生物碱促凋亡药物部分偶联的曲妥珠单抗(
Figure BDA0000433157570000031
)(例如，T-DM1)。相对于生长抑制策略来说，本发明人优选选择促凋亡策略，以通过除去抗性细胞而非仅仅抑制它们的生长来取消适应性再编程过程。
在多个实施方案中，所述第二促凋亡药通过与第一促凋亡药发挥细胞毒性作用之分子机制不同的分子机制来发挥细胞毒性作用。
在本文中将其称为“横向调节”，其中通过治疗方案活化或诱导两条独立的凋亡途径，相比而言，在“纵向调节”中，靶向单个促凋亡途径中的两个或更多个步骤。本发明人在本文中公开，采用例如T-DM1与第二促凋亡药之组合的横向调节在诱导激素难治性乳腺癌细胞凋亡中表现出协同作用。
在一些实施方案中，所述第二促凋亡药是通过非固有(extrinsic)途径诱导凋亡的药。在另一些实施方案中，所述第二促凋亡药是通过固有(intrinsic)途径诱导凋亡的药。例如，所述第二促凋亡抗癌药可以是法呢基-硫代水杨酸(FTS)、4-(4-氯-2-甲基苯氧基)-N-羟基丁酰胺(CMH)、雌二醇(E2)、四甲氧基茋(TMS)、δ-生育三烯酚、沙利霉素或姜黄素。
在多个实施方案中，本发明提供了第一促凋亡药与第二促凋亡药之组合在治疗癌症(例如乳腺癌)、更具体地在治疗如上所述的激素抗性乳腺癌中的医疗用途。例如，所述第一促凋亡药可以是诸如T-DM1的免疫缀合物，所述第二促凋亡药可以是通过与第一促凋亡药可发挥其抗癌作用的分子机制不同的分子机制来诱导癌细胞凋亡的药。
在多个实施方案中，本发明提供了包含免疫缀合物和第二促凋亡药的治疗组合物，其用于治疗癌症，例如乳腺癌，更具体地用于治疗如上所述的激素抗性乳腺癌，所述免疫缀合物包含单克隆抗体部分和第一促凋亡药部分。
所述免疫缀合物的单克隆抗体部分可以为第一促凋亡药提供靶向机制，例如靶向激素抗性乳腺癌细胞中上调的HER2受体。可以通过使用缀合物来获得抗癌药的靶向组分，所述缀合物例如共价偶联的部分，其中之一提供靶向机制，其中的另一部分提供细胞毒性作用或凋亡作用。一种这样的药剂-T-DM1是单克隆抗体曲妥珠单抗(
Figure BDA0000433157570000041
)与美登木素生物碱大环促凋亡细胞毒性剂的共价缀合物。T-DM1包含与促凋亡微管抑制剂DM1共价相连的HER2特异性人源化抗体曲妥珠单抗作为靶向部分。参见，例如，Oroudjev E，Lopus M，Wilson L，Audette C，ProvenzanoC，Erickson H，Kovtun Y，Chari R，Jordan MA(2010)Mol Cancer Ther9：2700-2713，Maytansinoid-antibody conjugates induce mitotic arrest bysuppressing microtubule polymerization。本发明人出乎意料地发现，T-DM1与其他促凋亡抗癌药组合可以协同作用以诱发无毒的细胞凋亡从而在体外杀死激素抗性乳腺癌细胞(MCF-7；T47D)和激素难治性乳腺癌细胞(LTED；TamR)，所述其他促凋亡抗癌药包括：法呢基-硫代水杨酸(FTS，Salirasib，一种靶向胱天蛋白酶依赖性内在线粒体死亡途径的Ras抑制剂)、雌二醇(E2，胱天蛋白酶依赖性内在线粒体死亡途径)、四甲氧基茋(TMS，胱天蛋白酶非依赖性线粒体死亡途径)、4-(4-氯-2-甲基苯氧基)-N-羟基丁酰胺(CMH，非固有凋亡途径)、δ-生育三烯酚、沙利霉素或姜黄素、或其任意组合。本领域中公知，用于评价本文公开并且要求保护之疗法的这样的细胞系可以很好地预测所述疗法在患有癌症之患者的体内应用中的成绩。
在多个实施方案中，本发明人公开了进行以确定如下假设之实验的结果：某些促凋亡剂的组合可以协同作用以诱导激素抗性(激素难治性)乳腺癌细胞凋亡、细胞死亡。例如，本发明提供了治疗癌症的方法，其包括向患有癌症之患者施用有效量的免疫缀合物，所述免疫缀合物包含靶向单克隆抗体和第一促凋亡药部分；以及向患者施用有效量的第二促凋亡药。协同意指治疗作用大于通过单独施用每种药会获得的各治疗作用的相加。
附图简述
图1A-1F示出凝胶电泳放射自显影图(1A、1B、1D、1E)和条形图(1C、1F)，其总结了当用FTS处理LTED细胞，研究胞质级分和线粒体级分中蛋白质水平之改变时获得的关于所示促凋亡蛋白质水平之结果。
图2A-B示出时间进程条形图(2A)和细胞活力对浓度的曲线(2B)，其示出(图2A)FTS与姜黄素的组合对野生型MCF-7细胞的作用；和(图2B)单独的FTS或FTS与姜黄素的组合对MCF-7细胞活力的作用。
图3A-B示出时间进程条形图(3A)和细胞活力对浓度的曲线(3B)，其示出沙利霉素对MCF-7细胞的作用。
图4示出用所示组合处理5天之非适应性细胞的剂量效应图的图示说明：MCF-7细胞(a-c；上图)和T47D(d-f；下图)。
图5示出用所示组合处理5天之适应性细胞系LTED D29的剂量效应图的图示说明。
图6示出按照所示处理的非适应性MCF-7细胞(a-c；上面三幅图)和T47D(d-f；下面三幅图)之组合指数的图示说明。纵坐标-组合指数(Combination Index，CI)；横坐标-作用分数。
图7A-B示出按照所示处理的适应性细胞系LTED D29(a-i)和TamR细胞(i-s)之组合指数的图示说明。
图8示出用所示组合处理的非适应性细胞MCF-7细胞(a-c；上面三幅图)和T47D细胞(d-f；下面三幅图)之等效应图分析(Isobologramanalysis)的图示说明。纵坐标-剂量A；横坐标-剂量B。
图9示出按照所示处理的适应性细胞系LTED D29细胞(a-i)之等效应图分析的图示说明。纵坐标-剂量A；横坐标-剂量B。
发明详述
在本发明的描述和权利要求中，下列术语将依照下文给出的定义使用。除非另有指明，否则本文使用的全部技术和科学术语与本发明所属领域普通技术人员通常理解的含义相同。虽然任何类似或等同于本文所述方法和材料的方法和材料可以在本发明的实践或试验中使用，但优选的方法和材料亦在本文描述。本文使用的下列每个术语具有本部分中与其相关的含义。下文列出的用于自由基、取代基和范围的具体和优选的值仅用于说明；并不排除其他定义值或者自由基和取代基定义范围内的其他值。
本文使用的无数量词修饰形式是指一个(种)或多于一个(种)、即至少一个(种)所示语法宾语。例如，“元素”是指一种元素或多于一种元素。
本文使用的术语“约”是指“大约”、“上下”、“大体上”或“左右”。当术语“约”用于修饰一个数值范围时，它通过扩展所设定数值的上下界限来修改范围。一般来说，本文使用的术语“约”用于在给定值上下20％范围内修改数值。
本文使用的术语“受影响的细胞”是指患有疾病或障碍之对象的细胞，与未患有疾病、病症或障碍的对象相比，所述受影响的细胞具有改变的表型。
相对于未患有疾病、病症或障碍之对象中的同种细胞或组织来说，如果细胞或组织具有改变了的表型，则该细胞或组织受疾病或障碍“所影响”。
本文使用的“激动剂”是物质的组合物，当向哺乳动物(例如人)施用时，其增强或延长目的生物活性。这种作用可以是直接或间接的。
“拮抗剂”是物质的组合物，当向哺乳动物(例如人)施用时，其抑制或阻碍可归因于哺乳动物中固有化合物水平或存在的生物活性。这种作用可以是直接或间接的。
本文使用的术语“芳香酶抑制剂”涉及阻碍雄烯二酮转化为雌酮和/或睾酮转化为雌二醇的组合物。芳香酶抑制剂包括类固醇类抑制剂和非类固醇类抑制剂二者，包括例如依西美坦、阿那曲唑和来曲唑。
本文使用的化合物之“类似物”是这样的化合物，例如，在结构上与另一化合物相似但不一定是异构体(例如，5-氟尿嘧啶是胸腺嘧啶的类似物)。
术语“凋亡”是指由可以通过多种方法诱导的生物化学途径介导的细胞程序性死亡。“促凋亡”剂或“促凋亡”药是产生导致细胞程序性死亡之生物化学作用的生物活性剂或药。如本文所述，凋亡可以由如在下文中进一步描述的内源性或非固有途径或机制导致或诱导。“非固有”凋亡途径涉及死亡受体，并且该途径由与死亡受体结合的配体活化。“固有”凋亡途径涉及启动凋亡的线粒体途径。横向调节中的“横向”是指影响多于一种特定途径的刺激，而纵向调节中的“纵向”是指涉及同一途径中的若干步骤。
本文使用的术语“乳腺癌”涉及乳房或乳腺组织的多种癌类型和子类型的任一种。
本文使用的术语“癌”定义为其独特特征-失去正常控制-导致生长失调、不分化、局部组织侵袭和转移之细胞的增殖。实例包括但不限于乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、宫颈癌、皮肤癌、胰腺癌、结肠直肠癌、肾癌和肺癌。
本文使用的“化合物”是指通常认为是药或用作药的候选物以及上述之组合和混合物的任何类型的物质或试剂。
“缀合物”是组合彼此结合的至少两个“部分”或结构域的分子实体。“共价”缀合物是其中所述部分通过共价化学键(例如本领域中公知的)相连的缀合物。例如，可以使蛋白质(例如单克隆抗体)与有机化合物(例如药)例如通过共价结合形成缀合物。当所述蛋白质是抗体(例如单克隆抗体)时，在本文中将所得缀合物称为“免疫缀合物”。蛋白质(例如单克隆抗体)与有机化合物(例如药)之间的共价结合可以通过“接头”或“接头部分”发生，所述“接头”或“接头部分”与有机化合物和蛋白质二者共价结合。实例在下文中有讨论。
本文使用的术语“接头”或“接头部分”是指共价地或非共价地(例如，通过离子键或氢键或范德华相互作用)连接两个其他分子部分的分子部分。在下文中提供有具体实例。“连接”或“接头”是指两个基团之间的连接。
本文使用的术语“部分”是指大分子的结构域；例如，在缀合物T-DM1中，美登木素生物碱药通过接头与单克隆抗体相偶联，使得在终产物中，美登木素生物碱药部分通过接头部分与单克隆抗体部分相结合。包含这样的部分之缀合物的实例由分子实体T-DM1提供，分子实体T-DM1是单克隆抗体曲妥珠单抗()与美登木素生物碱大环细胞毒性化合物的共价缀合物，其结构如下所示：
据信接头通过接头部分与蛋白质曲妥珠单抗的侧链氨基酸残基(例如赖氨酸残基)之氮原子的结合与曲妥珠单抗偶联。未详细提供曲妥珠单抗的分子结构，因为其在本领域中是公知的。可以通过本文和通过引用并入本文的文件中所述的方法制备和评价免疫缀合物，例如抗体和促凋亡药物(例如美登木素生物碱)。
免疫缀合物包含与一种或更多种生物活性分子缀合的抗体。如上所示，免疫缀合物T-DM1包含与单克隆抗体部分偶联的美登木素生物碱部分。美登木素生物碱是有丝分裂抑制剂，其通过抑制微管蛋白聚合或诱导微管解聚起作用。如在本领域中公知的，微管蛋白聚合和解聚是参与细胞分裂的有丝分裂的必要事件。据信细胞分裂的长时间抑制是可以诱导有丝分裂受到抑制之细胞的凋亡的状态。
美登木素首次分离自东非灌木齿叶美登木(美国专利No.3896111)。随后发现某些微生物也产生美登木素生物碱，例如美登醇和C-3美登醇酯(美国专利No.4,151,042)。例如下列美国专利公开了合成美登醇及其衍生物和类似物：No.4，137,230、4,248,870、4,256,746、4,260,608、4,265,814、4,294,757、4,307,016、4,308,268、4,308,269、4,309,428、4,313,946、4,315,929、4,317,821、4,322,348、4,331,598、4,361,650、4,364,866、4,424,219、4,450,254、4,362,663以及4,371,533。
美登木素生物碱药部分是抗体-药缀合物中有吸引力的药部分，因为它们：(i)相对易于通过发酵或发酵产物的化学修饰或衍生化来制备；(ii)易于用适于通过非二硫化物(非还原性)接头与抗体缀合的官能团衍生化；(iii)在血浆中稳定；以及(iv)有效对抗多种肿瘤细胞系。
适合用作美登木素生物碱药部分的美登木素化合物在本领域中是公知的，并且可以依照已知方法从天然来源分离或者使用基因工程技术生产(参见Yu等(2002)PNAS99：7968-7973)。美登醇和美登醇类似物还可以根据已知方法合成地制备。
美登木素生物碱药部分包括具有经修饰芳香环的那些，例如：C-19-脱氯(美国专利No.4256746)(通过安丝菌素(ansamytocin)P2的氢化锂铝还原来制备)；C-20-羟基(或C-20-脱甲基)+/-C-19-脱氯(美国专利No.4361650和4307016)(通过使用链霉菌(Streptomyces)或放线菌（Actinomyces)的脱甲基化或使用LAH的脱氯化来制备)；以及C-20-脱甲氧基、C-20-酰氧基(-OCOR)、+/-脱氯(美国专利No.4,294,757)(通过使用酰氯的酰化来制备)，以及在其他位置具有修饰的那些。
示例性美登木素生物碱药部分还包括具有例如以下修饰的那些：C-9-SH(美国专利No.4424219)(通过美登醇与H2S或P2S5的反应来制备)；C-14-烷氧基甲基(脱甲氧基/CH2OR)(US4331598)；C-14-羟甲基或酰氧基甲基(CH2OH或CH2OAc)(美国专利No.4450254)(制备自诺卡氏菌(Nocardia))；C-15-羟基/酰氧基(US4364866)(通过链霉菌(Streptomyces)对美登醇的转化来制备)；C-15-甲氧基(美国专利No.4313946和4315929)(分离自Trewia nudlflora)；C-18-N-脱甲基(美国专利No.4362663和4322348)(通过链霉菌对美登醇的脱甲基化来制备)；以及4,5-脱氧基(US4371533)(通过美登醇的三氯化钛/LAH还原来制备)。
本文使用的术语“奥瑞斯他汀”是指诸如多拉司他汀和奥瑞斯他汀的肽类抗癌药，已证实其干扰微管动力学、GTP水解以及核和细胞分裂(Woyke等(2001)Antimicrob.Agents and Chemother45(12)：3580-3584)，并且具有抗癌(美国专利No.5663149)和抗真菌活性(Pettit等(1998)Antimicrob.Agents Chemother42：2961-2965)。参见例如美国专利No.5635483和5780588。
“对照”对象是与受试对象具有相同特征(例如相似类型的依赖性等)的对象。例如，对照对象可以与所治疗或检测的受试对象在同一时间或几乎同时进行检测。例如，对照对象还可以与受试对象相隔一定时间进行检测，可以记录对照对象的检测结果，从而可以将该记录结果与受试对象的检测结果进行比较。
“受试”对象是所治疗的对象。
本文使用的化合物之“衍生物”是指这样的化合物，其可以在一个或更多个步骤中由另一种结构相似的化合物产生，例如用烷基、酰基或氨基替代H。
“疾病”是对象的一种健康状况，其中对象不能维持稳态，并且如果该疾病不能得到改善，则该对象的健康状况将继续恶化。相比而言，对象中的“障碍”是一种健康状况，其中对象能够维持稳态，但对象的健康状况没有不存在该障碍时好。
