CN103614342A - 传染性胰脏坏死病病毒标准样品及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开传染性胰脏坏死病病毒标准样品及其制备方法，其属于检测用病毒样品及其制备方法技术领域，具体包括即先将传染性胰脏坏死病病毒分离株经特异性PCR方法及ELISA试验检测，通过特异序列测定分析后，进行病毒增殖和TCID₅₀滴度测定，再通过病毒培养物加入蔗糖脱脂奶粉冻干，均匀性和稳定性测试后，进行定值即为成品。传染性胰脏坏死病病毒标准样品成品为冻干粉末状，1mL/支，安瓿瓶真空包装，其为定性样品，用于该病毒检测的质量控制、新方法研制等。对积极开展我国水生动物及其产品检测标准样品的研制，添补该测量领域的空白，具有很重要的现实意义。

Description

传染性胰脏坏死病病毒标准样品及其制备方法

技术领域

本发明属于检测用病毒培养物标准品及其制备方法技术领域，具体涉及IPNV标准样品及其制备方法。

背景技术

传染性胰脏坏死病病毒(Infectious Pancreatic Necrosis Virus，IPNV)，为双股核糖核酸类型，病毒颗粒呈六角形或近似圆形，20面体，直径50-72纳米，少数可大到75-110纳米，有单层衣壳，没有囊膜，有92个壳粒。对乙醚、氯仿等脂溶剂、胰酶及乙二胺四乙酸不敏感，对甘油也很稳定，对热和酸稳定。可以在多种冷水性鱼类的细胞株中增殖，并使细胞产生病变；而在温水性鱼类的细胞株中不增殖，也不出现细胞病变。敏感细胞接种病毒后，在15℃-25℃均能出现细胞病变，最适温度为15-20℃。该病毒现有VR299、Sp、Ab、He等不同血清型。传染性胰脏坏死病（Infectious Pancreatic Necrosis，IPN）是由传染性胰脏坏死病病毒(InfectiousPancreatic Necrosis Virus，IPNV)引起的危害极其严重的一种鱼病，该病是世界性鱼病，主要危害溪鳟、虹鳟、克氏鲑、红克鲑、银大马哈鱼、枇杷鳟、红大马哈鱼等鱼苗和幼鱼。最早发生在加拿大、美国，后来在丹麦、法国、希腊、英国、德国、挪威、意大利、瑞典、日本等国发生流行，本世纪80年代又传入朝鲜、我国台湾省及东北、山西、山东、甘肃等养殖虹鳟地区。在我国山西省某虹鳟养殖场于1986年和1987年有过二次大流行，造成90％的虹鳟稚鱼死亡，东北地区也有过流行。该病往往属于急性流行，死亡率高达50％-100％，而20周龄以上的幼鱼一般不发病。此病常在水温10℃-15℃时流行，10℃以下或15℃以上发病少，而且病情较轻，死亡率低。发病后残存未死的，可数年以上用到终身成为带毒者，并通过粪例、鱼卵、精液排出病毒，继续传播。自80年代该病传入我国以来，随着进出口贸易的急剧增加，IPNV已经成为口岸水生动物及其产品的检疫对象。

实验室的质量控制一直是人们关注的事情，传染性胰脏坏死病已有国际或国内的标准方法。然而标准方法的使用并不总能保证测试结果的良好的重复性，针对内部质量控制，许多实验室使用自己的标准样品，这种样品制备特别费时，进一步来讲个体的内部标准样品与不同的实验室结果的比对是不可能的。为了帮助实验室完成好的质量保证，辽宁出入境检验检疫局从2005年就开始做这项工作。本标准样品的研制成功，不仅为检测研究、医药研究、应用研究提供了标准样品的需求，同时为检验检疫机构技术指导、服务出口企业提供技术上的支持。

发明内容

本发明的技术方案为，先将传染性胰脏坏死病病毒分离株经特异性PCR方法及ELISA试验检测，通过特异序列测定分析后，进行病毒增殖和TCID₅₀滴度测定，再通过病毒培养物加入蔗糖脱脂奶粉冻干，均匀性和稳定性测试后，进行定值即为成品。

