CN103604891B - 一种生物质材料油脂的提取方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种生物质材料油脂的提取方法及其应用。本发明生物质材料油脂的提取方法采取高渗透性的DMSO-甲醇强极性溶剂在温和条件下破坏细胞的细胞膜和细胞壁，再用弱极性的正己烷/乙醚溶剂系统对胞内脂肪体中的甘油酯等中性油脂进行提取。本发明生物质材料油脂的提取方法可用于分析生物质材料总脂含量和脂肪酸组成。本发明操作简单快速，条件温和，环境压力小，提取率高，其中细胞破壁率、油脂萃取率均可达99%以上，提取油脂过程无酸败、脂质氧化发生，提取获得的总脂能较好地维持其在生物材料中原始组分和结构，可为后续的脂肪组学及脂肪酸组分的解析提供高品质油脂材料。该方法对总脂含量和脂肪酸组分分析的重现性好，可靠性高。
Description
技术领域
本发明涉及一种生物质材料油脂的提取方法及该方法在生物质材料总脂含量和脂肪酸组成分析中的应用。
背景技术
随着全球经济发展和人口增长，油脂与人类的关系越来越密切，无论是作为生物柴油的原料还是加工成为保健食品，油脂都具有至关重要的作用。目前，油脂的主要生物材料来源仍然是植物如油菜、棕榈树、橄榄、芝麻科、豆科、棉科、花生科等，以及动物脂肪，但是这种传统的油脂来源已经远远不能满足人类食用、工业使用等需求因此寻求成本低、来源广以及成分好的油脂原料是目前油脂科学相关研究的重要领域之一（孙珊，郑立，韩笑天.微藻油脂含量和组分及影响因子的研究[J].海洋科学,2009,33(12):15-16）。
近年来，微藻、真菌等单细胞生物，能在通过光合自养或者光合异养在细胞内大量合成油脂并以脂肪体和油滴的形式储存于细胞内。通常合成储存于细胞内的油脂含量为细胞干重的20%-70%（Li,Y.Zhao,Z.Bai,F.EnzymeMicrob.Technol.2007,41:312-317），其中，有些生物体如隐甲藻、裂殖壶菌、高山被孢霉菌、菱形藻等生物体合成油脂50%以上由人体必需多不饱和脂肪酸如DHA（二十二碳六烯酸）、EPA（二十碳五烯酸）、AA（二十碳四烯酸）等组成。因此，筛选和选育高产油或高产高值活性产物油脂的单细胞生物种源在近年来受到及其广泛的关注。尤其是近年来随着微藻生物能源的快速发展，选育获得优质高产油微藻及其它产油微生物已经是亟待攻克的科学和技术难题。
由于微藻、真菌如酵母、裂殖壶菌等单细胞生物在油脂积累后常形成坚硬的细胞壁，传统用于鱼类等动物组织样品总脂提取和分析的方法，因无法有效破碎细胞壁，很难有效直接应用于厚壁单细胞产油生物体的油脂提取。
目前对厚壁单细胞产油生物体油脂的提取方法主要包括机械破壁处理后（MatthewsRF,BraddockRJ.FoodTechnology,1987,41:57-61）采用超临界萃取法（CN1015500078A）、或者直接借鉴传统用于鱼类组织样品总脂提取的高毒有机溶剂萃取法（BlighEG,DyerWJ.Arapidmethodoftotallipidextractionandpurification[J].CanJBiochemPhysiol,1959,37:911-917）。