如果疾病或障碍之症状的严重程度、患者经受这种症状的频率或者上述两者降低，则疾病、病症或障碍得以“缓解”。
本文使用的“有效量”是指足以产生选定效果(例如缓解疾病或障碍的症状)的量。在施用两种或更多种化合物的情形中，当与另一化合物组合施用时，每种化合物的量可以与单独施用该化合物时不同。
本文使用的术语“雌激素”涉及一类包括天然或合成地制备的成分的化合物，已证实其具有在雌激素响应细胞中诱导细胞增殖和/或启动新蛋白质合成的能力。天然雌激素包括雌酮(E1)、雌二醇-17B(E2)和雌三醇(E3)，其中，雌二醇在药理学上最具活性。合成雌激素是不天然产生和复制或在某种程度上模拟内源雌激素之活性的化合物。这些化合物包括多种类固醇和非类固醇成分，例如双烯雌酚、苯雌酚、己雌酚、美雌酚、己烯雌酚(DES)、炔雌醚(Estrovis)、氯烯雌醚(Tace)和美沙雌酸(Vallestril)。
本文使用的术语“雌激素拮抗剂”涉及在与雌激素同时施用时对该雌激素活性具有中和或抑制作用的化合物。雌激素抑制剂的实例包括他莫昔芬和托瑞米芬。
本文使用的“功能性”分子是表现出其特征所在之特性或活性的形式的分子。例如，功能性酶是表现出该酶特征所在之特征性催化活性的酶。
本文使用的术语“激素剥夺治疗”涉及任何阻碍患者中激素的作用或除去激素的存在(通过防止激素合成或增强对激素的破坏)的患者治疗。在乳腺癌的特定情况下，激素剥夺治疗可以包括通过阻碍雌激素的生物合成或阻碍雌激素对雌激素受体(例如HER2)的作用来剥夺雌激素。
本文使用的术语“激素响应细胞/组织”涉及天然响应于例如雌激素或雄激素的非癌细胞或组织，其中所述细胞或组织在激素的存在下增殖和/或启动新蛋白质合成。激素响应性组织包括乳腺、睾丸、前列腺、子宫和子宫颈。正常响应于雌激素或雄激素的组织可能失去其对激素的响应。因此，本文使用的“激素响应性组织”是广义的并且涵盖正常响应于激素的激素敏感性组织和激素不敏感性组织二者。“雌激素响应性细胞/组织”是响应于雌激素的细胞/组织。
本文使用的术语“激素响应性癌”涉及得自激素响应性细胞/组织的细胞或组织，“适应性激素响应性癌细胞”是应答于不会在相应激素响应性细胞中产生应答之激素水平而将增殖的激素响应性癌细胞。
在暴露于例如以下物质之后，例如见于乳腺癌中的雌激素响应性癌细胞可产生对组织中雌激素水平降低的耐受：芳香酶抑制剂，如上所述其阻碍雌激素产生；或雌激素拮抗剂，例如他莫昔芬；或者具有类似的雌激素阻碍作用的其他药剂。在这样的情况下，使用芳香酶抑制剂在控制乳腺癌中不再有效。在本文中将参与这些癌症的细胞称为“长期雌激素剥夺”、“激素抗性”或“激素难治性”细胞，并且将宏观疾病可互换地称为“激素抗性”或“激素难治性”乳腺癌。但是，应理解，“激素抗性”或“激素难治性”细胞和癌也可以通过其他机制产生。
本文使用的术语“适应性激素应答”或“适应性应答”涉及得自激素响应性组织的细胞或组织变得能够应答于(即增殖和/或启动新蛋白质合成)先前不会在这些细胞中产生应答之激素水平的过程。
根据使用术语“抑制”的上下文，本文使用的术语“抑制”是指化合物或任意药剂降低或阻碍所述功能、水平、活性、合成、释放、结合等的能力。优选地，抑制是抑制至少10％，更优选地至少25％，更优选地至少50％，最优选地功能被抑制至少75％。术语“抑制”可与“减少”和“阻碍”互换使用。
本文使用的术语“抑制蛋白质”是指抑制蛋白质合成、水平、活性或功能的任何方法或技术，以及对目的蛋白质的合成、水平、活性或功能的诱导或刺激进行抑制的方法。该术语也指可以调节目的蛋白质之合成、水平、活性或功能的任何代谢或调节途径。该术语包括与其他分子结合以及复合物形成。因此，术语“蛋白质抑制剂”是指这样的任何药剂或化合物，其施用导致蛋白质功能或蛋白质途径功能的抑制。然而，该术语并不意味着这些功能中的每一个功能必须同时被抑制。“抑制剂”可以实现任意这些功能，例如，芳香酶抑制剂阻碍芳香酶(蛋白质)将前体转化为雌激素的生物合成催化活性。
本文使用的术语“mTOR活性的抑制”涉及mTOR将其底物(包括例如，p70S6K和PHAS-I)中的一种或更多种磷酸化之能力的可检测降低。mTOR抑制剂是对mTOR活性具有直接抑制作用的化合物(即，mTOR活性的抑制不是通过对上游途径酶的抑制作用介导的)。
本文使用的“说明材料”包括出版物、录制品、图表或任何其他表达介质，其可用于传达用于缓解本文所述多种疾病和障碍的药剂盒中本发明化合物的效用。任选地或可替选地，所述说明材料可以描述缓解对象中疾病或障碍的一种或更多种方法。例如，本发明药盒的说明材料可以贴附至含有本发明化合物的容器或者可随含有所述化合物的容器一起装运。或者，所述说明材料可与容器分开装运，这样说明材料和化合物意在被接收者配合使用。
本文使用的“配体”是特异性结合靶标化合物或分子的化合物。当配体在结合反应中起作用时，配体“特异性结合”化合物或与化合物“特异性反应”，这可以确定异质化合物样品中所述化合物的存在。
“受体”是特异性地与配体结合的化合物或分子。
本文使用的术语“核酸”涵盖RNA以及单链和双链DNA和cDNA。此外，术语“核酸”、“DNA”、“RNA”和类似术语还包括核酸类似物，即，具有非磷二酯骨架的类似物。
术语“肽”通常是指短的多肽。
“多肽”是指由氨基酸残基构成的聚合物、相关的天然结构变体、和通过肽键相连的其合成非天然类似物、相关的天然结构变体及其合成非天然类似物。合成的多肽可以例如使用自动多肽合成仪来合成。
术语“蛋白质”通常是指大的多肽。
“重组多肽”是指基于重组多核苷酸表达产生的多肽。
本文使用的术语“每次施加”是指向对象施用药或化合物。
本文使用的术语“可药用载体”包括任何标准的药物载体，例如磷酸盐缓冲溶液、水、乳剂(如水包油型或油包水型乳剂)以及多种类型的润湿剂。该术语还包括由美国联邦政府管理机构批准的或在美国药典中列出的用于动物(包括人)的任何药剂。“可药用盐”是指由管理机构批准的或在美国药典中列出的可药用酸性或碱性分子实体，其形式为与反离子的盐。
本文使用的术语“生理上可接受的”酯或盐是指活性成分的酯或盐形式，其与药物组合物中的任何其他成分相容，并且其对待施用该组合物的对象无害。
本文使用的术语“预防”是指阻止某事情发生，或预先采取措施防止可能的事情发生。在医药方面，“预防”一般是指用来减少疾病或病症发生之机会的措施。
本文使用的涉及末端氨基之“保护基团”是指肽的末端氨基，其末端氨基与传统上用于肽合成的任意各种氨基端保护基团偶联。例如，这样的保护基团包括酰基保护基团例如甲酰基、乙酰基、苯甲酰基、三氟乙酰基、琥珀酰基和甲氧琥珀酰基；芳香族氨基甲酸酯保护基团例如苄氧羰基；以及脂肪族氨基甲酸酯保护基团例如叔丁氧基羰基或金刚烷基氧基羰基。参见有关合适的保护基团的Gross和Mienhofer编著，The Peptides，第3卷，第3-88页(Academic Press，New York，1981)。
本文使用的涉及末端羧基的“保护基团”是指肽的末端羧基，其末端羧基与多种羧基端保护基团的任一种偶联。例如，这样的保护基团包括叔丁基、苄基或者通过酯或醚键与末端羧基连接的其他可用基团。
本文使用的术语“纯化”及类似术语涉及从天然环境中通常与分子或化合物有关的其他成分富集该分子或化合物。术语“纯化”不一定表示在此过程中实现特定分子的完全纯化。本文使用的“高度纯化的”化合物是指纯度大于90％的化合物。
术语“调节”是指刺激或抑制目的功能或活性。
本文使用的“样品”是指来自对象的生物样品，包括但不限于正常组织样品、病变组织样品、活检样品、血液、唾液、粪便、精液、泪液和尿液。样品也可以是从对象获得的任何其他材料来源，包括目的细胞、组织或流体。
本文使用的术语“特异性结合”是指分子识别并结合特异性分子，但基本上不识别或结合样品中的其他分子，或者它是指作为细胞调节过程之一部分的两种或更多种分子的结合，其中所述分子基本上不识别或结合样品中的其他分子。
本文使用的术语“标准”是指用于作比较的事物。例如，它可以是已知的标准药剂或化合物，当加入测试化合物时，其被施用或添加并用于比较结果；或者它可以是标准的参数或函数，当利用参数或函数测量药剂或化合物的作用时，测量其以获得对照值。标准也可以指“内部标准”，例如，当样品被处理或进行纯化或提取过程时，在目的标志物被测量前，以已知量加入到样品中并且可用于确定这些物质之纯化率或回收率的药剂或化合物。内部标准常常是已被例如放射性同位素标记的目的纯化标志物，这使得它区别于固有标志物。
诊断或治疗的“对象”是哺乳动物，包括人。
本文使用的术语“症状”是指患者所经历的在结构、功能或感觉上的任何病态现象或与正常状态的偏离，并指示疾病。相比而言，体征是疾病的客观表现。例如，流鼻血是体征。这对于患者、医生、护士和其他观察者是明显的。
本文使用的术语“治疗”可包括对特定疾病、障碍或病症的预防，或对特定疾病、障碍或病症相关症状的缓解和/或防止或消除所述症状。“预防性”治疗是指向未表现出疾病体征或仅表现出疾病早期体征的对象施用的治疗，其用于降低发生该疾病相关之病理的风险。在本文中，“治疗”与“疗法”互换使用。例如，治疗癌症包括防止或减慢癌细胞的生长和/或分裂以及杀伤癌细胞或降低肿瘤大小。癌之成功治疗的其他标志包括归一化测试，例如血细胞计数、红细胞计数、血小板计数、红细胞沉降速率以及多种酶(例如转氨酶和氢化酶)的水平。此外，临床医师可以观察到可检测肿瘤标志物(例如前列腺特异性抗原(PSA))的减少。
“治疗性”治疗是对表现出病理体征的对象施用的治疗，用于减少或消除这些体征。
化合物的“治疗有效量”是足以向施用该化合物的对象提供有益作用的化合物的量。
在本发明方法的多个实施方案中，所述免疫缀合物可以是上文讨论的任意免疫缀合物。上文提供了T-DM1的结构。
本文提到的促凋亡药包括：
FTS
Figure BDA0000433157570000141
Figure BDA0000433157570000142
CMH(droxinostat)
Figure BDA0000433157570000151
TMS(2’,3,4’,5-四甲氧基茋)
Figure BDA0000433157570000152
δ-生育三烯酚
Figure BDA0000433157570000153
雌二醇(E2)
Figure BDA0000433157570000154
姜黄素
Figure BDA0000433157570000155
沙利霉素
Figure BDA0000433157570000161
实施方案
在多个实施方案中，本发明涉及开发适于其中癌细胞产生抗性或者具有产生抗性之高可能性的疾病状态的抗癌疗法，其使用如本文所公开和要求保护的诱导细胞死亡(凋亡)之药剂的相加或协同组合。通过使用这些方法，相对于使用单一抗癌药的抗性产生频率，可以减少癌细胞对药物之抗性的产生，或者可以克服已经历针对治疗的适应性突变之癌细胞的抗性。在多个实施方案中，本发明方法可以有效用于治疗激素抗性乳腺癌，其中所述癌症不再响应于一线治疗，例如使用芳香酶抑制剂(例如阿那曲唑等)或者使用雌激素受体调节剂或拮抗剂(例如他莫昔芬等)。
例如，耐治疗性癌症可以是乳腺癌，例如芳香酶抗性乳腺癌、他莫昔芬抗性乳腺癌、ER+激素难治性乳腺癌或包含其中HER2表达上调之癌细胞的乳腺癌(HER2阳性乳腺癌)、或其任意组合。
如上文所讨论的，长期雌激素剥夺细胞(例如，接受了芳香酶抑制剂或雌激素拮抗剂治疗的患者中的雌激素响应性乳腺癌细胞)可以对大大低于正常见于乳腺组织中的雌激素水平产生增加水平的响应。该作用可以作为编码HER受体之基因(例如，编码HER2之基因)的上调和过表达之结果而发生。在已经用一线药剂(例如芳香酶抑制剂或雌激素拮抗剂)治疗的乳腺癌患者中，这样的细胞可以在不存在正常雄激素水平的条件下增殖，导致对这些一线疗法产生抗性的乳腺癌，即，已成为激素抗性或激素难治性乳腺癌。在这样的疾病状态下，使用二线疗法变得对于患者存活至关重要。在多个实施方案中，本发明提供了用于治疗激素抗性乳腺癌(例如已通过这样的机制产生抗性的那些癌症)的二线疗法。
相对于生长抑制策略来说，本发明人优选选择促凋亡策略，以通过除去抗性癌细胞而非仅仅抑制它们的生长来降低靶细胞中适应性突变的频率。本发明人还公开了，发现使用横向地(即，以两种不同途径)起作用(“横向调节”)的至少两种促凋亡剂(其中每一种均可导致诱导凋亡和细胞死亡)在凋亡的诱导中提供相加或协同作用，其中抗性产生的频率降低。在涉及激素抗性乳腺癌细胞之治疗的二线治疗中，通过诱导细胞死亡，促凋亡策略可以降低进一步适应性突变的可能性。横向调节的进一步使用可以进一步降低细胞通过适应性突变避免凋亡的可能性，因为可以激发多于一种单一凋亡诱导机制，并且单个细胞在其死亡之前的两种抗性产生机制的可能性低于单一抗性产生机制的可能性。
凋亡可以通过死亡受体途径(非固有途径)或者通过线粒体介导的途径(固有途径)发生。本发明人出乎意料地发现了通过不同的分子机制起诱导凋亡之作用的促凋亡抗癌剂的相加和协同组合(例如一对促凋亡剂)，与野生型MCF-7和T47D细胞系相比，其有效杀伤良好表征的细胞系中的激素适应性癌细胞，所述良好表征的细胞系例如作为激素难治性乳腺癌之模型的他莫昔芬抗性(TamR)细胞系和长期雌激素剥夺(LTED)细胞系。据信，当两种促凋亡抗癌剂通过不同的机制诱导凋亡时，最可能发生协同作用。
在多个实施方案中，本发明的治疗方法在癌症治疗(尤其是乳腺癌)中提供协同治疗作用。本申请公开了如下出乎意料的结果，当治疗乳腺癌细胞时，某些药的组合提供协同作用。在一个实施方案中，发现使用FTS和CMH的组合治疗提供协同作用。在一个实施方案中，使用TMS和CMH的组合治疗提供协同作用。因此，本发明还包括不仅使用FTS、TMS和CMH，而且使用具有类似活性之药的组合治疗，两种或更多种这样的药联合施用可以例如在乳腺癌(例如激素难治性和激素抗性乳腺癌)的治疗中提供协同治疗作用。例如，使用FTS和ES的组合提供出乎意料地高的协同作用。
在一些实施方案中，T-DM1与E2、FTS和CMH的任意组合提供协同作用，其中T-DM1与FTS或CMH的组合示出最强的协同作用，参见下表1。
本发明人公开了治疗方法，其包括向患有癌症(例如乳腺癌)之患者施用两种或更多种通过横向调节影响细胞的促凋亡抗癌剂，在所述横向调节中，两种药剂以不同的凋亡途径而非单一凋亡途径中的相继步骤(纵向调节)起作用。非固有途径涉及死亡受体，并且该途径由与死亡受体结合的配体活化。固有途径涉及启动凋亡的线粒体途径。横向是指影响多于一条特定途径的刺激，而纵向是指涉及同一途径中的若干步骤。在多个实施方案中，至少两种药实现横向调节。在多个实施方案中，横向调节提供至少两种药的协同作用。在多个实施方案中，本发明的使用至少两种药的联合治疗对非适应性乳腺癌细胞产生协同作用。
在多个实施方案中，本发明的方法提供了治疗癌症的方法，其包括向患有癌症之患者施用有效量的免疫缀合物，所述免疫缀合物包含单克隆抗体部分和通过接头部分与之相连的第一促凋亡药部分；和向所述患者施用有效量的第二促凋亡药。例如，所述免疫缀合物可以包含如在下文中更详细讨论的与之共价相连的第一促凋亡药部分。
