CN103602641A - 一种产γ-环糊精的β-环糊精葡萄糖基转移酶突变体及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种产γ-环糊精的β-环糊精葡萄糖基转移酶突变体及其用途，其氨基酸序列如SEQIDNO:1所示，该突变体酶相对于未突变的β-环糊精葡萄糖基转移酶具有高产γ-环糊精的功能，在以淀粉为原料生产γ-环糊精中具有广泛的用途。

Description

一种产γ-环糊精的β-环糊精葡萄糖基转移酶突变体及其用途

技术领域

本发明属于酶学领域，涉及一种产γ-环糊精的β-环糊精葡萄糖基转移酶突变体，还涉及该突变体在以淀粉为底物生产γ-环糊精中的用途。 

背景技术

环糊精葡萄糖基转移酶（CyclodextrinGlycosyltransferase,简写CGTase,EC2.4.1.19）是糖基水解酶家族13的重要成员，其功能是将淀粉转化为环糊精。从1891年研究者发现一种叫Bacillusmacerans的菌株能利用淀粉生产环糊精至今，国内外研究者对CGTase的研究已经有百年历史(李兆丰，顾正彪，堵国成等，2010，环糊精葡萄糖基转移酶的结构特征与催化机理，中国生物工程杂志，30(06)：144–150。)。产环糊精葡萄糖基转移酶的微生物主要为芽孢杆菌，其中类芽孢杆菌、克雷伯氏菌、嗜热厌氧菌、嗜热厌氧物种和放线菌的近几十种CGTase基因已经被分离鉴定了(Cristiane Moriwakia,Glauciane L.Costaa,Rubia Pazzettoa,et al.2007,Production and characterization of a new cyclodextrin glycosyltransferase from Bacillus firmus isolated from Brazilian soil,Process Biochemistry.42（10）:1384-l390.)。 

根据催化生成环糊精的主要类型不同，环糊精葡萄糖基转移酶可分为α-、β-、γ-CGTase三种。目前，国内外已经对α-和β-CGTase进行了广泛深入的研究，但是对γ-CGTase的研究则是非常少的，目前只发现来源于Bacillusfirmus290-3，Bacillussp.G-825-6，alkalophilicBacillusclarkii7364的环糊精葡萄糖基转移酶为γ-CGTase(杨东，田靖斐，陈晟等，2012，亚位点-7处突变对碱性芽孢杆菌CGT酶产物特异性的影响，生物工程学报，28(2)：191-202。)。我国对CGTase研究较少，主要集中在通过筛选和诱变野生型菌、菌株发酵条件优化等方面进行研究(朱德艳，2013，产环糊精葡萄糖基转移酶菌株发酵条件的优化，湖北农业科学，52(1)：171-173，185。)。江南大学的王峰对高产γ-CGTase 的Bacillus macorousWSH02-06的发酵产酶条件进行了系统的研究(WangF,Du G and ChenJ,2005,Optimization of Cultivation Condition for the Production of γ-Cyclodextrin Glucanotransferase by Bacillus macorous.Food Biotechnoligy,18(2):251-264.)和曹新志对一株嗜碱芽孢杆菌Bacillusalkalophilus1177进行诱变及发酵条件优化(曹新志，金征宇，嗜碱芽孢杆菌产环糊精葡萄糖基转移酶发酵条件的优化，2005，食品科学，26(2)：122-126。)。江南大学陈坚课题组对来源于Peanibacillus maceransJFB05-01的CGT酶进行了定点突变，分别获得了三个具有高产α-环糊精能力的环糊精葡萄糖基转移酶突变体和三个具有高产β-环糊精的环糊精葡萄糖基转移酶突变体，并都已经获得了专利授权(专利号ZL200910029154.2和ZL200910029153.8)。广西科学院的庞浩等人对一个β-环糊精葡萄糖基转移酶进行突变，获得一个高产麦芽糖的突变体(专利号ZL201210387243.6)。 