上述依赖于机械破壁后的溶剂提取方法首先因机械破壁效率不高（通常小于70%）而导致后续总脂提取不完全，进而大大低估了总脂的含量；其次，不同微藻和菌体细胞壁的生物质组成差异较大，坚固程度也不一，很难通过一个固定的操作模式达到对成千上万种生物细胞的普适性；再次机械破壁往往伴随着超声、高压、高温等极端操作条件，提取油脂过程易导致脂质氧化、酸败等，这对后续以总脂含量、脂肪组学（脂质的组成）、高值产物（多不饱和脂肪酸含量）为主导的筛选参数会造成严重影响。此外，直接采用氯仿甲醇等高毒有机溶剂的直接提取方法因无法有效破碎细胞壁，而对微藻和真菌细胞油脂提取效率极低。最后，索氏抽提法提取温度较高，容易引起不饱和脂肪酸的氧化、酸败问题，影响后续筛选。氯仿等高毒有机溶剂在操作过程中对操作人员和环境也将构成安全隐患。
发明内容
本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种生物质材料油脂的提取方法。
本发明的目的还在于提供上述生物质材料油脂的提取方法在生物质材料总脂含量和脂肪酸组成分析中的应用。
本发明采用低毒性的双溶剂系统在温和条件下进行总脂的破壁提取，减小环境危害，优化工艺过程，避免提取过程油脂酸败、氧化的发生，提高提取效率，再结合气相检测技术，精确解析脂肪酸的组成。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
一种生物质材料油脂的提取方法，包含如下步骤：将生物质材料加入到甲醇和DMSO的混合溶剂中水浴加热破壁，离心收集上层油相；往离心的沉淀中加入亲脂性的有机溶剂水浴加热萃取油脂，离心收集上层油相，油脂在上层油相中。
所述的生物质材料不限于产油单细胞生物，还包括产油动植物细胞、组织和器官。其中产油单细胞生物包括但不限于：酵母、霉菌、细菌和微藻等；例如：真菌中常见的产油微生物有：浅白色隐球酵母（Cryptococusalbidus）、弯隐球酵母（Cryptococusalbidum）、斯达氏油脂酵母（Lipomycesstarkeyi）、类酵母红冬孢（Rhodosporidiumtorulqides）等；常见的产油霉菌有：土霉菌（Asoergullusterreus）、紫癜麦角菌（Clavicepspurpurea）、高粱褶孢黑粉菌（Tolyposporiumehrenbergii）、高山被孢霉（Mortierellaalpina）、深黄被孢霉（Mortierellaisabellina）等。产油细菌有：棒状杆菌（Corynebacterium）、诺卡氏菌（Nocardia）、分枝杆菌（Mycobacterium）等。产油微藻有：小球藻（Chlorellasp.）、球等边金藻（Isochrysisgalbana)、球等鞭三角褐指藻（Phaeodactylumtricornutum）、裂殖壶菌（Schizochytriumlimacinum）、隐甲藻（Crypthecodiniumcohnii）等。产油动植物细胞、组织和器官包括高等植物种子和其它组织，水生植物的种子和其它组织，动物细胞、组织和器官。
所述的甲醇和DMSO的混合溶剂中甲醇与DMSO的体积比优选为5～10:1。
所述的亲脂性的有机溶剂优选为正己烷与乙醚按体积比0.5～2:1组成的混合溶剂。
所述的水浴加热破壁和水浴加热萃取油脂的条件均优选为45～60℃水浴加热10～40分钟。为了提高破壁效率，可在水浴加热的过程中增加不断连续搅拌的操作。
上述生物质材料油脂的提取方法在生物质材料总脂含量和脂肪酸组成分析中的应用。
一种生物质材料总脂含量的分析方法，包括如下步骤：
（1）对待测定生物质材料进行冷冻干燥处理；准确称取一定量生物质材料；