例如，待治疗癌症可以是乳腺癌。更具体地，所述乳腺癌可以是激素抗性(激素难治性)乳腺癌，例如得自已经历适应性突变的长期雌激素剥夺细胞的增殖。在赋予激素抗性的一些适应性突变中，将乳腺癌称为HER2抗性乳腺癌。HER2抗性乳腺癌意为其中细胞已经历提供对一线治疗之抗性的适应性突变的乳腺癌，所述一线治疗靶向分子实体及其与HER2受体的相互作用。在一些赋予激素抗性的适应性突变中，将乳腺癌称为芳香酶抗性乳腺癌。芳香酶抗性乳腺癌意为已变得对芳香酶治疗有抗性的乳腺癌。如上所述，芳香酶是参与雌激素生物合成之关键步骤的酶。
在多个实施方案中，免疫缀合物的靶向部分与HER2受体结合。在已变得对芳香酶或雌激素拮抗剂治疗有抗性的癌细胞中，HER2受体的过表达可以为因。当发生过表达时，受体变得选择性地在抗性癌细胞之每个细胞中更为富含，并且在HER2特异性单克隆抗体靶向部分的存在下，每个细胞的抗体-药缀合物可以结合更多分子。使用位于肿瘤细胞上的免疫缀合物，可以获得局部浓度较高的第一促凋亡抗癌药部分。参见Liu C和Chari R，The development of antibody delivery systems to target cancerwith highly potent maytansinoids，Exp.Opin.Invest.Drugs(1997)6(2)：169-172。
因此，在多个实施方案中，本发明方法可用于治疗癌症，其中所述癌症是乳腺癌。更具体地，所述乳腺癌可以是芳香酶抗性乳腺癌；或者所述乳腺癌可以是ER+激素难治性乳腺癌；或者所述乳腺癌可以是HER2阳性乳腺癌；或者所述乳腺癌包含其中HER2表达上调的癌细胞。在多个实施方案中，如上所述的免疫缀合物与表达于乳腺癌细胞(例如激素抗性乳腺癌细胞)中的受体HER2相结合。例如，所述免疫缀合物的单克隆抗体可以是曲妥珠单抗，已知其对HER2受体有特异性。
在多个实施方案中，第一促凋亡抗癌药部分可以是微管解聚剂，例如美登木素生物碱或奥瑞斯他汀。例如，共价缀合物可以基本上由通过接头与美登木素生物碱促凋亡抗癌药部分共价偶联的曲妥珠单抗组成。
可以与单克隆抗体靶向部分缀合的美登木素生物碱药部分的示例性实施方案包括：DM1、DM3和DM4，其具有以下结构：
Figure BDA0000433157570000191
其中，波形线表示药的硫原子与抗体-药缀合物之接头(L)的共价结合。通过SMCC与DM1相连的
Figure BDA0000433157570000201
(曲妥珠单抗)已有报道(WO2005/037992；US2005/0276812A1)。
在多个实施方案中，所述共价免疫缀合物是T-DM1(结构如上所示)，即，与曲妥珠单抗共价偶联的如上所示的DM1。在另一些实施方案中，共价免疫缀合物可以是与曲妥珠单抗相偶联的另一种美登木素生物碱(例如DM3或DM4)。例如，用于实施本发明方法的美登木素生物碱抗体-药缀合物可以具有以下结构和缩写，(其中，Ab是抗体，p为1至约8)：
Figure BDA0000433157570000202
其中DM1通过BMPEO接头与抗体的巯基相连的示例性抗体-药缀合物具有以下结构和缩写：
Figure BDA0000433157570000211
其中Ab是抗体；n为0、1或2；p为1、2、3或4。
包含美登木素生物碱的免疫缀合物、制备所述免疫缀合物的方法及其治疗用途公开于例如美国专利No.5,208,020、美国专利No.5,416,064、US2005/0276812A1以及欧洲专利EP0425235B1中，其公开内容通过引用明确地并入本文。Liu等.Proc.Natl.Acad.Sci.USA93：8618-8623(1996)描述了包含与针对人结直肠癌之单克隆抗体C242相连的称为DM1之美登木素生物碱的免疫缀合物。发现该缀合物对培养的结肠癌细胞具有高度细胞毒性，并且在体内肿瘤生长测定中示出抗肿瘤活性。Chari等Cancer Research52：127-131(1992)描述了这样的免疫缀合物：其中美登木素生物碱通过二硫化物接头与结合人结肠癌细胞系上之抗原的鼠抗体A7缀合，或者与结合HER2/neu原癌基因的另一种鼠单克隆抗体TA.1缀合。在体外测试了TA.1-美登木素生物碱缀合物对人乳腺癌细胞系SK-BR-3的细胞毒性，其中每个细胞表达3×105个HER2表面抗原。该药物缀合物获得了与游离美登木素生物碱药相类似的细胞毒性水平，该水平可以通过增加每抗体分子美登木素生物碱分子数来提高。A7-美登木素生物碱缀合物在小鼠中示出低全身性细胞毒性。
通过将抗体与美登木素生物碱分子化学连接而不显著降低抗体或美登木素生物碱分子的生物活性来制备抗体-美登木素生物碱缀合物。参见，例如，美国专利No.5,208,020，其公开内容通过引用明确地并入本文。每抗体分子缀合的平均3至4个美登木素生物碱分子已示出在提高靶细胞的细胞毒性而不会不利地影响抗体的功能或溶解性中的效力，但甚至期望一分子的毒素/抗体相对于裸抗体的使用来说增强细胞毒性。美登木素生物碱在本领域中是公知的并且可以通过已知技术来合成或者分离自天然来源。合适的美登木素生物碱公开于例如美国专利No.5,208,020和上文中提及的其他专利和非专利出版物中。优选的美登木素生物碱是美登醇和美登醇分子的芳香环或其他位置处经修饰的美登醇类似物，例如多种美登醇酯。
本领域中已知许多连接基团可用于制备抗体-美登木素生物碱缀合物，包括例如美国专利No.5,208,020或欧洲专利0425235B1；Chari等，Cancer Research52：127-131(1992)；以及US2005/016993A1中公开的那些，其公开内容明确地通过引用并入本文。包含接头组分SMCC的抗体-美登木素生物碱缀合物可以如US2005/0276812A1，“Antibody-drugconjugates and Methods”中所公开的来制备。所述接头包括二硫化物基团、硫醚基团、酸不稳定基团、光不稳定基团、肽酶不稳定基团、或酯酶不稳定基团，如上文所述专利中所公开的。本文中描述和例示了另一些接头。
在多个实施方案中，所述共价缀合物包含选择使得在进入机体之后连接断裂(例如通过酶促作用、酸水解、碱水解等)并且随后形成两种独立化合物的接头部分。在另一些实施方案中，所述接头部分基于在生物条件下的稳定性来选择，其中促凋亡抗癌药部分可以发挥细胞毒性作用，同时仍与靶向部分(例如诸如曲妥珠单抗的单克隆抗体)相连。
可以使用来自本领域中先前的结构-活性关系(SAR)研究的数据作为指南以确定使用哪种化合物以及分子上用以附接连接子(tether)的最佳位置使得化合物的效力和选择性仍然高。所述连接子或接头部分选自被证实可用于将生物活性分子连接在一起的那些。本文公开了可以以不同的组合连接在一起以形成杂二价治疗分子的代表性化合物。
可使用多种双官能蛋白质偶联剂来制备抗体与美登木素生物碱的缀合物，所述双官能蛋白质偶联剂例如：N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)、琥珀酰亚胺基-4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸酯(SMCC)、亚氨基硫烷(IT)、酰亚胺酯的双官能衍生物(例如盐酸己二酰亚胺二甲酯)、活性酯类(例如辛二酸二琥珀酰亚胺酯)、醛类(例如戊二醛)、双叠氮基化合物(例如双(对叠氮基苯甲酰基)己二胺)、双重氮衍生物(例如双-(对重氮基苯甲酰基)乙二胺)、二异氰酸酯(例如甲苯2,6-二异氰酸酯)以及双活性氟化合物(例如1,5-二氟-2,4-二硝基苯)。在某些实施方案中，所述偶联剂是N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)(Carlsson等，Biochem.J.173：723-737(1978))或N-琥珀酰亚胺基-4-(2-吡啶基硫代)戊酸酯(SPP)以提供二硫化物连接。
根据连接的类型，可将接头附接于美登木素生物碱分子的多个位置处。例如，可以使用常规偶联技术通过与羟基反应形成酯连接。反应可发生在具有羟基的C-3位置处、经羟甲基修饰的C-14位置处、经羟基修饰的C-15位置处和具有羟基的C-20位置处。在一个实施方案中，在美登醇或美登醇类似物的C-3位置处形成连接。
例如可用于本发明治疗方法和用途的多个实施方案中的免疫缀合物可以包含如上所述与微管解聚剂(例如美登木素生物碱)缀合的靶向单克隆抗体，或者可以包含多拉司他汀或多拉司他汀肽类似物或衍生物(例如奥瑞斯他汀)(参见美国专利No.5635483；5780588)作为第一促凋亡抗癌药部分。多拉司他汀和奥瑞斯他汀已示出干扰微管动力学、GTP水解以及核和细胞分裂(Woyke等(2001)Antimicrob.Agents and Chemother.45(12)：3580-3584)并且具有抗癌(美国专利No.5663149)和抗真菌活性(Pettit等(1998)Antimicrob.Agents Chemother.42：2961-2965)。多拉司他汀或奥瑞斯他汀药部分可经由肽药部分的N(氨基)末端或C(羧基)末端附接至抗体(WO02/088172)。
示例性奥瑞斯他汀实施方案包括N-末端连接的单甲基奥瑞斯他汀药部分DE和DF，其公开于Senter等，Proceedings of the American Associationfor Cancer Research，第45卷，摘要号623，2004年3月28日公开，其公开内容明确地通过引用整体并入本文。实例如下所示。
一个奥瑞斯他汀类似物促凋亡抗癌药部分可以选自下式DE和DF：
Figure BDA0000433157570000231
其中，DE和DF的波形线表示与抗体或抗体-接头组分的共价相连点，并且在各位置处独立地：
R2选自H和C1-C8烷基；
R3选自H、C1-C8烷基、C3-C8碳环、芳基、C1-C8烷基-芳基、C1-C8烷基-(C3-C8碳环)、C3-C8杂环以及C1-C8烷基-(C3-C8杂环)；
R4选自H、C1-C8烷基、C3-C8碳环、芳基、C1-C8烷基-芳基、C1-C8烷基-(C3-C8碳环)、C3-C8杂环以及C1-C8烷基-(C3-C8杂环)；
R5选自H和甲基；
或者R4和R5连接形成碳环并且具有式-(CRaRb)n-，其中Ra和Rb独立地选自H、C1-C8烷基和C3-C8碳环，n选自2、3、4、5和6；
R6选自H和C1-C8烷基；
R7选自H、C1-C8烷基、C3-C8碳环、芳基、C1-C8烷基-芳基、C1-C8烷基-(C3-C8碳环)、C3-C8杂环和C1-C8烷基-(C3-C8杂环)；
每个R8独立地选自H、OH、C1-C8烷基、C3-C8碳环以及O-(C1-C8烷基)；
R9选自H和C1-C8烷基；
R10选自芳基或C3-C8杂环；
Z是O、S、NH或NR12，其中R12是C1-C8烷基；
R11选自H、C1-C20烷基、芳基、C3-C8杂环、-(R13O)m-R14或-(R13O)m-CH(R15)2；
m为1至1000的整数；
R13是C2-C8烷基；
R14是H或C1-C8烷基；
R15每次出现时独立地为H、COOH、-(CH2)n-N(R16)2、-(CH2)n-SO3H或-(CH2)n-SO3-C1-C8烷基；
R16每次出现时独立地为H、C1-C8烷基或-(CH2)n-COOH；
R18选自-C(R8)2-C(R8)2-芳基、-C(R8)2-C(R8)2-(C3-C8杂环)和-C(R8)2-C(R8)2-(C3-C8碳环)；并且
n为0至6的整数。
在一个实施方案中，R3、R4和R7独立地为异丙基或仲丁基，R5是-H或甲基。在一个示例性实施方案中，R3和R4各自为异丙基，R5为-H，R7为仲丁基。
在另一个实施方案中，R2和R6各自为甲基，R9为-H。
在另一个实施方案中，R8每次出现时为-OCH3。
在一个示例性实施方案中，R3和R4各自为异丙基，R2和R6各自为甲基，R5为-H，R7为仲丁基，R8每次出现时为-OCH3，并且R9为-H。
在一个实施方案中，Z是-O-或-NH-。
在一个实施方案中，R10是芳基。
在一个示例性实施方案中，R10是-苯基。
在一个示例性实施方案中，当Z是-O-时，R11是-H、甲基或叔丁基。
在一个实施方案中，当Z是-NH时，R11是-CH(R15)2，其中R15是-(CH2)n-N(R16)2，R16是-C1-C8烷基或-(CH2)n-COOH。
在另一个实施方案中，当Z是-NH时，R11是-CH(R15)2，其中R15是-(CH2)n-SO3H。
式DE的一个示例性奥瑞斯他汀实施方案是MMAE，其中波形线表示与抗体-药缀合物的接头(L)共价相连：
Figure BDA0000433157570000251
式DF的一个示例性奥瑞斯他汀实施方案是MMAF，其中波形线表示与抗体-药缀合物的接头(L)共价相连(参见US2005/0238649和Doronina等.(2006)Bioconjugate Chem.17：114-124)：
Figure BDA0000433157570000252
其他药部分包括下述MMAF衍生物，其中波形线表示与抗体-药缀合物的接头(L)共价相连：
Figure BDA0000433157570000261
在一个方面中，如上所示的亲水基团(包括但不限于三乙二醇酯(TEG))可以在R11处与药部分相连。不受任何特定理论约束，所述亲水基团有助于药部分的内化和不集聚。
式I的ADC示例性实施方案(包括奥瑞斯他汀/多拉司他汀或其衍生物)描述于US2005-0238649A1和Doronina等.(2006)Bioconjugate Chem.17：114-124中，其明确地通过引用并入本文。式I的ADC示例性实施方案(包括MMAE或MMAF和多种接头组分)具有以下结构和缩写(其中“Ab”是抗体，例如曲妥珠单抗；p为1至约8，“Val-Cit”是缬氨酸-瓜氨酸二肽；“S”是硫原子)：
Figure BDA0000433157570000272
Figure BDA0000433157570000281
式I的ADC示例性实施方案(包括MMAF和多种接头组分)还包括Ab-MC-PAB-MMAF和Ab-PAB-MMAF。有趣的是，包含通过不能经蛋白水解切割之接头与抗体连接的MMAF的免疫缀合物已示出具有比得上包含通过可以经蛋白水解切割的接头与抗体连接的MMAF之免疫缀合物的活性。参见，Doronina等.(2006)Bioconjugate Chem.17：114-124。在这种情况下，认为通过细胞中的抗体降解进行药物释放，Id。
通常，肽基药部分可以通过在两个或更多个氨基酸和/或肽片段之间形成肽键来制备。这样的肽键可以例如依照在肽化学领域中公知的液相合成法(参见E.和K.