环糊精(cyclodextrin,CD)是环糊精葡萄糖基转移酶作用于淀粉生成的一类寡糖，其一般有6-12个D-吡喃葡萄糖基以α-1,4-葡萄糖苷键连接成的环状低聚糖(Szejtli J.1998,Introduction and General Overview of Cyclodextrin Chemistry.Chem Rev,98(5):1743–1753.)。其中研究最多、应用最广的是由6，7和8个葡萄糖残基组成的环糊精，分别称为α-、β-和γ-CD(RonanM.Kelly,Lubbert Dijkhuizen,Hans Leemhuis.2009.The evolution of cyclodextrin glucano-transferase product specificity.Appl.Microbiol.Biotechnol.,84(1):119-133.)。环糊精分子是内部疏水、外部亲水的呈中间圆筒型的立体结构。其疏水空洞可与适当大小、形状及疏水性的分子非共价作用而形成稳定的包合物，从而改变被包合物的形状和反应性能。因而可应用在食品、医药、纺织等许多行业(王宁，2010，α-环糊精以及γ-环糊精的酶转化工艺研究，江南大学，硕士论文：1。)。其中γ-CD空腔最大能够包含更大的分子，β-CD次之，α-CD最小。 

在食品方面，环糊精被公认为无害寡糖，在许多食物和营养食品吸收过程中无副作用，并广泛作为多种食物和营养食品的配料或添加剂(Food Standards in Australia New Zealand Final assessment report,Application A438:gamma cyclodextrin as a novel food ingredient/food additive.2003,March19)。 

在制药行业，环糊精已进行深入研究，由于其独特性能，可以作为药物载体。从目前环糊精的研究来看，β-CD的应用最常见。但是由于β-CD的水溶性差、组织刺激大等缺点而大大限制了其应用，而γ-CD的腔体更大，水溶性好且局部刺激小、毒性最小等有点。因此，γ-CD在改善药物的溶解度等方面有着更显著的优势(陈卉，陈燕忠，谢清春等，2012，相溶解度法研究两种不同类型环糊精对吲达帕胺的包合作用，中国药师，15(9)：1281-1283。)。陈迪钊等人通过溶液共混法制备了青藤碱-γ-CD包合物从而大大增加了青藤碱的溶解度(陈迪钊，朱士龙，李勇等，2013，青藤碱-γ-环糊精包合物的性质及谱学分析，食品科学，34(03)：115-118。)。 

以环糊精葡萄糖基转移酶为名称查找国家知识产权局专利检索数据库，共出现11项发明专利。关于产环糊精葡萄糖基转移酶的菌株的专利有1项；关于α-或β-环糊精葡萄糖基转移酶基因及其应用的专利有3项；关于环糊精葡萄糖基转移酶突变体的专利有3项(1项是突变成高产α-环糊精，1项是突变成高产β-环糊精，1项是突变成高产麦芽糖)；其它4项发明专利是关于环糊精葡萄糖基转移酶的酶制剂及其应用的。 

以γ-环糊精为关键词查找国家知识产权局专利检索数据库，共出现61项发明专利，其中只有5项是酶法生成γ-环糊精，其他46项专利都与γ-环糊精的应用相关。在这5项酶法生成γ-环糊精中有4项是采用野生菌株产生的γ-环糊精葡萄糖基转移酶来生成γ-环糊精，只有1项专利是缺失第155位至包括第195为氨基酸在内的区域中的4-8个氨基酸，获得的环糊精葡萄糖基转移酶突变体产γ-环糊精量在一定程度上有所提高。 

寻找和克隆高产γ-环糊精的环糊精葡萄糖基转移酶的途径有2个：一是筛选新型酶的微生物；二是对酶进行适当的蛋白质工程改造。微生物菌种选育是工业生产和学术研究中最常用和最简单的手段之一，但是工作量大、随机性强，因此往往很难筛选到理想菌株。蛋白质工程改造是新兴的、利用分子生物学和生物信息学的方法对蛋白进行定向突变和理性改造，从而获得理想蛋白或酶的方法，其优点在于工作量相对较小和成功概率较大，但是多数突变体蛋白质的酶学性质没有改变或者变得更差。因此，获得效果更好的环糊精葡萄糖基转移酶突变体一直是本领域的研究热点。 

