CN103610212A

CN103610212A - 板栗鞣花酸鞣质在制备抗氧化剂中的应用

Info

Publication number: CN103610212A
Application number: CN201310654781.1A
Authority: CN
Inventors: 秦岭; 曹庆芹; 姜奕晨; 杨柳; 冯永庆; 张小琴; 成军; 邢宇
Original assignee: Beijing University of Agriculture
Current assignee: Beijing University of Agriculture
Priority date: 2013-12-05
Filing date: 2013-12-05
Publication date: 2014-03-05
Anticipated expiration: 2033-12-05
Also published as: CN103610212B

Abstract

本发明提供板栗鞣花酸鞣质在制备抗氧化剂中的应用，所述板栗鞣花酸鞣质的制备方法为，将板栗栗蓬、栗花或栗叶经干燥后加工成粉末，加入至乙醇水溶液中，得到板栗栗蓬、栗花或栗叶粉末的乙醇水分散液，对所述乙醇水分散液进行超声提取后再进行水浴回流提取，浓缩滤液经冷冻干燥即得板栗鞣花酸鞣质。本发明首次发现板栗鞣花酸鞣质具有较强的抗氧化性，极强的还原力，特别适用于羟基自由基、超氧自由基、DPPH自由基等的清除以及亚硝酸盐的还原，另外，板栗鞣花酸鞣质对大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、米曲霉、黑曲霉等致病微生物具有较强的抑菌活性。

Description

板栗鞣花酸鞣质在制备抗氧化剂中的应用

技术领域

本发明涉及化学领域和微生物学领域，具体地说，涉及板栗鞣花酸鞣质在制备抗氧化剂中的应用。

背景技术

板栗（Castanea mollissima Blume）属山毛榉科（Fagacene）植物，为落叶乔木。栗蓬是栗子的外刺苞，栗花为板栗雄花序，栗叶为板栗树叶。众多研究表明，栗蓬、栗花或栗叶中富含鞣花酸鞣质等植物多酚类物质。植物多酚是一类多羟基化合物，是一种天然的无毒的抗氧化剂，试验表明其具有较强的清除自由基和抗氧化能力，并对大肠杆菌有抑制作用，具有一定的药理作用。已经广泛应用于食品、药品和日用品。因此，对栗蓬、栗花或栗叶中鞣花酸鞣质进行制备，将其用于饲料工业原料、食品工业原料、化工业原料和医药产品，将具有广阔的开发和应用前景；在使板栗废弃物得到充分利用，减少环境污染的同时，也提高板栗的附加值，带动农村经济发展，对我国循环经济的发展，建设资源节约型、环境友好型社会具有十分重要的意义。

发明内容

本发明的目的是提供板栗鞣花酸鞣质在制备抗氧化剂中的应用。

为了实现本发明目的，本发明首先提供板栗鞣花酸鞣质在制备抗氧化剂中的应用，其中，所述板栗鞣花酸鞣质的制备方法为：将板栗栗蓬、栗花或栗叶经干燥后加工成粉末，加入至乙醇水溶液中，得到板栗栗蓬、栗花或栗叶粉末的乙醇水分散液，对所述乙醇水分散液进行超声提取后再进行水浴回流提取，浓缩滤液经冷冻干燥即得板栗鞣花酸鞣质。

本发明还提供板栗鞣花酸鞣质在制备还原剂中的应用，其中，所述板栗鞣花酸鞣质的制备方法为：将板栗栗蓬、栗花或栗叶经干燥后加工成粉末，加入至乙醇水溶液中，得到板栗栗蓬、栗花或栗叶粉末的乙醇水分散液，对所述乙醇水分散液进行超声提取后再进行水浴回流提取，浓缩滤液经冷冻干燥即得板栗鞣花酸鞣质。