Figure BDA0000433157570000283
，“The Peptides”，第1卷，第76-136页，1965，Academic Press)来制备。奥瑞斯他汀/多拉司他汀药部分可以依照以下文献中的方法来制备：US2005-0238649A1；美国专利No.5,635,483；美国专利No.5780588；Pettit等(1989)J.Am.Chem.Soc.111：5463-5465；Pettit等(1998)Anti-Cancer Drug Design13：243-277；Pettit，G.R.等.Synthesis，1996,719-725；Pettit等(1996)J.Chem.SOc.Perkin Trans.15：859-863；以及Doronina(2003)Nat.Biotechnol.21(7)：778-784。
特别地，式DF的奥瑞斯他汀/多拉司他汀药部分(例如MMAF及其衍生物)可以使用US2005-0238649A1和Doronina等(2006)BioconjugateChem.17：114-124中所述的方法来制备。式DE的奥瑞斯他汀/多拉司他汀药物部分(例如MMAE及其衍生物)可以使用Doronina等(2003)Nat.Biotech.21：778-784中所述的方法来制备。药物-接头部分MC-MMAF、MC-MMAE、MC-vc-PAB-MMAF和MC-vc-PAB-MMAE可以通过常规方法方便地合成，然后与目的抗体缀合，所述常规方法例如Doronina等.(2003)Nat.Biotech.21：778-784和专利申请公开No.uS2005/0238649A1中所述。
科学文献报道的接头的实例包括：亚甲基(CH2)n接头(Hussey等，J.Am.Chem.Soc.，2003，125：3692-3693；Tamiz等，J.Med.Chem.，2001，44：1615-1622)；用于将纳曲胺(naltrexamine)与其他阿片样物质相连的低聚亚乙基氧基O(-CH2CH2O-)n单元、用于将阿片类拮抗剂和激动剂连接在一起的式-NH-(COCH2NH)nCOCH2CH2CO-(NHCH2CO)nNH-的甘氨酸低聚物((a)Portoghese等，Life Sci.，1982，31：1283-1286；(b)Portoghese等，J.Med.Chem.，1986，29：1855-1861)、用于将阿片样肽连接在一起的亲水性二胺(Stepinski等，Internat.J.of PeDtide&Protein Res.，1991，38：588-92)、刚性双链DNA间隔物(Paar等，J.Immunol.，2002，169：856-864)和生物可降解的接头聚(L-乳酸)(Klok等，Macromolecules，2002，35：746-759)。连接子与化合物的连接可以使化合物获得有利的结合取向。接头本身可以是或可以不是生物可降解的。接头可采取前药的形式，并且针对所连接药物的最佳释放动力学是可调节的。接头可在其全长上是构象可变的，或者连接子的区段可被设计成构象受限的(Portoghese等，J.Med.Chem.，1986，29：1650-1653)。
示例性接头
接头可以包含一种或更多种接头组分。示例性接头组分包括：6-马来酰亚胺基己酰基(“MC”)、马来酰亚胺基丙酰基(“MP”)、缬氨酸-瓜氨酸(“val-cit”或“vc”)、丙氨酸-苯丙氨酸(“ala-phe”)、对氨基苄基氧基羰基(“PAB”)、N-琥珀酰亚胺基4-(2-吡啶基硫代)戊酸酯(“SPP”)、N-琥珀酰亚胺基4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸酯(“SMCC”)和N-琥珀酰亚胺基(4-碘-乙酰基)氨基苯甲酸酯(“SIAB”)。本领域中已知许多接头组分，其中一些在下文中有描述。
接头可以是“可切割接头”，协助药物在细胞中的释放。例如，可以使用酸不稳定性接头(例如腙)、蛋白酶敏感性(例如肽酶敏感性)接头、光不稳定性接头、二甲基接头或含二硫化物的接头(Chari等，CancerResearch52：127-131(1992)；美国专利No.5,208,020)。
在一些实施方案中，接头组分可包含“延伸物单元(stretcher unit)”，所述延伸物单元将抗体与另一种接头组分或药部分相连接。示例性延伸物单元在下文中示出(其中波形线表示与抗体共价相连的位点)：
Figure BDA0000433157570000301
在一些实施方案中，接头组分可包含氨基酸单元。在一个这样的实施方案中，所述氨基酸单元允许通过蛋白酶切割接头，从而促进药物在暴露于细胞内蛋白酶(例如溶酶体酶)之后从免疫缀合物释放。参见，例如，Doronina等.(2003)Nat.Biotechnol.21：778-784。示例性氨基酸单元包括但不限于二肽、三肽、四肽和五肽。示例性二肽包括：缬氨酸-瓜氨酸(vc或val-cit)、丙氨酸-苯丙氨酸(af或ala-phe)、苯丙氨酸-赖氨酸(fk或phe-lys)或N-甲基-缬氨酸-瓜氨酸(Me-val-cit)。示例性三肽包括：甘氨酸-缬氨酸-瓜氨酸(gly-val-cit)和甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸(gly-gly-gly)。氨基酸单元可以包括天然氨基酸残基，以及次要氨基酸和非天然氨基酸类似物，例如瓜氨酸。氨基酸单元可以在它们对特定酶(例如肿瘤相关蛋白酶、组织蛋白酶B、C和D、或纤溶酶蛋白酶)的酶促切割的选择性方面进行设计和优化。
在一些实施方案中，接头组分可包含“间隔物”单元，其使抗体与药部分直接相连或通过延伸物单元和/或氨基酸单元相连。间隔物单元可以是“自我牺牲的(self-immolative)”或“非自我牺牲的”。“非自我牺牲的”间隔物单元为部分或所有间隔物单元在ADC酶促(例如蛋白质水解)切割后保持与药部分结合的间隔物单元。非自我牺牲的间隔物单元的实例包括但不限于甘氨酸间隔物单元和甘氨酸-甘氨酸间隔物单元。还包括易受序列特异性酶促切割的肽类间隔物的其他组合。例如，含有甘氨酸-甘氨酸间隔物单元的ADC通过肿瘤细胞相关蛋白酶进行酶促切割会导致甘氨酸-甘氨酸-药部分从ADC的剩余部分释放。在一个这样的实施方案中，甘氨酸-甘氨酸-药部分随后在肿瘤细胞内发生独立的水解步骤，从而从药部分切割甘氨酸-甘氨酸间隔物单元。
“自我牺牲的”间隔物单元允许释放药部分而无需独立的水解步骤。在某些实施方案中，接头的间隔物单元包含对氨基苄基单元。在一个这样的实施方案中，对氨基苄基醇通过酰胺键与氨基酸单元相连，并且在苄基醇与细胞毒性剂之间形成氨基甲酸酯、甲基氨基甲酸酯或碳酸酯。参见，例如，Hamann等.(2005)Expert Opin.Ther.Patents(2005)15：1087-1103。在一个实施方案中，间隔物单元是对氨基苄基氧基羰基(PAB)。在某些实施方案中，对氨基苄基单元的亚苯基部分被Qm取代，其中Q为-C1-C8烷基、-O-(C1-C8烷基)、-卤素、-硝基或-氰基；且m为0至4的整数。自我牺牲的间隔物单元的实例还包括但不限于在电子方面与对氨基苄基醇类似的芳族化合物(参见，例如，US2005/0256030A1)，例如2-氨基咪唑-5-甲醇衍生物(Hay等(1999)Bioorg.Med.Chem.Lett.9：2237)和邻位或对位氨基苄基乙缩醛。可以使用在酰胺键水解时进行环化的间隔物，例如取代的和未取代的4-氨基丁酸酰胺类(Rodrigues等，ChemistryBiology，1995，2，223)；适当取代的双环[2.2.1]和双环[2.2.2]环体系(Storm等，J.Amer.Chem.Soc.，1972，94，5815)和2-氨基苯基丙酸酰胺类(Amsberry等，J.Org.Chem.，1990，55，5867)。消去在甘氨酸上的a位上取代的含胺药物(Kingsbury等，J.Med.Chem.，1984，27，1447)也是可用于ADC的自我牺牲的间隔物的实例。
在一个实施方案中，间隔物单元是如下文所描绘的支化的双(羟甲基)苯乙烯(BHMS)单元，其可用于并入和释放多种药物。
Figure BDA0000433157570000321
其中Q是-C1-C8烷基、-O-(C1-C8烷基)、-卤素、-硝基或-氰基；m为0至4的整数；n为0或1；并且p为1至约20。
接头可包含任意一种或更多种上述接头组分。在某些实施方案中，接头如以下ADC式II的括号中的内容所示：
Ab([Aa-Ww-Yy]-D)p    II，
其中A是延伸物单元，并且a为0至1的整数；w是氨基酸单元，并且w是0至12的整数；Y是间隔物单元，并且y为0、1或2；Ab、D和p如上文式I所定义。这样的接头的示例性实施方案描述于US2005-0238649A1中，其通过引用明确地并入本文。
在式II ADC的上下文中，示例性接头组分及其组合如下所示：
Figure BDA0000433157570000322
Figure BDA0000433157570000331
可以通过本领域中已知的方法来合成接头组分，包括延伸物、间隔物和氨基酸单元，例如描述于US2005-0238649A1中的那些方法。
在多个实施方案中，本发明的治疗方法提供了如上所述提供横向调节的治疗方法，其中所述第二促凋亡药通过与第一促凋亡抗癌药部分发挥细胞毒性作用机制之分子机制不同的分子机制来发挥细胞毒性作用，诱导凋亡。当第一促凋亡抗癌药部分与第二促凋亡抗癌药对不同的生物化学级联或过程(其各自均可独立地导致凋亡)起作用时实现横向调节。例如，如下表2所示，第一促凋亡抗癌药部分(例如美登木素生物碱或奥瑞斯他汀)可以通过固有凋亡机制(例如微管解聚)起作用，第二促凋亡抗癌药可以是通过非固有途径(例如Fas途径或c-FLIP途径，如在本领域中公知)诱导凋亡的药。或者，如果第一促凋亡抗癌药部分通过非固有途径发挥其作用，则第二促凋亡抗癌药可以是通过固有途径(例如胱天蛋白酶非依赖性途径)或通过胱天蛋白酶依赖性途径诱导凋亡的药。
因此，在多个实施方案中，第二促凋亡药是通过非固有途径诱导凋亡的药，例如第二促凋亡药通过Fas途径诱导凋亡，或者第二促凋亡药通过c-FLIP途径诱导凋亡。更具体地，第二促凋亡药可以是CMH、E2或δ-生育三烯酚。
在另一些实施方案中，第二促凋亡药是通过固有途径诱导凋亡的药；例如，第二促凋亡药可以通过胱天蛋白酶非依赖性途径诱导凋亡，或者可替选地，第二促凋亡药可以通过胱天蛋白酶依赖性途径诱导凋亡。更具体地，第二促凋亡药可以是E2、FTS、δ-生育三烯酚、沙利霉素或姜黄素。
因此，在多个实施方案中，第二促凋亡抗癌药是FTS、CMH、E2、TMS、δ-生育三烯酚、沙利霉素或姜黄素。在多个实施方案中，免疫缀合物是T-DM1，并且第二促凋亡药是FTS、CMH、E2、TMS、δ-生育三烯酚或姜黄素。当免疫缀合物是T-DM1时，第二促凋亡药可以是E2、FTS、δ-生育三烯酚或TMS；或者更具体地，免疫缀合物是T-DM1，第二促凋亡药是FTS。
本发明提供了其中施用免疫缀合物和第二促凋亡药可具有协同作用的方法。在一些实施方案中，通过使用横向调节实现协同作用。
但是，即使在两种促凋亡抗癌剂通过纵向调节起作用时，也可以实现协同或相加作用。此外，就待实现的横向调节而言，两种抗癌剂二者都仍然可能通过非固有途径或固有途径起作用，前提是它们不都通过途径中的相同过程起作用，其中用以提供耐药性的适应性突变仍将会需要通过两种同时的突变发生以赋予抗性。
在多个实施方案中，本发明提供了治疗癌症的方法，其包括向癌症患者施用曲妥珠单抗-DM1(T-DM1)，靶标单克隆抗体的上述共价缀合物的一个实施方案，曲妥珠单抗(
Figure BDA0000433157570000341
)通过接头部分与第一促凋亡抗癌药部分(美登木素生物碱蒽沙大环内酯(ansa macrolide))结合。本发明人在本文中公开了该缀合物T-DM1以在联合治疗方案中提供，发现使用法呢基-硫代水杨酸酯FTS作为第二促凋亡抗癌药提供出乎意料地高的协同作用。在另一个方面中，E2和T-DM1的联合治疗提供出乎意料地高的协同作用。在另一个方面中，CMH和T-DM1的联合治疗提供出乎意料地高的协同作用。
在上述T-DM1的实例中，第一促凋亡抗癌药部分(美登木素的接近类似物)通过接头部分与曲妥珠单抗(Herceptin)相偶联。该接头不并入二硫键，因此根据本文的含义认为其为非还原性接头部分；即，不存在易于还原的二硫键。因此，在多个实施方案中，本发明提供了基本上由通过非还原性接头与第一促凋亡抗癌药部分共价偶联的单克隆抗体部分组成的共价缀合物，其中非还原性是指不存在被认为在生物条件下可能发生还原的二硫键或其他基团。
在下表1中，给出了示出相加和协同作用的多种组合的结果。
表1
Figure BDA0000433157570000351
在T-DM1与FTS和CMH的组合中观察到了强协同。用于确定协同程度的方法和许多研究结果描述于下文中并且以图表形式在图中示出。
在另一些实施方案中，第一促凋亡药部分可以通过可还原接头与第一促凋亡药部分共价偶联。“可还原”连接意为认为或期望这样的接头可能通过可能在生物条件下发生的还原性过程而被切割，即，二硫键的还原。在这样的缀合物中，预期靶向部分(例如，单克隆抗体)将第一促凋亡药部分赋予期望靶标，例如，在激素抗性乳腺癌的情况下为HER2或相关受体，因此，可发生药从靶向部分切割，释放药物使得其可更易于通过组织扩散、通过细胞膜等。
在多个实施方案中，当癌症是乳腺癌时，可以使用该治疗癌症的方法。乳腺癌意为可影响乳腺组织的多种癌症类型的任一种。在另一些实施方案中，可以类似地治疗其他癌症类型，即通过使用对该癌症类型的特征性表位具有特异性的靶向部分(例如过表达受体)，其中所选择的单克隆抗体或其他靶向部分与第一促凋亡药共价相连，所得缀合物与第二促凋亡药联合施用。在这些实施方案中，认为横向调节方法提供靶标癌细胞产生抗性的较低可能性。
癌细胞中的促凋亡机制
在下文中更详细地描述了可用于本发明治疗方法的具体促凋亡药物。FTS
首先，本发明人研究了影响MOMP(线粒体外膜孔)形成的蛋白质类别，所述MOMP形成是凋亡固有途径的关键组分。促凋亡成员(例如Bax、Bim和Bak)促进细胞色素c从线粒体释放，而抗凋亡成员(例如Bcl-2和Mcl-1)防止释放。因此，促凋亡和抗凋亡Bcl-2蛋白的平衡影响细胞命运。用75μM FTS处理LTED细胞0、4、8、16、24和48小时以检查细胞质级分(图1A)。凋亡信号传导导致在24小时时Mcl-1降低，而Bim升高，但Bcl-2未改变。二氧磷基JNK经48小时升高，而p21从4小时直至48小时时间点示出稳定降低(图4A)。存活素从8小时直至16小时降低，并且在24小时和48小时达到检测不到的水平，但XIAP未改变(图1A)。