发明内容

本发明的目的在于针对上述技术问题，通过对β-环糊精葡萄糖基转移酶进行蛋白质工程改造，从而获得一种以淀粉为底物高产γ-环糊精的β-环糊精葡萄糖基转移酶突变体。 

为实现上述目的，本发明所采用的技术方案是： 

本发明提供的一种产γ-环糊精的β-环糊精葡萄糖基转移酶突变体，其氨基酸序列为SEQIDNO:1，该突变体是通过对专利ZL201110171181.0中的β-环糊精葡萄糖基转移酶Pcgt进行改造而得到的，具体是通过分子改造β-环糊精葡萄糖基转移酶基因Pcgt，将Pcgt分子上的53位的氨基酸R突变成T、将93～100位的氨基酸INYSGVNN突变成TPGGF同时将151～158位的氨基酸SSDQPSFA突变成D，改造得到一个新的β-环糊精葡萄糖基转移酶突变体。该β-环糊精葡萄糖基转移酶突变体和原酶相比，能够以淀粉为原料高产γ-环糊精。 

本发明还提供了含有本发明的β-环糊精葡萄糖基转移酶突变体的宿主细胞，所述宿主细胞可以为原核细胞或真核细胞。 

本发明所述的β-环糊精葡萄糖基转移酶突变体在以淀粉为原料生产γ-环糊精中具有广泛的用途。 

本发明所述的β-环糊精葡萄糖基转移酶突变体的制备方法包括以下步骤： 

1）克隆获得β-环糊精葡萄糖基转移酶基因； 

2）将步骤1）所获得的基因改造得到β-环糊精葡萄糖基转移酶突变体基因； 

3）将步骤2）所获得的β-环糊精葡萄糖基转移酶突变体基因进行表达和纯化，得到β-环糊精葡萄糖基转移酶突变体的纯化产物； 

4）测定β-环糊精葡萄糖基转移酶突变体水解淀粉所得的产物。 

本发明运用蛋白质工程改造的方法对β-环糊精葡萄糖基转移酶进行了定向改造，获得了高产γ-环糊精的β-环糊精葡萄糖基转移酶突变体，本发明的β-环糊精葡萄糖基转移酶突变体在以淀粉为原料生产γ-环糊精中具有广泛的用途。 

附图说明

图1为本发明的β-环糊精葡萄糖基转移酶突变体部分纯化物的SDS-PAGE图； 

图2为突变前的β-环糊精葡萄糖基转移酶的淀粉水解产物的HPLC图； 

图3为本发明的β-环糊精葡萄糖基转移酶突变体的淀粉水解产物的HPLC图。 

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和本质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。 

实施例1β-环糊精葡萄糖基转移酶突变体的制备 

材料：大肠杆菌（Escherichiacoli）XL10-Gold、载体pSE380购自Invitrogen公司、Ni-NTA蛋白质组氨酸纯化介质购自Novagen公司、聚合酶购自TaKaRa公司、修饰酶DpnI购自MBI公司。其余试剂若无特别说明，均为从市场上购得的常规试剂。 

1）β-环糊精葡萄糖基转移酶基因的克隆 

使用上游引物5’-TCGCCATGGTGCACCACCACCACCACCACATTACGCCAGCTTGCATGCTGCAG-3’(包含一个NcoI酶切位点和一个6xHis标签在5’末端)和下游引物5’-CACAAGCTTTTAAGGCTGCCAGTTCACGTTAATG-3’(包含一个HindIII酶切位点)，通过聚合酶链式反应（PCR）扩增环糊精葡萄糖基转移酶基因Pcgt，用限制性内切酶NcoI和HindIII酶切环糊精葡萄糖基转移酶基因Pcgt后，插入到经NcoI和HindIII酶切的表达载体pSE380进行连接。获得的重组质粒命名为pSE-Pcgt。 

