CN103630522A - 一种有色可溶性有机物三维荧光数据的校正和定标方法 - Google Patents
一种有色可溶性有机物三维荧光数据的校正和定标方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提出了一种有色可溶性有机物三维荧光数据的校正和定标方法,包括:设定三维荧光激发、发生波长范围及扫描速度等测定条件;测定样品的三维荧光光谱;测定超纯水的三维荧光光谱;用样品的激发-发射三维荧光光谱减去超纯水的激发-发射三维荧光光谱进行拉曼散射校正;对三维荧光图谱三角区域赋值为0进行瑞利散射校正;利用超纯水350nm激发波长,371-428nm发射波长荧光强度进行定标;测定样品的吸收光谱,得到样品吸光度;利用样品吸光度对三维荧光数据进行内滤波效应校正。本方法无需进行样品的稀释即能消除高浓度样品内滤波效应对荧光强度的影响,同时可以用于不同荧光仪测定数据的比较。
Description
技术领域
本发明涉及环境科学及监测技术领域,具体的,对环境样品中有色可溶性有机物三维荧光测定及数据的校正和定标方法。
背景技术
有色可溶性有机物是地表各种环境介质中的重要化学组分,分布广泛。越来越多的研究已经表明:它在地表生态系统的物理、化学和生物过程中都起着十分重要的作用;它与生态系统的各个重要环节密切相关,是生态系统中能量与物质循环的重要途径。因此,有色可溶性有机物不仅是生物地球化学、生态学和环境科学等研究领域的重要内容之一,而且也是环境污染的评价、预测和治理研究中的基础理论问题,是目前环境质量、毒理学、环境立法和管理研究共同关注的科学问题。有色可溶性有机物由腐质酸、富里酸、芳烃聚合物等一系列物质组成,主要是土壤、陆生和水生植物降解的产物。一方面,作为水体中紫外辐射和光合有效辐射的重要吸收物质,有色可溶性有机物对于光线进入水下环境具有重大的影响,并影响着生物生产力、化学反应物的形成以及痕量金属的迁移转化和有效性;另一方面,作为溶解性有机碳库的重要组成部分,其对全球碳循环以及气候变化也具有不可忽视的调节作用。因此,准确测定和鉴别有色可溶性有机物的化学组成、结构和来源,已成为生物地球化学、生态学和环境科学的研究重点和热点。
由于有色可溶性有机物来源多样,结构复杂,以往定量描述主要基于光谱吸收,随着三维荧光光谱法以及相应的数据分析方法(平行因子分析及主成分分析)在有色可溶性有机物研究中的应用,已为有色可溶性有机物的来源甄别、结构解析提供了新的可能。但由于有色可溶性有机物荧光对不同荧光仪的发射和吸收的仪器响应还没有一致的标准,加之荧光仪灯强度受环境条件及使用寿命的影响,致使不同荧光仪以及相同的荧光仪在不同的环境条件下测定相同样品其三维荧光仪数据存在差异,无法进行定量比对。
尽管样品在不同荧光计上的测定结果在校准前差异显著,且不同仪器生产商提供的仪器校准因子有差别,但是经校准后同一样品测定的荧光谱图的重叠度提高。因而,建立一种有色可溶性有机物三维荧光数据的校正和定标方法,可以有效消除样品浓度、仪器差异、测定环境对荧光强度的影响,使得测定获得的有色可溶性有机物三维荧光图谱具有可比性。
发明内容
本发明目的是建立一种准确、快速的有色可溶性有机物三维荧光数据的校正和定标方法,适用于不同荧光仪、不同浓度样品、不同环境条件测定的三维荧光数据分析处理和比较,同时操作方法简便,无需使用其它化学试剂,适用于推广和应用。
本发明上述目的通过以下技术方案实现:设定三维荧光激发、发射波长范围及扫描速度等测定条件;经0.22μm滤膜过滤获得有色可溶性有机物样品,测定样品的激发-发射三维荧光光谱;测定超纯水的激发-发射三维荧光光谱;用样品的激发-发射三维荧光光谱减去超纯水的激发-发射三维荧光光谱进行拉曼散射校正;对三维荧光图谱三角区域赋值为0进行瑞利散射校正;利用超纯水350nm激发波长,371-428nm发射波长荧光强度进行定标;测定样品的吸收光谱,得到样品吸光度;利用样品吸光度对三维荧光数据进行内滤波效应校正。