（2）加甲醇和DMSO的混合溶剂水浴加热破壁，离心，收集上层油相；
（3）收集离心的沉淀，加入亲脂性的有机溶剂水浴加热萃取油脂，离心收集上层油相；
（4）合并上述收集的油相，水洗，离心，收集上层油相；
（5）下层水相用有机溶剂萃取，离心，收集上层油相；
（6）合并油相并进行浓缩处理，获得总脂，计算总脂含量。
步骤（5）中所述的有机溶剂优选为正己烷或石油醚。
步骤（6）中所述的浓缩处理的方法优选为用氮气吹干、真空离心干燥或其它小体积浓缩方法，并冷冻干燥除去油脂中的痕量水。
优选的，所述的生物质材料总脂含量的分析方法，包括如下步骤：
（1）对待测定生物质材料进行冷冻干燥处理；准确称取冷冻干燥后的生物质材料100～200mg（总脂含量在20%（w/w）以上的，为使总脂含量在60～120mg，需要适当增加或减少待测物质的用量）；
（2）加2～10mL甲醇与DMSO以体积比5～10:1组成的混合溶剂45～60℃水浴加热10～40分钟破壁，离心，收集上层油相；
（3）重复步骤（2），将离心的沉淀用甲醇与DMSO的混合溶剂水浴加热破壁1～5次，收集上层油相；
（4）收集离心的沉淀，加入2～10mL正己烷与乙醚以体积比0.5～2:1组成的混合溶剂45～60℃水浴加热10～40分钟萃取油脂，离心收集上层油相；
（5）重复步骤（4），将离心的沉淀用正己烷与乙醚的混合溶剂水浴加热萃取油脂1～5次，收集上层油相；
（6）合并上述收集的油相，水洗，离心，收集上层油相；
（7）下层水相用正己烷或石油醚萃取，离心，收集上层油相；
（8）重复步骤（7）1～3次，收集上层油相；
（9）合并油相，用氮气吹干、真空离心干燥或其它小体积浓缩方法进行油脂浓缩处理，再用冷冻干燥的方法除去油脂中的痕量水，获得总脂，计算总脂含量。
一种生物质材料总脂脂肪酸组成的分析方法，包含如下步骤：
（1）使用上述方法获得总脂后，用有机溶剂配制一定浓度的总脂溶液；
（2）将总脂溶液用氮气吹干后进行甲酯化，萃取甲酯化生成的脂肪酸甲酯；
（3）气相检测分析脂肪酸甲酯组成及含量。
步骤（1）中所述的有机溶剂优选为正己烷或石油醚，所述的总脂溶液的浓度优选为10～30mg/mL。
步骤（2）优选为：取50～100μL浓度为10～30mg/mL总脂溶液，氮气吹干后，加0.5～2mL浓度为0.1～1mol/mL的KOH-甲醇溶液，40～70℃水浴反应10～40min；待冷却到室温，加0.5～2mL浓度为14%的BF3-甲醇溶液，45～65℃水浴反应5～20min；待冷却到室温，加0.5～2mL饱和食盐水和0.5～2mL正己烷或石油醚萃取脂肪酸甲酯。
步骤（3）中所述的气相检测的方法优选为：色谱柱：毛细管柱HP-88（60m×250μm×0.2μm）或类似固定相的毛细管气相色谱柱；载气：高纯度N2；柱流速：1.5mL/min；尾吹流速：25mL/min；H2流速：30mL/min；空气流速：400mL/min；分流比：20:1；汽化室温度：240℃；，检测器温度：240℃；色谱柱梯度升温：初始温度为100℃，保持5min，以4℃/min升至240℃，保持10min。
本发明基于“相似相溶”原理，细胞体与双溶剂充分混合接触时，极性溶剂甲醇、DMSO会溶解藻细胞的极性脂如磷脂、糖脂、脂蛋白、脂多糖等成分，从而破坏极性脂质与蛋白质分子间的氢键和静电作用，使非极性溶剂正己烷进入细胞并溶解胞内疏水性的脂肪体以及组成脂肪体或脂滴的中性脂成分，并且由于使用的试剂温和，不会使提取出的脂类物质成分改变，符合多不饱和脂肪酸和脂肪组学样品制备提取要求。充分萃取后，在体系中加入水，极性溶剂即溶于水而与含油脂的非极性溶剂分层，后又用非极性溶剂正己烷洗涤油脂层1～3次，使油脂萃取更加完全，并减少油脂中的非油胶质等杂质，从而提高了总脂和脂肪酸测定的准确度。