为了确定Bax是否在经FTS处理的LTED细胞中活化，免疫沉淀Bcl-2，然后探测Bim和Bax(参见图1B)。使用只识别构型改变的Bax蛋白的抗体，对探测的细胞提取物进行探测。如图1B所示，Bax在经FTS处理的细胞中经历了构型改变，这会有助于MOMP。Bim的促凋亡作用主要是通过其与Bcl-2结合除去Bcl-2促存活功能来进行[16,17]。如图1B所示，我们发现Bim与Bcl-2的相互作用提高，而Bax与Bcl-2的相互作用降低。作为蛋白质通过线粒体膜孔流失的证据，细胞溶质中细胞色素c和Smac水平在24小时和48小时升高，此时，Mcl-1降低，Bim升高(图1A)。凋亡诱导因子(AIF)(另一个重要的细胞死亡组分)仅在48小时时出现在细胞溶质中。在示出对MOMP的这些作用之后，研究了参与凋亡的其他关键因素。
已报道FTS通过胱天蛋白酶活化在非乳腺组织中激发细胞死亡[18-20]。为了解决FTS是否通过活化胱天蛋白酶促进乳腺癌细胞死亡的问题，用载剂、FTS或在升高浓度的pan-胱天蛋白酶抑制剂z-VAD-fmk存在下的FTS处理了LTED细胞(参见图1C，上图)。发现，z-VAD-fmk阻碍了FTS诱导的凋亡。现有报道已经表明，在其他癌症中，FTS通过死亡受体诱导凋亡，如通过增加胱天蛋白酶-8证明的[18-20]。在乳腺癌细胞中，死亡受体途径看起来未参与，因为胱天蛋白酶-8未发生显著变化(参见图1C，下图)。胱天蛋白酶8的活性看起来确实升高了；但是，其不受Z-IETD-FMK抑制。参见图2，示出时间进程条形图(2A)和细胞活力对浓度的曲线(2B)，其示出(图2A)FTS与姜黄素的组合对野生型MCF-7细胞的作用；和(图2B)单独的FTS或与姜黄素的组合对MCF-7细胞活力的作用。
雌二醇
研究了在LTED细胞中哪些促凋亡因素对雌二醇诱导的凋亡而言必不可少。用雌二醇处理细胞0、2、4、8、24和48小时，并制备细胞质级分。BimEL和BimL在早期时间点升高(图1D，将4、8小时与对照相比)，但Bax未升高。线粒体级分(图1D，右图)确定了Bim同种型的升高。到48小时的时间点，细胞色素c和Smac/Diablo被释放入细胞溶质中，证明雌二醇组分通过线粒体途径介导凋亡。因为看起来Bim对于雌二醇介导的凋亡是必须的，所以我们实施了E2的滴定，对Bim进行探测，并发现其随时间增加(参见图1E)。Bim敲除也阻碍凋亡(图1F)。研究了凋亡的上游调节因子，发现JNK的磷酸化形式增加(参见图lE)。Bok(一种促凋亡蛋白)也以浓度依赖的方式升高(参见图1E)。还发现，通过添加雌激素，抗凋亡因子Mcl-1降低，但XlAP或存活素未降低。
先前公开的数据间接地提示雌二醇诱导之凋亡中的非固有死亡受体途径。这些现有数据表明，雌二醇提高LTED细胞中FAS-配体的水平，存在FAS，并且可以通过对抗FAS(其刺激凋亡)的单克隆抗体活化该途径。此处，通过证明对抗Fas-配体的siRNA部分取消雌二醇诱导的凋亡，提供了FAS/FAS-配体参与的直接证据(图1F)。因此，雌二醇通过非固有途径活化和固有途径活化二者启动凋亡。
基于过去和现在的结果以及文献综述，每种药剂对线粒体介导的凋亡的作用和非固有死亡受体介导的凋亡途径的作用总结于下表2中。
沙利霉素
沙利霉素在不同的生物膜(包括细胞质膜和线粒体膜)中作为对碱性离子具有严格选择性并且对钾具有强偏好性的离子载体起作用，从而促进线粒体和细胞钾流出，并抑制线粒体氧化磷酸化。最近的研究披露，沙利霉素诱导凋亡，并且克服不同来源的人癌细胞的耐凋亡性。首先，证明了低于Gupta等所用剂量的沙利霉素在分离自患有急性T细胞白血病之患者的CD4+T细胞白血病细胞中诱导大量凋亡。参见http：//www.scitopics.com/New_mission_for_salinomycin_in_cancer.html。据信沙利霉素通过内源性胱天蛋白酶非依赖性途径起作用以诱导凋亡。沙利霉素在癌细胞中活化未伴随细胞周期停滞并且独立于肿瘤抑制蛋白p53、胱天蛋白酶活化、CD95/DC95配体体系和26S蛋白酶体的不同和非常规凋亡途径。这可能是沙利霉素为何可以克服人癌细胞的耐药和耐凋亡的多种机制的一个原因。许多癌细胞具有或获得由p53的损失和具有提高的蛋白水解活性的Bcl-2、P-糖蛋白或26S蛋白酶体的过表达介导的多种耐凋亡机制。但是，沙利霉素看起来能够克服这些耐药和耐凋亡机制。参见图3，其示出时间进程条形图(3A)和细胞活力对浓度的曲线(3B)，其示出沙利霉素对MCF-7细胞的作用。
表2：所选促凋亡药之作用的分子机制
在多个实施方案中，本发明提供了如上所述的治疗方法，其中所述第二促凋亡抗癌药是FTS、CMH、E2、TMS、δ-生育三烯酚、姜黄素或沙利霉素。下文中提供了这些化合物的结构，上文描述了选择这些化合物的合理性。据信这些药中的某些(例如沙利霉素和姜黄素)可以作用于干细胞。
姜黄素
姜黄素是来自香料姜黄(Curcuma longa Linn)的活性成分，它是强效抗氧化剂和抗炎剂。近来证实其具有独特(discrete)化学预防性活性。但是，姜黄素的该抗癌特性的根本分子机制仍未了解，尽管已假设癌细胞凋亡的诱导可能是一种可能的解释。在目前的研究中，发现姜黄素通过诱导肿瘤细胞的凋亡降低埃利希氏腹水癌(Ehrlich′s ascites carcinoma)(EAC)细胞数目，如通过核DNA的细胞周期分布和寡核小体片段化的流式细胞检测分析证实的。进一步探测分子信号导致EAC细胞凋亡，我们观察到姜黄素通过上调促癌蛋白Bax、细胞色素c从线粒体释放以及活化胱天蛋白酶-3导致肿瘤细胞死亡。在EAC中，Bcl-2的状态保持不变，这意味着姜黄素绕过Bcl-2检查点并且撤销其对凋亡的保护作用。因此，据信姜黄素可以通过内源性胱天蛋白酶依赖性途径诱导凋亡。
参见http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/11676493。
组合伴侣之选择的理论基础
选择会激发多种形式的细胞死亡的药剂，使得使用本发明的联合治疗方法可以实现横向调节。FTS(Salirasib)通过线粒体细胞死亡途径激发胱天蛋白酶依赖性癌细胞死亡[11,12]。FTS促进MCF-7细胞和肿瘤异种移植物凋亡[13]。CMH是细胞FLICE(FADD样IL-1β-转化酶)-抑制蛋白(c-FLIP)的小分子抑制剂，并且CMH可以通过抑制c-FLIP活化胱天蛋白酶-8和-10[14,15]。CMH敏化细胞为死亡配体的能力之机制的一部分是通过其抑制HDAC3、HDAC6和HDAC8的能力[15]。TMS是通过线粒体死亡途径经微管抑制主要激发胱天蛋白酶非依赖性死亡的药剂[16,17]。TMS有效用于降低TamR抗性乳腺癌肿瘤异种移植物生长[17]。雌二醇被证实通过线粒体细胞死亡途径[18,19]和Fas死亡受体途径[19]诱导长期雌激素剥夺细胞的凋亡。现有工作已经表明，雌二醇促进体外[18-22]、异种移植物模型[23,24]以及患者[25]中长期雌激素剥夺细胞凋亡。已示出，美登木素生物碱-抗体缀合物通过微管解聚将乳腺癌细胞停滞在有丝分裂前中期/间期来抑制细胞增殖[26]。
当细胞在细胞周期中停滞较长一段时间时，其可导致凋亡[27,28]。T-DM1是曲妥珠单抗-DM1(一种美登木素衍生物)的药物抗体缀合物，其被证实有效用于降低表达HER2的异种移植物[29]以及在患有HER2晚期乳腺癌的患者中有效[30]。通过向已在体内于异种移植物模型中剥夺雌激素的乳腺癌细胞系施用芳香酶抑制剂来曲唑(letrozole)导致HER2信号上调[31,32]。此外，HER2示出在用芳香酶抑制剂治疗期间在乳腺癌患者中上调[33]。因此，经历了雌激素长期剥夺的乳腺癌细胞具有提高水平的HER2而对T-DM1敏感。
协同分析
联合治疗中协同作用的分析集中于三种细胞系：MCF-7、T147D和LTED。MCF-7和T47D细胞系代表非适应性乳腺癌模型。LTED(长期雌激素剥夺)细胞系代表长期雌激素剥夺后的内分泌抗性。在非适应性细胞系中使用如下药剂：法呢基硫代水杨酸(FTS，Salirasib)、4-(4-氯-2-甲基苯氧基)-N-羟基丁酰胺(CMH)和2，4，3’，5’-四甲氧基茋(TMS)。对于适应性细胞系而言，还包括雌二醇(E2)和曲妥珠单抗-DM1(T-DM1)。
随着干细胞群体作为肿瘤生长之重要组分的出现，还研究了姜黄素在体外体系中的作用。在非乳腺癌研究中，姜黄素诱导菌落形成和干细胞球体形成的剂量和时间依赖性抑制。出于该原因，我们开始对该药剂在乳腺癌长期雌激素剥夺(LTED)细胞中之作用进行初步研究。我们以剂量应答方式研究了姜黄素的作用。该药剂在降低细胞数目中高度有效，在250nM时观察到初始作用。之后的研究示出在125nM时的作用。然后，我们研究了姜黄素与FTS的组合。FTS的剂量包括载剂，25、50、75和100μM。单独的FTS将细胞数目降低至对照的14％。在125nM下单独的姜黄素将细胞数目降低至相似的程度。因为高水平的姜黄素效力，所以无法确定FTS是否在这些实验中引起相加作用或协同作用。
沙利霉素是被证实有效杀伤干细胞的另一种药剂。该药剂不如姜黄素有效，但在2μM时对MCF-7细胞表现出50％的抑制作用。参见图3。使用之前已示出在体内经历凋亡的MCF-7-5C细胞进行研究以研究单独的E2、T-DM-1以及与这些细胞的组合的作用。E2和T-DM-1二者诱导凋亡。在中等剂量下，E2和T-DM-1的组合看起来比单独的药剂更有效。
我们在非适应性细胞系(参见图4、6、8)和适应性细胞系(参见图5、7、9)二者中研究了这些药剂中的一些。我们用升高浓度的各种药物处理了乳腺癌细胞，然后对其组合进行了测试。我们确定了被杀伤细胞的数目(受影响百分数，fa)和未受药影响的细胞数目(未受影响百分数，fu)(参见图4)。然后，通过中效图将剂量效应曲线转化为其相应的线性形式，其中y＝log(fa/fu)对x＝log(D)[8,34]。从该中效图可以确定组合指数(CI)。我们使用了蒙特卡洛选项(Monte Carlo option)来绘制CI图，因为该方法计算平均值和标准偏差并且显示出置信区间(参见图6、7)。
当组合指数等同于1(CI＝1)时，这意味着两种药以相加的方式一起起作用。当组合指数小于1(CI<1)时，药比它们单独相加的和更有效，并且它们示出协同作用。当组合指数小于1(CI<1)时，两种药物一起不如单独提供时有效，因此显示出拮抗作用。然后，将有效剂量1(D1)绘制在x轴，将有效剂量2(D2)绘制在y轴。可以在Fa等于0.5、0.75、0.9和0.95时进行有效剂量(ED)的绘制。这产生等效应图。我们使用了这两种方法(组合指数(图6,7)和等效应图(图8,9))来确定当使用不同药剂组合时是否存在协同作用。结果总结示于上表1中。
非适应性细胞系结果
当我们研究非适应性细胞时(图4、6、8)，我们发现TMS和FTS的组合指数在MCF-7细胞系中是相加的(图6a，图8a)而在T47D细胞中是拮抗的(图6d，图8d)。FTS与CMH的组合在MCF-7细胞系中对于该组合而言表现出协同作用(图6b，8b)，但在T47D细胞系中仅为轻度协同(图6e，8e)。TMS与CMH的组合在MCF-7(图6c，8c)和T47D(图6f，8f)二者中示出协同作用。
适应性细胞系结果
改变与TMS的组合。当将TMS与CMH组合时，对于LTED细胞系而言有协同作用，而对于他莫昔芬抗性细胞系而言有轻度协同作用。当将TMS与FTS、E2或T-DM1组合时，对于LTED细胞和TamR细胞二者而言，这样的组合在本质上是相加的(图7a、c-d、j、l-m)。FTS与CMH的组合在LTED细胞和TamR细胞二者中示出轻度协同作用(图7e，n)。但是，与他莫昔芬抗性细胞系(图70，p)相比，FTS与T-DM1以及FTS与E2的组合在LTED细胞中示出较强的协同作用(图7f，g)。E2与CMH的组合在两种细胞系中是相加的(图7e，q)。在LTED细胞系中，最有效的组合是CMH与T-DM1的组合(图7i)。我们在他莫昔芬抗性细胞系中观察到该组合的轻度协同作用(图7s)。这可能是由于如下事实：他莫昔芬抗性细胞在较低程度上培养于低雌激素环境中，因此表达较低水平的HER2。
另参见图9，其示出适应性细胞系之等效应图分析的图示说明。
结果概述
上表1示出结果概述，并且突出了导致协同作用的组合。我们观察到，最强的协同作用来自施用于适应性LTED细胞系的T-DM11CMH的组合。这可能是由于该组合靶向固有线粒体死亡途径和非固有死亡受体途径二者，即实现了横向调节。T-DM1允许靶向LTED细胞表面上过表达的HER2，并且DM1药剂通过固有线粒体途径激发细胞死亡。CMH调节c-FLIP以活化非固有死亡受体途径[14,15]。效力和T-DM1靶向HER2二者可能对于所观察到的协同作用是关键的。所测试的所有与TMS的组合在本质上是相加的(参见图6-9)。与非适应性LTED细胞系相比，适应性细胞系中的FTS组合较弱(比较图6b、d、e与图7e、f、g以及图8b、d、e与图9e、f、g)。
施用和组合物
本发明还提供了可与联合药物治疗相结合使用的辅助治疗。在多个实施方案中，促凋亡抗癌药的组合(例如，其中发生凋亡诱导之不同分子机制的组合)可与本领域中公知的其他治疗方法(包括放射治疗例如X-射线、γ-射线、放射性核素发射和亚原子颗粒暴露、近距离治疗)组合使用，以及使用另外的抗癌剂(其本身为促凋亡的或者是细胞生长抑制剂或细胞繁殖抑制剂)。用于评价这些组合和分析结果的方法在本领域中是已知的。
用以靶向多种途径的有效药物的组合为开发用于治疗癌症之药物疗法开辟了新的领域。如本文所公开的，本发明的组合疗法基于靶向不同/多种途径，包括但不限于：诱导胱天蛋白酶依赖性细胞死亡；抑制细胞FLICE；活化胱天蛋白酶(包括胱天蛋白酶的间接活化)；抑制HDAC3、HDAC6和HDAC8；诱导胱天蛋白酶非依赖性死亡；调节线粒体死亡和Fas死亡受体途径和破坏微管结构。
在多个实施方案中，本发明提供了用于联合施用第一促凋亡抗癌剂和第二促凋亡抗癌剂的方法。本领域普通技术人员将理解，彼此联合施用的两种或更多种药剂不一定同时或以相同剂量施用。在一个方面中，作为药物联合治疗之一部分被施用的化合物分开施用。在另一个方面中，在施用第二化合物之前施用第一化合物。在另一个方面中，第一化合物和第二化合物几乎同时施用。在另一个方面中，在施用第二化合物之后施用第一化合物。每种药剂均可以基于医师的知识和技能以多种剂量、多种施用频率和间隔时间施用多次。
