CN103596978A - 抗il-12/il-23抗体及其用途 - Google Patents

抗il-12/il-23抗体及其用途 Download PDF

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Abstract

本发明提供了抗体及其抗原结合部分，其结合包含来自于IL-12和/或IL-23的p40亚基的残基1-197的至少一个氨基酸残基的表位。本发明还提供了编码所述抗体的核酸、包含所述抗体的组合物、载体和宿主细胞以及它们的制备和使用方法。

Description

抗IL-12/IL-23抗体及其用途
相关申请
本申请要求2011年1月7日提交的美国临时申请号61/460,780的优先权。上述申请的全部内容在此引为参考。
发明背景
人白介素12(IL-12)被表征为是具有独特结构和多向效应的细胞因子(Kobayashi等，(1989)J.Exp Med.170：827-845；Seder等，(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.90：10188-10192；Ling等，(1995)J.Exp Med.154：116-127；Podlaski等，(1992)Arch.Biochem.Biophys.294：230-237)。IL-12在与涉及免疫和炎性应答的几种疾病相关的病理学中发挥关键作用。有关IL-12、其生物学活性及其在疾病中的作用的综述可以在Gately等，(1998)Ann.Rev.Immunol.16：495-521中找到。
在结构上，IL-12是异二聚体蛋白，其包含35kDa亚基(p35)和40kDa亚基(p40)，两者通过二硫桥连接在一起(被称为“p70亚基”)。该异二聚体蛋白主要由抗原呈递细胞例如单核细胞、巨噬细胞和树突细胞产生。这些细胞类型也分泌相对于p70亚基过量的p40亚基。p40和p35亚基在基因上无关，并且没有具有生物活性的报道，尽管p40同型二聚体可以起IL-12拮抗剂的作用。
在功能上，IL-12在调控抗原特异性T辅助细胞1型(Th1)与2型(Th2)淋巴细胞之间的平衡中起关键作用。Th1和Th2细胞控制自身免疫障碍的起始和发展，并且IL-12在Th1-淋巴细胞分化和成熟的调控中起关键作用。由Th1细胞释放的细胞因子是炎性的，并包括γ干扰素(IFN-γ)、IL-2和淋巴毒素(LT)。Th2细胞分泌IL-4、IL-5、IL-6、IL-10和IL-13以促进体液免疫、变态反应和免疫抑制。与自身免疫疾病中Th1应答占优势以及IFN-γ的促炎性活性相一致的是，IL-12可以在与很多自身免疫和炎性疾病例如类风湿性关节炎(RA)、多发性硬化症(MS)和克罗恩病有关的病理学中发挥主要作用。
已经证实患有MS的人类患者具有IL-12表达提高，正如通过急性MS斑块中的p40mRNA水平所证实的(Windhagen等，(1995)J.Exp.Med.182：1985-1996)。此外，与对照T细胞相比，用来自于MS患者的表达CD40L的T细胞离体刺激抗原呈递细胞导致IL-12产生增加，这与CD40/CD40L相互作用是IL-12的强诱导剂的观察相一致。
在RA患者的滑液中已检测到与健康对照相比增高的IL-12 p70水平(Morita等，(1998)Arthritis and Rheumatism.41：306-314)。RA滑液中细胞因子信使核糖核酸(mRNA)的表达谱主要鉴定出Th1细胞因子(Bucht等人(1996)Clin.Exp.Immunol.103：347-367)。IL-12似乎也在与克罗恩病有关的病理学中发挥关键作用。已经在患有该疾病的患者的肠粘膜中观测到IFN-γ和IL-12表达的增加(Fais等，(1994)J.Interferon Res.14：235-238；Parronchi等，(1997)Am.J.Path.150：823-832；Monteleone等，(1997)Gastroenterology112：1169-1178；以及Berrebi等，(1998)Am.J Path 152：667-672)。来自于CD患者的鼓膜中层(lamina propria)的T细胞的细胞因子分泌谱特征在于以Th1反应为主，包括极大提高的IFN-γ水平(Fuss等人(1996)J Immunol.157：1261-1270)。此外，来自于CD患者的结肠组织切片显示出富含表达IL-12的巨噬细胞和表达IFN-γ的T细胞(Parronchi等，(1997)Am.J.Path.150：823-832)。
由于人IL-12在各种人体障碍中的作用，因此设计了抑制或抵消IL-12活性的治疗策略。具体来说，已寻求结合并中和IL-12的抗体作为抑制IL-12活性的手段。抗原(Ag)的高特异性识别允许抗体(Ab)对外来侵入物表现出体液免疫应答并区分自身和非自身。已开发了单克隆抗体(mAb)用于在各种病症包括自身免疫疾病的治疗中用作蛋白治疗剂(Brekke，O.H.和I.Sandlie(2003)，Therapeuticantibodies for human diseases at the dawn of the twenty-first century，Nat Rev Drug Discov 2(1)：52-62)。抗体可以通过中和与疾病相关的靶分子或通过靶向特定细胞进行破坏而起到治疗剂的作用。
白介素23(IL-23)是人异二聚体细胞因子蛋白，其由两个亚基p 19(IL-23的α亚基)和p40构成，p40是IL-12的β亚基(即IL-12B)。IL-23由许多不同细胞(包括巨噬细胞和树突细胞)分泌。与IL-12相同，IL-23表现为在自身免疫疾病的发展中是重要的；例如，它在多发性硬化症的鼠类模型中发挥关键作用(Cua，D.J.，J.Sherlock等，(2003)Interleukin-23 rather than interleukin-12 is the critical cytokinefor autoimmune inflammation of the brain，Nature 421(6924)：744-8)。
一些最早的抗体是鼠单克隆抗体(mAb)，其由从IL-12免疫的小鼠的脾细胞制备的杂交瘤分泌(参见例如Strober等的世界专利申请公布号WO 97/15327；Neurath等，(1995)J.Exp.Med.182：1281-1290；Duchmann等，(1996)J.Immunol.26：934-938)。由于与小鼠抗体施用于人相关的问题例如血清半衰期短、不能够引发某些人效应子功能以及在人体中引发针对小鼠抗体的不想要的免疫应答(“人抗小鼠抗体”(HAMA)反应)，这些鼠IL-12抗体的体内应用受到限制。
总的来说，为克服与在人体中使用全鼠抗体相关的问题而进行的尝试涉及将抗体进行遗传工程改造成更加“类人的”。例如，已经制备了嵌合抗体，其中抗体链的可变区是鼠源的，而抗体链的恒定区是人源的(Junghans等，(1990)Cancer Res.50：1495-1502；Brown等，(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.88：2663-2667；Kettleborough等，(1991)Protein Engineering.4：773-783)。然而，由于这些嵌合的和人源化的抗体仍保留一些鼠序列，因此特别是当长期施用时，它们仍可能引起不想要的免疫应答，即人抗嵌合抗体(HACA)反应。比鼠抗体或其衍生物(例如嵌合或人源化抗体)更优选的IL-12抑制剂是完全人抗IL-12抗体，因为这样的试剂不引发HAMA反应，即使是长期使用。
已经批准了17种mAb用于治疗性应用。其实例包括鼠mAb(例如用于急性同种异体移植排斥的ORTHOCLONE OKT
Figure BPA00001751564500041
3(抗CD3)(Ortho Multicenter Transpl ant Study Group(1985).A randomizedclinical trial of OKT3 monoclonal antibody for acute rejection ofcadaveric renal transplants，Ortho Multicenter Transplant Study Group，N Engl J Med 313(6)：337-42))，其中鼠可变结构域被嫁接到人恒定结构域上的鼠-人嵌合mAb(例如用于类风湿性关节炎和克罗恩病的Remicade
Figure BPA00001751564500042
(抗TNFα)，(Bondeson，J.和R.N.Maini(2001).Tumour necrosis factor as a therapeutic target in rheumatoid arthritisand other chronic inflammatory diseases：the clinical experience withinfliximab(REMICADE)，Int J Clin Pract 55(3)：211-6)，和用于非霍奇金淋巴瘤的Rituxan
Figure BPA00001751564500043
(抗CD20)(White，C.A.，R.L.Weaver等，(2001)，Antibody-targeted immunotherapy for treatmentof malignancy.，Annu Rev Med 52：125-45))，其中将鼠互补决定区(CDR)整合到其他为人免疫球蛋白中的人源化mAb(例如用于乳腺癌的Herceptin(抗Her2)(Shak，S.(1999)，Overview of thetrastuzumab(Herceptin)anti-HER2 monoclonal antibody clinicalprogram in HER2-overexpressing metastatic breast cancer.HerceptinMultinational Investigator Study Group)，Semin Oncol 26(4 Suppl 12)：71-7))，以及最近的重组人mAb(例如用于类风湿性关节炎的Humira(抗TNFα)(Weinblatt，M.E.，E.C.Keystone等，(2003)，Adalimumab，a fully human anti-tumor necrosis factor alpha monoclonalantibody，for the treatment of rheumatoid arthritis in patients takingconcomitant methotrexate：the ARMADA trial.，Arthritis Rheum 48(1)：35-45))，其中高变区和框架区残基两者都从天然存在的人免疫球蛋白序列取得。
科学家和临床医生都对治疗性mAb的三维结构具有相当大的兴趣。mAb结合亲和性和特异性以及Ag结合和释放的动力学都是对临床成功与否极为关键的功能特性。从mAb和mAb-Ag复合体的结构知识可以更全面地理解这些特性。对这些性质的结构基础的理解也随之带来了为治疗性应用合理地优化抗原结合分子的能力。因此，对于被优化以结合抗原(例如IL-12和IL-23的p40亚基)的治疗性药剂(例如抗体和由其衍生的抗原结合性蛋白)存在着持续需求。这些抗体将有效地缓解异常IL-12和/或IL-23活性的效应。
发明简述
本发明至少部分地基于包含单独的和与白介素-12(IL-12)p70(在后文中称为IL-12p70或简称IL-12)复合的抗IL-12/IL-23的p40亚基的抗体J695的抗原结合片段(Fab)的多肽的x-射线晶体学研究。来自于该研究的原子坐标可用于鉴定和设计结合含p40的细胞因子(例如IL-12和IL-23)的改进的抗体和其他抗体样结合分子(例如抗体片段或结构域抗体)。这些改进的抗体可用于患有由含有p40的细胞因子的生物活性所调节或由其造成的病症的患者的治疗方法中，所述病症包括例如由免疫系统的不适当或不希望的刺激所造成的病症(多发性硬化症、银屑病、类风湿性关节炎、克罗恩病、红斑狼疮、慢性炎性疾病和移植手术后的移植物排斥)或癌症。
因此，一方面，本发明提供了结合IL-12和/或IL-23的p40亚基的分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段结合p40亚基的包含选自SEQ ID NO：3的氨基酸序列的残基1-197的至少一个氨基酸残基(例如至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196或197个残基)或在所述氨基酸残基的
Figure BPA00001751564500061
之内的部分和/或构象表位。在一种实施方式中，本发明提供了结合IL-12和/或IL-23的p40亚基的分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段结合p40亚基的包含选自SEQ ID NO：3的氨基酸序列的残基1-107的至少一个氨基酸残基或在所述氨基酸残基的
Figure BPA00001751564500062
之内的部分和/或构象表位。
在另一种实施方式中，本发明提供了结合IL-12和/或IL-23的p40亚基的分离的抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体结合p40亚基的包含p40亚基的环1-7的至少一个氨基酸残基或在所述氨基酸残基的