所述还原剂用于羟基自由基、超氧自由基、DPPH自由基等的清除以及亚硝酸盐的还原。

本发明进一步提供板栗鞣花酸鞣质在制备抑菌剂中的应用，其中，所述板栗鞣花酸鞣质的制备方法为：将板栗栗蓬、栗花或栗叶经干燥后加工成粉末，加入至乙醇水溶液中，得到板栗栗蓬、栗花或栗叶粉末的乙醇水分散液，对所述乙醇水分散液进行超声提取后再进行水浴回流提取，浓缩滤液经冷冻干燥即得板栗鞣花酸鞣质。

所述抑菌剂用于抑制大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、米曲霉、黑曲霉等致病微生物。

具体地，上述板栗鞣花酸鞣质的制备方法为：将板栗栗蓬、栗花或栗叶经干燥后加工成粉末，向1g板栗栗蓬、栗花或栗叶粉末（粉末粒度为20-40目，优选20目）中加入10～40mL乙醇水溶液，得到板栗栗蓬、栗花或栗叶粉末的乙醇水分散液，于40℃～50℃（优选40℃），40KHz超声提取30～40min（优选30min）后，于50℃～80℃（优选50℃或80℃）进行2次水浴回流提取，每次提取0.5～1.5h（优选0.5h、1h或1.5h），浓缩滤液于-50℃～-60℃（优选-50℃、-56℃或-60℃）冷冻干燥15-25h（优选15h、20h或25h）。

其中，使用乙醇水溶液进行水浴回流，所述乙醇水溶液中乙醇的质量百分含量为5%～45%（优选15%、30%或45%）。优选使用与初始加入的乙醇水溶液等体积的乙醇水溶液进行水浴回流。

本发明具有以下优点：

本发明首次提供板栗鞣花酸鞣质在制备抗氧化剂、还原剂和抑菌剂中的用途，并首次发现板栗鞣花酸鞣质具有较强的抗氧化性，极强的还原力，特别适用于羟基自由基、超氧自由基、DPPH自由基等的清除以及亚硝酸盐的还原，另外，板栗鞣花酸鞣质对大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、米曲霉、黑曲霉等致病微生物具有较强的抑菌活性。

我国是世界板栗生产大国，随着板栗产量的持续增长和板栗加工产业的不断发展，使得生产过程中栗蓬、栗花和栗叶等废弃物急剧增加。对这些废弃物的传统处理方法通常为燃烧和自然堆弃腐烂，这不但给板栗栽培区域环境造成了不良的影响，同时也形成了资源浪费。板栗废弃物栗花、栗蓬、栗叶鞣花酸鞣质在氧化剂和抗菌剂的开发中具有潜在的利用价值，将这些废弃资源加以开发利用，使其变废为宝，利用从板栗废弃物中提取的天然抗氧化性物质，不仅可以延长食品的贮存期、货架期，而且有助于保护环境，更有助于提高食品安全性，避免了化学防腐杀菌剂的滥用及危害。

本发明通过对板栗废弃物加以充分利用，一方面减少环境污染，另一方面使其变废为宝，提高板栗的附加值，带动农村经济发展。为推动我国循环经济的发展，建设资源节约型、环境友好型社会具有十分重要的经济价值和社会意义。

附图说明

图1为本发明实施例4中板栗栗蓬、栗花或栗叶鞣花酸鞣质提取物和VC的还原力比较结果。

图2为本发明实施例4中板栗栗蓬、栗花或栗叶鞣花酸鞣质提取物与VC对·OH清除作用的比较结果。

图3为本发明实施例4中板栗栗蓬、栗花或栗叶鞣花酸鞣质提取物与VC对O₂ ^-·清除作用的比较结果。

图4为本发明实施例4中板栗栗蓬、栗花或栗叶鞣花酸鞣质提取物与VC对DPPH·清除作用的比较结果。

图5为本发明实施例4中板栗栗蓬、栗花或栗叶鞣花酸鞣质提取物与VC对亚硝酸盐清除作用的比较结果。

图6A-图6D为本发明实施例5中板栗栗蓬、栗花或栗叶鞣花酸鞣质提取物溶液的抑菌效果比较；其中，图6A为大肠杆菌，图6B为枯草芽孢杆菌，图6C为米曲霉，图6D为黑曲霉。