本发明还提供了包含本发明化合物的药物组合物。该药物组合物可以包含一种或更多种本发明化合物及其生物活性类似物、同族物、衍生物、修饰体及可药用盐和可药用载体。在一个实施方案中，将化合物作为药物组合物施用。
施用途径可以根据所施用化合物的类型而不同。在一个方面中，所述化合物通过诸如经口、外用、直肠、肌内、黏膜内、鼻内、吸入、眼以及静脉内的途径施用。
本发明还提供了施用作为受控释放制剂的本发明化合物。
在一个实施方案中，与使用任意单独的化合物的作用相比，用两种或更多种化合物的组合治疗对象的结果是相加的。在一个方面中，在使用两种或更多种化合物时看到的作用大于单独使用任意化合物时看到的作用。
本组合物可任选地包含合适量的可药用载剂以提供用于适当施用于患者的形式。
本组合物还可以与行为治疗或相互作用组合施用于对象。
本发明的范围内包括多种个体异头物、非对映体和对映体及其混合物。此外，本发明的化合物还包括任何可药用盐，例如：碱金属(例如钠和钾)盐；铵盐；单烷基铵盐；二烷基铵盐；三烷基铵盐；四烷基铵盐；以及氨丁三醇盐。化合物的水合物和其他溶剂合物包括在本发明的范围内。
如果起始剂量无效，则可以提高联合治疗的一种或更多种化合物的剂量。如果起始剂量导致与上述速率相比更迅速的重量损失，则可以降低至少两种化合物中的一种或更多种的剂量。
可药用碱加成盐可由无机碱和有机碱制备。衍生自无机碱的盐包括例如钠盐、钾盐、锂盐、铵盐、钙盐和镁盐。衍生自有机碱的盐包括但不限于：伯胺、仲胺和叔胺的盐，例如烷基胺、二烷基胺、三烷基胺、取代烷基胺、二(取代烷基)胺、三(取代烷基)胺、烯胺、二烯胺、三烯胺、取代烯胺、二(取代烯基)胺、三(取代烯基)胺、环烷基胺、二(环烷基)胺、三(环烷基)胺、取代环烷基胺、二取代环烷基胺、三取代环烷基胺、环烯基胺、二(环烯基)胺、三(环烯基)胺、取代环烯基胺、二取代环烯基胺、三取代环烯基胺、芳香胺、二芳胺、三芳胺、杂芳胺、二杂芳胺、三杂芳胺、杂环胺、双杂环胺、三杂环胺、混合的二胺和三胺的盐，其中胺上至少两个取代基是不同的，所述取代基选自烷基、取代烷基、烯基、取代烯基、环烷基、取代环烷基、环烯基、取代环烯基、芳基、杂芳基、杂环基等。还包括两个或三个取代基与氨基氮一起形成杂环基或杂芳基的胺。例如，合适的胺的实例包括异丙胺、三甲胺、二乙胺、三(异丙基)胺、三(正丙基)胺、乙醇胺、2-二甲基乙醇胺、氨基丁三醇、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、咖啡因、普鲁卡因、海巴胺(hydrabamine)、胆碱、甜菜碱、乙二胺、氨基葡萄糖、N-烷基葡糖胺、可可碱、嘌呤、哌嗪、哌啶、吗啉、N-乙基哌啶等。还应该理解，其他羧酸衍生物可用于本发明的实践中，例如羧酸酰胺，包括羧胺、低级烷基羧胺、二烷基羧胺等。
可药用酸加成盐可由无机酸和有机酸制备。衍生自无机酸的盐包括盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、磷酸等。衍生自有机酸的盐包括乙酸、丙酸、乙醇酸、丙酮酸、草酸、苹果酸、丙二酸、琥珀酸、马来酸、富马酸、酒石酸、柠檬酸、苯甲酸、肉桂酸、扁桃酸、甲磺酸、乙磺酸、对甲苯磺酸、水杨酸等。
在一个实施方案中，本发明的组合物可包含一种本发明化合物。在另一实施方案中，本发明的组合物可包含多于一种的本发明化合物。在一个实施方案中，可用于治疗其他障碍的另外的药物或化合物可作为组合物的一部分。在一个实施方案中，只包含一种本发明化合物的组合物可以与包含至少一种另外的本发明化合物的另一组合物同时施用。在一个实施方案中，不同的组合物可彼此在不同的时间施用。当本发明的组合物只包含一种本发明化合物时，还必须使用包含至少一种另外的化合物的另外的组合物。
可用于实践本发明的药物组合物可以例如以1ng/kg/天至100mg/kg/天的剂量来施用。
可用于本发明方法中的药物组合物可以例如以口服固体制剂或作为眼药、栓剂、气雾剂、外用药或其他类似制剂全身施用。除了合适的化合物以外，这些药物组合物还可以含有可药用载体和其他已知能增强和有利于药物施用的成分。还可以使用其他可能的制剂(例如纳米颗粒、脂质体、重新包封的红细胞(resealed erythrocyte)和基于免疫的系统)来根据本发明的方法施用合适的化合物或者其类似物、修饰物或衍生物。
使用本文所述的任意方法鉴定出的化合物可以配制并施用给对象以用于治疗本文公开的疾病。本领域的普通技术人员将理解，这些方法也会对其他疾病、障碍和病症有用。
“前药”是指在体内转化成为母体药物(parent drug)的药剂。由于在某些情况下，前药可能会比母体药物更易于施用，因此前药往往是有用的。例如，前药可通过口服给药而被生物体利用，而母体药物则不能。前药还可以具有与母体药物相比更为改善的药物组合物中溶解度，或者可以表现出提高的适口性或者更易于配制。前药的一个非限制性实例是作为酯(所谓“前药”)施用的本发明化合物，用以利于跨越细胞膜(在此处，水溶性是不利于流动的)，随后所述酯被水解代谢成羧酸(即活性实体)，一旦进入细胞，水溶性便成为有利的。前药的另一实例可以是与酸基团键合的短肽(聚氨基酸)，在此处肽被代谢以提供活性部分。
本发明包括制备和使用包含可作为活性成分用于治疗本文所公开之疾病的化合物的药物组合物。这样的药物组合物可以仅由活性成分组成(采用适于施用于对象的形式)，或者所述药物组合物可以包含活性成分以及一种或更多种可药用载体、一种或更多种其他成分、或其某些组合。活性成分可采用生理上可接受的酯或盐的形式存在于药物组合物中，例如本领域中公知的与生理上可接受的阳离子或阴离子组合。
本文所述的药物组合物的制剂可以通过任何已知方法或药物领域今后开发的任何方法来制备。一般来说，此类制备方法包括将活性成分与载体或者一种或更多种其他辅助成分结合的步骤，然后，如有必要或需要，可将产品塑形或包装成所需的单剂量单位或多剂量单位。
虽然本文提供的药物组合物的说明主要针对适用于符合伦理地向人施用的药物组合物，但本领域技术人员会理解，这些组合物一般情况下也适用于向各种动物施用。应理解，为了使组合物适于向各种动物施用，可以对适于向人施用的药物组合物进行修饰，并且普通的兽医药理学家可以仅通过普通的实验(如果有的话)来设计和进行这种修饰。施用本发明药物组合物的对象包括但不限于：人和其他灵长类、哺乳动物包括商业相关的哺乳动物(例如牛、猪、马、绵羊、猫和狗)以及鸟类包括商业相关的鸟类(例如鸡、鸭、鹅和火鸡)。
本发明方法包括的一种施用类型是肠胃外施用，其包括但不限于：通过注射组合物来施用药物组合物、通过手术切口施加组合物以及通过组织穿透的非手术创伤的组合物施加等。特别地，预计肠胃外施用包括但不限于：皮下、腹膜内、肌内和胸腔内注射以及肾透析输注技术。
可用于本发明方法中的药物组合物可以以适于口服、经直肠、经阴道、肠胃外、外用、经肺、鼻内、吸入、含服、经眼、鞘内或其他施用途径的制剂进行制备、包装或出售。其他预期的制剂包括抛射式纳米颗粒、脂质体制剂、含有活性成分的重新包封的红细胞以及基于免疫的制剂。
本发明的药物组合物可作为单一单位剂量或作为多个单一单位剂量进行批量制备、包装或出售。本文使用的“单位剂量”是指药物组合物的个别量，所述药物组合物包含预定量的活性成分。活性成分的量一般等于向对象施用的活性成分的剂量，或者是这一剂量的便于使用的部分，例如，这一剂量的一半或三分之一。
本发明药物组合物中活性成分、可药用载体与任何其他成分的相对量将依据所治疗对象的身份、体积和状态而改变，还可依据该组合物的施用途径而改变。例如，所述组合物可包含0.1％至100％(w/w)的活性成分。
除了活性成分以外，本发明的药物组合物还可包含一种或更多种另外的药学活性剂。特别预期的其他药剂包括镇吐药和清除剂(例如氰化物和氰酸盐/酯清除剂)。
可利用常规技术制备本发明药物组合物的受控释放或持续释放剂型。
本发明药物组合物适于口服的制剂可采用独立的固体剂量单位的形式来制备、包装或出售，所述剂型包括但不限于片剂、硬胶囊剂或软胶囊剂、扁囊剂、含片或锭剂，其中每个都包含预定量的活性成分。适于口服施用的其他制剂包括但不限于：粉末状或颗粒状的制剂、水性或油性混悬液、水性或油性溶液或者乳剂。
本文使用的“油性”液体是包含含碳液体分子的“油性”液体，其表现出比水弱的极性特征。
例如，包含活性成分的片剂可通过对活性成分进行压缩或模制以及任选地与一种或更多种其他成分一起来制备。压缩片剂可通过在合适的装置中压缩自由流动形式(如粉末或颗粒制备物)的活性成分(其任选地与粘合剂、润滑剂、赋形剂、表面活性剂和分散剂中的一种或更多种混合)来制备。模制的片剂可通过在合适的装置中对活性成分、可药用载体和至少足以润湿混合物之液体的混合物模制而制成。制备片剂中使用的可药用赋形剂包括但不限于：惰性稀释剂、成粒剂和崩解剂、粘结剂和润滑剂。已知的分散剂包括但不限于：马铃薯淀粉和羟基乙酸淀粉钠。已知的表面活性剂包括但不限于：月桂基硫酸钠。已知的稀释剂包括但不限于：碳酸钙、碳酸钠、乳糖、微晶纤维素、磷酸钙、磷酸氢钙和磷酸钠。已知成粒剂和崩解剂包括但不限于：玉米淀粉和海藻酸。已知的粘结剂包括但不限于：明胶、阿拉伯树胶、预胶化的玉米淀粉、聚乙烯吡咯烷酮和羟丙基甲基纤维素。已知的润滑剂包括但不限于：硬脂酸镁、硬脂酸、二氧化硅和滑石粉。
片剂可以无包被或者可以利用已知的方法进行包被，以实现在对象的消化道中延迟崩解，从而提供活性成分的持续释放和吸收。例如，可使用例如单硬脂酸甘油酯或双硬脂酸甘油酯的材料来包被片剂。又例如，片剂可通过使用美国专利No.4，256，108、4，160，452和4，265，874中所述的方法进行包被以形成渗透型受控释放片剂。片剂还可包含甜味剂、调味剂、着色剂、防腐剂或其某些组合以提供适于药用的和适口的制剂。
包含活性成分的硬胶囊剂可利用生理可降解的组合物(例如明胶)来制备。这样的硬胶囊剂包含活性成分，并且还可包含其他成分包括例如惰性固体稀释剂(如碳酸钙、磷酸钙或高岭土)。
包含活性成分的软明胶胶囊剂可利用生理可降解的组合物(例如明胶)来制备。这样的软胶囊剂包含活性成分，其可与水或油性介质(如花生油、液体石蜡或橄榄油)混合。
乳果糖也可用作能被自由消化(freely erodible)的填料，并且在本发明化合物制备成胶囊剂形式时可用。
适于口服施用的本发明药物组合物的液体制剂可以液体形式或以在使用前用水或其他合适的载剂重溶的干品形式制备、包装和出售。
混悬液可以使用常规方法来制备，以实现活性成分在水性或油性载剂中的悬浮。例如，水性载剂包括水和等渗盐水。例如，油性载剂包括杏仁油、油酯、乙醇、植物油(例如花生油、橄榄油、芝麻油或椰子油、分馏植物油)和矿物油(例如液体石蜡)。混悬液还可包含一种或更多种额外成分，包括但不限于：助悬剂、分散剂或润湿剂、乳化剂、缓和剂、防腐剂、缓冲剂、盐、矫味剂、着色剂和甜味剂。油性混悬液还可包含增稠剂。已知的助悬剂包括但不限于：山梨糖醇糖浆、氢化食用脂肪、海藻酸钠、聚乙烯吡咯烷酮、西黄蓍胶、阿拉伯胶和纤维素衍生物(例如羧甲基纤维素钠、甲基纤维素和羟丙甲基纤维素)。已知的分散剂或润湿剂包括但不限于：天然磷脂(例如卵磷脂)；烯基氧化物与脂肪酸、长链脂肪醇、来自脂肪酸和己糖醇的偏酯或来自脂肪酸和己糖醇酸酐的偏酯的缩合产物(例如，分别为硬脂酸聚氧乙烯、十七碳乙烯羟十六醇、单油酸聚氧乙烯山梨醇和单油酸聚氧乙烯山梨聚糖)。已知的乳化剂包括但不限于：卵磷脂和阿拉伯树胶。已知防腐剂包括但不限于：甲基-、乙基-或正丙基-对羟基苯甲酸酯、抗坏血酸和山梨酸。已知的甜味剂包括例如：甘油、丙二醇、山梨醇、蔗糖和糖精。已知的用于油性混悬剂的增稠剂包括例如：蜂蜡、硬蜡和十六醇。
在一个方面中，糖浆剂或酏剂形式的制剂或滴剂形式施用的制剂可包含活性成分以及甜味剂(优选是不含热量的)，其还可包含作为防腐剂的尼泊金甲酯或尼泊金丙酯、矫味剂和合适的着色剂。
活性成分存在于水性或油性溶剂中的液体溶液可采用与混悬液基本上相同的方法来制备，主要区别在于活性成分是溶解的，而非悬浮在溶剂中。本发明药物组合物的液体溶液可以包含混悬液中所述的每种组分，应理解，助悬剂不必然辅助活性成分溶解于溶剂中。水性溶剂包括例如水和等渗盐水。油性溶剂包括例如：杏仁油、油酯、乙醇、植物油(例如花生油、橄榄油、芝麻油、椰子油或分馏植物油)和矿物油(例如液体石蜡)。
可使用已知方法来制备本发明药物制剂的粉末和颗粒制剂。这种制剂可直接施用给对象，例如形成片剂、填充胶囊剂或通过向其加入水性或油性载剂来制备水性或油性混悬剂或溶液。这些制剂中的每一种都可以进一步包含一种或更多种分散剂或润湿剂、助悬剂和防腐剂。这些制剂中还可以包含另外的赋形剂(例如填充剂和甜味剂、矫味剂或着色剂)。
本发明的药物组合物还可以采用水包油乳剂或油包水乳剂的形式来制备、包装或出售。油相可以是植物油(例如橄榄油或花生油)、矿物油(例如液体石蜡)或其组合。这些组合物还可包含一种或更多种乳化剂，包括天然胶(例如阿拉伯胶或西黄蓍胶)、天然磷脂(例如大豆磷脂或卵磷脂)、衍生自脂肪酸和己糖醇酸酐组合的酯或偏酯(例如山梨醇单油酸酯)以及这些偏酯与烯基氧化物的缩合产物(例如单油酸聚氧乙烯山梨聚糖)。这些乳剂还可以包含其他成分，包括例如甜味剂或矫味剂。
本发明的药物组合物可以以适于直肠施用的制剂进行制备、包装或出售。这样的组合物可采用例如栓剂、保留灌肠剂以及用于直肠或结肠灌洗的溶液的形式。
栓剂制剂可通过将活性成分与非刺激性的可药用赋形剂组合而制成，其中所述赋形剂在普通室温下(即约20℃)为固体而在对象的直肠温度下(即在健康人中约37℃)为液体。合适的可药用赋形剂包括但不限于：可可脂、聚乙二醇和多种甘油酯。栓剂制剂还可包含多种额外成分，包括但不限于抗氧化剂和防腐剂。
保留灌肠剂或者用于直肠或结肠灌洗的溶液可以通过将活性成分与可药用液体载体组成而制成。本领域中公知，灌肠剂可以使用适于对象直肠解剖结构的递送装置来施用，并可以包装在其内。灌肠剂还可包含多种额外成分，包括但不限于抗氧化剂和防腐剂。
本发明的药物组合物可以以适于阴道施用的制剂进行制备、包装或出售。这样的组合物可以采用例如栓剂、经浸渍或经包被的阴道可插入材料(如卫生棉条)或用于阴道冲洗的灌洗制剂或凝胶或霜剂或溶液的形式。
使用化学组合物浸渍或包被材料的方法是本领域已知的，包括但不限于将化学组合物沉积或粘附到材料表面的方法、在材料合成期间将化学组合物掺入材料(即，例如使用生理可降解的材料)结构中的方法以及将水性或油性溶液或混悬液吸收到有吸收性材料中的方法(有或没有后续干燥步骤)。
用于阴道冲洗的灌洗制剂或溶液可以通过将活性成分与可药用液体载体组合而制成。本领域中公知，灌洗制剂可以使用适于对象阴道解剖结构的递送装置来施用，并可以包装于其内。灌洗制剂还可包含多种额外成分，包括但不局限于抗氧化剂、抗生素、抗真菌剂和防腐剂。