Figure BPA00001751564500063
之内的部分和/或构象表位，且其中所述至少一个氨基酸残基选自SEQ ID NO：3的氨基酸序列的残基14-23、58-60、84-107、124-129、157-164和194-197。
在另一种实施方式中，本发明提供了结合IL-12和/或IL-23的p40亚基的分离的抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体结合p40亚基的包含p40亚基的环1-7的至少一个氨基酸残基或在所述氨基酸残基的
Figure BPA00001751564500064
之内的部分和/或构象表位，并且其中所述至少一个氨基酸残基选自SEQ ID NO：3的氨基酸序列的残基Asp14、Trp15、Tyr16、Pro17、Asp18、Ala19、Pro20、Gly21、Glu22、Met23、Lys58、Glu59、Phe60、Lys84、Lys85、Glu86、Asp87、Gly88、Ile89、Trp90、Ser91、Thr92、Asp93、Ile94、Leu95、Lys96、Asp97、Gln98、Lys99、Glu100、Pro101、Lys102、Asn103、Lys104、Thr105、Phe106、Leu107、Thr124、Thr125、Ile126、Ser127、Thr128、Asp129、Arg157、Val158、Arg159、Gly160、Asp161、Asn162、Lys163、Glu164、His194、Lys195、Leu196和Lys197。
在一种实施方式中，所述分离的抗体或其抗原结合部分结合p40亚基的包含选自残基14-23的环1的至少一个氨基酸残基或在所述氨基酸残基的
Figure BPA00001751564500071
之内的部分和/或构象表位。在一种实施方式中，所述分离的抗体或其抗原结合部分结合p40亚基的包含选自残基14-18的环1的至少一个氨基酸残基或在所述氨基酸残基的
Figure BPA00001751564500072
之内的部分和/或构象表位。在一种实施方式中，所述分离的抗体或其抗原结合部分结合p40亚基的包含选自残基14-17的环1的至少一个氨基酸残基或在所述氨基酸残基的
Figure BPA00001751564500073
之内的部分和/或构象表位。在一种实施方式中，所述分离的抗体或其抗原结合部分结合p40亚基的包含选自残基15-17的环1的至少一个氨基酸残基或在所述氨基酸残基的
Figure BPA00001751564500074
之内的部分和/或构象表位。
在一种实施方式中，所述分离的抗体或其抗原结合部分结合p40亚基的包含选自残基58-60的环2的至少一个氨基酸残基或在所述氨基酸残基的
Figure BPA00001751564500075
之内的部分和/或构象表位。
在一种实施方式中，所述分离的抗体或其抗原结合部分结合p40亚基的包含选自残基84-94的环3的至少一个氨基酸残基或在所述氨基酸残基的
Figure BPA00001751564500076
之内的部分和/或构象表位。在一种实施方式中，所述分离的抗体或其抗原结合部分结合p40亚基的包含选自残基85-93的环3的至少一个氨基酸残基或在所述氨基酸残基的
Figure BPA00001751564500077
之内的部分和/或构象表位。在一种实施方式中，所述分离的抗体或其抗原结合部分结合p40亚基的包含选自残基86-89和93的环3的至少一个氨基酸残基或在所述氨基酸残基的
Figure BPA00001751564500078
之内的部分和/或构象表位。在一种实施方式中，所述分离的抗体或其抗原结合部分结合p40亚基的包含选自残基86、87、89和93的环3的至少一个氨基酸残基或在所述氨基酸残基的
Figure BPA00001751564500079
之内的部分和/或构象表位。在一种实施方式中，所述分离的抗体或其抗原结合部分结合p40亚基的包含环3的氨基酸残基87或在所述氨基酸残基的
Figure BPA000017515645000710
之内的部分和/或构象表位。
在一种实施方式中，所述分离的抗体或其抗原结合部分结合p40亚基的包含选自残基95-107的环4的至少一个氨基酸残基或在所述氨基酸残基的
Figure BPA00001751564500081
之内的部分和/或构象表位。在一种实施方式中，所述分离的抗体或其抗原结合部分结合p40亚基的包含选自残基102-104的环4的至少一个氨基酸残基或在所述氨基酸残基的
Figure BPA00001751564500082
之内的部分和/或构象表位。
在一种实施方式中，所述分离的抗体或其抗原结合部分结合p40亚基的包含选自残基124-129的环5的至少一个氨基酸残基或在所述氨基酸残基的
Figure BPA00001751564500083
之内的部分和/或构象表位。
在一种实施方式中，所述分离的抗体或其抗原结合部分结合p40亚基的包含选自残基157-164的环6的至少一个氨基酸残基或在所述氨基酸残基的之内的部分和/或构象表位。
在一种实施方式中，所述分离的抗体或其抗原结合部分结合p40亚基的包含选自残基194-197的环7的至少一个氨基酸残基或在所述氨基酸残基的之内的部分和/或构象表位。
在一种实施方式中，所述分离的抗体或其抗原结合部分结合p40亚基的包含选自残基14-23、58-60、84-94和95-107的环1-4的至少一个氨基酸残基或在所述氨基酸残基的
Figure BPA00001751564500086
之内的部分和/或构象表位。在一种实施方式中，所述分离的抗体或其抗原结合部分结合p40亚基的包含选自残基14-18、85-93和102-104的环1-4的至少一个氨基酸残基或在所述氨基酸残基的
Figure BPA00001751564500087
之内的部分和/或构象表位。在一种实施方式中，所述分离的抗体或其抗原结合部分结合p40亚基的包含选自残基14-17、86-89、93和103-104的环1-4的至少一个氨基酸残基或在所述氨基酸残基的
Figure BPA00001751564500088
之内的部分和/或构象表位。在一种实施方式中，所述分离的抗体或其抗原结合部分结合p40亚基的包含选自残基15-17、86-87、89、93和104的环1-4的至少一个氨基酸残基或在所述氨基酸残基的
Figure BPA00001751564500089
之内的部分和/或构象表位。
在一种实施方式中，所述分离的抗体或其抗原结合部分结合p40亚基的包含选自残基14-23和58-60的环1-2的至少一个氨基酸残基或在所述氨基酸残基的
Figure BPA00001751564500091
之内的部分和/或构象表位。在一种实施方式中，所述分离的抗体或其抗原结合部分结合p40亚基的包含选自残基15、17-21、23和58-60的环1-2的至少一个氨基酸残基或在所述氨基酸残基的
Figure BPA00001751564500092
之内的部分和/或构象表位。
在一种实施方式中，所述分离的抗体或其抗原结合部分结合p40亚基的包含选自残基14-23的环1的至少一个氨基酸残基和选自残基58-60的环2的至少一个氨基酸残基或在所述氨基酸残基的
Figure BPA00001751564500093
之内的部分和/或构象表位。
在一种实施方式中，所述分离的抗体或其抗原结合部分结合p40亚基的包含选自残基14-23和残基84-94的环1和3的至少一个氨基酸残基或在所述氨基酸残基的
Figure BPA00001751564500094
之内的部分和/或构象表位。
在一种实施方式中，所述分离的抗体或其抗原结合部分结合p40亚基的包含选自残基14-23的环1的至少一个氨基酸残基和选自残基84-94的环3的至少一个氨基酸残基或在所述氨基酸残基的之内的部分和/或构象表位。
在一种实施方式中，所述分离的抗体或其抗原结合部分结合p40亚基的包含选自残基14-23和95-107的环1和4的至少一个氨基酸残基或在所述氨基酸残基的
Figure BPA00001751564500096
之内的部分和/或构象表位。
在一种实施方式中，所述分离的抗体或其抗原结合部分结合p40亚基的包含选自残基14-23的环1的至少一个氨基酸残基和选自残基95-107的环4的至少一个氨基酸残基或在所述氨基酸残基的
Figure BPA00001751564500097
之内的部分和/或构象表位。
在一种实施方式中，所述分离的抗体或其抗原结合部分结合p40亚基的包含选自残基84-94和95-107的环3和4的至少一个氨基酸残基或在所述氨基酸残基的
Figure BPA00001751564500098
之内的部分和/或构象表位。
在一种实施方式中，所述分离的抗体或其抗原结合部分结合p40亚基的包含选自残基84-94的环3的至少一个氨基酸残基和选自残基95-107的环4的至少一个氨基酸残基或在所述氨基酸残基的
Figure BPA00001751564500101
之内的部分和/或构象表位。
在另一种实施方式中，本发明提供了与任何上述抗体竞争结合的分离的抗体或其抗原结合部分。
在另一种实施方式中，所述分离的抗体或其抗原结合部分不是抗体Y61或J695。
另一方面，本发明提供了结合IL-12和/或IL-23的p40亚基的分离的抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体包含SEQ ID NO：1的重链可变区氨基酸序列和SEQ ID NO：2的轻链可变区氨基酸序列，其中除SEQ ID NO：1的氨基酸残基27、32、52、53、97、101和102及SEQ ID NO：2的氨基酸残基35、51和90-101之外的任一可变区残基独立地被不同的氨基酸取代。
另一方面，本发明提供了结合IL-12和/或IL-23的p40亚基的分离的抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体包含SEQ ID NO：1的重链可变区氨基酸序列和SEQ ID NO：2的轻链可变区氨基酸序列，其中SEQ ID NO：1的可变区氨基酸残基27、32、52、53、97、101和102及SEQ ID NO：2的可变区氨基酸残基35、51和90-101的一个或多个独立地被不同的氨基酸残基取代。
在一种实施方式中，SEQ ID NO：1的可变区氨基酸残基27、32和102的一个或多个独立地被芳香族残基取代。
在一种实施方式中，SEQ ID NO：1的可变区氨基酸残基97及SEQ ID NO：2的可变区氨基酸残基35和92的一个或多个独立地被选自Lys、Arg、Tyr、Asn和Gln的氨基酸残基取代。
在一种实施方式中，SEQ ID NO：2的可变区氨基酸残基92和97的一个或多个独立地被芳香族残基取代。
在一种实施方式中，SEQ ID NO：1的可变区氨基酸残基101和SEQ ID NO：2的可变区氨基酸残基51的一个或多个独立地被选自Tyr、Ser、Thr、Asn和Gln的氨基酸残基取代。
在一种实施方式中，SEQ ID NO：2的可变区氨基酸残基91被Gln之外的任何氨基酸残基取代。
在一种实施方式中，SEQ ID NO：2的可变区氨基酸残基95被不同的芳香族氨基酸残基取代。
在一种实施方式中，SEQ ID NO：2的可变区氨基酸残基97被选自Phe、Tyr、Trp、His、Asp、Glu、Asn和Gln的氨基酸残基取代。
在一种实施方式中，SEQ ID NO：2的可变区氨基酸残基90-101的一个或多个独立地被至少一个或多个不同的氨基酸取代，并且其中抗体的CDRL3的长度大于或等于12个氨基酸残基。
在一种实施方式中，所述分离的抗体具有一个或多个下述取代：(a)SEQ ID NO：2的可变区氨基酸残基90-101的一个或多个独立地被至少一个或多个不同的氨基酸取代，并且其中抗体的CDRL3的长度大于或等于12个氨基酸残基；(b)SEQ ID NO：2的可变区氨基酸残基91被Gln之外的任何氨基酸残基取代；(c)SEQ ID NO：2的可变区氨基酸残基95被不同的芳香族氨基酸残基取代；或者(d)SEQ ID NO：2的可变区氨基酸残基97被选自Phe、Tyr、Trp、His、Asp、Glu、Asn和Gln的氨基酸残基取代。
在一种实施方式中，SEQ ID NO：1的可变区氨基酸残基52和53的一个或多个独立地被选自Tyr、Ser、Thr、Asn、Gln、Lys和Arg的氨基酸残基取代。
另一方面，本发明提供了结合IL-12和/或IL-23的p40亚基的分离的抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体包含SEQ ID NO：1的重链可变区氨基酸序列和SEQ ID NO：2的轻链可变区氨基酸序列，其中SEQ ID NO：1的可变区氨基酸残基33、50、57和99及SEQ ID NO：2的可变区氨基酸残基33的一个或多个独立地被不同的氨基酸残基取代。
在一种实施方式中，SEQ ID NO：1的可变区氨基酸残基33被选自Phe、Tyr、Trp、His、Met、Val、Leu、Ile、Pro、Ala、Ser、Thr、Asn、Gln、Arg和Lys的氨基酸残基取代。在一种实施方式中，SEQID NO：1的可变区氨基酸残基33被Lys取代。
在一种实施方式中，SEQ ID NO：1的可变区氨基酸残基50被选自Phe、Tyr、Trp、His、Met、Gln、Arg和Lys的氨基酸残基取代。在一种实施方式中，SEQ ID NO：1的可变区氨基酸残基50被Tyr或Trp取代。