图7为本发明实施例5中用板栗栗蓬、栗花或栗叶鞣花酸鞣质提取物水溶液处理土豆的防腐试验结果。

图8为本发明实施例5中用板栗栗蓬、栗花或栗叶鞣花酸鞣质提取物水溶液处理茄子的防腐试验结果。

图9为本发明实施例5中用板栗栗蓬、栗花或栗叶鞣花酸鞣质提取物水溶液处理豆腐的防腐试验结果。

图10为本发明实施例5中用板栗栗蓬、栗花或栗叶鞣花酸鞣质提取物水溶液处理猪肉的防腐试验结果。

图11为板栗鞣花酸HPLC高效液相色谱色谱图；其中，a为鞣花酸标准品16μg/mL；b为栗叶样品；c为栗花样品；d为栗苞样品；EA：鞣花酸。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。

实施例1板栗鞣花酸鞣质的制备

将板栗栗蓬、栗花或栗叶阴干后加工成粉末，向1g板栗栗蓬、栗花或栗叶粉末（粉末粒度为20目）中加入乙醇质量百分含量为30%的乙醇水溶液30mL，得到板栗栗蓬、栗花或栗叶粉末的乙醇水分散液，于40℃，40KHz超声提取30min后，于80℃进行2次水浴回流提取，每次提取1h，浓缩滤液于-56℃冷冻干燥20h。其中，每次回流使用乙醇质量百分含量为30%的乙醇水溶液30mL进行。

实施例2板栗鞣花酸鞣质的制备

将板栗栗蓬、栗花或栗叶阴干后加工成粉末，向1g板栗栗蓬、栗花或栗叶粉末（粉末粒度为30目）中加入乙醇质量百分含量为15%的乙醇水溶液10mL，得到板栗栗蓬、栗花或栗叶粉末的乙醇水分散液，于45℃，40KHz超声提取35min后，于60℃进行2次水浴回流提取，每次提取1.5h，浓缩滤液于-60℃冷冻干燥25h。其中，每次回流使用乙醇质量百分含量为15%的乙醇水溶液10mL进行。

实施例3板栗鞣花酸鞣质的制备

将板栗栗蓬、栗花或栗叶阴干后加工成粉末，向1g板栗栗蓬、栗花或栗叶粉末（粉末粒度为20目）中加入乙醇质量百分含量为45%的乙醇水溶液40mL，得到板栗栗蓬、栗花或栗叶粉末的乙醇水分散液，于50℃，40KHz超声提取40min后，于50℃进行2次水浴回流提取，每次提取0.5h，浓缩滤液于-50℃冷冻干燥15h。其中，每次回流使用乙醇质量百分含量为45%的乙醇水溶液40mL进行。

实施例4板栗鞣花酸鞣质抗氧化性的研究

1、还原力的测定

由于Fe²⁺比Fe³⁺更易被生物体吸收，而还原剂能够将铁氰化钾还原成亚铁氰化钾，亚铁氰化钾再与Fe³⁺作用生成普鲁士蓝，在700nm波长测定其吸光度值，以检测剩余的铁氰化钾，与标准液的差值越大表示其还原力越高。

K₃[Fe(CN)₆]+R→ K₄Fe(CN)₆

铁氰化钾亚铁氰化钾

K₄Fe(CN)₆+FeCL₃→ Fe₄[Fe(CN)₆]₃

亚铁氰化钾普鲁士蓝

取一定浓度板栗栗蓬、栗花或栗叶鞣花酸鞣质提取物溶液1mL（实施例1中浓缩滤液未经冷冻干燥即为板栗栗蓬、栗花或栗叶鞣花酸鞣质提取物溶液）与2.5mL磷酸缓冲液（pH值6.6）混合后加入1%铁氰化钾2.5mL，混合后于50℃恒温20min，然后加入10%三氯乙酸2.5mL充分混合后，于3000r/min离心10min，取上清液2.5mL加去离子水2.5mL和0.1%三氯化铁0.5mL，混合后静置10min，在700nm测定吸光度，吸光度越高，还原力越强，以同样浓度的VC做为对照。结果如图1所示，不同浓度鞣花酸鞣质提取物都具有一定的还原作用，随着浓度的增高，还原力也呈递增趋势。当浓度小于等于0.15mg/mL时，随着浓度梯度的增加其还原力呈极显著增加，当浓度大于0.15mg/mL时，还原力增加不显著，并且其还原力高于同样浓度的VC溶液。