本发明所涉及的传染性胰脏坏死病病毒标准样品的来源是：辽宁地区实验室分离株，IPNV毒株由辽宁出入境检验检疫局的实验室分离保存，毒株名称：IPNV-DL。（发表的相关文章：胡晓利，李伟，肇慧君，吴斌.虹鳟鱼传染性胰脏坏死病病毒的分离与鉴定[J].中国动物检疫，2012,29（3）：27-30）。

本发明为了完成本项标准样品的制备工作，辽宁出入境检验检疫局成立了研制工作小组，IPNV标准样品制备工艺流程见图1。

本发明一方面涉及一种传染性胰脏坏死病病毒标准样品的制备方法，其步骤包括：

a.IPNV-DL毒株感染CHSE-214细胞获得病毒增殖液；

b.将步骤a中获得的病毒增殖液低温真空冷冻干燥制备成混合冻干粉；

c.检测步骤b中获得的混合冻干粉样品均匀性、稳定性后定值并分装。

本发明的上述技术方案涉及的传染性胰脏坏死病病毒标准样品的制备方法，步骤a包括：将已长满单层的CHSE-214细胞用0.05%胰酶消化，悬浮于含10%胎牛血清的M199培养基中，以1～2×10⁶个细胞/细胞瓶分装，待细胞长至培养单层80%面积时，倒掉含10%胎牛血清的M199培养基，加入200μL步骤a中的感染IPNV-DL病毒的组织病料稀释液的上清液，20℃感作1h，再用无血清的M199培养基清洗两次，覆盖含1%甲基纤维素、2%血清的M199维持液；20℃低温培养箱继续培养，直至细胞病变达到80%时，反复冻融3次后，4℃,10000rpm，离心10min，得上清液即为IPNV-DL病毒增殖液；

本发明的上述技术方案涉及的传染性胰脏坏死病病毒标准样品的制备方法，其所述步骤b中低温真空冷冻干燥冻干保护剂为：按蔗糖：去离子水的重量体积比为5%，脱脂奶粉：去离子水的重量体积比20%配制，108℃高压灭菌15min。

本发明的上述技术方案涉及的传染性胰脏坏死病病毒标准样品的制备方法，其所述步骤b中低温真空冷冻干燥条件：将IPNV-DL病毒增殖液经6000rpm，离心10min去除细胞碎片后，保留上清液，在无菌操作条件下按1:1体积比和冻干保护剂混合，在-40℃冰柜中预冻24h，在设定的冻干条件进行冻干，其中所述的设定的冻干条件为冷肼温度为-80℃，真空度30mtorr，冻干时间24h；

本发明的上述技术方案涉及的传染性胰脏坏死病病毒标准样品的制备方法，其所述步骤a中感染IPNV-DL病毒的组织病料稀释液为：用M199细胞培养液将感染IPNV-DL病毒的组织病料样品匀浆、依次稀释成1：10、1：100及1：1000三个稀释度。

本发明的上述技术方案涉及的传染性胰脏坏死病病毒标准样品的制备方法，其所述步骤a中获得病毒增殖液TCID₅₀为10^-8..5/0.1mL。

本发明另一方面涉及一种由上文所述方法制备的传染性胰脏坏死病病毒标准样品。

利于本发明上述技术方案所述方法制备传染性胰脏坏死病病毒标准样品，即先将传染性胰脏坏死病病毒分离株经特异性PCR方法及ELISA试验检测，通过特异序列测定分析后，进行病毒增殖和TCID₅₀滴度测定，再通过病毒培养物加入蔗糖脱脂奶粉冻干，均匀性和稳定性测试后，进行定值即为成品。传染性胰脏坏死病病毒标准样品成品为冻干粉末状，1mL/支，安瓿瓶真空包装，其为定性样品，用于该病毒检测的质量控制、新方法研制等。应在生物安全Ⅱ级条件下，加入2mL超纯水进行水化，待样品完全溶解后即可使用，用完之后立即放入-20℃冰箱保存。避光、-20℃条件贮存，室温可存放30天。产品性质：乳白或淡黄色粉末。