在一种实施方式中，SEQ ID NO：1的可变区氨基酸残基57被选自Phe、Tyr、Trp、His、Met、Val、Leu、Ile、Pro、Ala、Ser、Thr、Asp、Glu、Asn和Gln的氨基酸残基取代。在一种实施方式中，SEQID NO：1的可变区氨基酸残基57被Ile或Trp取代。在一种实施方式中，SEQ ID NO：1的可变区氨基酸残基57被Ser或Thr取代。
在一种实施方式中，SEQ ID NO：1的可变区氨基酸残基99被选自Phe、Tyr、Trp、His、Met、Arg和Lys的氨基酸残基取代。在一种实施方式中，SEQ ID NO：1的可变区氨基酸残基99被Tyr或Trp取代。
在一种实施方式中，SEQ ID NO：2的可变区氨基酸残基33被选自Phe、Tyr、Trp、His、Gln和Lys的氨基酸残基取代。在一种实施方式中，SEQ ID NO：2的可变区氨基酸残基33被Tyr或Trp取代。
在一种实施方式中，所述分离的抗体或其抗原结合部分不是抗体J695或Y61。
另一方面，本发明提供了与任何上述抗体竞争结合的分离的抗体或其抗原结合部分。
再另一方面，本发明提供了用于改变结合IL-12和/或IL-23的p40亚基的分离的抗体或其抗原结合部分的活性的方法，其中所述抗体或其抗原结合部分包含SEQ ID NO：1的重链可变区氨基酸序列和SEQ ID NO：2的轻链可变区氨基酸序列，所述方法包括用不同的氨基酸残基独立地取代SEQ ID NO：1的可变区氨基酸残基27、32、52、53、97、101和102以及SEQ ID NO：2的氨基酸残基35、51和90-101的一个或多个，由此改变结合IL-12和/或IL-23的p40亚基的抗体或其抗原结合部分的活性。
在一种实施方式中，SEQ ID NO：1的可变区氨基酸残基27、32和102的一个或多个独立地被芳香族残基取代。
在一种实施方式中，SEQ ID NO：1的可变区氨基酸残基97及SEQ ID NO：2的可变区氨基酸残基35和92的一个或多个独立地被选自Lys、Arg、Tyr、Asn和Gln的氨基酸残基取代。
在一种实施方式中，SEQ ID NO：2的可变区氨基酸残基92和97的一个或多个独立地被芳香族氨基酸残基取代。
在一种实施方式中，SEQ ID NO：1的可变区氨基酸残基101和SEQ ID NO：2的可变区氨基酸残基51的一个或多个独立地被选自Tyr、Ser、Thr、Asn和Gln的氨基酸残基取代。
在一种实施方式中，SEQ ID NO：2的可变区氨基酸残基91被Gln之外的任何氨基酸残基取代。
在一种实施方式中，SEQ ID NO：2的可变区氨基酸残基95被不同的芳香族氨基酸残基取代。
在一种实施方式中，SEQ ID NO：2的可变区氨基酸残基97被选自Phe、Tyr、Trp、His、Asp、Glu、Asn和Gln的氨基酸残基取代。
在一种实施方式中，SEQ ID NO：2的可变区氨基酸残基90-101的一个或多个独立地被至少一个或多个不同的氨基酸取代，并且其中抗体的CDRL3的长度大于或等于12个氨基酸残基。
在一种实施方式中，所述分离的抗体或其抗原结合部分具有一个或多个下述取代：(a)SEQ ID NO：2的可变区氨基酸残基90-101的一个或多个独立地被至少一个或多个不同的氨基酸取代，并且其中抗体的CDRL3的长度大于或等于12个氨基酸残基；(b)SEQ IDNO：2的可变区氨基酸残基91被Gln之外的任何氨基酸残基取代；(c)SEQ ID NO：2的可变区氨基酸残基95被不同的芳香族氨基酸残基取代；或者(d)SEQ ID NO：2的可变区氨基酸残基97被选自Phe、Tyr、Trp、His、Asp、Glu、Asn和Gln的氨基酸残基取代。
在一种实施方式中，SEQ ID NO：1的可变区氨基酸残基52和53位的一个或多个独立地被选自Tyr、Ser、Thr、Asn、Gln、Lys和Arg的氨基酸残基取代。
在一种实施方式中，本发明的分离的抗体或其抗原结合部分还结合US 2009/0202549中所描述的一个或多个表位，所述专利申请的全部公开内容在此引入。
另一方面，本发明提供了用于改变结合IL-12和/或IL-23的p40亚基的分离的抗体或其抗原结合部分的活性的方法，其中所述抗体或其抗原结合部分包含SEQ ID NO：1的重链可变区氨基酸序列和SEQ ID NO：2的轻链可变区氨基酸序列，所述方法包括用不同的氨基酸残基独立地取代SEQ ID NO：1的可变区氨基酸残基33、50、57和99以及SEQ ID NO：2的可变区氨基酸残基33的一个或多个，由此改变结合IL-12和/或IL-23的p40亚基的抗体或其抗原结合部分的活性。
在一种实施方式中，SEQ ID NO：1的可变区氨基酸残基33被选自Phe、Tyr、Trp、His、Met、Val、Leu、Ile、Pro、Ala、Ser、Thr、Asn、Gln、Arg和Lys的氨基酸残基取代。在一种实施方式中，SEQID NO：1的可变区氨基酸残基33被Lys取代。
在一种实施方式中，SEQ ID NO：1的可变区氨基酸残基50被选自Phe、Tyr、Trp、His、Met、Gln、Arg和Lys的氨基酸残基取代。在一种实施方式中，SEQ ID NO：1的可变区氨基酸残基50被Tyr或Trp取代。
在一种实施方式中，SEQ ID NO：1的可变区氨基酸残基57被选自Phe、Tyr、Trp、His、Met、Val、Leu、Ile、Pro、Ala、Ser、Thr、Asp、Glu、Asn和Gln的氨基酸残基取代。在一种实施方式中，SEQID NO：1的可变区氨基酸残基57被Ile或Trp取代。在一种实施方式中，SEQ ID NO：1的可变区氨基酸残基57被Ser或Thr取代。
在一种实施方式中，SEQ ID NO：1的可变区氨基酸残基99被选自Phe、Tyr、Trp、His、Met、Arg和Lys的氨基酸残基取代。在一种实施方式中，SEQ ID NO：1的可变区氨基酸残基99被Tyr或Trp取代。
在一种实施方式中，SEQ ID NO：2的可变区氨基酸残基33被选自Phe、Tyr、Trp、His、Gln和Lys的氨基酸残基取代。在一种实施方式中，SEQ ID NO：2的可变区氨基酸残基33被Tyr或Trp取代。
在另一种实施方式中，本发明提供了按照本发明的方法产生的分离的抗体或其抗原结合部分。
再进一步的方面，本发明提供了结合IL-12和/或IL-23的p40亚基的分离的抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体结合在构象表位的
Figure BPA00001751564500151
之内，所述构象表位包含选自SEQ ID NO：3的氨基酸序列的氨基酸残基16、87和93的至少一个氨基酸残基。在一种实施方式中，所述分离的抗体或其抗原结合部分结合氨基酸残基16。
在一种实施方式中，所述分离的抗体或其抗原结合部分以1x10-3M-1或以下的Koff或者1x10-10M或以下的Kd结合IL-12和/或IL-23的p40亚基。
在一种实施方式中，所述分离的抗体或其抗原结合部分中和IL-12和/或IL-23的p40亚基的生物活性。
另一方面，本发明提供了药物组合物，其包含本发明的分离的抗体或其抗原结合部分以及药学上可接受的载体或赋形剂。在一种实施方式中，所述药物组合物还包括至少一种另外的生物活性药剂。
另一方面，本发明提供了分离的核酸，其编码本发明的抗体或其抗原结合部分。
另一方面，本发明提供了分离的核酸载体，其包含与至少一个转录调控核酸序列可操作地连接的本发明的核酸。
再另一方面，本发明提供了宿主细胞，其包含本发明的核酸载体。在一种实施方式中，所述宿主细胞是真核宿主细胞或原核宿主细胞。
又另一方面，本发明提供了用于诊断受试者中至少一种IL-12和/或IL-23相关病症的方法。所述方法包括将来自所述受试者的生物样品与本发明的分离的抗体或其抗原结合部分相接触，并测量样品中存在的IL-12和/或IL-23的p40亚基的量，其中与正常或对照相比，检测到样品中IL-12和/或IL-23的p40亚基的水平升高或降低指示IL-12和/或IL-23相关病症的存在或不存在，由此诊断所述受试者中的至少一种IL-12和/或IL-23相关病症。
在一种实施方式中，所述分离的抗体或其抗原结合部分含有可检测标记或通过具有可检测标记的第二分子检测。
另一方面，本发明提供了用于鉴别调节生物样品中IL-12和/或IL-23的表达、水平和/或活性中的至少一种的药剂的方法。所述方法包括将所述样品与本发明的分离的抗体抗体或其抗原结合部分相接触，并检测样品中IL-12和/或IL-23的表达、水平和/或活性，其中与未处理样品相比，IL-12和/或IL-23的表达、水平和/或活性中的至少一种的增加或降低指示能够调节IL-12和/或IL-23的表达、水平和/或活性中的至少一种的药剂，由此鉴别调节样品中IL-12和/或IL-23的表达、水平和/或活性中的至少一种的药剂。
在一种实施方式中，所述分离的抗体或其抗原结合部分含有可检测标记或可以通过具有可检测标记的第二分子检测。
在一种实施方式中，本发明提供了结合IL-12和/或IL-23的p40亚基的分离的抗体其抗原结合部分，其中所述抗体结合p40亚基的包含选自SEQ ID NO：3的氨基酸序列的残基1-197的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196或197个氨基酸残基或在所述氨基酸残基的
Figure BPA00001751564500171
之内的部分。在一种实施方式中，所述抗体或其抗原结合部分结合p40亚基的包含SEQ ID NO：3的残基1-197的部分。
在另一种实施方式中，本发明提供了分离的抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体结合p40亚基的包含选自SEQ ID NO：3的氨基酸序列的残基1-107的至少一个氨基酸残基或至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106或107个氨基酸残基或在所述氨基酸残基的
Figure BPA00001751564500172
之内的部分。在一种实施方式中，所述抗体或其抗原结合部分结合p40亚基的包含SEQ ID NO：3的氨基酸序列的残基1-107的部分。
在另一种实施方式中，本发明提供了分离的抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体结合p40亚基的包含p40亚基的环1-7的至少一个氨基酸残基或至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54或55个氨基酸残基或在所述氨基酸残基的之内的部分，其中所述至少一个氨基酸残基或至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54或55个氨基酸残基选自SEQID NO：3的氨基酸序列的残基14-23、58-60、84-107、124-129、157-164和194-197。在另一种实施方式中，所述抗体或其抗原结合部分结合p40亚基的包含SEQ ID NO：3的氨基酸序列的至少残基14-23、58-60、84-107、124-129、157-164和194-197的部分。在一种实施方式中，所述抗体或其抗原结合部分结合p40亚基的包含SEQ ID NO：3的氨基酸序列的残基14-23、58-60、84-107、124-129、157-164和194-197的部分。
在另一种实施方式中，本发明提供了分离的抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体结合p40亚基的包含选自残基14-23的环1的至少一个氨基酸残基或至少2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸残基或在所述氨基酸残基的
Figure BPA00001751564500181
之内的部分。在一种实施方式中，所述抗体或其抗原结合部分结合p40亚基的包含环1的残基14-23的部分。
在一种实施方式中，所述分离的抗体结合p40亚基的包含选自残基14-18的环1的至少一个氨基酸残基或至少2个、至少3个、至少4个或至少5个氨基酸残基或在所述氨基酸残基的
Figure BPA00001751564500182
之内的部分。在另一种实施方式中，所述抗体或其抗原结合部分结合p40亚基的包含环1的残基14-18的部分。
在另一种实施方式中，所述分离的抗体结合p40亚基的包含选自残基14-17的环1的至少一个氨基酸残基、至少2个、至少3个或至少4个氨基酸残基或在所述氨基酸残基的
Figure BPA00001751564500183
之内的部分。在另一种实施方式中，所述抗体或其抗原结合部分结合p40亚基的包含环1的残基14-17的部分。
在再另一种实施方式中，所述分离的抗体结合p40亚基的包含选自残基15-17的环1的至少一个氨基酸残基、至少2个或至少3个氨基酸残基或在所述氨基酸残基的
Figure BPA00001751564500184
之内的部分。在另一种实施方式中，所述抗体或其抗原结合部分结合p40亚基的包含环1的残基15-17的部分。
在另一种实施方式中，所述分离的抗体结合p40亚基的包含选自残基58-60的环2的至少一个氨基酸残基、至少2个氨基酸残基或至少3个氨基酸残基或在所述氨基酸残基的
Figure BPA00001751564500191
之内的部分。在另一种实施方式中，所述抗体或其抗原结合部分结合p40亚基的包含环2的残基58-60的部分。