2、·OH清除率的测定

羟基自由基（·OH）是最活泼、毒性最大的自由基，它可与活细胞中的任何分子发生反应，引发组织细胞病变，导致各种疾病发生和加速机体衰老，且反应速度非常快。该方法利用的是Feton反应的Fe（Ⅱ）--H₂O₂体系产生的羟基自由基（·OH），羟基自由基具有很高的反应活性，存在时间短，若在反应体系中加入水杨酸就能有效地捕捉·OH，并产生有色产物（紫色），该产物在510nm处有强吸收，在反应体系中加入样品抗氧化剂后，通过测定510nm处吸光度值的变化即可测定样品清除活性氧羟自由基的能力。

取若干支比色管，加入9mmol/L FeSO₄溶液1mL，9mmol/L水杨酸-乙醇溶液2mL，不同浓度的鞣花酸鞣质提取物溶液（实施例1中浓缩滤液未经冷冻干燥即为板栗栗蓬鞣花酸鞣质提取物溶液）2mL，最后加入8.8mmol/L H₂O₂溶液2mL启动反应，于室温下反应1h，离心，以去离子水调零，在510nm处测定样品的吸光度A，按下式计算其清除率：

清除率S%=[A₀-(A-A₁)]/A₀×100%

式中：

A₀-空白对照液的吸光度；以蒸馏水代替显色剂的吸光度；

A-样品组的吸光度；

A₁-样品溶液本身的吸光度，以蒸馏水代替显色剂的吸光度。

结果如图2所示，当浓度小于等于1.00mg/mL时，鞣花酸鞣质对·OH的清除率均达到极显著水平，浓度为1.00mg/mL时，VC的清除率为77.07%，栗蓬为99.12%，栗花为99.62%，栗叶为99.36%鞣花酸鞣质对·OH的清除率显著高于VC。

3、对O^2-·清除率的测定

采用邻苯三酚氧化法测定。在碱性条件下，邻苯三酚发生自氧化反应，生成超氧自由基（O^2-·）和中间产物，该中间产物在320nm波长下有一特征吸收峰，当加入样品抗氧化剂时，邻苯三酚自氧化过程受阻，O^2-·在生成时也受到抑制，溶液在320nm处吸收峰减弱，故通过测定吸收值变化可以推断样品对O^2-·的清除作用。

向5.6ml的50mmol/L的Tris-HCL缓冲溶液（pH值8.2）中分别加入0.2ml不同浓度的板栗栗蓬、栗花或栗叶鞣花酸鞣质提取物溶液（实施例1中浓缩滤液未经冷冻干燥即为板栗栗蓬、栗花或栗叶鞣花酸鞣质提取物溶液）、VC溶液，于25℃保温10min，然后加入0.2mL，25℃预温的60mM的邻苯三酚，总体积6mL，准确反应4min后，加入10mol/L盐酸1mlL终止反应，在320nm处测定其吸光度值A，空白实验以等量去离子水代替抗氧化剂溶液，测定其吸光度值A1，用Tris-HCL缓冲溶液5.6mL、10mol/LHCL0.2mL及抗氧化剂溶液0.2mL调零点A0，以扣除试样本身颜色的影响，按下式计算清除率。

清除率S%=[A₀-(A-A₁)]/A₀×100%

结果如图3所示，当浓度小于等于1.00mg/mL时，对O^2-·的清除率梯度间达到显著水平，浓度大于1.00mg/mL时，对O^2-·的清除率不显著。当浓度为1.00mg/mL时，VC对O^2-·的清除率达到48.21%，栗蓬的清除率为85.28%，栗花的清除率为90.33%，栗叶的清除率为88.13%，鞣花酸鞣质对O^2-·的清除率显著高于VC。