均匀性检验：在制备的标准样品中随机取8份样品，每个样品分为2个小样，根据GB15805.1-2008传染性胰脏坏死病病毒检疫方法中的IPNV ELISA法，将测定结果进行分析统计，结果显示为无显著性差异，即所测样品是均匀的。

稳定性检验：在两种温度类型条件下，对标准样品进行稳定性试验（GB15805.1-2008传染性胰脏坏死病病毒检疫方法中的IPNV ELISA法）：一种是在贮存温度(-20℃)下的稳定性试验，随机取24份样品（样品A和B），每个月检测2份，共计12个月；另一种是在较高的温度（模拟样品的运输条件4℃）下的稳定性试验，样品取24份，每1天检测2份共计12天。将测定结果分析统计，无显著性差异即所测样品是均匀的、稳定的。

附图说明

图1.IPNV-DL标准样品制备工艺流程。

图2.IPNV-DL PCR扩增结果，经琼脂糖凝胶电泳鉴定，结果显示扩增出224bp大小的片段，与预期相符。1：DL2000Marker；2～7：PCR扩增产物扩增出224bp大小的片段；8：阴性对照。

图3.PCR扩增产物测序后与GENBANK上公布的多株IPNV核苷酸序列进行比对分析，序列比对结果显示扩增片段的核苷酸与多株IPNV序列同源性较高。

图4.CHSE-214细胞随感染IPNV-DL时间的增长细胞病变检测图；图4a:正常CHSE-214细胞100×；图4b:CHSE-214细胞100×(接毒48h)；图4c:CHSE-214细胞100×(接毒72h)；图4d:CHSE-214细胞100×(接毒72h)；从图示结果分析可以证明：IPNV接种单层CHSE-214细胞48h后，细胞开始聚集、圆缩脱落，细胞病变结果如图所示。结果显示CHSE-214细胞随感染IPNV时间的增长，细胞病变越加明显。

具体实施方式

下述非限制性实施例可以使本领域的普通技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。

本发明中使用的传染性胰脏坏死病病毒感染病料由本实验室保存（发表的相关文章：胡晓利，李伟，肇慧君，吴斌.虹鳟鱼传染性胰脏坏死病病毒的分离与鉴定[J].中国动物检疫，2012,29（3）：27-30）。M199培养基为美国Gibco公司产品；胎牛血清购自杭州四季青生物工程公司。PCR试剂盒、蛋白酶K均购自大连TaKaRa有限公司；pMD18-T载体，宿主菌DH5α、PCR试剂盒、分子量标准DL-2000、DNA快速纯化回收试剂盒、质粒提取试剂盒等均为TaKaRa公司产品；IPNV ELISA检测试剂盒购自TEST-LINE Ltd；氨苄青霉素（Amp）为上海生工公司产品；其余试剂均为分析纯产品。CHSE-214细胞购自ATCC。

根据IPNV-DL的保守基因N基因序列，设计特异性引物，由宝生物公司合成，序列如表1，利用该特异性引物分别扩增224bp大小的片段。引物终浓度均为20μmol/L。

表1检测IPNV-DL的引物序列

实施例1标准样品制备

1.组织病料的处理：用组织研磨器将取得的组织病料样品（包括脑、肝、脾和肾）匀浆，匀浆后，再用含有适量双抗（1000IU/mL的青霉素和1000μg/mL的链霉素）的M199细胞培养液，按1：10的最终稀释度悬浮，于4℃过夜孵育。7000rpm/min离心15min，收集上清液。将1：10稀释的组织匀浆上清液用细胞培养液再做两次10倍稀释，然后将这1：10、1：100及1：1000三种稀释度的上清液，用无菌操作方法，以适当体积接种到生长约24h的CHSE-214单层细胞中，20℃吸附1h后，加入细胞培养液，置于20℃低温培养箱中培养。待细胞感染病毒后脱落，出现细胞病变（CPE）后反复冻融细胞培养物三次，4℃,10000rpm离心10min得病毒增殖液，备用。