本文使用的药物组合物的“肠胃外施用”包括特征在于在对象组织中以物理方式开口并经由该组织裂口进行药物组合物施用的任何施用途径。因此，肠胃外施用包括但不限于：通过注射组合物、通过手术切开施加组合物以及通过组织穿透的非手术创伤的组合物施加等来施用药物组合物。特别地，肠胃外施用预期包括但不限于：皮下、腹膜内、肌内和胸腔内注射以及肾透析输注技术。
适于肠胃外施用的药物组合物的制剂包含与可药用载体(如无菌水或无菌等渗盐水)组合的活性成分。这样的制剂可以以适于推注施用或适于连续施用的形式来制备、包装或出售。注射用制剂可以以单位剂量的形式来制备、包装或出售，例如在安瓿中或在含有防腐剂的多剂量容器中。肠胃外施用的制剂包括但不限于：混悬剂、溶液、油性或水性载剂中的乳剂、膏剂和可植入的持续释放制剂或生物可降解的制剂。这样的制剂还可包含一种或更多种额外成分，包括但不限于助悬剂、稳定剂或分散剂。在肠胃外施用制剂的一个实施方案中，活性成分以干燥的形式(即粉末或颗粒)提供，其用于用合适的载体(例如，无菌无热原水)重溶，而后将该重溶组合物进行肠胃外施用。
所述药物组合物可以以无菌可注射的水性或油性混悬液或溶液的形式制备、包装或出售。该混悬液或溶液可根据现有技术配制，并且除了活性成分以外，还可包含其他成分例如本文所述的分散剂、润湿剂或助悬剂。这样的无菌注射制剂可以使用无毒肠胃外可接受的稀释剂或溶剂(例如水或1,3-丁二醇)来制备。其他可接受的稀释剂和溶剂包括但不限于：林格氏液、等渗氯化钠溶液和不挥发油(例如合成的单-或双-甘油酯)。其他可用的可肠胃外施用的制剂包括以微晶形式在脂质体制剂中包含活性成分的制剂，或者包含作为生物可降解聚合物体系之组分的活性成分的制剂。用于持续释放或植入的组合物可包含可药用的聚合物材料或疏水材料(例如乳剂、离子交换树脂、难溶性聚合物或难溶性盐)。
适于外用施用的制剂包括但不限于：液体或半液体制剂，例如搽剂、洗剂、水包油型或油包水型乳剂(例如乳膏剂、软膏剂或膏剂)以及溶液或混悬液。可外用施用的制剂可以例如包含约1％至约10％(w/w)的活性成分，但活性成分的浓度可以与该活性成分在溶剂中的溶解度界限一样高。用于外用施用的制剂还可包含本发明所述的一种或更多种额外成分。
本发明的药物组合物可以以适于经由口腔进行肺部施用的制剂来制备、包装或出售。这样的制剂可包括干燥颗粒，其包含活性成分并且具有约0.5至约7nm的直径(优选约1至约6nm)。这样的组合物可方便地采用干粉形式通过使用包含干粉贮存器的装置来施用，可以向所述干粉贮存器加入抛射剂流以使粉末分散，或者通过使用自我抛射的溶剂/粉末配药容器(例如在密封的容器中包含溶解在或悬浮在低沸点抛射剂中的活性成分的设备)。优选地，这样的粉末包含颗粒，其中按重量计至少98％的粒径大于0.5nm，以及按数目计至少95％的粒径小于7nm。更优选地，按重量计至少95％的粒径大于1nm，以及按数目计至少90％的粒径小于6nm。干粉组合物优选地包含固体细小粉末稀释剂，例如糖，并方便地以单位剂量的形式提供。
低沸点抛射剂一般包括在大气压下沸点低于65°F的液体抛射剂。一般来说，抛射剂可占组合物的约50％至约99.9％(w/w)，而活性成分可占组合物的约0.1％至约20％(w/w)。抛射剂还可包含额外成分，例如液体非离子或固体阴离子表面活性剂或固体稀释剂(优选地具有与包含活性成分的颗粒同一数量级的粒径)。
配制用于肺部递送的本发明药物组合物还可以以溶液或混悬液的小滴形式提供活性成分。这样的制剂可作为包含活性成分的水性或稀酒精溶液或混悬液(任选地，无菌的)进行制备、包装或出售，并且可以方便地使用任何喷雾或雾化装置进行施用。这样的制剂还可包含一种或更多种另外的成分，包括但不限于矫味剂(例如糖精钠)、挥发油、缓冲剂、表面活性剂或防腐剂(如甲基羟苯酸盐)。通过该施用途径提供的小滴优选地具有约0.1至约200nm的平均直径。
可用于肺部递送的本文所述制剂也可用于本发明药物组合物的鼻内递送。
适于鼻内施用的另一制剂是包含活性成分且具有约0.2至约500μm平均粒径的粗粉末。这样的制剂采用鼻吸的方式来施用，即经由鼻腔通道从鼻孔附近盛有粉末的容器中快速吸入。
适于经鼻施用的制剂可以例如包含低至约0.1％(w/w)至高达约100％(w/w)的活性成分，并还可包含本文所述的一种或更多种额外成分。
本发明的药物组合物可以以适于含服施用的制剂进行制备、包装或出售。这样的制剂可以例如采用使用常规方法制备的片剂或锭剂形式，并可以例如包含约0.1％至约20％(w/w)的活性成分，其余部分包含经口可溶解的或可降解的组合物以及任选地本发明所述的一种或更多种额外成分。或者，适于含服施用的制剂可包含含有活性成分的粉末、喷雾状或雾化的溶液或混悬液。当配药时，这样的粉末状、喷雾状或雾化的制剂优选具有约0.1至约200nm的平均粒径或小滴大小，并且还可包含本文所述的一种或更多种额外成分。
本发明的药物组合物可以以适于眼部施用的制剂进行制备、包装或出售。这样的制剂可以例如采用滴眼剂的形式，其包括例如在水性或油性液体载体中0.1％至1.0％(w/w)活性成分的溶液或混悬液。这样的滴眼剂还可包含缓冲剂、盐或者本文所述的一种或更多种额外成分。可用的其他可眼部施用的制剂包括包含微晶形式的或在脂质体制剂中的活性成分的制剂。
本发明的药物组合物可以以适于粘膜内施用的制剂进行制备、包装或出售。本发明提供了允许化合物跨粘膜穿过或吸收的化合物粘膜内施用。这样的施用类型可用于经口(经牙龈、舌下、口腔等)、经直肠、经阴道、经肺、经鼻等吸收。
在一些方面中，舌下施用具有优势，即在某些情况下，当活性成分口服施用时要经由肝脏经历大量的首过代谢和酶促降解，其导致快速的代谢和与肝酶类(其将分子转化成无活性代谢物，或者由于该生物转化使得分子活性降低)活性相关的治疗活性的丢失。
在一些情况下，由于相当大的渗透性和口腔粘膜的血管系统，舌下施用途径能够产生快速的作用。此外，舌下施用还可以允许施用在口服施用后不能在胃粘膜或消化粘膜水平正常吸收的活性成分，或者是在摄入(例如片剂)后在酸性介质中被部分或完全降解的活性成分。
现有技术中已知的舌下片剂制备技术通常通过将含有活性成分的粉末和用于压缩的赋形剂(例如稀释剂、粘合剂、崩解剂和辅料)的混合物直接压缩来制备。在一种替代性的制备方法中，活性成分和压缩赋形剂可预先经干燥制粒或湿润制粒。在一个方面中，活性成分分布在片剂的整个实体中。WO00/16750描述了舌下使用的片剂，其迅速崩解并包含有序的混合物，所述混合物中活性成分采用微粒的形式，所述微粒粘附于水溶性颗粒(其体积较大，构成活性微粒的支持物)的表面，该组合物还包含粘膜粘附剂。WO00/57858描述了舌下使用的片剂，其包含与泡腾系统(其旨在促进吸收)结合的活性成分，同时包含pH值调节剂。
本发明的化合物可以适于施用的制剂或药物组合物进行制备，所述施用允许或促进跨粘膜吸收。粘膜吸收促进剂包括但不限于：胆盐、脂肪酸、表面活性剂或酒精。在具体实施方案中，渗透促进剂可以是胆酸钠、十二烷基硫酸钠、脱氧胆酸钠、牛磺脱氧胆酸盐、甘氨胆酸钠、二甲基亚砜或乙醇。在另一实施方案中，本发明的化合物可以与粘膜渗透促进剂一起配制，以便于化合物的递送。该制剂的pH可以针对溶解度、药物稳定性以及跨粘膜(例如鼻腔粘膜、口腔粘膜、阴道粘膜、呼吸道和肠道粘膜)的吸收来进行优化。
为了进一步提高本发明药物制剂的粘膜递送，包含活性剂的制剂也可以包含亲水性低分子量化合物作为基质或赋形剂。这样的亲水性低分子量化合物提供了通道介质，水溶性活性剂(如生理活性肽或蛋白质)通过该通道介质可以经由所述基质扩散至机体表面(活性剂在此处被吸收)。所述亲水性低分子量化合物任选地从粘膜或施用环境中吸收水分并且溶解所述水溶性活性肽。该亲水性低分子量化合物的分子量一般不超过10000，优选不超过3000。示例性的亲水性低分子量化合物包括多羟基化合物，如寡糖、二糖和单糖(如蔗糖、甘露醇、乳糖、L-阿拉伯糖、D-赤藓糖、D-核糖、D-木糖、D-甘露糖、D-半乳糖、乳果糖、纤维二糖、龙胆二糖)、甘油和聚乙二醇。可用作本发明中载体的其他亲水性低分子量化合物的实例包括N-甲基吡咯烷酮和醇类(如寡乙烯醇、乙醇、乙二醇、丙二醇等)。这些亲水性低分子量化合物可以单独使用或彼此组合使用，或者与鼻内制剂的其他活性或非活性组分一起使用。
当本发明的受控释放药物制剂进一步包含亲水性基质时，很多选择都可供考虑。亲水基质的实例包括：亲水性聚合物(如聚乙二醇和聚乙烯吡咯烷酮)、糖醇(如D-山梨醇和木糖醇)、糖类(如蔗糖、麦芽糖、乳果糖、D-果糖、右旋糖苷和葡萄糖)、表面活性剂(如聚氧乙烯氢化蓖麻油、聚氧乙烯聚氧丙烯乙二醇和聚氧乙烯山梨聚糖)、高级脂肪酸酯、盐类(如氯化钠和氯化镁)、有机酸(如柠檬酸和酒石酸)、氨基酸(如甘氨酸、β-丙氨酸和赖氨酸盐酸盐)以及氨基糖(如甲葡胺)。聚乙二醇、蔗糖、聚乙烯吡咯烷酮是优选的，更优选的是聚乙二醇。本发明中可使用一种亲水基质或者两种或更多种亲水基质的组合。
本发明包括通过吸入器进行经肺、经鼻或口服施用。在一个实施方案中，可通过吸入器递送定量的剂量。
吸入器是患者自我施用至少一种本发明化合物的装置，其包含喷雾吸入器(如鼻腔、口腔、或肺部喷雾吸入器)，其中含有至少一种本发明化合物和可药用分散剂的气溶胶喷雾制剂。一方面，所述装置通过形成喷雾定量分散一定量的喷雾制剂，所述喷雾制剂包含一剂量的、可有效地治疗本发明所涵盖疾病或障碍的至少一种本发明化合物。所述分散剂可以是表面活性剂，例如但不限于聚氧乙烯脂肪酸酯、聚氧乙烯脂肪酸醇、聚氧乙烯山梨聚糖脂肪酸酯。也可以使用基于磷脂的表面活性剂。
在另一些实施方案中，喷雾制剂作为干粉末喷雾制剂提供，其中本发明的化合物作为细小分离的粉末存在。该干粉末制剂还可包含充填剂，例如但不限于乳糖、山梨醇、蔗糖和甘露醇。
在另一具体实施方案中，喷雾制剂是液体喷雾制剂，其还包含可药用的稀释剂(例如但不限于：无菌水、盐水、缓冲盐溶液和葡萄糖溶液)。
在另一些实施方案中，喷雾制剂还包含至少一种另外的本发明化合物，其浓度使得由所述装置分散的定量的喷雾制剂包含一剂量的所述另外化合物，当与至少本发明第一或第二化合物联用时，其量能有效改善本文所公开之疾病或障碍的症状。
因此，本发明提供了自我施用方法用于治疗门诊病人的成瘾性相关疾病或障碍(如酒精相关的疾病或障碍)。这种施用方法可以在医院、诊所或在医院或诊所外由非医务人员进行自我施用。
本发明化合物可以适于经鼻施用的制剂或药物组合物进行制备。在另一实施方案中，本发明的化合物可以与粘膜渗透促进剂一起配制，以便于药物递送。该制剂的pH也可针对溶解度、药物稳定性、通过鼻腔粘膜的吸收及其他因素进行优化。
用在吸入器或吹入器中的小塑料容器(capsule)、吸塑容器和药筒(cartridge)可制作成含有本文所提供的药物组合物的粉末混合物、合适的粉末基质(如乳糖或淀粉)以及性能改良剂(如L-亮氨酸、甘露醇或硬脂酸镁)。乳糖可以是无水的或以一水化合物的形式存在。其他合适的赋形剂包括右旋糖酐、葡萄糖、麦芽糖、山梨醇、木糖醇、果糖、蔗糖和海藻糖。本文提供的用于吸入/鼻内施用的药物组合物还可包含合适的调味剂(如薄荷醇和左薄荷脑)或甜味剂(如糖精或糖精钠)。
对于吸入施用，用于本发明方法的化合物可采用气溶胶喷雾(来自加压的容器或喷雾器)的形式方便地递送，其使用合适的抛射剂例如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳或其他合适的气体。在加压气溶胶的情况下，可通过使用阀门来定量递送从而确定剂量单位。用于吸入器或吹入器中的例如明胶的小塑料容器和药筒可被制成包含药的粉末混合物以及合适的粉末基质(如乳糖或淀粉)。
本文使用的“另外成分”包括但不限于以下的一种或更多种：赋形剂、表面活性剂、分散剂、惰性稀释剂、制粒剂、崩解剂、粘结剂、润滑剂、甜味剂、调味剂、着色剂、防腐剂、生理可降解的组合物(如明胶)、水性载体和溶剂、油性载体和溶剂、助悬剂、分散剂或润湿剂、乳化剂、缓和剂、缓冲液、盐类、增稠剂、填充剂、乳化剂、抗氧化剂、抗生素，抗真菌剂、稳定剂以及可药用的聚合材料或疏水材料。其他可包含在本发明药物组合物中的“额外成分”是本领域已知的并描述于例如Genaro编著，1985，Remington′s Pharmaceutical Sciences，Mack Publishing Co.，Easton，PA中，其通过引用并入本文中。
通常来说，本发明化合物可施用于动物(优选人)的剂量为每千克动物体重约1.0μg至约100g的范围。精确的施用剂量将依据诸多因素而改变，包括但不限于：动物的类型、所治疗的疾病状态的类型、动物的年龄和施用途径。优选地，所述化合物的剂量从每千克动物体重约1mg至约10g变化。更优选地，所述剂量从每千克动物体重约10mg至约1g变化。
所述化合物可以频繁地每天向对象施用数次，或者可以较不频繁地施用，如每天一次、每周一次、每两周一次、每月一次，或更加不频繁地施用，如数月一次或甚至一年一次或更少。给药频率对于熟练的技术人员来说是显而易见的，并且其取决于很多因素，例如但不限于所治疗疾病的类型和严重程度和动物年龄等。
本发明还包括含有本发明化合物的药盒和描述该化合物用法的说明材料。在另一个实施方案中，该药盒包含溶剂(优选无菌的)，其适用于在向哺乳动物施用该化合物前溶解或混悬本发明的组合物。
本文使用的“说明材料”包括出版物、录制品、图表或任何其他表达介质，其可以用于介绍药剂盒中本发明化合物的效用，即使得本文中记载的多种疾病或障碍得以改善。任选地或作为替代地，说明材料可以描述改善所述疾病或障碍的一种或更多种方法。例如，本发明药剂盒的说明材料可以附贴于装有本发明化合物的容器上或者可随装有化合物的容器一起装运。或者，说明材料可与容器分开装运，以使说明材料和化合物可被接收者配合使用。
无需进一步描述，认为本领域普通技术人员可以利用前面的描述和下面的说明性实施例来制备和使用本发明的化合物以及实践所要求保护的方法。因此，以下工作实施例具体指出本发明的优选实施方案，并且不视为以任何方式限制所公开的其他内容。
实施例
材料和方法
药物和化学品
S-反式，反式法呢基硫代水杨酸(FTS，Salirasib)(一种已知的Ras抑制剂)得自Concordia Pharmaceuticals，Inc.Ft.Lauderdale，FL.4-(4-氯-2-甲基苯氧基)-N-羟基丁酰胺(CMH)(5809354)及其失活类似物4-(4-氯-2-甲基苯氧基)-N-(3-乙氧基丙基)丁酰胺(CMB)(6094911)购自Chem Bridge Corporation(San Diego，CA)。按照之前所述合成TMS(Kim S，Ko H，Park JE，Jung S，Lee SK，Chun YJ：Design，synthesis，and discovery of novel trans-stilbene analogues as potent and selectivehuman cytochrome P4501B1inhibitors.JMed Chem2002，45：160-164)。17β-雌二醇获自Steraloids，Inc.(Newport，RI)。T-DM1是来自Genentech，San Francisco，CA的礼物。他莫昔芬和δ-生育三烯酚购自Sigma-AldrichCo.(St.Louis，MO)。