4、对DPPH·抑制率的测定

DPPH·在有机溶剂中由于苯环的共轭和位阻及硝基的吸电子作用是一种稳定的自由基，呈紫色，在517nm处有强吸收峰，在自由基清除剂存在时，DPPH·与给出的氢相结合，孤电子被配对，使其颜色由紫色变为淡黄色，吸光度减少，反应结束后达到稳定，因此，可通过在此波长处吸光度的测定，检测自由基的清除情况，来评价试验样品的抗氧化能力，大小由抑制率表示。

精密吸取不同质量浓度的板栗栗蓬、栗花或栗叶鞣花酸鞣质提取物溶液（实施例1中浓缩滤液未经冷冻干燥即为板栗栗蓬、栗花或栗叶鞣花酸鞣质提取物溶液）0.2mL，加入5×10^-5mol/L的DPPH·溶液8mL，摇匀后放置30min，以样品溶液作对照，测定517nm处的吸光度值A，同时测定样品溶液在517nm处的吸光度值A₀，DPPH·溶液在517nm处的吸光度值A₁，按下式计算其抑制率：

抑制率S%=[A₀-(A-A₁)]/A₀×100%

A-样品组与DPPH·溶液混合后的吸光值；

A₁-样品组的吸光值；

A₀-DPPH·溶液的吸光值。

结果如图4所示，对DPPH·有很好的清除作用，开始时随着提取物用量的增大，提取物对DPPH·的清除作用迅速增强。当浓度小于等于0.075mg/mL时，对DPPH·的清除率梯度之间达到显著水平，当浓度大于0.075mg/mL时，则不显著。当提取物用量达到0.075mg/mL时，VC对DPPH·的清除率为61.03%，栗蓬的清除率为90.96%，、栗花的清除率为92.47%，栗叶的清除率91.79%，鞣花酸鞣质对DPPH·的清除率显著高于VC。

5、对亚硝酸盐清除率的测定

亚硝酸盐与胺类化合物，在酸性条件下或细菌作用下容易形成亚硝胺类化合物，亚硝胺类化合物具有强烈的致癌作用。亚硝酸盐在弱酸性条件下，与对氨基苯磺酸重氮化，再与盐酸萘乙二胺偶合生成红色络合物，红色络合物在544nm处有一强吸收峰，当加入样品抗氧化剂时，重氮生成过程受阻，溶液在544nm处吸收峰减弱，故通过测定吸收值变化可以推断样品对亚硝酸盐的清除作用。

取已知浓度的板栗栗蓬、栗花或栗叶鞣花酸鞣质提取物溶液（实施例1中浓缩滤液未经冷冻干燥即为板栗栗蓬、栗花或栗叶鞣花酸鞣质提取物溶液）1mL于20mL的刻度试管中，加入5μg/mL的NaNO₂标准溶液1.5mL，加入柠檬酸-磷酸缓冲溶液（pH值3.0）2.5mL，37℃下反应30min，立即加入0.4%对氨基苯磺酸溶液1mL，混合，精置3-5min后，加入0.5mL0.2%盐酸萘乙二胺溶液，加去离子水6mL，混匀，静置15min，以5mL提取液为空白，在544nm处测定吸光度，按下式计算清除率：

清除率S%=[A₀-(A-A₁)]/A₀×100%

式中A₀-样品组的吸光值；

A₁-NO^2-的溶液吸光度；

A-样品组的吸光度。

结果如图5所示，随着提取物用量的增大，对亚硝酸盐的清除率增加。当浓度小于等于1.00mg/mL时，各浓度梯度之间对亚硝酸盐的清除率达到极显著水平，当浓度大于1.00mg/mL时，则不显著。当浓度等于1.00mg/mL时，VC对亚硝酸盐的清除率为72.39%，栗蓬的清除率为92.00%，栗花的清除率为93.21%，栗叶的清除率为93.07%。