根据本发明的实施例,本发明提出了一种有色可溶性有机物三维荧光数据的校正和定标方法,其包括以下步骤:
(1)测定样品的激发-发射三维荧光光谱,以便得到样品三维荧光光谱;
(2)测定超纯水的激发-发射三维荧光光谱,以便得到超纯水三维荧光光谱;
(3)利用所述超纯水三维荧光光谱,对所述样品三维荧光光谱进行拉曼散射校正;
(4)确定样品三维荧光光谱的三维荧光图谱三角区域,并且通过对所述三维荧光图谱三角区域赋值为0,进行瑞利散射校正;
(5)确定超纯水在350nm激发波长,371-428nm发射波长下的荧光强度均值,并利用所得到的荧光强度进行荧光定标;
(6)测定所述样品的吸收光谱,得到样品吸光度;
(7)利用所述样品吸光度对所述样品三维荧光光谱进行内滤波效应校正。
该方法适用于不同荧光仪、不同浓度样品、不同环境条件测定的三维荧光数据分析处理和比较,同时操作方法简便,无需使用其它化学试剂,适用于推广和应用
在本发明的一个实施例中,所述样品三维荧光光谱和所述超纯水三维荧光光谱分别是利用具有激发发射同步的三维扫描功能的荧光仪在下列三维荧光测定条件下测定的:
激发波长范围为200-450nm,扫描间隔5nm,
发射波长范围为250-600nm,扫描间隔1nm,
狭缝宽度:5nm,
扫描速度为2400nm/min。
在本发明的一个实施例中,所述拉曼散射校正是通过将所述样品三维荧光光谱减去所述超纯水三维荧光光谱而进行的。
在本发明的一个实施例中,所述三维荧光图谱三角区域为矩阵发射波长≤激发波长+5nm以及发射波长≥激发波长+300nm的区域。
在本发明的一个实施例中,所述荧光定标是通过利用所述样品三维荧光光谱除以超纯水在350nm激发波长,371-428nm发射波长下的荧光强度均值而进行的。
在本发明的一个实施例中,所述吸收光谱是采用具有光谱扫描功能的分光光度计在200~600nm的测定系光度波长范围内进行测定的。
在本发明的一个实施例中,采用下式进行所述内滤波效应校正:
其中,FRay为经过拉曼散射校正、瑞利散射校正、超纯水定标的样品三维荧光光谱,AEx、AEm分别为激发波长和发射波长对应的吸光度,FCorr为内滤波效应校正后的样品三维荧光光谱。
在本发明的一个实施例中,所述步骤是在Matlab平台上进行的。
本发明的优点及有益效果:
(1)有色可溶性有机物三维荧光测定,计算、校正和定标均具有高灵敏度、高选择性、高信息量、且不破坏样品结构的优点。
(2)有色可溶性有机物三维荧光数据量大,处理复杂,容易出错且不易检查,本发明通过计算机程序可以实现批量样品三维荧光数据的快速、准确处理,同时可以实现校正后数据的可视化,使用人员可以自定义停滞时间,易于甄辨出三维荧光数据中的异常样品。
(3)操作十分简便,所需成本低,不需任何化学试剂。
附图说明
图1显示了根据本发明一个实施例的有色可溶性有机物样品三维荧光图谱;
图2显示了根据本发明一个实施例的不同时间测定的超纯水三维荧光图谱对比;
图3显示了根据本发明一个实施例的经拉曼散射校正后的有色可溶性有机物三维荧光图谱;
图4显示了根据本发明一个实施例的经拉瑞利散射校正后的有色可溶性有机物三维荧光图谱;
图5显示了根据本发明一个实施例的不同时间测定的超纯水350nm激发波长,365-460nm发射光谱范围荧光强度对比;
图6显示了根据本发明一个实施例的定标后的有色可溶性有机物三维荧光图谱
图7显示了根据本发明一个实施例的有色可溶性有机物样品吸收光谱;
图8显示了根据本发明一个实施例的经内滤波效应校正后的有色可溶性有机物三维荧光图谱。
具体实施方式
根据下述实施例,可以更好地理解本发明。然而,本领域的技术人员容易理解,实施例所描述的内容仅用于说明本发明,而不应当也不会限制权利要求书中所描述的本发明。下面以内陆富营养化水体太湖有色可溶性有机物三维荧光数据测定、校正和定标,对本方法做进一步说明。