在另一种实施方式中，所述分离的抗体或其抗原结合部分结合p40亚基的包含选自残基84-94的环3的至少一个氨基酸残基或至少2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸残基或在所述氨基酸残基的
Figure BPA00001751564500192
之内的部分。在另一种实施方式中，所述抗体或其抗原结合部分结合p40亚基的包含环3的残基84-94的部分。
在另一种实施方式中，所述分离的抗体或其抗原结合部分结合p40亚基的包含选自残基85-93的环3的至少一个氨基酸残基或至少2、3、4、5、6、7、8或9个氨基酸残基或在所述氨基酸残基的之内的部分。在另一种实施方式中，所述抗体或其抗原结合部分结合p40亚基的包含环3的残基85-93的部分。
在另一种实施方式中，所述分离的抗体或其抗原结合部分结合p40亚基的包含选自残基86-89和93的环3的至少一个氨基酸残基、至少2、3、4或5个氨基酸残基或在所述氨基酸残基的之内的部分。在另一种实施方式中，所述抗体或其抗原结合部分结合p40亚基的包含环3的残基86-89和93的部分。
在另一种实施方式中，所述分离的抗体结合p40亚基的包含选自残基86、87、89和93的环3的至少一个氨基酸残基、至少2、3或4个氨基酸残基或在所述氨基酸残基的之内的部分。在另一种实施方式中，所述抗体或其抗原结合部分结合p40亚基的包含环3的残基86、87、89和93的部分。
在再另一种实施方式中，所述分离的抗体结合p40亚基的包含环3的氨基酸残基87或在所述氨基酸残基的
Figure BPA00001751564500196
之内的部分。
在另一种实施方式中，所述分离的抗体或其抗原结合部分结合p40亚基的包含选自残基95-107的环4的至少一个氨基酸残基、至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或13个氨基酸残基或在所述氨基酸残基的
Figure BPA00001751564500201
之内的部分。在另一种实施方式中，所述抗体或其抗原结合部分结合p40亚基的包含环4的残基95-107的部分。
在另一种实施方式中，所述分离的抗体或其抗原结合部分结合p40亚基的包含选自残基102-104的环4的至少1、2或3个氨基酸残基或在所述氨基酸残基的
Figure BPA00001751564500202
之内的部分。在另一种实施方式中，所述抗体或其抗原结合部分结合p40亚基的包含环4的残基102-104的部分。
在另一种实施方式中，所述分离的抗体或其抗原结合部分结合p40亚基的包含选自残基124-129的环5的至少一个氨基酸残基或至少2、3、4、5或6个氨基酸残基或在所述氨基酸残基的之内的部分。在另一种实施方式中，所述抗体或其抗原结合部分结合p40亚基的包含环5的残基124-129的部分。
在另一种实施方式中，所述分离的抗体或其抗原结合部分结合p40亚基的包含选自残基157-164的环6的至少一个氨基酸残基或至少2、3、4、5、6、7或8个氨基酸残基或在所述氨基酸残基的
Figure BPA00001751564500204
之内的部分。在另一种实施方式中，所述抗体或其抗原结合部分结合p40亚基的包含环6的残基157-164的部分。
在另一种实施方式中，所述分离的抗体或其抗原结合部分结合p40亚基的包含选自残基194-197的环7的至少一个氨基酸残基酸残基或至少2、3或4个氨基酸残基或在所述氨基酸残基的之内的部分。在另一种实施方式中，所述抗体或其抗原结合部分结合p40亚基的包含环7的残基194-197的部分。
在另一种实施方式中，所述分离的抗体或其抗原结合部分结合p40亚基的包含选自残基14-23、58-60、84-94和95-107的环1-4的至少一个氨基酸残基或至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36或37个氨基酸残基或在所述氨基酸残基的
Figure BPA00001751564500206
之内的部分。在另一种实施方式中，所述抗体或其抗原结合部分结合p40亚基的包含环1-4的残基14-23、58-60、84-94和95-107的部分。
在另一种实施方式中，本发明提供了分离的抗体或其抗原结合部分，其结合p40亚基的包含选自残基14-18、85-93和102-104的环1-4的至少一个氨基酸残基或至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16或17个氨基酸残基或在所述氨基酸残基的
Figure BPA00001751564500211
之内的部分。在另一种实施方式中，所述抗体或其抗原结合部分结合p40亚基的包含环1-4的残基14-18、85-93和102-104的部分。
在另一种实施方式中，所述分离的抗体或抗原结合部分结合p40亚基的包含选自残基14-17、86-89、93和103-104的环1-4的至少一个氨基酸残基或至少2、3、4、5、6、7、8、9、10或11个氨基酸残基或在所述氨基酸残基的
Figure BPA00001751564500212
之内的部分。在另一种实施方式中，所述抗体或其抗原结合部分结合p40亚基的包含环1-4的残基14-17、86-89、93和103-104的部分。
在另一种实施方式中，所述分离的抗体或其抗原结合部分结合p40亚基的包含选自残基15-17、86-87、89、93和104的环1-4的至少一个氨基酸残基、至少2、3、4、5、6、7或8个氨基酸残基或在所述氨基酸残基的之内的部分。在另一种实施方式中，所述抗体或其抗原结合部分结合p40亚基的包含环1-4的残基15-17、86-87、89、93和104的部分。
在另一种实施方式中，所述分离的抗体或其抗原结合部分结合p40亚基的包含选自残基14-23和58-60的环1-2的至少一个氨基酸残基、至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或13个氨基酸残基或在所述氨基酸残基的
Figure BPA00001751564500214
之内的部分。在另一种实施方式中，所述抗体或其抗原结合部分结合p40亚基的包含环1-2的残基14-23和58-60的部分。
在另一种实施方式中，所述分离的抗体或其抗原结合部分结合p40亚基的包含选自残基15、17-21、23和58-60的环1-2的至少一个氨基酸残基或至少2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸残基或在所述氨基酸残基的
Figure BPA00001751564500221
之内的部分。在另一种实施方式中，所述抗体或其抗原结合部分结合p40亚基的包含环1-2的残基15、17-21、23和58-60的部分。
在另一种实施方式中，所述分离的抗体或其抗原结合部分结合p40亚基的包含选自残基14-23的环1的至少一个氨基酸残基或至少2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸残基及选自残基58-60的环2的至少一个氨基酸残基或至少2或3个氨基酸残基或在所述氨基酸残基的
Figure BPA00001751564500222
之内的部分。在另一种实施方式中，所述抗体或其抗原结合部分结合p40亚基的包含环1的残基14-23和环2的残基58-60的部分。
在另一种实施方式中，所述分离的抗体或其抗原结合部分结合p40亚基的包含选自残基14-23和84-94的环1和3的至少一个氨基酸残基或至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或21个氨基酸残基或在所述氨基酸残基的
Figure BPA00001751564500223
之内的部分。在另一种实施方式中，所述抗体或其抗原结合部分结合p40亚基的包含环1和3的残基14-23和84-94的部分。
在另一种实施方式中，所述分离的抗体或其抗原结合部分结合p40亚基的包含选自残基14-23的环1的至少一个氨基酸残基或至少2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸残基和选自残基84-94的环3的至少一个氨基酸残基或至少2、3、4、5、6、7、8、9、10或11个氨基酸残基或在所述氨基酸残基的
Figure BPA00001751564500224
之内的部分。在另一种实施方式中，所述抗体或其抗原结合部分结合p40亚基的包含环1的残基14-23和环3的残基84-94的部分。
在另一种实施方式中，所述分离的抗体或其抗原结合部分结合p40亚基的包含选自残基14-23和95-107的环1和4的至少一个氨基酸残基或至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22或23个氨基酸残基或在所述氨基酸残基的之内的部分。在另一种实施方式中，所述抗体或其抗原结合部分结合p40亚基的包含环1和4的残基14-23和95-107的部分。
在另一种实施方式中，所述分离的抗体或其抗原结合部分结合p40亚基的包含选自残基14-23的环1的至少一个氨基酸残基、至少2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸残基和选自残基95-107的环4的至少一个氨基酸残基或至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或13个氨基酸残基或在所述氨基酸残基的
Figure BPA00001751564500231
之内的部分。在另一种实施方式中，所述抗体或其抗原结合部分结合p40亚基的包含环2的残基14-23和环4的残基95-107的部分。
在另一种实施方式中，所述分离的抗体或其抗原结合部分结合p40亚基的包含选自残基84-94和95-107的环3和4的至少一个氨基酸残基或至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或24个氨基酸残基或在所述氨基酸残基的
Figure BPA00001751564500232
之内的部分。在另一种实施方式中，所述抗体或其抗原结合部分结合p40亚基的包含环3和4的残基84-94和95-107的部分。
在另一种实施方式中，所述分离的抗体或抗原结合部分结合p40亚基的包含选自残基84-94的环3的至少一个氨基酸残基或至少2、3、4、5、6、7、8、9、10或11个氨基酸残基和选自残基95-107的环4的至少一个氨基酸残基或至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或13个氨基酸残基或在所述氨基酸残基的之内的部分。在另一种实施方式中，所述抗体或其抗原结合部分结合p40亚基的包含环3的残基84-94和环4的残基95-107的部分。
在另一种实施方式中，本发明提供了分离的抗体或抗原结合部分，其与本文描述的任何抗体或其抗原结合部分竞争结合。
在一种实施方式中，所述分离的抗体或其抗原结合部分不是抗体Y61或J695。
在一种实施方式中，本发明提供了结合IL-12和/或IL-23的p40亚基的分离的抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体包含SEQ IDNO：1的重链可变区氨基酸序列和SEQ ID NO：2的轻链可变区氨基酸序列，其中SEQ ID NO：1的氨基酸残基27、32、52、53、97、101和102及SEQ ID NO：2的氨基酸残基35、51和90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100和101之外的任一可变区残基独立地被不同的氨基酸取代。在一种实施方式中，SEQ ID NO：1的氨基酸残基27、32、52、53、97、101和102和SEQ ID NO：2的氨基酸残基35、51和90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100和101位之外的至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50个或以上的可变区残基独立地被不同的氨基酸取代。
在另一种实施方式中，本发明提供了结合IL-12和/或IL-23的p40亚基的分离的抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体包含SEQID NO：1的重链可变区氨基酸序列和SEQ ID NO：2的轻链可变区氨基酸序列，其中SEQ ID NO：1的可变区氨基酸残基27、32、52、53、97、101和102及SEQ ID NO：2的可变区氨基酸残基35、51和90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100和101的一个或多个独立地被不同的氨基酸取代。在另一种实施方式中，SEQ ID NO：1的可变区氨基酸残基27、32、52、53、97、101和102及SEQ ID NO：2的可变区氨基酸残基35、51和90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100和101的至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或21个独立地被不同的氨基酸取代。在一种实施方式中，SEQ ID NO：1的可变区氨基酸残基27、32、52、53、97、101和102和SEQ ID NO：2的可变区氨基酸残基35、51和90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100和101的独立地被不同的氨基酸取代。