实施例5板栗鞣花酸鞣质抑菌性的研究

1、培养基、菌种活化及菌悬液的制备

营养肉汁琼脂培养基：蛋白胨10g、牛肉膏3g、琼脂15g、NaCL5g、蒸馏水1L，调pH值7。

Czapek′s琼脂培养基：蔗糖30g、NaNO₃3g、MgSO₄·7H₂O0.5g、KCL0.5g、K₂HPO₄1.0g、FeSO₄·4H₂O0.01g、琼脂15g、蒸馏水1L，调pH值6.0-6.5，121℃灭菌20min。将所有供测试的菌种接入相应的试管斜面培养，每种接多支重复。细菌置37℃恒温培养箱培养24h；霉菌置25-28℃恒温培养箱培养24h。

细菌用营养肉汁琼脂培养基，将供试菌种分别接种到装有对应培养基的试管内，进行扩大培养。细菌在37℃培养24h。取活化好的菌种斜面，用无菌生理盐水配制成1×10⁶～10×10⁶CFU的细菌菌悬液，备用。

真菌用Czapek′s琼脂培养基，将供试菌种分别斜面接种到Czapek′s琼脂培养基中，在28℃培养72h，由于真菌生长方式为辐射状生长，所以真菌抑菌可以从先制备好的真菌培养基中直接取菌片试验。

2、抑菌试验

抑菌实验其流程如下：

制备滤纸片→灭菌→浸泡于不同浓度板栗栗蓬、栗花或栗叶鞣花酸鞣质提取物溶液（实施例1中浓缩滤液未经冷冻干燥即为板栗栗蓬、栗花或栗叶鞣花酸鞣质提取物溶液）→贴入带菌平皿→测定MIC→与防腐剂比较→防腐试验。

将吸水性强的滤纸用打孔器打成直径10mm的圆形小纸片，分装于干净的小培养皿中，干热灭菌（160℃，2h）后，备用。将提取物溶于无菌水中，制备成质量分数为6%的溶液。用无菌镊子将滤纸片放入以上溶液中，另取滤纸片放入苯甲酸钠和无菌水中作对比空白试验，分别记做CK1和CK2，均浸泡24h。

取制备好的细菌菌悬液0.2mL，滴入已经倒有相应固体培养基的平皿表面，用涂布器使其均匀分布在培养基的表面。取出后沥去多余的试液，用无菌镊子夹取浸有上述3种液体的滤纸片，放入含菌平皿中，每皿3片。按上述相应条件培养，每种菌作2个重复实验，量取抑菌圈直径，取平均值。

测量方法：用三角尺分别测量每个抑菌圈两个垂直方向的直径大小，取其平均值。

将滤纸片分别浸入配制好的不同浓度的经微孔滤膜除菌供试溶液中24h，用无菌水二倍递减稀释法将供试提取物配制成浓度为6%、3%、1.5%、0.75%、0.375%、0.1875%、0.09375%、0.0468%的板栗提物系列培养基，每一系列接种一种菌，每个浓度做三个重复，取出沥去多余试液，经紫外灯照射20min进行灭菌处理，再用无菌镊子夹取浸有各种浓度的供试溶液的滤纸片，放入含菌平皿中，同一浓度每皿3片，每种菌种做2个重复实验，量取抑菌圈直径，取平均值。置于培养箱中，细菌在37℃下培养24h，霉菌30℃下培养72h，观察生长现象。观察结果是以无抑菌圈的最低溶液浓度为提取物或防腐剂的最低抑菌浓(MIC)。

观察结果是以不长菌的最低提取物溶液浓度为该提取物或防腐剂的最低抑菌浓度(MIC)。

滤纸片法抑菌试验结果显示：CK1和提取液对供试菌均有少量抑菌效果，CK2无明显抑菌效果，结果如表1和图6所示。

表1抑菌圈直径大小（mm)