所需试剂和耗材:
1)超纯水(Millq Water):Millipore公司超纯水机制备而成;
2)25mm的Millipore公司孔径0.22μm滤膜
所需设备:分光光度计、荧光光度计、超纯水机、压力泵、过滤器。
操作步骤:
(1)设定三维荧光仪测定条件,所用荧光仪要具有激发发射同步的三维扫描功能,激发波长范围为200-450nm,扫描间隔5nm,发射波长范围为250-600nm,扫描间隔1nm,狭缝宽度5nm,扫描速度为2400nm/min;
(2)经0.22μm滤膜过滤获得有色可溶性有机物样品,测定样品的激发-发射三维荧光光谱;
(3)利用Millipore超纯水机制定超纯水样品,测定超纯水的激发-发射三维荧光光谱;
(4)用样品的激发-发射三维荧光光谱减去超纯水的激发-发射三维荧光光谱进行拉曼散射校正;
(5)三维荧光图谱三角区域为矩阵发射波长≤激发波长+5nm以及发射波长≥激发波长+300nm的区域,在这些区域为消除瑞利散射的影响以零代替测量获得的荧光强度,进行瑞利散射校正;
(6)用样品的激发-发射三维荧光光谱除以超纯水在350nm激发波长,371-428nm发射波长范围内荧光强度的均值进行荧光定标;
(7)经0.22μm滤膜过滤获得有色可溶性有机物样品,在带光谱扫描功能的分光光度计上测定样品的吸收光谱,得到样品吸光度,测定的吸光度波长范围为200-600nm;
(8)利用样品吸光度对三维荧光进行内滤波效应校正,具体计算式如下:式中FRay为经过拉曼散射校正,瑞利散射校正,超纯水定标的激发-发射三维荧光光谱,AEx、AEm分别为激发波长和发射波长对应的吸光度,FCorr为内滤波效应校正后的激发-发射三维荧光光谱。
(9)利用Matlab程序对以上校正和定标进行编程,实现一键完成。
图1显示了有色可溶性有机物样品三维荧光图谱。通过此图可以确定,有色可溶性有机物三维荧光图谱呈现明显的峰谷特征。激发波长:270-280nm(<240nm),发射波长:330-370nm,类蛋白荧光峰非常高,主要为氨基酸荧光物质。在激发波长:290-325nm(<250nm),发射波长:370-430nm存在紫外类腐殖质荧光物质,在激发波长:320-360nm,发射波长:420-460nm存在可见光类腐殖质荧光物质。以上荧光物质的强度、位置以及各自的比例广泛应用区分有色可溶性有机物的组成及来源。除此之外,在发射波长等于激发波长,以及发射波长近似等于发射波长加300nm的两条线上表现出非常强的瑞利散射,这是由于入射光的直接散射所致。
图2显示了不同时间测定的超纯水三维荧光图谱对比。通过此图可以确定,除了图1中提到的瑞利散射之外,超纯水三维荧光图谱还含有较强的拉曼散射,拉曼散射属于非弹性散射,一部分入射光子在水分子作用下其能量用于振动,因此拉曼散射波长要大于入射波长。比较而言,纯水的拉曼散射较弱,。因此在有色可溶性有机物浓度高时,其形成的散射往往被有色可溶性有机物的荧光峰所掩盖,这也就是图1中未能呈现拉曼散射峰。从不同时间测定的纯水三维荧光图谱对比来看,由于测定的环境、荧光灯的强弱差异,致使三维荧光图谱存在些许差异,这也就是为什么有色可溶性有机物三维荧光数据测定时一定要进行同步的纯水三维荧光数据测定,并进行纯水三维荧光数据的扣除。
图3显示了经拉曼散射校正后的有色可溶性有机物三维荧光图谱。通过此图可以确定,扣除纯水的拉曼散射后,有色可溶性有机物三维荧光图谱要更为平滑,荧光峰要更为明显,但瑞利散射尚未消除,并且其值远远大于有色可溶性有机物的荧光有机物强度。
图4显示了经拉瑞利散射校正后的有色可溶性有机物三维荧光图谱。通过此图可以确定,在三维荧光图谱三角区域为矩阵发射波长≤激发波长+5nm以及发射波长≥激发波长+300nm的区域荧光强度赋值为0后,能很好的消除瑞利散射对有色可溶性有机物荧光强度的影响,便于进行平行因子分析等三维荧光数据处理。