在一种实施方式中，SEQ ID NO：1的可变区氨基酸残基27、32和102的1、2或3个独立地被芳香族残基取代。在另一种实施方式中，SEQ ID NO：1的可变区氨基酸残基27、32和102独立地被芳香族残基取代。
在另一种实施方式中，SEQ ID NO：1的可变区氨基酸残基97及SEQ ID NO：2的可变区氨基酸残基35和92的1个、2个或3个独立地被选自Lys、Arg、Tyr、Asn和Gln的氨基酸残基取代。在另一种实施方式中，SEQ ID NO：1的可变区氨基酸残基97及SEQ ID NO：2的可变区氨基酸残基35和92独立地被选自Lys、Arg、Tyr、Asn和Gln的氨基酸残基取代。
在另一种实施方式中，SEQ ID NO：2的可变区氨基酸残基92和97的一个或两个独立地被芳香族氨基酸残基取代。在另一种实施方式中，SEQ ID NO：2的可变区氨基酸残基92和97独立地被芳香族氨基酸残基取代。
在另一种实施方式中，SEQ ID NO：1的可变区氨基酸残基101和SEQ ID NO：2的可变区氨基酸残基51的一个或两个独立地被选自Tyr、Ser、Thr、Asn和Gln的氨基酸残基取代。在另一种实施方式中，SEQ ID NO：1的可变区氨基酸残基101和SEQ ID NO：2的可变区氨基酸残基51独立地被选自Tyr、Ser、Thr、Asn和Gln的氨基酸残基取代。
在另一种实施方式中，SEQ ID NO：2的可变区氨基酸残基91被Gln之外的任何氨基酸残基取代。在再另一种实施方式中，SEQ IDNO：2的可变区氨基酸残基95被不同的芳香族氨基酸残基取代。在另一种实施方式中，SEQ ID NO：2的可变区氨基酸残基97被选自Phe、Tyr、Trp、His、Asp、Glu、Asn和Gln的氨基酸残基取代。
在另一种实施方式中，SEQ ID NO：2的可变区氨基酸残基90-101的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个独立地被至少一个或多个不同的氨基酸取代，并且其中抗体的CDRL3的长度大于或等于12个氨基酸残基。
在另一种实施方式中，所述抗体或其抗原结合部分具有一个或多个下述取代：(a)SEQ ID NO：2的可变区氨基酸残基90-101的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个独立地被至少一个或多个不同的氨基酸取代，并且其中抗体的CDRL3的长度大于或等于12个氨基酸残基；(b)SEQ ID NO：2的可变区氨基酸残基91被Gln之外的任何氨基酸残基取代；(c)SEQ ID NO：2的可变区氨基酸残基95被不同的芳香族氨基酸残基取代；或者(d)SEQ ID NO：2的可变区氨基酸残基97被选自Phe、Tyr、Trp、His、Asp、Glu、Asn和Gln的氨基酸残基取代。在另一种实施方式中，SEQ ID NO：2的可变区氨基酸残基90-101全部独立地被至少一个或多个不同的氨基酸取代，并且其中抗体的CDRL3的长度大于或等于12个氨基酸残基。
在另一种实施方式中，SEQ ID NO：1的可变区氨基酸残基52和53的一个或两个独立地被选自Tyr、Ser、Thr、Asn、Gln、Lys和Arg的氨基酸残基取代。在一种实施方式中，SEQ ID NO：1的可变区氨基酸残基52和53独立地被选自Tyr、Ser、Thr、Asn、Gln、Lys和Arg的氨基酸残基取代。
在另一种实施方式中，本发明提供了结合IL-12和/或IL-23的p40亚基的分离的抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体包含SEQID NO：1的重链可变区氨基酸序列和SEQ ID NO：2的轻链可变区氨基酸序列，其中SEQ ID NO：1的可变区氨基酸残基33、50、57和99及SEQ ID NO：2的可变区氨基酸残基33的1、2、3、4或5个独立地被不同的氨基酸残基取代。在另一种实施方式中，SEQ ID NO：1的可变区氨基酸残基33、50、57和99及SEQ ID NO：2的可变区氨基酸残基33独立地被不同的氨基酸残基取代。
在一种实施方式中，SEQ ID NO：1的可变区氨基酸残基33被选自Phe、Tyr、Trp、His、Met、Val、Leu、Ile、Pro、Ala、Ser、Thr、Asn、Gln、Arg和Lys的氨基酸残基取代。在另一种实施方式中，SEQ ID NO：1的可变区氨基酸残基50被选自Phe、Tyr、Trp、His、Met、Gln、Arg和Lys的氨基酸残基取代。在另一种实施方式中，SEQ ID NO：1的可变区氨基酸残基57被选自Phe、Tyr、Trp、His、Met、Val、Leu、Ile、Pro、Ala、Ser、Thr、Asp、Glu、Asn和Gln的氨基酸残基取代。在另一种实施方式中，SEQ ID NO：1的可变区氨基酸残基99被选自Phe、Tyr、Trp、His、Met、Arg和Lys的氨基酸残基取代。在另一种实施方式中，SEQ ID NO：2的可变区氨基酸残基33被选自Phe、Tyr、Trp、His、Gln和Lys的氨基酸残基取代。
在另一种实施方式中，SEQ ID NO：1的可变区氨基酸残基33被Lys取代。在另一种实施方式中，SEQ ID NO：1的可变区氨基酸残基50被Tyr或Trp取代。在另一种实施方式中，SEQ ID NO：1的可变区氨基酸残基57被Ile或Trp取代。在另一种实施方式中，SEQ IDNO：1的可变区氨基酸残基57被Ser或Thr取代。在另一种实施方式中，SEQ ID NO：1的可变区氨基酸残基99被Tyr或Trp取代。在另一种实施方式中，SEQ ID NO：2的可变区氨基酸残基33被Tyr或Trp取代。
在一种实施方式中，所述分离的抗体或抗原结合部分不是抗体J695或Y61。
在另一种实施方式中，本发明提供了分离的抗体或其抗原结合部分，其与本文公开的任何抗体或其抗原结合部分竞争结合。
在一种实施方式中，本发明提供了用于改变结合IL-12和/或IL-23的p40亚基的抗体或其抗原结合部分的活性的方法，其中所述抗体或其抗原结合部分包含SEQ ID NO：1的重链可变区氨基酸序列和SEQ ID NO：2的轻链可变区氨基酸序列，所述方法包括用不同的氨基酸残基独立地取代SEQ ID NO：1的可变区氨基酸残基27、32、52、53、97、101和102以及SEQ ID NO：2的可变区氨基酸残基35、51和90-101的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或21个，由此改变结合IL-12和/或IL-23的p40亚基的抗体或其抗原结合部分的活性。在一种实施方式中，用不同的氨基酸残基取代SEQ ID NO：1的可变区氨基酸残基27、32、52、53、97、101和102以及SEQ ID NO：2的可变区氨基酸残基35、51和90-101，由此改变结合IL-12和/或IL-23的p40亚基的抗体或其抗原结合部分的活性。
在一种实施方式中，SEQ ID NO：1的可变区氨基酸残基27、32和102的1、2或3个独立地被芳香族残基取代。在另一种实施方式中，SEQ ID NO：1的可变区氨基酸残基27、32和102独立地被芳香族残基取代。在另一种实施方式中，SEQ ID NO：1的可变区氨基酸残基97和SEQ ID NO：2的可变区氨基酸残基35和92的一个或两个独立地被选自Lys、Arg、Tyr、Asn和Gln的氨基酸残基取代。在另一种实施方式中，SEQ ID NO：1的可变区氨基酸残基97和SEQID NO：2的可变区氨基酸残基35和92独立地被选自Lys、Arg、Tyr、Asn和Gln的氨基酸残基取代。在另一种实施方式中，SEQ ID NO：2的可变区氨基酸残基92和97的一个或两个独立地被芳香族残基取代。在另一种实施方式中，SEQ ID NO：2的可变区氨基酸残基92和97独立地被芳香族残基取代。在另一种实施方式中，SEQ ID NO：1的可变区氨基酸残基101和SEQ ID NO：2的可变区氨基酸残基51的一个或两个独立地被选自Tyr、Ser、Thr、Asn和Gln的氨基酸残基取代。在另一种实施方式中，SEQ ID NO：1的可变区氨基酸残基101和SEQ ID NO：2的可变区氨基酸残基51独立地被选自Tyr、Ser、Thr、Asn和Gln的氨基酸残基取代。
在另一种实施方式中，SEQ ID NO：2的可变区氨基酸残基91被Gln之外的任何氨基酸残基取代。在另一种实施方式中，SEQ ID NO：2的可变区氨基酸残基95被不同的芳香族氨基酸残基取代。在另一种实施方式中，SEQ ID NO：2的可变区氨基酸残基97被选自Phe、Tyr、Trp、His、Asp、Glu、Asn和Gln的氨基酸残基取代。在另一种实施方式中，SEQ ID NO：2的可变区氨基酸残基90-101的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个独立地被至少一个或多个不同的氨基酸取代，并且其中抗体的CDRL3的长度大于或等于12个氨基酸残基。在另一种实施方式中，SEQ ID NO：2的可变区氨基酸残基90-101独立地被至少一个或多个不同的氨基酸取代，并且其中抗体的CDRL3的长度大于或等于12个氨基酸残基。
在一种实施方式中，所述抗体或其抗原结合部分具有一个或多个下述取代：(a)SEQ ID NO：2的可变区氨基酸残基90-101的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个独立地被至少一个或多个不同的氨基酸取代，并且其中抗体的CDRL3的长度大于或等于12个氨基酸残基；(b)SEQ ID NO：2的可变区氨基酸残基91被Gln之外的任何氨基酸残基取代；(c)SEQ ID NO：2的可变区氨基酸残基95被不同的芳香族氨基酸残基取代；或者(d)SEQ ID NO：2的可变区氨基酸残基97被选自Phe、Tyr、Trp、His、Asp、Glu、Asn和Gln的氨基酸残基取代。在另一种实施方式中，SEQ ID NO：2的可变区氨基酸残基90-101独立地被至少一个或多个不同的氨基酸取代，并且其中抗体的CDRL3的长度大于或等于12个氨基酸残基。
在另一种实施方式中，SEQ ID NO：1的可变区氨基酸残基52和53的至少一个或两个独立地被选自Tyr、Ser、Thr、Asn、Gln、Lys和Arg的氨基酸残基取代。在另一种实施方式中，SEQ ID NO：1的可变区氨基酸残基52和53独立地被选自Tyr、Ser、Thr、Asn、Gln、Lys和Arg的氨基酸残基取代。
在另一种实施方式中，本发明提供了用于改变结合IL-12和/或IL-23的p40亚基的抗体或其抗原结合部分的活性的方法，其中所述抗体或其抗原结合部分包含SEQ ID NO：1的重链可变区氨基酸序列和SEQ ID NO：2的轻链可变区氨基酸序列，所述方法包括用不同的氨基酸残基独立地取代SEQ ID NO：1的可变区氨基酸残基33、50、57和99以及SEQ ID NO：2的可变区氨基酸残基33的至少1、2、3、4或5个，由此改变结合IL-12和/或IL-23的p40亚基的抗体或其抗原结合部分的活性。在一种实施方式中，用不同的氨基酸残基取代SEQ ID NO：1的可变区氨基酸残基33、50、57和99以及SEQ ID NO：2的可变区氨基酸残基33，由此改变结合IL-12和/或IL-23的p40亚基的抗体或其抗原结合部分的活性。
在一种实施方式中，SEQ ID NO：1的可变区氨基酸残基33被选自Phe、Tyr、Trp、His、Met、Val、Leu、Ile、Pro、Ala、Ser、Thr、Asn、Gln、Arg和Lys的氨基酸残基取代。在另一种实施方式中，SEQ ID NO：1的可变区氨基酸残基50被选自Phe、Tyr、Trp、His、Met、Gln、Arg和Lys的氨基酸残基取代。在另一种实施方式中，SEQ ID NO：1的可变区氨基酸残基57被选自Phe、Tyr、Trp、His、Met、Val、Leu、Ile、Pro、Ala、Ser、Thr、Asp、Glu、Asn和Gln的氨基酸残基取代。在另一种实施方式中，SEQ ID NO：1的可变区氨基酸残基99被选自Phe、Tyr、Trp、His、Met、Arg和Lys的氨基酸残基取代。在另一种实施方式中，SEQ ID NO：2的可变区氨基酸残基33被选自Phe、Tyr、Trp、His、Gln和Lys的氨基酸残基取代。
在一种实施方式中，SEQ ID NO：1的可变区氨基酸残基33被Lys取代。在另一种实施方式中，SEQ ID NO：1的可变区氨基酸残基50被Tyr或Trp取代。在另一种实施方式中，SEQ ID NO：1的可变区氨基酸残基57被Ile或Trp取代。在另一种实施方式中，SEQ IDNO：1的可变区氨基酸残基57被Ser或Thr取代。在另一种实施方式中，SEQ ID NO：1的可变区氨基酸残基99被Tyr或Trp取代。在另一种实施方式中，SEQ ID NO：2的可变区氨基酸残基33被Tyr或Trp取代。
在一种实施方式中，本发明提供了按照本文公开的方法产生的分离的抗体或其抗原结合部分。
在另一种实施方式中，本发明提供了结合IL-12和/或IL-23的p40亚基的分离的抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体结合包含选自SEQ ID NO：3的氨基酸序列的氨基酸残基的16、87和93的至少一个氨基酸残基或至少2或3个氨基酸残基或在所述氨基酸残基的