本发明在用有机溶剂破壁提取的过程中，加入加热搅拌的步骤，增大破壁剪切力，提高破壁率和提取率。其中水浴温度不得高于有机溶剂的沸点，本发明水浴温度45～60℃。加热搅拌时间10～40分钟。
本发明在油脂甲酯化步骤中，先在KOH-甲醇溶液中发生皂化反应，再用BF3催化脂肪酸甲酯化，整个反应过程均在45～65℃水浴中进行，以使反应完全。
本发明在油脂检测过程中，使用操作简单，环境危害小，检测限高的气相色谱准确测定油脂的组成及含量。
本发明相对于现有技术具有如下优点和效果：
本发明基于对微藻和菌体等生物体细胞壁的深入研究，认识细胞壁生物质组成的基础上，创造性的提出了以高渗透性的DMSO-甲醇强极性溶剂在温和条件下先行破坏细胞的细胞膜和细胞壁，在细胞壁和细胞膜上溶解或者部分溶解细胞膜上的极性磷脂和糖脂层，大大改善和提高了细胞膜和细胞壁的通透性。然后改用弱极性的正己烷/乙醚溶剂系统对胞内脂肪体中的甘油酯等中性油脂进行提取。相比机械破壁，该双溶剂提取系统可大大提高细胞壁的破碎效率。另外，正己烷/乙醚及甲醇等溶剂和具有神经系统剧毒性的氯仿相比，大大改善了提取方法的安全性和可操作性。提取油脂过程无酸败、脂质氧化发生，提取获得的总脂能较好地维持其在生物材料中原始组分和结构，可为后续的脂肪组学及脂肪酸组分的解析提供高品质油脂材料。
快捷高效的提取方法可实现对总脂含量的快速测定，结合气相色谱法对甲酯化的总脂进行测定，可达到快速筛选单细胞生物体中总脂含量和脂肪酸组成信息的目的。
综上所述，采用本发明的提取方法分析生物质材料总脂含量和脂肪酸组成，相比于已有传统的方法，细胞的破壁率和浸提率更高（可达99%以上），提取条件更简单温和，使用溶剂毒性低、对环境更友好，是目前成本较低，提取效率较高并最为准确的方法。采用本发明的总脂和脂肪酸的检测方法，操作更简单高效，可实现对单细胞厚壁微藻或微生物总脂和高值多不饱和脂肪酸的快速筛选。该方法对总脂和脂肪酸组分分析的重现性好，可靠性高。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例1裂殖弧菌菌粉总脂与脂肪酸组成分析
（1）油脂提取
1）准确称量冷冻干燥后的裂殖弧菌菌粉（总脂含量为77.01%）150.0mg，加3mL混合溶剂甲醇/DMSO（v:v=9:1），50℃水浴加热30分钟破壁，5000r/min离心5分钟，取上层油相，重复操作3次，收集上层油相。
2）向下层菌渣中加3mL混合溶剂正己烷/乙醚（v:v=1:1），60℃水浴加热30分钟，萃取油脂，5000r/min离心5分钟，取上层油相，重复操作3次，收集上层油相。
3）合并两次收集的油相，加入3mL纯化水，水洗，2000r/min离心5分钟，收集上层油相。
4）向下层水相中加3mL正己烷萃取，2000r/min离心5分钟，取上层油相，重复操作3次，收集上层油相。
5）将上述油相收集合并于离心管中，采用氮气吹干的方法去除有机溶剂，并冷冻干燥20h除去油脂中的痕量水和有机溶剂残留，称量并代入公式：
其中：m1表示离心管总质量（含总脂），mg；m2表示离心管净质量，mg；m表示所取干菌粉的质量，mg。算得油脂质量为115.1mg，占干菌粉总质量的76.73%，与菌粉中实际总脂含量77.01%非常接近。