图5显示了不同时间测定的超纯水350nm激发波长,365-460nm发射光谱范围荧光强度对比。通过此图可以确定,由于测定的环境、荧光灯的强弱差异,超纯水的荧光强度存在差异,如2009年8月17日350nm激发波长下的拉曼散射峰最大荧光强度是196A.U.,而2009年9月20日测定的350nm激发波长下的拉曼散射峰最大荧光强度只有180A.U.。由于纯水本身的三维荧光是恒定的,造成其差异主要是由于测定的环境、荧光灯的强弱差异所致,因此每次进行有色可溶性有机物三维荧光数据测定时必须同批次测定超出水的三维荧光图谱,一方面用于拉曼散射的校正,一方面同拉曼散射峰可以对测定的有色可溶性有机物三维荧光数据进行定标。
图6显示了定标后的有色可溶性有机物三维荧光图谱。通过此图可以确定,其变化与图4一样,只是在图4的基础上除掉一个常数项。
图7显示了有色可溶性有机物样品吸收光谱。由于三维荧光数据测定的激发波长为200-450nm,发射波长为250-600nm,因此校正的吸光度光谱范围为200-600nm。通过此图可以确定,有色可溶性有机物吸收随波长降低逐渐增加,特别是在240nm之后增加更为迅速。
图8显示了经内滤波效应校正后的有色可溶性有机物三维荧光图谱。理论上,有色可溶性有机物荧光强度随其浓度增加呈现线性增加,但当荧光物质浓度过大时,会产生自淬灭现象等荧光淬灭造成荧光强度下降,因此必须进行内滤波效应校正。通过此图和图6对比可以确定,在短波激发和发射区域,荧光强度经校正后有所增加。
Claims (8)
1.一种有色可溶性有机物三维荧光数据的校正和定标方法,其特征在于,包括以下步骤:
(1)测定样品的激发-发射三维荧光光谱,以便得到样品三维荧光光谱;
(2)测定超纯水的激发-发射三维荧光光谱,以便得到超纯水三维荧光光谱;
(3)利用所述超纯水三维荧光光谱,对所述样品三维荧光光谱进行拉曼散射校正;
(4)确定样品三维荧光光谱的三维荧光图谱三角区域,并且通过对所述三维荧光图谱三角区域赋值为0,进行瑞利散射校正;
(5)确定超纯水在350nm激发波长,371-428nm发射波长下的荧光强度均值,并利用所得到的荧光强度进行荧光定标;
(6)测定所述样品的吸收光谱,得到样品吸光度;
(7)利用所述样品吸光度对所述样品三维荧光光谱进行内滤波效应校正。
2.根据权利要求1所述的三维荧光数据的校正和定标方法,其特征在于,所述样品三维荧光光谱和所述超纯水三维荧光光谱分别是利用具有激发发射同步的三维扫描功能的荧光仪在下列三维荧光测定条件下测定的:
激发波长范围为200-450nm,扫描间隔5nm,
发射波长范围为250-600nm,扫描间隔1nm,
狭缝宽度:5nm,
扫描速度为2400nm/min。
3.根据权利要求1所述的三维荧光数据的校正和定标方法,其特征在于,所述拉曼散射校正是通过将所述样品三维荧光光谱减去所述超纯水三维荧光光谱而进行的。
4.根据权利要求1所述的三维荧光数据的校正和定标方法,其特征在于,所述三维荧光图谱三角区域为矩阵发射波长≤激发波长+5nm以及发射波长≥激发波长+300nm的区域。
5.根据权利要求1所述的三维荧光数据的校正和定标方法,其特征在于,所述荧光定标是通过利用所述样品三维荧光光谱除以超纯水在350nm激发波长,371-428nm发射波长下的荧光强度均值而进行的。
6.根据权利要求1所述的三维荧光数据的校正和定标方法,其特征在于,所述吸收光谱是采用具有光谱扫描功能的分光光度计在20~600nm的波长范围内进行吸光度测定。
8.根据权利要求1所述的三维荧光数据的校正和定标方法,其特征在于,所述步骤是在Matlab平台上进行的。
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