2）β-环糊精葡萄糖基转移酶突变体基因γ-Pcgt的获得 

β-环糊精葡萄糖基转移酶突变体基因是根据Pcgt基因序列信息通过设计三对引物依次进行三次突变而获得。第一次突变是利用反向PCR将53位的氨基酸R突变成T进行的，以1）中构建的pSE-Pcgt为模板，使用正向引物R53T1： 5’-GCACGAACCTCACTCTGTATTGCGGCGGCG-3’和反向引物R53T2：5’-CGCCGCCGCAATACAGAGTGAGGTTCGTGC-3’进行PCR，PCR反应程序：第一步95℃2分钟；第二步进行30个循环，循环为98℃10秒，61.7℃6.5分钟；第三步72℃10分钟。PCR产物使用1μLDpnI在37℃酶切一个小时，然后转化到CaCl2化学法制备的大肠杆菌XL10-Gold感受态细胞中。转化产物克隆送交华大生物公司进行DNA测序分析确定正确的转化子，突变子命名为R53T。第二次突变在第一次成功突变的基础上进行PCR，以R53T为模板，使用正向引物7D1：5’-CATACGTCGCCCGCCGATGAAAACGGCCGGCTG-3’和反向引物7D2：5’-CAGCCGGCCGTTTTCATCGGCGGGCGACGTATG-3’进行PCR，PCR反应程序：第一步95℃2分钟；第二步进行30个循环，循环为98℃10秒，59℃6.5分钟；第三步72℃10分钟。PCR产物使用1μLDpnI在37℃酶切一个小时，然后转化到CaCl₂化学法制备的大肠杆菌XL10-Gold感受态细胞中。转化产物克隆送交华大生物公司进行DNA测序分析确定正确的转化子，突变子命名为R53T-7D。第三次突变在第二次成功突变的基础上进行PCR，以R53T-7D为模板，使用正向引物r1：5’-AACATCTACAGCATCACTCCTGGCGGCTTCACGGCCTATCACGGC-3’和反向引物r2:5’-GCCGTGATAGGCCGTGAAGCCGCCAGGAGTGATGCTGTAGATGTT-3’进行PCR，PCR反应程序：第一步95℃2分钟；第二步进行30个循环，循环为98℃10秒，56℃6.5分钟；第三步72℃10分钟。PCR产物使用1μLDpnI在37℃酶切一个小时，然后转化到CaCl2化学法制备的大肠杆菌XL10-Gold感受态细胞中。转化产物克隆送交华大生物公司进行DNA测序分析确定正确的转化子，将突变子命名为γ-Pcgt。 

3）β-环糊精葡萄糖基转移酶突变体基因γ-Pcgt的表达和表达产物的部分纯化 

将含有质粒pSE-γ-Pcgt的重组大肠杆菌XL10-Gold菌株接种到20mL含100μg/mL氨苄青霉素的LB培养基中，37℃振荡培养，待OD600为0.6时，加入终浓度为0.5mmol/L的IPTG、终浓度为100mmol/L的L-三梨醇和终浓度为2.5mmol/L的甜菜碱，20℃诱导20小时。11000转离心3min，收集菌体，用4mL裂解缓冲液（50mmol/LNaH₂PO₄，300mmol/LNaCl，10mmol/L咪 唑，pH8.0）重悬菌体，超声波破胞9min。12000转离心10min，取上清进行后面的蛋白质纯化。按每4ml上清液加入1mL50%的镍亲和层析胶体，在4℃用200转摇60分钟，把混合物灌注到柱子，收集流出物。加1ml冲洗缓冲液（50mmol/LNaH₂PO₄，300mmol/LNaCl，20mmol/L咪唑，pH8.0）到柱子里，缓慢搅拌，收集流出物。重复冲洗步骤4次。加入洗脱缓冲液（50mmol/LNaH₂PO₄，300mmol/LNaCl，250mmol/L咪唑，pH8.0）洗脱蛋白质。收集洗脱的蛋白质溶液，用变性的聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）验证，所得的SDS-PAGE图如图1所示，发现有目的大小的蛋白质条带。 