Figure BPA00001751564500301
之内的构象表位。在一种实施方式中，所述或其抗原结合部分结合氨基酸残基16。在一种实施方式中，所述或其抗原结合部分结合SEQ ID NO：3的氨基酸残基16、87和93。
在另一种实施方式中，所述分离的抗体或其抗原结合部分以1x10-3M-1或以下的Koff或者1x10-10M或以下的Kd结合IL-12和/或IL-23的p40亚基。
在另一种实施方式中，所述分离的抗体或其抗原结合部分中和IL-12和/或IL-23的p40亚基的生物活性。
在一种实施方式中，本发明的抗体或其抗原结合部分不包括在本发明之前的现有技术中已知的结合本文中所述的表位的任何抗体。例如，在一种实施方式中，所述抗体或其抗原结合部分不是美国专利公开号2009/0202549中所描述的抗体，所述专利公开的全部内容在此明确引为参考。在另一种实施方式中，所述抗体或其抗原结合部分不是美国专利号6,902,734或美国专利号7,166,285中所描述的抗体，所述各个专利的全部内容在此明确引为参考。在另一种实施方式中，所述抗体或其抗原结合部分不是在美国专利号6,902,764或美国专利号7,166,285中所描述的抗体C340，所述专利的全部内容在此明确引为参考。
另一方面，本发明提供了用于在患有其中IL-12和/或IL-23的活性有害的障碍的受试者中抑制IL-12和/或IL-23的活性的方法，所述方法包括向所述受试者施用本发明的抗体或其抗原结合部分，以便抑制所述受试者中IL-12和/或IL-23的活性。在一种实施方式中，向所述受试者施用有效量的所述抗体。
在相关方面中，本发明提供了用于治疗患有其中IL-12和/或IL-23的活性有害的障碍的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用本发明的抗体或其抗原结合部分，由此治疗所述受试者。在一种实施方式中，向所述受试者施用有效量的所述抗体。
另一方面，本发明提供了本发明的抗体或其抗原结合部分在治疗中的用途。另一方面，本发明提供了本发明的抗体或其抗原结合部分治疗其中IL-12和/或IL-23的活性有害的障碍中的用途。另一方面，本发明提供了本发明的抗体或其抗原结合部分在制备用于治疗其中IL-12和/或IL-23的活性有害的障碍的药物中的用途。另一方面，本发明提供了本发明的抗体或其抗原结合部分用于抑制患有其中IL-12和/或IL-23的活性有害的障碍的受试者中IL-12和/或IL-23的活性的用途。另一方面，本发明提供了本发明的抗体或其抗原结合部分在制备用于抑制患有其中IL-12和/或IL-23的活性有害的障碍的受试者中IL-12和/或IL-23的活性的药物中的用途。
在一种实施方式中，其中IL-12和/或IL-23的活性有害的障碍是选自银屑病、类风湿性关节炎、克罗恩病、多发性硬化症和银屑病性关节炎的障碍。在一种实施方式中，其中IL-12和/或IL-23的活性有害的障碍是银屑病。在一种实施方式中，其中IL-12和/或IL-23的活性有害的障碍是类风湿性关节炎。在一种实施方式中，其中IL-12和/或IL-23的活性有害的障碍是克罗恩病。在一种实施方式中，其中IL-12和/或IL-23的活性有害的障碍是多发性硬化症。在一种实施方式中，其中IL-12和/或IL-23的活性有害的障碍是银屑病性关节炎。
在一种实施方式中，其中IL-12和/或IL-23的活性有害的障碍是选自肉样瘤病、掌跖脓疱性银屑病和掌跖脓疱病、严重掌跖银屑病、活动期强直性脊柱炎和原发性胆汁性肝硬化。在一种实施方式中，其中IL-12和/或IL-23的活性有害的障碍是肉样瘤病。在一种实施方式中，其中IL-12和/或IL-23的活性有害的障碍是掌跖脓疱性银屑病。在一种实施方式中，其中IL-12和/或IL-23的活性有害的障碍是掌跖脓疱病。在一种实施方式中，其中IL-12和/或IL-23的活性有害的障碍是严重掌跖银屑病。在一种实施方式中，其中IL-12和/或IL-23的活性有害的障碍是脊柱炎。在一种实施方式中，其中IL-12和/或IL-23的活性有害的障碍是原发性胆汁性肝硬化。
在一种实施方式中，其中IL-12和/或IL-23的活性有害的障碍是自身免疫疾病。在一种实施方式中，所述自身免疫疾病伴有炎症，包括但不限于类风湿性脊柱炎、过敏症、自身免疫性糖尿病、自身免疫性葡萄膜炎。
在一种实施方式中，其中IL-12和/或IL-23的活性有害的障碍是选自下列的障碍：类风湿性关节炎、骨关节炎、幼年慢性关节炎、莱姆关节炎、银屑病性关节炎、反应性关节炎、脊椎关节病、系统性红斑狼疮、克罗恩病、溃疡性结肠炎、炎性肠病、胰岛素依赖性糖尿病、甲状腺炎、哮喘、过敏性疾病、银屑病、皮炎硬皮病、特应性皮炎、移植物抗宿主病、器官移植排斥、与器官移植相关的急性或慢性免疫疾病、肉样瘤病、动脉粥样硬化、播散性血管内凝血、川畸病、Grave′s病、肾病综合征、慢性疲劳综合征、韦格纳肉芽肿、Henoch-Schoenlein紫癜、肾微小性血管炎、慢性活动性肝炎、葡萄膜炎、脓毒性休克、中毒休克综合征、脓毒症综合征、恶病质、传染病、寄生虫病、获得性免疫缺陷综合征、急性横向骨髓炎、亨廷顿舞蹈病、帕金森氏病、阿尔兹海默氏病、中风、原发性胆汁性肝硬化、溶血性贫血、恶性肿瘤、心力衰竭、心肌梗塞、阿狄森氏病、散发性I型多腺缺乏和II型多腺缺乏、Schmidt′s综合征、成人(急性)呼吸窘迫综合征、脱发、斑形脱发、血清反应阴性关节病、关节病、Reiter′s病、银屑病性关节病、溃疡性结肠关节病、肠病性滑膜炎、衣原体、耶尔森氏菌和沙门氏菌相关关节病、脊椎关节病、动脉粥样化疾病/动脉硬化、特应性过敏症、自身免疫性大疱病、寻常性天疱疮、落叶性天疱疮、类天疱疮、线性IgA病、自身免疫性溶血性贫血、Coombs阳性溶血性贫血、获得性恶性贫血、青少年恶性贫血、肌痛性大脑炎/Royal Free病、慢性粘膜皮肤念珠菌病、巨细胞关节炎、原发性硬化性肝炎、起因不明自身免疫性肝炎、获得性免疫缺陷病综合征、获得性免疫缺陷相关疾病、丙型肝炎、常见的各种免疫缺陷(常见的各种血丙种球蛋白减少症)、膨胀心肌病、女性不孕症、卵巢衰竭、卵巢功能早衰、纤维变性肺病、起因不明的纤维组织形成牙槽炎、炎症后间质性肺病、间质性肺炎、与间质性肺病相关的结缔组织疾病、与肺病相关的混合结缔组织疾病、与间质性肺病相关的系统性硬化、与间质性肺病相关的类风湿性关节炎、与肺病相关的系统性红斑狼疮、与肺病相关的皮肤肌炎/多肌炎、与肺病相关的Sjogren′s病、与肺病相关的强直性脊柱炎、血管炎弥散肺病、与肺病相关的含铁血黄素沉着病、药物诱导的间质性肺病、辐射纤维化、闭塞性细支气管炎、慢性嗜酸性肺炎、淋巴细胞浸润性肺病、传染病后间质性肺病、痛风性关节炎、自身免疫性肝炎、1型自身免疫性肝炎(典型自身免疫性或狼疮样肝炎)、2型自身免疫性肝炎(抗-LKM抗体肝炎)、自身免疫介导的低血糖、具有黑色棘皮症的B型胰岛素抵抗、甲状旁腺机能减退、与器官移植相关的急性免疫疾病、与器官移植相关的慢性免疫疾病、骨关节炎、原发性硬化性胆管炎、特发性白细胞减少、自身免疫中性白细胞减少、肾病NOS、肾小球肾炎、肾微小性血管炎、莱姆病、盘形红斑狼疮、特发性男性不孕症或NOS、精液自身免疫、多发性硬化症(所有亚型)、胰岛素依赖型糖尿病、交感神经眼炎、结缔组织疾病继发性高血压、Goodpasture′s综合征、结节性多动脉炎的肺表现、急性风湿热、类风湿性脊柱炎、Still′s病、系统性硬化症、Takayasu′s病/动脉炎、自身免疫性血小板减少、特发性血小板减少、自身免疫性甲状腺病、甲状腺机能亢进、甲状腺肿性自身免疫性甲状腺机能减退(Hashimoto′s病)、萎缩性自身免疫性甲状腺机能减退、原发性粘液水肿、晶状体原性葡萄膜炎、原发性血管炎和白癫风。
附图简述
本专利或申请文件含有至少一张彩图。本专利或专利申请公开的带有彩图的拷贝在提出要求并付出必需费用后由专利局提供。
图1示出了结合人类IL-12p40的人抗体J695的重链和轻链可变区氨基酸序列。使用Kabat编号确定氨基酸位置。
图2示出了J695和所选的前体抗体的CDR序列和功能特征。
图3示出了J695 CDR L3的使磷酸根离子能够配合在结合位点中心处的独特发夹构象。示出了含有顺式His-L95A-Pro0L95B肽键和所选的其他残基的J695的CDR L3(Fab晶型I)，以及紧密结合的水分子(红色球体)和磷酸根离子(橙色/红色)。氢键显示为灰色线。
图4示出了采取非正则构象的J695 CDR L3。将J695 CDR L3(Fab晶型I)与来自于正规类1的代表性结构的CDR L3(AI-Lazikani，Lesk等，1997)(4-4-20 Fab，pdb entry 1flr(Whitlow，Howard等，1995))叠加。在J695中CDR L3更加延伸并具有以Pro-L95B为中心的凸起，两者都改变保守的脯氨酸残基的位置。
图5示出了J695抗原结合位点(Fab晶型II)的表面特征图，其表明J695和IL-12 p40具有带互补电荷的表面，特别是示出了J695结合位点的高度电正性的结合裂隙。按照静电表面电位对溶剂可接近表面着色(蓝色、白色、红色：+15、0、-15kT/e)。左手的视图来自于抗原结合位点侧，右手的视图来自于正上方。插入图：Fab晶型I。
图6示出了IL-12 p70的表面特征图，表明它的高电负性表面斑片。静电标度和着色为：蓝色、白色、红色：分别为+15、0、-15kT/e；p35亚基着色为浅绿色。IL-12 p40的N-末端在左边，C-末端在右边。说明书中讨论的抗体结合位点被突出显示。
图7示出了结合IL-12 p70的p40亚基的J695。在该图中，根据J695Fab/IL-12 p70复合物的晶体结构，将J695Fab轻链着色为浅蓝色，重链着色为深蓝色。各个CDR具有明显不同的颜色。IL-12 p40亚基为黄褐色，p35亚基为浅绿色。p40上与J695相互作用的主要环(大部分在结构域D1中)各自具有明显不同的颜色。
图8示出了在多个位点结合IL-12 p40的J695。在该图中，根据J695Fab/IL-12 p70复合物的晶体结构，J695 Fab着色为浅蓝色(轻链)和深蓝色(重链)；各个CDR具有明显不同的颜色。IL-12 p40亚基为黄褐色。标记了J695和IL-12 p40上的各个关键接触残基；标出了IL-12 p40的环1、3和4。
图9示出了J695结合位点的表面特征图。在该图中，根据J695Fab/IL-12 p70复合物的晶体结构，各个CDR差别地着色。视图来自于结合的IL-12 p40的位置。IL-12 p40的残基Asp87(侧链原子示出为球体)深深插入到由CDR L1、L2、L3和H3形成的口袋中。
图10是晶体结构，其描绘了在J695与IL-12 p40之间的结合位点处存在大的间隙。(顶图)从侧面(从图9旋转-90°)观察的J695表面。注意到深的裂隙。(底图)p40的结合在CDR H2和L3与p40的环3和4之间留下未填充的间隙(箭头)。
图11示出了通过嵌合体作图在IL-12 p40上确定的6个抗体结合位点。在p40亚基的这一部分序列比对中标明了二级结构元件和溶剂可接近性(根据(Yoon，C，S.C.Johnston等，2000“Chargedresidues dominate a unique interlocking topography in the heterodimericcytokine interleukin-12”)，The EMBO Journal 19(14)：3530-3521)；白色、蓝绿色和蓝色条：不可接近、部分可接近和完全可接近)。相同的残基加绿色框；同源和非保守残基为棕色和红色。食蟹猴的IL-12p40(未示出)与恒河猴的p40相同，具有附加的25个残基的C-末端延长。
图12示出了通过嵌合体作图在IL-12 p40上确定的6个抗体结合位点的位置。基于J695 Fab/IL-12 p70复合物的晶体结构的卡通特征图示出了IL-12 p40位点7-12的三维位置。p40和p35亚基为棕黄色和浅蓝色；p40 N-末端位于右侧，C-末端位于左侧。J695 Fv用蓝色阴影示出。
图13是示出了通过嵌合体作图在IL-12 p40上确定的6个抗体结合位点的位置的晶体结构。基于J695 Fab/IL-12 p70复合物的晶体结构的表面特征图示出了IL-12 p40位点7-12(图11)的三维位置。p40和p35亚基为棕黄色和浅蓝色；p40 N-末端位于右侧，C-末端位于左侧。J695 Fv(卡通)用蓝色阴影示出。插入图：背视图；可以看见位点7a、7b、8、9和11。
图14是示出了通过嵌合体作图确定的6个另外的IL-12 p40表位的位置的晶体结构。如图13中，基于J695 Fab/IL-12 p70复合物的晶体结构的表面特征图示出了表位2-5的近似位置。左侧：表位3.1、3.2和5。右侧：表位2、4a、4b和4c。
图15是示出了与通过嵌合体作图在IL-12 p40上所确定的抗体结合位点相邻的另外的抗体结合位点的位置的晶体结构。表面特征图基于J695 Fab/IL-12 p70复合物的晶体结构。与图13中的位点7-12一起，示出了IL-12 p40位点13-18的三维位置。插入图：背视图；可以看见位点13、14、15、16和17。
发明详述
本发明至少部分地是基于包含单独的和与IL-12 p70复合的抗IL-12/IL-23的p40亚基的抗体J695的抗原结合片段(Fab)的多肽的x-射线晶体学研究。得自于该研究的原子坐标可用于鉴定和设计结合含p40的细胞因子例如IL-12和IL-23的改进的抗体和其他抗体样结合分子(例如抗体片段、域抗体、adnectin、纳米抗体、unibodies、适体或亲合抗体)。如上所述，IL-23是异二聚体细胞因子，由二硫键连接的p40(与IL-12中存在的p40相同)和p19亚基构成。