2.RNA提取：将450μL细胞病变悬液放入1.5mL的离心管中，再加入450μLCTAB溶液并混匀，25℃作用2h。加入600μL抽提液1（酚：三氯甲烷：异戊醇=25:24:1），充分混合至少30s；12000rpm，5min，取上层水相；再加700μL抽提液2（三氯甲烷：异戊醇=24:1），充分混合30s；12000rpm，5min，取上层水相；然后加入1.5倍体积的-20℃无水乙醇，混匀后，-20℃放置6h以上；15000rpm，30min，弃上清，立即用滤纸吸干，37℃干燥20min；最后加10μLDEPC水溶解后作为RT-PCR反应模板。

3.变性和退火：在PCR管中加入10μL模板溶液和2.5μL引物R1，加2.5μLDEPC水至总体积为15μL。置于70℃反应5min。立即冰浴，低速离心约5s，将液体收集在离心管底部。

4.cDNA合成：在步骤3的反应管中继续加入：5μL的5倍逆转录酶浓缩缓冲液、2μLdNTP、0.5μLRNA酶抑制剂（20U）、1μL逆转录酶AMV（10IU），加DEPC水至25μL。42℃60min反应，合成模板cDNA。

5.PCR扩增反应

反应体系：在上文步骤4的反应管中继续加入Taq酶用10倍缓冲液8μL、25mmol/L氯化镁8μL、dNTP2μL、引物F1和R1各2μL、Taq酶5U，最后加水至100μL。

反应条件：94℃,4min,55℃,1min，72℃,1min；94℃，1min，55℃，1min，72℃，1min，30cycles；72℃，10min；4℃保温。

IPNV-DL PCR扩增结果：经琼脂糖凝胶电泳鉴定，结果显示扩增出224bp大小的片段，与预期相符。结果如图2，1：DL2000Marker；2～7：PCR扩增产物扩增出224bp大小的片段；8：阴性对照。

6.扩增片段序列分析

将PCR产物进行序列测定、分析，与GENBANK中IPNV-DL序列进行比较分析。

应用IPNV-DL ELISA检测试剂盒，对上文步骤1的中的细胞培养进行检测，操作步骤按照试剂盒说明进行。

ELISA检测结果：依据判定标准，P/N值>2.1，阴性对照OD490_nm=0.086<0.1，待测样品的OD490_nm=1.587，结果显示本研究获得的病毒即为IPNV-DL。

7.病毒增殖

将已长满单层的CHSE-214细胞用0.05%胰酶消化，悬浮于含10%胎牛血清的M199培养基中，以1-2×10⁶个细胞分装至细胞瓶中，待细胞长至80%面积时，倒掉10%M199培养基，加入200μL IPNV-DL病料稀释液（稀释液为M199细胞培养液，将组织病料样品匀浆、依次稀释成1：10、1：100及1：1000三个稀释度），20℃感作1h，再用无血清的M199培养基清洗两次，覆盖含1%甲基纤维素、2%血清的M199维持液。20℃低温培养箱继续培养，直至细胞病变达到80%时，反复冻融3次后，收毒放置-80℃冰箱保存备用。同时设正常未接病料细胞对照。

8.病毒的TCID₅₀测定

将长势良好的CHSE-214细胞用0.05%胰酶消化，分装96孔板，90μL/孔（2×10⁴细胞），然后加入1.2.2收集的病毒液，依次做10^-1-10^-8稀释，每孔加10μL，每个稀释度接种8个孔，混匀后放入20℃低温培养箱中继续培养。吸附1h后，PBS洗涤后，加入含2%血清的M199培养液100ul/孔继续静置培养；逐日观察，观察细胞病变的产生，连续6天，统计所观察的结果并记录下来。按Reed与Muench氏法计算IPNV-DL病毒株的TCID₅₀。

病毒的TCID₅₀测定：根据96孔板上IPNV-DL感染CHSE-214细胞病变的记录结果，按Reed-Muench法计算TCID₅₀，结果IPNV-DL毒株的TCID₅₀为10^-8..5/0.1mL。

9.样品的冻干

冻干机：美国SIM FD5508；脱脂奶粉购自美国BD公司；蔗糖购自Sigma公司。

冻干条件：将在CHSE-214细胞中稳定增殖的IPNV-DL细胞培养物经低速离心（6000rpm，离心10min）去除细胞碎片后，保留上清液，在无菌操作条件下按1:1比例和冻干保护剂混合，在-40℃冰柜中预冻24h，在设定的冻干条件（冷肼温度设定为-80℃，真空度30mtorr，冻干时间24h）进行冻干。所用冻干保护剂为：按照重量体积比，蔗糖：去离子水=5%，脱脂奶粉：去离子水=20%配制，108℃，高压灭菌15min即可。