注：E为大肠杆菌；B为枯草芽孢杆菌；A.n为米曲霉；A.o为黑曲霉；“+”表示有抑菌圈;“—”表示没有抑菌圈。

板栗鞣花酸鞣质提取物对供试菌种的最低抑菌浓度不超过3%，是一种较有效的天然抑菌剂。以抑菌圈直径为参比，结果见表2和表3。

表2溶液浓度对几种微生物抗菌效力的影响

注：E为大肠杆菌；B为枯草芽孢杆菌；A.o为米曲霉；A.n为黑曲霉。

表3板栗鞣花酸鞣质的最低抑菌浓度(MIC）

2、食物防腐试验

将土豆、茄子、豆腐和猪肉切成小块煮熟，分别用板栗提取物水溶液（质量百分数为3%，即将实施例1中浓缩滤液未经冷冻干燥所得的提取物溶液与水按比例混合）处理l0min后，分装于经过灭菌的培养皿中，置于30℃下培养48h，肉眼观察食品感官变化情况。用无菌水作空白对照实验。

实验结果（表4）表明，用提取物溶液处理过的土豆、茄子、豆腐和猪肉，其质地、色泽和气味基本无变化，表面长菌不明显；但未经提取物溶液处理过的土豆、茄子和豆腐则都腐烂变质，表面长有明显的菌膜，有馊臭味；未经处理的猪肉表面有一层粘性物质，色泽黄黑，有腐臭味，表面长有厚的菌膜，所以提取物对食品防腐具有一定的效果（图7-图10）。

表4提取物对食品的防腐效果

实施例6板栗鞣花酸鞣质成分的研究

鞣花酸鞣质(ellagitannin)是一种可水解类鞣质，水解生成的酚酸为鞣花酸或其他与六羟基联苯二甲酸有生源关系的物质。

（一）HPLC高效液相色谱法测定板栗栗蓬等废弃资源中的游离鞣花酸

1.标准曲线绘制：准确称取鞣花酸标准品20mg，转移至100mL容量瓶中，用二甲基亚砜定容至刻度，得到质量浓度为200μg/mL的标准溶液，然后稀释至4、8、12、16、20、40、80、120μg/mL。

2.色谱分析条件：色谱柱为TSKGEL ODS-80TS（5μm，4.5mm×150mm），柱温25℃，流动相为乙腈和0.1%磷酸梯度洗脱（表1），流速1.0mL/min，检测波长254nm，上样量10μL。

表5梯度洗脱程序

3.样品的处理：取阴干粉碎过35目筛的板栗废弃物鞣花酸鞣质，准确称取0.500g粉末，放入100mL的带塞三角瓶中，加入含0.01%盐酸的甲醇50mL，置于水温为60℃的超声波清洗机中超声30min，保温30min后取出，将上清转移至2mL离心管中，18000rpm离心15min，取上清用针头式滤器（0.45μm，有机相）过滤于色谱上样瓶中，4℃保存待上机分析。

结果与分析

1.鞣花酸鞣质色谱图

按照设定色谱条件对鞣花酸标准品和提取的板栗废弃物样品进行分析，由图11可以看出，样品中游离鞣花酸峰型较好，经计算其与前后共存峰的分离度均大于1.5，符合分析要求。

2.方法的线性范围

根据鞣花酸色谱图峰面积（A）和配制系列浓度（C，μg/mL）作图，得到标准曲线，线性方程为：A=91.472C+82.193，相关系数为0.9998。鞣花酸含量在4-120μg/mL范围内与峰面积呈现良好的线性关系。

3.精密度和稳定性试验

选取16μg/mL的鞣花酸标准品溶液注入液相色谱仪分析，重复9次，鞣花酸峰面积和保留时间的测定值分别保持在1549.43-1561.11和7.890-7.920之间，计算RSD值分别为0.30%和0.16%，表明仪器精密度良好。取同批次提取样品，分别于0、24、48、72h测定（表2），鞣花酸峰面积RSD在2.02%-4.37%之间，表明供试溶液在72小时内稳定。

表6样品稳定性试验数据分析

4.方法回收率试验

采用加标准品回收法，准确称取板栗废弃物样品2份，每份0.500g，其中一份加入200μg/mL的鞣花酸标准溶液1mL，一份不加，重复3次。由表7可知该方法回收率在95.00%-98.75%之间。