本文提供的改进的抗体可用于患有由含p40的细胞因子的生物活性所调节或依赖于所述活性的病症的患者的治疗方法中，所述病症包括例如依赖于免疫系统的不适当或不需要的刺激的病症(多发性硬化症、银屑病、类风湿性关节炎、克罗恩病、红斑狼疮、慢性炎性疾病和移植手术后的移植物排斥)或癌症。
为了可以更容易地理解本发明，首先对某些术语进行定义。
I.定义
在本专利申请中使用了下列缩写和首字母缩略词。“Ab”是指抗体。“mAb”是指单克隆抗体，“Ig”是指免疫球蛋白。“Fab”是指抗体的抗原结合片段。“野生型”是指蛋白质的未改变的天然氨基酸序列。
当在本文中使用时，术语“白介素12”或“人白介素12”(在本文中缩写为IL-12或hIL-12)包括主要由巨噬细胞和树突细胞分泌的人类细胞因子。该术语包括异二聚体蛋白，其包含以二硫桥连接在一起的35kD亚基(p35)和40kD亚基(p40)。所述异二聚体蛋白被称为“p70亚基”。人IL-12的结构进一步描述在例如Kobayashi等，(1989)J.Exp Med.170：827-845；Seder等，(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.90：10188-10192；Ling等，(1995)J.Exp Med.154：116-127；Podlaski等，(1992)Arch.Biochem.Biophys.294：230-237中。术语人IL-12意图包括重组人IL-12(rh IL-12)，其可以通过标准的重组表达方法来制备。
白介素-12(IL-12)是由刺激针对细胞内病原体的细胞介导免疫的抗原呈递细胞所分泌的早期促炎性细胞因子(Wolf，S.F.，P.A.Temple等，(1991)，Cloning of cDNA for natural killer cell stimulatoryfactor，a heterodimeric cytokine with multiple biologic effects on T andnatural killer cells，J Immunol 146(9)：3074-81；D′Andrea，A.，M.Rengaraju等，(1992)，Production of natural killer cell stimulatoryfactor(interleukin 12)by peripheral blood mononuclear cells，J.Exp.Med.176：1387-1398；Trinchieri，G.(1998)；Interleukin-12：a cytokineat the interface of inflammation and immunity，Advanced Immunology70：83-243)。已明确地确定，细胞因子参与多种自身免疫疾病例如类风湿性关节炎、克罗恩病和多发性硬化症(Flavell，R.A.(2002)，The relationship of inflammation and initiation of autoimmune disease：role of TNF super family members，Curr Top Microbiol Immunol 266：1-9；O′Shea，J.J.，A.Ma等，(2002)，Cytokines and autoimmunity，Nat Rev Immunol 2(1)：37-45)。具体来说，不受调控的IL-12分泌引起不适当的自身免疫反应，例如在克罗恩病中(Tsukada，Y.，T.Nakamura等，(2002)，Cytokine profile in colonic mucosa of ulcerativecolitis correlates with disease activity and responsegranulocytapheresis，The American Journal of Gastroenterology 97(11)：2820-2828)。
当在本文中使用时，术语“白介素23”或“人白介素23”(在本文中缩写为IL-23或hIL-23)包括由两种亚基，即p19(IL-23的α亚基)和作为IL-12的β亚基的p40(即IL-12B)，构成的人异二聚体细胞因子蛋白。IL-23由多种不同细胞包括巨噬细胞和树突细胞分泌。IL-23与IL-12类似，在自身免疫疾病的发生中显得重要，例如，它在多发性硬化症的鼠类模型中发挥关键作用(Cua，D.J.，J.Sherlock等，(2003)Interleukin-23 rather than interleukin-12 is thecritical cytokine for autoimmune inflammation of the brain，Nature 421(6924)：744-8)。IL23的受体由IL12的β1亚基(IL12RB 1)和IL23特异性亚基IL23R形成。IL23和IL12两者都能激活转录激活因子STAT4，并刺激γ-干扰素(IFNG)的产生。与主要作用于初始CD4(+)T细胞的IL 12相反，IL23优先作用于记忆CD4(+)T细胞。IL-23是对抗感染的炎性反应的重要部分。它促进基质金属蛋白酶MMP9的上调，增加血管形成并减少CD8+T-细胞浸润。最近，已将IL-23与癌性肿瘤的发生相关联。与IL-6和TGF-β1相结合，IL-23刺激初始CD4+T细胞分化成被称为Th17细胞的新的细胞亚集，其与经典的Th1和Th2细胞不同。p40或p19或者IL-23受体的任一亚基(IL-23R和IL12R-β1)缺陷的基因敲除小鼠发生症状严重性较低的多发性硬化症和炎性肠病，强调了IL-23在炎症途径中的重要性。
“表位”是表示抗体与其抗原之间的相互作用的一个或多个位点的现有技术术语。正如(Janeway，C，Jr.，P.Travers等，(2001)，Immunobiology：the immune system in health and disease.Part II，Section 3-8，New York，Garland Publishing，Inc)所描述的：“抗体一般只识别大分子例如蛋白质表面上的小区域，……[某些表位]可能由通过蛋白质折叠而被带到一起的来自于[抗原]多肽链不同部分的氨基酸构成。这种类型的抗原决定簇被称为构象或不连续表位，因为所识别的结构是由在抗原的氨基酸序列中不连续但在三维结构中被集合到一起的蛋白质片段构成。相反，由多肽链的单一片段构成的表位被称为连续或线性表位”(Janeway，C，Jr.，P.Travers等，(2001)，Immunobiology：the immune system in health and disease.Part II，Section 3-8，New York，Garland Publishing，Inc)。
当在本文中使用时，术语“构象表位”或“非线性表位”或“不连续表位”可互换使用，是指由单一蛋白链中不是连续氨基酸的至少两个氨基酸构成的表位。例如，构象表位可以由被一段中间氨基酸分隔开但是近得足以被本发明的抗体识别为单一表位的两个或更多氨基酸构成。作为进一步的实例，在单一蛋白链上被中间氨基酸分隔开的氨基酸或存在于分开的蛋白质链上的氨基酸可以由于蛋白质结构的构象形状或复合而被带到邻近位置，以变成可以被本发明的抗体结合的构象表位。本文中描述了具体的不连续和构象表位。
本领域技术人员会认识到，一般来说，被本发明的抗体结合的线性表位可以依赖于或不依赖于抗原例如IL-12或IL-23的二级、三级或四级结构。例如，在某些实施方式中，本发明的抗体可以结合一组氨基酸而不论它们是否折叠成天然的三维蛋白质结构。在其他实施方式中，本发明的抗体可能不识别构成表位的单个氨基酸残基，并且可能需要特定构象(弯曲、扭转、转角或折叠)以便识别并结合该表位。
当在本文中使用时，术语“环”被用于指称蛋白质二级结构中的转角，其中两个Cα原子彼此接近(例如在或更小距离之内)并且不参与规则的二级结构元件例如α螺旋或β折叠。环可以是延展的和/或不具有良好形成的或固定的内部氢键的无序的。环可以包括其中两个Cα原子被2、3、4、5个或更多残基隔开的转角。
术语“原子坐标”(或“结构坐标”或“原子模型”)是指从与结晶材料的原子(x-射线散射中心)的x-射线衍射获得的图案相关的数学方程推导出的材料中原子的数学三维坐标的技术术语。衍射数据用于计算晶体晶胞的电子密度图。这些电子密度图被用于建立晶体晶胞中单个原子的位置。正如本领域技术人员所知的，原子坐标可以变换成不同坐标系统而不影响原子的相对位置。这样变换的原子坐标应该被视为与原始坐标等同。
除非另有指明，否则术语“抗体”被用于合称抗体，包括完整抗体及其任何抗原结合片段(即“抗原结合部分”)或单链，以及抗体变体包括双特异性、异特异性和异偶联物形式。本发明的抗体可以是多克隆、单克隆、嵌合、人源化或人抗体。还包括了含有包含免疫球蛋白分子的至少一部分(例如但不限于重链或轻链的至少一个互补性决定区(CDR)或其配体结合部分、重链或轻链可变区、重链或轻链恒定区、框架区或其任何部分)的分子的任何蛋白质或肽。术语“抗体”在本文中还用于指称抗体样结合分子或“抗体模拟物”，例如模拟抗体或其片段或部分的结构和/或功能的分子，但是其不限于天然抗体结构。这样的抗体样分子包括例如域抗体、adnectin、纳米抗体，versabody、unibody、亲合抗体、avimer、抗运载蛋白(anticalin)、DARPin、类肽分子(peptidic molecule)和适体。
在一种实施方式中，“抗体”是指包含由二硫键互连的至少两条重(H)链和两条轻(H)链的糖蛋白或其抗原结合部分。各条重链由重链可变区(在本文中缩写为VH)和重链恒定区构成。重链恒定区由3个结构域CH1、CH2和CH3构成。各条轻链由轻链可变区(在本文中缩写为VL)和轻链恒定区构成。轻链恒定区由一个结构域CL构成。VH和VL区可以进一步细分为被称为互补性决定区(CDR)的高变性区域，其中散布有更保守性的被称为框架区(FR)的区域。各VH和VL由3个CDR和4个FR构成，从氨基端至羧基端以下面的顺序排列：FR1，CDR1，FR2，CDR2，FR3，CDR3，FR4。重链和轻链的可变区含有与抗原相互作用的结合结构域。抗体的恒定区可以介导免疫球蛋白与宿主组织或因子(包括免疫系统的各种细胞(例如效应子细胞)和经典补体系统的第一组分(C1q))的结合。
当在本文中使用时，术语抗体的“抗原结合部分”(或简称“抗体部分”是指抗体的保留了特异性结合抗原(例如IL-12和/或IL-23的p40亚基)的能力的一个或多个片段。已显示，抗体的抗原结合功能可以由全长抗体的片段执行。涵盖在术语抗体的“抗原结合部分”中的结合片段的实例包括(i)Fab片段，其是由VL、VH、CL和CH1结构域构成的单价片段；(ii)F(ab′)2片段，其是包含通过在铰链区的二硫桥相连接的两个Fab片段的二价片段；(iii)Fab′片段，其基本上是带有铰链区的部分的Fab(参见《基础免疫学(FUNDAMENTAL IMMUNOLOGY)》，Paul主编，第三版，1993)；(iv)Fd片段，其由VH和CH1结构域构成；(v)Fv片段，其由抗体的单臂的VL和VH结构域构成；(vi)dAb片段(Ward等，(1989)Nature 341：544-546)，其由VH结构域构成；(vii)分离的互补性决定区(CDR)；以及(viii)纳米抗体，其是含有单一可变结构域和两个恒定结构域的重链可变区。此外，尽管Fv片段的两个结构域VL和VH由单独的基因编码，但是可以使用重组方法通过合成接头将它们联结在一起，从而能够将它们制成VL和VH区在其中配对以形成单价分子的单一蛋白质链(被称为单链Fv(scFv)；参见例如Bird等，(1988)Science 242：423-426；和Huston等，(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：5879-5883)。这样的单链抗体也打算涵盖在术语抗体的“抗原结合部分”中。这些抗体片段使用本领域技术人员已知的常规技术来获得，并以与完整抗体相同的方式筛选片段的用途。
构成本文中描述或涵盖的抗体的氨基酸通常用缩写表示。氨基酸名称可以通过用其单字母编码、三字母编码或本领域公知的名称命名氨基酸来标出(Alberts，B.，A.Johnson等，(2002)，MolecularBiology of The Cell，New York，Garland Publishing，Inc.)：
单字母编码 三字母编码 名称
A Ala 丙氨酸
C Cys 半胱氨酸
D Asp 天冬氨酸
E Glu 谷氨酸
F Phe 苯丙氨酸
G Gly 甘氨酸
H His 组氨酸
I Ile 异亮氨酸
K Lys 赖氨酸
L Leu 亮氨酸
M Met 甲硫氨酸
N Asn 天冬酰胺
P Pro 脯氨酸
Q Gln 谷氨酰胺
R Arg 精氨酸
S Ser 丝氨酸
T Thr 苏氨酸
V Val 缬氨酸
W Trp 色氨酸
Y Tyr 酪氨酸