4）β-环糊精葡萄糖基转移酶突变体γ-Pcgt水解淀粉的产物测定 

取3μlβ-环糊精葡萄糖基转移酶突变体γ-Pcgt的部分纯化物，与1%(w/v)淀粉溶液（用50mmol/LpH7.0磷酸缓冲液溶解）在500μl的反应体系中37℃作用3个小时。反应时间到后，在100℃加热10分钟终止反应。γ-Pcgt的产物用高效液相色谱法（HPLC）进行检测。HPLC检测的结果图如图3所示，结果显示：γ-Pcgt的产物中有葡萄糖、α-环糊精、β-环糊精和γ-环糊精存在，其中水解产物中γ-环糊精的产量占总的水解产物的74.63%。 

HPLC条件：仪器：Agilent1100色谱仪，Alltech2000ES型蒸发光散射检测器，XWK-III无油空气泵；色谱柱：Alltima Amino5μ色谱柱(250×4.6mm);流动相：乙腈:水（70:30）;流速：1.0mL/min;进样量20μL；柱温28℃。 

对照例β-环糊精葡萄糖基转移酶Pcgt水解淀粉的产物测定 

取3μlβ-环糊精葡萄糖基转移酶Pcgt的部分纯化物，与1%(w/v)淀粉溶液（用50mmol/LpH7.0磷酸缓冲液溶解）在500μl的反应体系中37℃作用3个小时。反应时间到后，在100℃加热10分钟终止反应。Pcgt的产物用高效液相色谱法（HPLC）进行检测。HPLC检测的结果图如图2所示。 

HPLC条件：仪器：Agilent1100色谱仪，Alltech2000ES型蒸发光散射检测器，XWK-III无油空气泵；色谱柱：AlltimaAmino5μ色谱柱(250×4.6mm);流动相：乙腈:水（70:30）;流速：1.0mL/min;进样量20μL；柱温28℃。 

结果： 

从图1了解到，环糊精葡萄糖基转移酶突变体γ-Pcgt部分纯化物的分子量为74.1kDa。 

图2中的A、B和C分别是葡萄糖、α-环糊精和β-环糊精的标样，D是Pcgt转化淀粉的产物。从图2的D中了解到，β-环糊精葡萄糖基转移酶Pcgt能将淀粉转化成葡萄糖、α-环糊精、β-环糊精和γ-环糊精，其中γ-环糊精的产量占总环糊精的9.68%，见表1所示。 

表1β-环糊精葡萄糖基转移酶Pcgt水解淀粉的产物测定表 

图3中的A、B、C和D分别是葡萄糖、α-环糊精、β-环糊精和γ-环糊精的标样，E是γ-Pcgt转化淀粉的产物。从图3的E中了解到，β-环糊精葡萄糖基转移酶突变体γ-Pcgt能将淀粉转化成葡萄糖、α-环糊精、β-环糊精和γ-环糊精，其中水解产物中γ-环糊精的产量占总水解产物的74.63%，见表2所示。 

表2β-环糊精葡萄糖基转移酶突变体γ-Pcgt水解淀粉的产物测定表 

从表1和表2的数据可以看出，本发明的β-环糊精葡萄糖基转移酶突变体以淀粉为原料进行水解，水解产物中γ-环糊精的产量占总水解产物的74.63%， 大大高于未突变的β-环糊精葡萄糖基转移酶水解淀粉所得的γ-环糊精产量，说明本发明的β-环糊精葡萄糖基转移酶突变体是一种高产γ-环糊精的突变体酶。 

序列表 

。

Claims (3)

1.一种产γ-环糊精的β-环糊精葡萄糖基转移酶突变体，其特征在于：所述产γ-环糊精的β-环糊精葡萄糖基转移酶突变体的氨基酸序列如SEQIDNO:1所示。

2.一种宿主细胞，其特征在于：所述宿主细胞为含有权利要求1所述的β-环糊精葡萄糖基转移酶突变体的原核细胞或真核细胞。

3.按照权利要求1所述的一种产γ-环糊精的β-环糊精葡萄糖基转移酶突变体在以淀粉为原料生产γ-环糊精中的用途。

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