表7方法回收率数据分析

5.板栗废弃物中鞣花酸的含量

取板栗废弃物样品，按照上述样品制备和色谱分析条件进行测定，采用外标法定量计算样品中游离鞣花酸含量（表8），结果表明每克栗花干粉中含游离鞣花酸2.267mg，其含量极显著的高于栗叶和栗苞。

表8板栗废弃物中游离鞣花酸含量比较

（二）鞣花酸核磁共振波谱特征鉴定

核磁共振波谱法（nuclear magnetic resonance spectroscopy;NMRspectroscopy），研究原子核在磁场中吸收射频辐射能量进而发生能级跃迁现象的一种波谱法。在NMR中，峰的个数标志分子中磁不等性质子的种类；峰的强度表示每类质子的数目，峰的位移δ表示每类质子的所处的化学环境。

测试化合物的核磁共振（NMR）氢谱和碳谱，并对其进行结构分析。

鞣花酸（Ellagic acid；2,3,7,8-tetrahydroxybenzopyrano5,4,3-cdebenzopyran-5,10-dione)，分子式C₁₄H₆O₈，分子量228.25，它是没食子酸的二聚衍生物，是一种多酚二内酯。它不仅能以游离的形式存在，而且更多的是以缩合形式(如鞣花单宁、苷等)存在于自然界，其结构如式（I）所示。

由于鞣花酸的特殊结构特征¹³C和¹H，该型化合物C1、C2、C3、C4、C5、C6、C7与C1′、C2′、C3′、C4′、C5′、C6′、C7′属于180°中心对称结构，H5与H5′也属于中心对称，所以核磁共振波谱特征对C1、C2、C3、C4、C5、C6、C7与H5（H5′）的有完全对称的峰位移δ，根据化合物的波谱特征来定性化合物的类型。

（三）鞣花酸的核磁共振波谱特征分析

采用核磁共振波谱法对鞣花酸的7个¹³C原子（1,2,3,4,5,6,7与1′,2′,3′,4′,5′,6′,7′位置上的C原子相同）和1个¹H原子（H5与H5′）的峰位移（δ）对比，如表3-4与3-5所示，与Xing-Cong Li等所示鞣花酸的NMR结果相吻合。

表9¹³C在二甲亚砜中的NMR峰位移δppm

表10¹H在二甲亚砜中的NMR峰位移δppm

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims

1.板栗鞣花酸鞣质在制备抗氧化剂中的应用，其特征在于，所述板栗鞣花酸鞣质的制备方法为：将板栗栗蓬、栗花或栗叶经干燥后加工成粉末，加入至乙醇水溶液中，得到板栗栗蓬、栗花或栗叶粉末的乙醇水分散液，对所述乙醇水分散液进行超声提取后再进行水浴回流提取，浓缩滤液经冷冻干燥即得板栗鞣花酸鞣质。

2.板栗鞣花酸鞣质在制备还原剂中的应用，其特征在于，所述板栗鞣花酸鞣质的制备方法为：将板栗栗蓬、栗花或栗叶经干燥后加工成粉末，加入至乙醇水溶液中，得到板栗栗蓬粉末的乙醇水分散液，对所述乙醇水分散液进行超声提取后再进行水浴回流提取，浓缩滤液经冷冻干燥即得板栗鞣花酸鞣质。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述还原剂用于羟基自由基、超氧自由基、DPPH自由基的清除以及亚硝酸盐的还原。

4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述板栗鞣花酸鞣质的制备方法为：将板栗栗蓬、栗花或栗叶经干燥后加工成粉末，向1g板栗栗蓬、栗花或栗叶粉末中加入10～40mL乙醇水溶液，得到板栗栗蓬、栗花或栗叶粉末的乙醇水分散液，于40℃～50℃，40KHz超声提取30～40min后，于50℃～80℃进行2次水浴回流提取，每次提取0.5～1.5h，浓缩滤液于-50℃～-60℃冷冻干燥15-25h；

其中，使用乙醇水溶液进行水浴回流，所述乙醇水溶液中乙醇的质量百分含量为5%～45%。