（2）油脂检测
1）用5mL正己烷溶解稀释油脂，得浓度为23.02mg/mL的供试液。
2）取50μL供试液，氮气吹干溶剂正己烷，加1mL浓度为0.5mol/mL的KOH-甲醇溶液，65℃水浴反应30min；待冷却到室温，加0.5mL质量浓度为14%的BF3-甲醇溶液，65℃水浴反应10min；待冷却到室温，加1mL饱和食盐水和0.5mL正己烷萃取脂肪酸甲酯，取上层油相，气相检测油脂的脂肪酸组成。
3）所使用的气相色谱仪：Agilent7890A型气相色谱仪，生产厂商美国Agilent公司。
4）气相色谱检测条件：色谱柱：毛细管柱HP-88（60m×250μm×0.2μm）；载气：高纯度N2；柱流速：1.5mL/min；尾吹流速：25mL/min；H2流速：30mL/min；空气流速：400mL/min；分流比：20:1；汽化室温度：240℃；检测器温度：240℃；色谱柱梯度升温：初始温度为100℃，保持5min，以4℃/min升至240℃，保持10min。
5）气相检测结果如表1所示。
表1.气相检测裂殖弧菌菌粉中脂肪酸的组成
| 脂肪酸种类 | 百分组成（%） |
| 豆蔻酸 | 0.64 |
| 棕榈酸 | 29.78 |
| 硬脂酸 | 1.35 |
| 山嵛酸 | 0.31 |
| 花生三烯酸 | 0.32 |
| 二十二碳二烯酸 | 0.61 |
| 二十碳五烯酸EPA | 0.37 |
| 二十二碳五烯酸DPA | 12.79 |
| 二十二碳六烯酸DHA | 53.83 |
实施例2裂殖弧菌菌粉总脂与脂肪酸组成分析
（1）油脂提取
1）准确称量冷冻干燥后的裂殖弧菌菌粉（总脂含量为41.72%）180.1mg，加4mL混合溶剂甲醇/DMSO（v:v=10:1），55℃水浴加热20min破壁，5000r/min离心5min，取上层油相，重复操作4次，收集上层油相。
2）向下层藻渣中加4mL混合溶剂正己烷/乙醚（v:v=1.5:1），55℃水浴加热20min，萃取油脂，5000r/min离心5min，取上层油相，重复操作4次，收集上层油相。
3）合并两次收集的油相，加入4mL纯化水，水洗，2000r/min离心5min，收集上层油相。
4）向下层水相中加4mL正己烷萃取，2000r/min离心5min，取上层油相，重复操作3次，收集上层油相。
5）将上述油相收集合并于离心管中，采用氮气吹干的方法去除有机溶剂，并冷冻干燥20h除去油脂中的痕量水和有机溶剂残留，称量并代入公式，算得油脂质量为74.89mg，占干藻粉总质量的41.58%，与菌粉中实际总脂含量41.72%非常接近。
（2）油脂检测
1）用5mL正己烷溶解稀释油脂，得浓度为14.98mg/mL的供试液。
2）取70μL供试液，氮气吹干溶剂正己烷，加1.5mL浓度为0.4mol/mL的KOH-甲醇溶液，60℃水浴反应20min；待冷却到室温，加1.5mL质量浓度为14%的BF3-甲醇溶液，55℃水浴反应15min；待冷却到室温，加1.5mL饱和食盐水和1.5mL正己烷萃取脂肪酸甲酯，取上层油相，气相检测油脂的脂肪酸组成。
气相检测条件及操作同实施例1，结果如表2所示。
表2.气相检测裂殖弧菌菌粉中脂肪酸的组成
| 脂肪酸种类 | 百分组成（%） |
| 豆蔻酸 | 0.48 |
| 棕榈酸 | 30.76 |
| 硬脂酸 | 1.30 |