实施例2均匀性试验

不论制备过程中是否经过均匀性初检，凡成批制备并分装成最小包装单元的标准样品，必须进行均匀性检验。对于分级分装的标准样品，凡由大包装分装成最小包装单元时，都需要进行均匀性检验。

冻干样品的定值：根据GB15805.1-2008传染性胰脏坏死病病毒检疫方法中的IPNVELISA法，按照IPNV ELISA检测试剂盒对传染性胰脏坏死病病毒标准样品进行定性定值试验，试验过程参见以下。

冻干后马上随机选取1×8份样品A和1×8份样品B进行均匀性测试。

方差分析公式

表1方差分析公式

$C=\frac{\left(\underset{i}{\mathrm{\&Sigma;}}\underset{j}{\mathrm{\&Sigma;}}{X}_{\mathrm{ij}}\right)}{N}$

样品均匀性试验结果：在制备的标准样品中随机取8份样品，每个样品分为2个小样(样品A和样品B)，根据GB15805.1-2008传染性胰脏坏死病病毒检疫方法中的IPNV ELISA法，将测定结果进行分析统计，结果见表2、表3、表4、表5。分析结果A组样品间及B组样品间均无显著性差异，即所测样品是均匀的。

表2样品A均匀性试验结果表

表3样品B均匀性试验结果表

表4样品A均匀性试验方差分析结果

按α=0.05，v₁=14，v₂=15查附表，F临界值=2.40>2.01，表明样品间没有显著性差异。

表5样品B均匀性试验方差分析结果

按α=0.05，v₁=14，v₂=15查附表，F临界值=2.35>2.01，表明样品间没有显著性差异。

实施例3稳定性试验

以两年为期，对制备的标准样品分阶段每次取二份样品，按照不同保存条件进行其含量测定，每份样品以测定4次的平均值为其定值结果。依据上述测定方法分别计算结果。标准样品应在规定的贮存或使用条件下，定期地进行待定特性量值的稳定性检验。

采用两种温度类型条件下的对标准样品进行稳定性试验（GB15805.1-2008传染性胰脏坏死病病毒检疫方法中的IPNV ELISA法）：一种是在贮存温度(-20℃)下的稳定性试验，随机取24份样品（样品A和B），每个月检测2份，共计12个月；另一种是在较高的温度（模拟样品的运输条件4℃）下的稳定性试验，样品取24份，每1天检测2份共计12天。

样品稳定性试验结果：采用两种温度类型条件下的对标准样品进行稳定性试验（GB15805.1-2008传染性胰脏坏死病病毒检疫方法中的IPNV ELISA法）：一种是在贮存温度(-20℃)下的稳定性试验，随机取24份样品（样品A和B），每个月检测2份，共计12个月；另一种是在较高的温度（模拟样品的运输条件4℃）下的稳定性试验，样品取24份，每1天检测2份共计12天。

测试结果见下表6、表7。其稳定性评价结果见表8，从表8可知，两个贮存条件（-20℃和4℃）下样品之间及同一温度下样品之间均不存在显著差异，可以认为样品是稳定的。

表6稳定性检验实验（-20℃）

表7稳定性检验实验（4℃）结果

表8传染性胰脏坏死病病毒标准样品稳定性评价结果

方差来源	平方和	自由度	均方MS	F比
					组间（瓶间）	0.1853	12	0.01269	2.48
组内（同一温度下）	0.0790	12	0.0058
					总和		24

表9传染性胰脏坏死病病毒标准样品稳定性检验

实施例4合作定值

1）均匀性合格，稳定性检验符合要求的标准样品方可进行定值。

2）定值的测量方法应在理论上和实践上经检验证明是准确可靠的方法。

3）多个实验室合作定值，参加合作的实验室应具有该标准样品定值的必备条件，并有一定的技术权威性。每个实验室可以采用统一的测量方法，也可以选该实验室确认为最好的方法。合作实验室的数目或独立定值组数应符合统计学的要求（当采用同一种方法时，独立定值组数一般不少于8个，当采用多种方法时，一般不少手6个）。定值时，测量数据可按如下程序处理：