将母本MCF-7培养在具有5％FBS的IMEM中。将T47D细胞培养在具有10％FBS的RPMI160中。将他莫昔芬抗性绝经后细胞培养在具有5％DCC的不含苯酚的IMEM中，并用他莫昔芬(10-7M)处理多于一年[5]。将长期雌激素剥夺细胞培养在具有5％DCC的不含苯酚的IMEM中[6]。LTED细胞是过表达芳香酶的细胞，其由Chen教授惠赠[7]，并且培养在不含酚红的补充有10％DCC、100mg/L丙酮酸钠、2mM L-谷氨酰胺、200mg/L G418的MEM中。
生长抑制和药物相互作用测定
将细胞以60,000个细胞每孔的密度置于6孔板中。两天之后，按照附图简述中所述一式三份处理细胞。在处理结束时，用盐水冲洗细胞两次。通过连续添加1mL HEPES-MgCl2溶液(0.01mol/L HEPES和1.5mmol/LMgCl2)和0.1mL ZAP溶液[含0.13mol/L十六烷基二甲基乙基溴化铵的3％冰乙酸(v/v)]制备了核酸，并使用Coulter计数器(Beckman Coulter,Inc.，Fullerton，CA)进行了计数。由一式三份的样品获得了剂量应答曲线，并且使用Compusyn软件计算了中值有效剂量Dm[8，9]。使用来自Biosoft(Cambridge，U.K.)的计算机软件CalcuSyn应用蒙特卡洛模拟计算了组合指数和平均值及标准偏差[10]。
免疫沉淀
用冷PBS洗涤了培养在100mm培养皿中的细胞，并用1ml裂解缓冲液(50mM Tris-HCl、150mM NaCl、5mM EDTA、25mM NaF、2mMNaVO4、5％甘油、1％Triton X-100、10μg/ml亮抑酶肽、抑肽酶以及胃酶抑素)提取。将样品在冰上孵育30分钟，超声并以14,000rpm在4℃下离心10分钟。在4℃下，用对抗靶蛋白的抗体过夜孵育了含0.5mg总蛋白的上清液，然后添加40μl G蛋白珠(Invitrogen)，并在4℃下继续孵育2小时。将具有免疫复合物的G蛋白珠以14,000rpm离心20秒。仔细除去上清液。将珠用1ml缓冲液II(20mM MOPS、2mM EGTA、5mM EDTA、25mM NaF、40mM B-甘油磷酸盐/酯、10mM焦磷酸钠、2mM NaVO4、0.5％Triton X-100、1mM PMSF、10μg/ml亮抑酶肽、抑肽酶以及胃酶抑素)清洗两次，然后在50μl2×Laemmli缓冲液中煮沸。在10％SDS聚丙烯酰胺凝胶中对样品进行电泳，然后进行免疫印迹。
组合指数和等效应图分析
通过Chou和Talalay的组合指数方法评价了药剂之间相互作用的性质[8,9]。该方法基于以下中效原理：
fa/fu(D/Dm)m (1)，
其中D是剂量，Dm是产生50％生长抑制的剂量，fa是受剂量D影响的细胞百分数，fu是未受影响的百分数，m是定义剂量效应曲线之S形(sigmoidicity)的系数。该质量作用关系和法则导致关于多种抑制剂之相互作用的一般方程：
(fa)A,B/(fu)A，B＝(fa)A/(fu)B+(fa)B/(fu)B+α(fa)A(fa)B/(fu)A(fu)B  (2)，
其中(fa)A、(fu)B和(fa)A，B是受单独的药剂A和B及其组合影响的百分数。从方程1和2可以推导出组合指数(CI)：
CI＝(D)A/(Dx)A+(D)B/(Dx)B+α(D)A(D)B/(Dx)A(Dx)B  (3)，
其中D是产生x％生长抑制的剂量，并且对于相互排除的药物而言，α＝0；对于相互不排除的药物而言，α＝1。通过CalcuSyn软件计算和定义的协同作用为CI<1；相加性为CI＝1，拮抗作用为CI>1[10]。
统计学分析
在CalcuSyn程序[10]中使用蒙特卡洛算法计算了组合指数的平均值和标准偏差。
本发明的实施方案
1.一种治疗癌症的方法，其包括向患有癌症的患者施用有效量的免疫缀合物，所述免疫缀合物包含单克隆抗体部分和与之相连的第一促凋亡药部分；以及向所述患者施用有效量的第二促凋亡药。
2.根据实施方案1所述的方法，其中所述第一促凋亡药部分与所述单克隆抗体部分共价相连。
3.根据实施方案1或2所述的方法，其中所述癌症是乳腺癌。
4.根据实施方案3所述的方法，其中所述乳腺癌是芳香酶抗性乳腺癌。
5.根据实施方案3所述的方法，其中所述乳腺癌是他莫昔芬抗性乳腺癌。
6.根据实施方案3所述的方法，其中所述乳腺癌是ER+激素难治性乳腺癌。
7.根据实施方案3所述的方法，其中所述乳腺癌是HER2阳性乳腺癌。
8.根据实施方案5所述的方法，其中所述乳腺癌是HER2阳性乳腺癌。
9.根据实施方案3所述的方法，其中所述乳腺癌包含其中HER2表达上调的癌细胞。
10.根据实施方案1至9中任一项所述的方法，其中所述免疫缀合物与HER2相结合。
11.根据实施方案9所述的方法，其中所述单克隆抗体部分是曲妥珠单抗。
12.根据实施方案1至11中任一项所述的方法，其中所述第一促凋亡药部分是微管解聚剂。
13.根据实施方案12所述的方法，其中所述第一促凋亡药部分是美登木素生物碱或奥瑞斯他汀。
14.根据实施方案1至12中任一项所述的方法，其中所述免疫缀合物是通过接头与美登木素生物碱促凋亡药部分共价偶联的曲妥珠单抗。
15.根据实施方案14所述的方法，其中所述免疫缀合物是T-DM1。
16.根据实施方案1至15中任一项所述的方法，其中所述第二促凋亡药通过与第一促凋亡药部分发挥细胞毒性作用之分子机制不同的分子机制来发挥细胞毒性作用。
17.根据实施方案1至16中任一项所述的方法，其中施用所述免疫缀合物与所述第二促凋亡药具有协同作用。
18.根据实施方案16所述的方法，其中所述第二促凋亡药是通过非固有途径诱导凋亡的药物。
19.根据实施方案18所述的方法，其中所述第二促凋亡药通过Fas途径诱导凋亡。
20.根据实施方案18所述的方法，其中所述第二促凋亡药通过c-FLIP途径诱导凋亡。
21.根据实施方案18所述的方法，其中所述第二促凋亡药是CMH、E2或δ-生育三烯酚。
22.根据实施方案1δ所述的方法，其中所述第二促凋亡药是通过固有途径诱导凋亡的药物。
23.根据实施方案22所述的方法，其中所述第二促凋亡药通过胱天蛋白酶非依赖性途径诱导凋亡。
24.根据实施方案22所述的方法，其中所述第二促凋亡药通过胱天蛋白酶依赖性途径诱导凋亡。
25.根据实施方案22所述的方法，其中所述第二促凋亡药是E2、FTS或δ-生育三烯酚。
26.根据实施方案1至25中任一项所述的方法，其中所述第二促凋亡抗癌药是FTS、CMH、E2、TMS、δ-生育三烯酚或姜黄素。
27.根据实施方案1至26中任一项所述的方法，其中所述免疫缀合物是T-DM1，所述第二促凋亡药是FTS、CMH、E2、TMS、δ-生育三烯酚或姜黄素。
28.根据实施方案27所述的方法，其中所述第二促凋亡药是E2、FTS、δ-生育三烯酚或TMS。
29.根据实施方案27所述的方法，其中所述第二促凋亡药是FTS。
30.根据实施方案27所述的方法，其中施用所述免疫缀合物和所述第二促凋亡药具有协同作用。
31.根据实施方案1至30中任一项所述的方法，其中在施用免疫缀合物之后，所述接头部分在体内于耐HER2性乳腺癌细胞中切割。
32.根据实施方案1所述的方法，其包括治疗患有芳香酶抗性乳腺癌之患者中的芳香酶抗性乳腺癌，其包括向所述患者联合施用有效量的T-DM1与有效量的FTS、CMH、E2、TMS、δ-生育三烯酚或姜黄素或其任意组合。
33.根据实施方案1至32中任一项所述的方法，其中所述方法是辅助疗法。
34.根据实施方案1至32中任一项所述的方法，其中所述方法是一线疗法。
35.根据实施方案1至32中任一项所述的方法，其中所述方法是二线疗法。
36.根据实施方案1至35中任一项所述的方法，其中所述免疫缀合物和所述第二促凋亡药作为组合制剂施用或者交替施用。
37.根据实施方案1至36中任一项所述的方法，其还包括向所述患者施用额外的抗癌药，其中所述额外的抗癌药任选地通过与所述第一促凋亡抗癌药部分之分子机制不同并且与所述第二促凋亡抗癌药之分子机制不同的分子机制来发挥作用；或者向所述患者施用电离辐射，包括X-射线、γ-射线、放射性核素的发射或亚原子颗粒；或其任意组合。
38.治疗组合物，其包含(a)免疫缀合物和(b)第二促凋亡药，其中所述免疫缀合物包含与第一促凋亡药部分连接的单克隆抗体部分。
39.根据实施方案38所述的组合物，其中所述共价免疫缀合物是T-DM1。
40.根据实施方案38所述的组合物，其中所述第二促凋亡抗癌药是FTS、CMH、E2、TMS、δ-生育三烯酚或姜黄素。
本文引用的每篇专利、专利申请和出版物的公开内容通过引用整体并入本文。
本文包含了参考文献的标题以供参考并帮助寻找某些章节。这些标题并不是要限制其所描述的概念的范围，并且这些概念适用于整个说明书中的其他章节。
虽然已公开本发明的具体实施方案，但很明显，本领域的其他技术人员可在不背离本发明的真正精神和范围的情况下设计出本发明的其他实施方案和变化形式。
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Claims (42)

1.一种治疗癌症的方法，其包括向患有癌症的患者施用有效量的免疫缀合物，所述免疫缀合物包含单克隆抗体部分和与之相连的第一促凋亡药部分；和向所述患者施用有效量的第二促凋亡药。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述第一促凋亡药部分与所述单克隆抗体部分共价相连。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述癌症是乳腺癌。
4.根据权利要求3所述的方法，其中所述乳腺癌是芳香酶抗性乳腺癌。
5.根据权利要求3所述的方法，其中所述乳腺癌是他莫昔芬抗性乳腺癌。
6.根据权利要求3所述的方法，其中所述乳腺癌是ER+激素难治性乳腺癌。
7.根据权利要求3所述的方法，其中所述乳腺癌是HER2阳性乳腺癌。
8.根据权利要求5所述的方法，其中所述乳腺癌是HER2阳性乳腺癌。
9.根据权利要求7所述的方法，其中所述单克隆抗体部分与HER2相结合。
10.根据权利要求9所述的方法，其中所述单克隆抗体部分是曲妥珠单抗。
11.根据权利要求1所述的方法，其中所述第一促凋亡药部分是微管解聚剂。
12.根据权利要求11所述的方法，其中所述第一促凋亡药部分是美登木素生物碱或奥瑞斯他汀。
13.根据权利要求11所述的方法，其中所述单克隆抗体部分与HER-2相结合。
14.根据权利要求12所述的方法，其中所述免疫缀合物是T-DM1。
15.根据权利要求1所述的方法，其中所述第二促凋亡药通过与所述第一促凋亡药部分发挥细胞毒性作用之分子机制不同的分子机制来发挥细胞毒性作用。
16.根据权利要求1所述的方法，其中施用所述免疫缀合物与所述第二促凋亡药具有协同作用。
17.根据权利要求15所述的方法，其中所述第二促凋亡药是通过非固有途径诱导凋亡的药。
18.根据权利要求17所述的方法，其中所述第二促凋亡药通过Fas途径诱导凋亡。
19.根据权利要求17所述的方法，其中所述第二促凋亡药通过c-FLIP途径诱导凋亡。
20.根据权利要求17所述的方法，其中所述第二促凋亡药是CMH、E2或δ-生育三烯酚。
21.根据权利要求15所述的方法，其中所述第二促凋亡药是通过固有途径诱导凋亡的药。
22.根据权利要求21所述的方法，其中所述第二促凋亡药通过胱天蛋白酶非依赖性途径诱导凋亡。
23.根据权利要求21所述的方法，其中所述第二促凋亡药通过胱天蛋白酶依赖性途径诱导凋亡。
24.根据权利要求21所述的方法，其中所述第二促凋亡药是E2、FTS、δ-生育三烯酚、沙利霉素或姜黄素。
25.根据权利要求1所述的方法，其中所述第二促凋亡抗癌药是FTS、CMH、E2、TMS、δ-生育三烯酚、沙利霉素或姜黄素。
26.根据权利要求13所述的方法，其中所述第二促凋亡药通过非固有途径诱导凋亡。
27.根据权利要求26所述的方法，其中施用所述免疫缀合物和所述第二促凋亡药具有协同作用。
28.根据权利要求26所述的方法，其中所述第二促凋亡药是CMH、E2或δ-生育三烯酚。
29.根据权利要求26所述的方法，其中所述免疫缀合物是T-DM1。
30.根据权利要求13所述的方法，其中所述第二促凋亡通过固有途径诱导凋亡。
31.根据权利要求30所述的方法，其中施用所述免疫缀合物和所述第二促凋亡药具有协同作用。
32.根据权利要求30所述的方法，其中所述第二促凋亡药是FTS。
33.根据权利要求30所述的方法，其中所述免疫缀合物是T-DM1。
34.根据权利要求1所述的方法，其包括治疗患有芳香酶抗性乳腺癌、他莫昔芬抗性乳腺癌或ER+激素难治性乳腺癌之患者的芳香酶抗性乳腺癌、他莫昔芬抗性乳腺癌或ER+激素难治性乳腺癌，所述方法包括向所述患者施用有效量的T-DM1和有效量的FTS、CMH、E2、TMS、δ-生育三烯酚或姜黄素或其任意组合。
35.根据权利要求1至34中任一项所述的方法，其中所述方法是辅助疗法。
36.根据权利要求1至34中任一项所述的方法，其中所述方法是一线疗法。
37.根据权利要求1至34中任一项所述的方法，其中所述方法是二线疗法。
38.根据权利要求1至34中任一项所述的方法，其中所述免疫缀合物和所述第二促凋亡药作为组合制剂施用或者交替施用。
39.根据权利要求1至34中任一项所述的方法，其还包括向所述患者施用另外的抗癌药，其中所述另外的抗癌药任选地通过与所述第一促凋亡抗癌药部分之分子机制不同并且与所述第二促凋亡抗癌药之分子机制不同的分子机制来发挥作用；或者向所述患者施用电离辐射，包括X-射线、γ-射线、放射性核素的发射或亚原子颗粒；或者其任意组合。
40.治疗组合物，其包含(a)免疫缀合物和(b)第二促凋亡药，所述免疫缀合物包含与第一促凋亡药部分相连接的单克隆抗体部分。
41.根据权利要求40所述的组合物，其中所述共价免疫缀合物是T-DM1。
42.根据权利要求40所述的组合物，其中所述第二促凋亡抗癌药是FTS、CMH、E2、TMS、δ-生育三烯酚或姜黄素。
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