| 山嵛酸 | 0.33 |
| 花生三烯酸 | 0.25 |
| 二十二碳二烯酸 | 0.54 |
| 二十碳五烯酸EPA | 0.35 |
| 二十二碳五烯酸DPA | 12.78 |
| 二十二碳六烯酸DHA | 53.21 |
实施例3隐甲藻藻粉总脂与脂肪酸组成分析
（1）油脂提取
1）准确称量冷冻干燥后的隐甲藻藻粉（总脂含量为40.69%）150.3mg，加10mL混合溶剂甲醇/DMSO（v:v=5:1），60℃水浴加热10min破壁，5000r/min离心5min，取上层油相，重复操作1次，收集上层油相。
2）向下层藻渣中加10mL混合溶剂正己烷/乙醚（v:v=0.5:1），45℃水浴加热40min，萃取油脂，5000r/min离心5min，取上层油相，重复操作1次，收集上层油相。
3）合并两次收集的油相，加入6mL纯化水，水洗，2000r/min离心5min，收集上层油相。
4）向下层水相中加10mL正己烷萃取，2000r/min离心5min，取上层油相，重复操作1次，收集上层油相。
5）将上述油相收集合并于离心管中，采用氮气吹干的方法去除有机溶剂，并冷冻干燥20h除去油脂中的痕量水和有机溶剂残留，称量并代入公式，算得油脂质量为60.6mg，占干藻粉总质量的40.32%，与藻粉中实际总脂含量40.69%非常接近。
（2）油脂检测
1）用5mL正己烷溶解稀释油脂，得浓度为12.12mg/mL的供试液。
2）取100μL供试液，氮气吹干溶剂正己烷，加2mL浓度为0.1mol/mL的KOH-甲醇溶液，40℃水浴反应40min；待冷却到室温，加2mL质量浓度为14%的BF3-甲醇溶液，45℃水浴反应20min；待冷却到室温，加2mL饱和食盐水和1mL正己烷萃取脂肪酸甲酯，取上层油相，气相检测油脂的脂肪酸组成。
气相检测条件及操作同实施例1，结果如表3所示。
表3.气相检测隐甲藻藻粉中脂肪酸的组成
| 脂肪酸种类 | 百分组成（%） |
| 豆蔻酸 | 0.52 |
| 棕榈酸 | 31.16 |
| 硬脂酸 | 1.23 |
| 山嵛酸 | 0.22 |
| 花生三烯酸 | 0.29 |
| 二十二碳二烯酸 | 0.60 |
| 二十碳五烯酸EPA | 0.29 |
| 二十二碳五烯酸DPA | 13.25 |
| 二十二碳六烯酸DHA | 52.44 |
实施例4隐甲藻藻粉总脂与脂肪酸组成分析
1）准确称量冷冻干燥后的隐甲藻藻粉（总脂含量为39.01%）199.9mg，加5mL混合溶剂甲醇/DMSO（v:v=7:1），45℃水浴加热40min破壁，5000r/min离心5min，取上层油相，重复操作5次，收集上层油相。
2）向下层藻渣中加5mL混合溶剂正己烷/乙醚（v:v=2:1），50℃水浴加热10min，萃取油脂，5000r/min离心5min，取上层油脂，重复操作5次，收集上层油相。
3）合并两次收集的油相，加入5mL纯化水，水洗，2000r/min离心5min，收集上层油相。
4）向下层油相中加5mL正己烷萃取，2000r/min离心5min，取上层油相，重复操作2次，收集上层油相。
5）将上述油脂收集合并于离心管中，氮气吹干有机溶剂，并冷冻干燥20h除去油脂中的痕量水和有机溶剂残留，称量并代入公式，算得油脂质量为77.5mg，占干藻粉总质量的38.77%，与藻粉中实际总脂含量39.01%非常接近。
（2）油脂检测
1）用5mL正己烷溶解稀释油脂，得浓度为15.50mg/mL的供试液.