对各个实验室的测量结果分别按上述进行检验。

汇总全部原始数据，考察全部测量数据分布的正态性。

在数据服从正态分布的情况下，将每个实验室的所测数据的平均值视为单次测量值。构成一组新的测量数据。用道格拉布斯法或狄克逊法从统计上剔除可疑值，当数据比较分散或可疑值比较多时，应认真检查每个实验室所使用的测量方法、测量条件及操作过程。

用科克伦（Cochran）法检查各组数据之间是否等精度，当数据是等精度时，计算出总平均值和标准偏差。

当全部原始数据服从正态分布或近似正态分布情况下，也可视其为一组新的测量数据，按格拉布斯法或狄克逊法从统计上剔除可疑值，再计算全部原始数据的总平均值和标准偏差。

当数据不服从正态分布时，应检查测量方法和找出各实验室可能存在的系统误差，对定值结果的处理持慎重态度。

本发明所述标准样品的制备工作中，通过选取适当的具有代表性的原料，采用合理可靠的工艺流程，充分保证标准样品的均匀性、稳定性，在制备过程中避免容器和环境对成品造成污染。通过选取代表性的参数对标准样品的均匀性进行检验并进行统计分析。选取准确可靠的测定方法并通过多个实验室进行协作定值，所选取的实验室均为国家或部门认可的实验室，对定值数据进行严格的统计处理。对标准样品的稳定性进行检验。采用合格的包装形式，便于运输和保存。采用合理的贮存方式进行保存。从而保证标准样品的均匀性、稳定性、定值结果、不确定度等技术指标达到国家标准样品的要求。

Claims (4)

1.一种传染性胰脏坏死病病毒标准样品的制备方法，其特征在于，制备步骤包括：

a.感染IPNV-DL病毒的组织病料稀释液接种CHSE-214细胞获得病毒增殖液；步骤包括：将已长满单层的CHSE-214细胞用0.05%胰酶消化，悬浮于含10%胎牛血清的M199培养基中，以1～2×10⁶个细胞/细胞瓶分装，待细胞长至培养单层80%面积时，倒掉含10%胎牛血清的M199培养基，加入200μL步骤a中的感染IPNV-DL病毒的组织病料稀释液的上清液，20℃感作1h，再用无血清的M199培养基清洗两次，覆盖含1%甲基纤维素、2%血清的M199维持液；20℃低温培养箱继续培养，直至细胞病变达到80%时，反复冻融3次后，4℃,10000rpm，离心10min，得上清液即为IPNV-DL病毒增殖液；

b.将步骤a中获得的病毒增殖液低温真空冷冻干燥制备成混合冻干粉；所述低温真空冷冻干燥条件：将IPNV-DL病毒增殖液经6000rpm，离心10min去除细胞碎片后，保留上清液，在无菌操作条件下按1:1体积比和冻干保护剂混合，在-40℃冰柜中预冻24h，在设定的冻干条件进行冻干，其中所述的设定的冻干条件为冷肼温度为-80℃，真空度30mtorr，冻干时间24h；所述冻干保护剂为：按蔗糖：去离子水的重量体积比为5%，脱脂奶粉：去离子水的重量体积比20%配制，108℃高压灭菌15min；

c.检测步骤b中获得的混合冻干粉样品均匀性、稳定性后定值并分装。

2.根据权利要求1所述的标准样品的制备方法，其特征在于，所述步骤a中感染IPNV-DL病毒的组织病料稀释液为：用M199细胞培养液将感染IPNV-DL病毒的组织病料样品匀浆、依次稀释成1：10、1：100及1：1000三个稀释度。

3.根据权利要求1所述的标准样品的制备方法，其特征在于，所述步骤a中获得病毒增殖液TCID₅₀为10^-8..5/0.1mL。

4.由权利要求1所述的方法制备的传染性胰脏坏死病病毒标准样品。

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