2）取80μL供试液，氮气吹干溶剂正己烷，加0.5mL浓度为1mol/mL的KOH-甲醇溶液，55℃水浴反应10min；待冷却到室温，加1mL浓度为14%的BF3-甲醇溶液，50℃水浴反应5min；待冷却到室温，加0.5mL饱和食盐水和2mL正己烷萃取脂肪酸甲酯，取上层油相，气相检测油脂的脂肪酸组成。
气相检测条件及操作同实施例1，结果如表4所示。
表4.气相检测隐甲藻藻粉中脂肪酸的组成
| 脂肪酸种类 | 百分组成（%） |
| 豆蔻酸 | 0.52 |
| 棕榈酸 | 32.11 |
| 硬脂酸 | 1.38 |
| 山嵛酸 | 0.29 |
| 花生三烯酸 | 0.31 |
| 二十二碳二烯酸 | 0.77 |
| 二十碳五烯酸EPA | 0.25 |
| 二十二碳五烯酸DPA | 13.34 |
| 二十二碳六烯酸DHA | 51.03 |
上述结果表明本发明几乎可以提取生物质材料中的全部油脂，准确的分析生物质材料中总脂的含量和脂肪酸组成。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (2)
1.一种生物质材料总脂含量的分析方法，其特征在于包括如下步骤：
(1)对待测定生物质材料进行冷冻干燥处理；准确称取冷冻干燥后的生物质材料100～200mg；
(2)加2～10mL甲醇与DMSO以体积比5～10:1组成的混合溶剂45～60℃水浴加热10～40分钟破壁，5000r/min离心5min，收集上层油相；
(3)重复步骤(2)，将离心的沉淀用甲醇与DMSO的混合溶剂水浴加热破壁1～5次，收集上层油相；
(4)收集离心的沉淀，加入2～10mL正己烷与乙醚以体积比0.5～2:1组成的混合溶剂45～60℃水浴加热10～40分钟萃取油脂，5000r/min离心5min收集上层油相；
(5)重复步骤(4)，将离心的沉淀用正己烷与乙醚的混合溶剂水浴加热萃取油脂1～5次，收集上层油相；
(6)合并上述收集的油相，水洗，2000r/min离心5min，收集上层油相；
(7)下层水相用正己烷或石油醚萃取，2000r/min离心5min，收集上层油相；
(8)重复步骤(7)1～3次，收集上层油相；
(9)合并油相，用氮气吹干或真空离心干燥进行油脂浓缩处理，再用冷冻干燥的方法除去油脂中的痕量水，获得总脂，计算总脂含量；
所述的生物质材料为裂殖弧菌或隐甲藻。
2.一种生物质材料总脂脂肪酸组成的分析方法，其特征在于包含如下步骤：
(1)使用权利要求1所述的方法获得总脂后，用正己烷或石油醚配制浓度为10～30mg/mL的总脂溶液；
(2)取50～100μL浓度为10～30mg/mL总脂溶液，氮气吹干后，加0.5～2mL浓度为0.1～1mol/mL的KOH-甲醇溶液，40～70℃水浴反应10～40min；待冷却到室温，加0.5～2mL浓度为14％的BF3-甲醇溶液，45～65℃水浴反应5～20min；待冷却到室温，加0.5～2mL饱和食盐水和0.5～2mL正己烷或石油醚萃取脂肪酸甲酯；
(3)气相检测分析脂肪酸甲酯组成及含量，所述的气相检测的方法为：色谱柱：毛细管柱HP-88；载气：高纯度N2；柱流速：1.5mL/min；尾吹流速：25mL/min；H2流速：30mL/min；空气流速：400mL/min；分流比：20:1；汽化室温度：240℃；检测器温度：240℃；色谱柱梯度升温：初始温度为100℃，保持5min，以4℃/min升至240℃，保持10min；
所述的生物质材料为裂殖弧菌或隐甲藻。
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