此外，本文描述的氨基酸序列包括“保守突变”，包括在编码序列中改变、添加或缺失单个氨基酸或少数氨基酸的核酸的取代、缺失或添加，其中核酸的改变引起化学上类似的氨基酸的置换。保守氨基酸置换是指第一氨基酸被具有与第一氨基酸类似的化学和/或物理性质(例如电荷、结构、极性、疏水性/亲水性)的第二氨基酸替换。保守置换包括下列组内的一种氨基酸被另一种氨基酸替换：赖氨酸(K)、精氨酸(R)和组氨酸(H)；天冬氨酸(D)和谷氨酸(E)；天冬酰胺(N)和谷氨酰胺(Q)；N、Q、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)和酪氨酸(Y)；K、R、H、D和E；D、E、N和Q；丙氨酸(A)、缬氨酸(V)、亮氨酸(L)、异亮氨酸(I)、脯氨酸(P)、苯丙氨酸(F)、色氨酸(W)、甲硫氨酸(M)、半胱氨酸(C)和甘氨酸(G)；F、W和Y；H、F、W和Y；C、S和T；C和A；S和T；S、T和Y；V、I和L；V、I和T。取决于所讨论的氨基酸的情况，其他保守氨基酸置换也被认为是有效的。例如，在某些情况下，甲硫氨酸(M)可以置换赖氨酸(K)。此外，具有保守变异的差异的序列一般是同源的。
当在本文中使用时，“分离的抗体”是指基本上不含具有不同抗原特异性的其他抗体的抗体(例如，特异性结合IL-12/IL-23的p40亚基的分离的抗体基本上不含特异性结合IL-12/23的p40亚基之外的抗原的抗体)。此外，分离的抗体可以基本上不含其他细胞材料和/或化学物质。
当在本文中使用时，术语“单克隆抗体”或“单克隆抗体组合物”是指单一分子组成的抗体分子的制剂。单克隆抗体组合物表现出对特定表位的单一结合特异性和亲和性。
当在本文中使用时，术语“人抗体”意图包括可变区中的框架和CDR区两者都源自于人种系免疫球蛋白序列的抗体。此外，如果抗体含有恒定区，所述恒定区也源自于人种系免疫球蛋白序列。本发明的人抗体可以包括不由人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如通过体外随机或定点诱变或通过体内体细胞突变引入的突变)。然而，当在本文中使用时，术语“人抗体”不意图包括将源自于另一种哺乳动物物种例如小鼠的CDR序列嫁接到人框架序列上的抗体。
术语“人单克隆抗体”是指可变区中的框架和CDR区两者都源自于人种系免疫球蛋白序列的表现出单一结合特异性的抗体。在一种实施方式中，人单克隆抗体通过杂交瘤生产，所述杂交瘤包括与永生化细胞融合的从基因组包含人重链转基因和轻链转基因的非人转基因动物例如转基因小鼠获得的B细胞。
当在本文中使用时，术语“重组人抗体”包括通过重组手段制备、表达、产生或分离的所有人抗体，例如(a)从对于人免疫球蛋白基因的转基因或转染色体的动物(例如小鼠)或从其制备的杂交瘤(在下文中进一步描述)分离的抗体，(b)从被转化以表达人抗体的宿主细胞例如从转染瘤分离的抗体，(c)从重组的组合人抗体文库分离的抗体，以及(d)通过涉及将人免疫球蛋白基因序列拼接到其他DNA序列上的任何其他手段制备、表达、产生或分离的抗体。这样的重组人抗体具有框架和CDR区源自于人种系免疫球蛋白序列的可变区。然而，在某些实施方式中，这样的重组人抗体可以经历体外诱变(或者当使用人Ig序列转基因的动物时，经历体内体细胞突变)，因此重组抗体的VH和VL区的氨基酸序列是可能不是天然存在于体内人抗体种系序列库中的序列，尽管该序列源自于人种系VH和VL序列和与其相关。
当在本文中使用时，“同种型”是指由重链恒定区基因编码的抗体种类(例如IgM或IgG1)。
词语“识别抗原的抗体”和“抗原特异性的抗体”在本文中可以与术语“特异性结合抗原的抗体”互换使用。
术语“人抗体衍生物”是指人抗体的任何修饰形式，例如抗体与另一种试剂或抗体的偶联物。
术语“人源化抗体”意图指称将源自于另一种哺乳动物物种例如小鼠的种系的CDR序列嫁接到人框架序列上的抗体。可以在人框架序列中进行其他的框架区修饰。本领域技术人员将认识到，当序列“源自于”特定物种时，所述序列可以是蛋白质序列，例如当可变区氨基酸获自鼠类抗体时，或者所述序列可以是DNA序列，例如当编码可变区的核酸获自鼠类DNA时。也可以根据人和非人(例如鼠类或兔)抗体的已知序列来设计人源化抗体。可能结合有人和非人残基两者的设计的抗体可以化学合成。该序列也可以在DNA水平上合成并在体外或体内表达以产生人源化抗体。
术语“嵌合抗体”意图是指可变区序列源自于一种物种和恒定区序列源自于另一物种的抗体，例如可变区序列源自于小鼠抗体和恒定区序列源自于人抗体的抗体。
术语“抗体模拟物”或“模拟抗体”意图是指能够模拟抗体结合抗原的能力的分子，但是其不限于天然抗体结构。这样的抗体模拟物的实例包括但不限于结构域抗体、Adnectin(即基于纤连蛋白的结合分子)、亲合抗体、DARPin、抗运载蛋白(anticalin)、Avimer、纳米抗体、Unibody、Versabody、适体和类肽分子，它们尽管模拟传统抗体结合，但都利用了经由不同机制产生并通过不同机制发挥作用的结合结构。本发明的实施方式，如涉及抗体或其抗原结合部分一样，也适用于上面描述的抗体模拟物。
氨基酸置换(“点”)突变用野生型氨基酸残基类型、残基号和突变的氨基酸残基类型来表示。例如，96位甘氨酸至天冬酰胺的点突变使用标准的三字母或单字母氨基酸缩写表示成“Gly-96-Asn”或“G96N”。
术语“Kabat编号”、“Kabat定义”和“Kabat标记”在本文中可互换使用。为本领域所公认的这些术语是指氨基酸残基的编号系统，所述氨基酸残基比抗体或其抗原结合部分的重链和轻链可变区中的其他氨基酸残基更加可变(即高变)(Kabat等(1971)Ann.NY Acad，Sci.190：382-391和Kabat，E.A.，等(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest，第五版，U.S.Department of Health and Human Services，NIH公开号91-3242)。例如，对于本文中所指的人抗IL-12/IL-23的p40亚基的抗体J695来说，高变区如下。对于重链可变区来说，高变区CDR1的范围为27至35位氨基酸，CDR2的范围为50至65位氨基酸，CDR3的范围为95至102位氨基酸。对于轻链可变区来说，高变区CDR1的范围为24至34位氨基酸，CDR2的范围为50至56位氨基酸，CDR3的范围为89至97位氨基酸。(参见图1中示出的J695的Kabat编号)。
术语“活性”包括如抗体对抗原的结合特异性/亲合性(例如结合IL-12抗原的抗-hIL-12抗体)和/或抗体中和效力(例如抗-hIL-12抗体，所述抗体与hIL-12的结合抑制hIL-12的生物活性，例如抑制PHA胚细胞增殖或在人IL-12受体结合测定中抑制受体结合)的多种活性。
当在本文中使用时，术语“修饰”意图是指改变抗体或其抗原结合部分中的一个或多个氨基酸。所述改变可以通过在一个或多个位置处添加、置换或删除氨基酸来产生。所述改变可以使用已知技术例如PCR诱变来产生。
在提供了值的范围的情况下，应该理解，除非上下文另有明确叙述，否则在所述范围的上限与下限之间以及所陈述的范围内任何其他陈述的或中间的值之间的各个中间值(到下限的十分之一单位)被涵盖在本发明之内。可能独立地包含在较小范围内的这些较小范围的上限和下限也涵盖在本发明之内，除所陈述范围内的任何具体排除限制。在所陈述的范围包括一个或两个限值的情况下，排除了这两个所包含的限值中的任一个的范围也包括在本发明内。
在下面的章节中进一步详细描述本发明的各个方面。
II.J695 Fab的晶体结构
本文的实例描述了包含人mAb J695的Fab的多肽的制备和结晶。J695是针对人IL-12和人IL-23的p40亚基的重组人mAb，其具有治疗和诊断用途。J695包含IgG1重链和λ轻链恒定区同种型。它紧密结合人IL-12(Kd 102±25pM)并阻止其与IL-12受体的相互作用(Salfeld等，1992 Science 255(5047)：959-965)。同样地，J695紧密结合单独的hp40和hIL-23两者。参照Kabat编号系统，完整的J695 CDR序列(参见图1和2)为：H1：27FTFSSYGMH35(SEQ IDNO：1的27-35位氨基酸)；H2：50FIRYDGSNKYYADSVKG65(SEQID NO：1的50-66位氨基酸)；H3：95HGSHDN102(SEQ ID NO：1的99-104位氨基酸)：L1：24SGSRSNIGSNTVK34(SEQ ID NO：2的23-35位氨基酸)；L2：50YNDQRPS56(SEQ ID NO：2的51-57位氨基酸)；L3：89QSYDRYTHPALL97(SEQ ID NO：2的90-101位氨基酸)。
J695Fab片段由CHO细胞产生的J695免疫球蛋白通过木瓜蛋白酶消化然后进行纯化来制备。对于J695来说，Fab由SEQ ID NO：1的从约残基1至约残基220的重链氨基酸残基(如SEQ ID NO：1中所示)，与SEQ ID NO：2的从约残基1至约残基217的轻链氨基酸残基(如SEQ ID NO：2中所示)相结合构成。Fab的重链和轻链通常通过二硫键共价连接。与结合的IL-12p70(p40链)发生相互作用的具体的J695Fab氨基酸残基在下面更详细讨论。
将J695Fab在多种条件下结晶。具体来说，Fab以斜方空间群P212121，
Figure BPA00001751564500471
Figure BPA00001751564500472
Figure BPA00001751564500473
结晶。这种晶型在本文中被称为“I型”(参见图4)。此外，具体来说，J695 Fab以单斜空间群P21，
Figure BPA00001751564500474
Figure BPA00001751564500475
Figure BPA00001751564500476
β＝105.5°结晶。这种晶型在本文中被称为“II型”(参见图5)。术语“空间群”是指称晶体晶胞的对称要素集合的技术术语。术语“晶胞”是指称晶体的基本重复单元(类似于构造砌块)的技术术语。这些晶型以前都未报道过。
7种参数独特地描述晶体的对称性和几何特征。这些参数是空间群(对称性)、三个晶胞轴长度“a”、“b”和“c”，以及三个晶胞轴间夹角“α”、“β”和“γ”(几何特征)。“晶胞轴长度”和“晶胞轴间夹角”是指称晶胞的三维几何特征(主要是其长度、宽度和高度以及结构块是垂直还是倾斜平行六面体)的技术术语。晶胞轴长度和轴间夹角可以改变多达±10％而不实质性改变晶胞内的分子的排列方式。因此，当各个晶胞轴长度和轴间夹角在本文中被称为“约”某特定的值时，应该理解这意味着这些晶胞轴长度和轴间夹角的组合可以相对于所陈述的值变化多达±10％。类似地，在特定情况下，晶体的空间群(并且通常与晶胞参数相结合)可以被改变以提供第一眼看来似乎是具有改变的对称性(和几何)特征的不同晶体。然而，事实上，这种表面上新的晶体仅仅是描述基本上相同的晶型的另一种方式。正如下面以及实施例中详细描述的，J695Fab以单斜空间群P21结晶。对于提供或不提供基本上相同晶体的所有上面的晶体参数变化的讨论来说，本文提出的J695 Fab晶型是独特的，无论可选的同等有效的描述基本上相同的晶体分子排列的方式。
这里报道的P212121斜方晶胞在晶体学不对称单元中包含一个J695 Fab分子。术语“不对称单元”是指称晶体的分子内含物的独特部分的技术术语，所述独特部分可以使用特定空间群专用的并且为本领域技术人员所熟悉的数学对称性运算扩展以首先产生完整晶胞，然后通过应用数学平移对称性运算产生整个宏观晶体。这里报道的P21单斜晶胞在晶体学不对称单元中包含8个J695 Fab分子。在II型晶体中的8个独特Fab通过非晶体学假对称性彼此相关。具体来说，以反向平行方式粗略地沿着(011)晶体方向对齐的两个Fab通过与[100]平行的假二次旋转轴(“并矢”)彼此相关。第二对Fab围绕相同并矢排列，但是位移～1/2a。这种四聚体Fab组合体通过平移矢量[～1/2a，～1/2b，～1/2c]重复以给出晶体学不对称单元中的其他4个Fab。本文中报道的两种新的J695 Fab晶型都具有提供了该抗体的抗原结合位点的详细原子排布的优点。
正如通过晶体学结构测定所显示的，空间群P212121中的J695Fab晶体事实上在晶体学不对称单元中不仅含有一个J695 Fab分子，而且含有许多有序的水分子。也正如通过晶体学结构测定所显示的，空间群P21的新J695 Fab晶体事实上在晶体学不对称单元中不仅含有8个J695 Fab分子，而且含有许多有序的水分子。
此外，正如本领域技术人员显而易见的，通过略微改变蛋白质或结晶条件(例如所使用的蛋白质的准确形式)，可以获得与上述两种晶型没有实质性差异的其他晶型。这些可能采取不同空间群并因此一眼看去似乎不同的其他晶型应该被认为是本文报道的晶型的等同物。
正如在实施例中所描述的，通过x-射线晶体学对这些晶体中的某些进行了研究，并获得了多肽的原子坐标。J695 Fab的晶体结构使用分子置换来确定，并且对于I型和II型的晶体来说，分别在
Figure BPA00001751564500491
和
Figure BPA00001751564500492
分辨率下优化到19.7％和26.1％的自由R-因子(FreeR factor)。“自由R-因子”(或“R自由”)是指示晶体的实验测定的x-射线衍射数据与从被构建用于解释实验数据的原子模型(或原子坐标)所计算的理论衍射数据之间的无偏倚符合度的技术术语。R自由值总是大于0％(其指示完全符合)；10至30％范围内的值指示在原子模型与实验数据之间基本上正确符合。R自由值通常依赖于实验测定的x-射线衍射数据的分辨率。较低分辨率的数据(例如
Figure BPA00001751564500493
至
Figure BPA00001751564500494
分辨率)一般伴有较高的R自由值，而较高分辨率的数据(例如
Figure BPA00001751564500495
至分辨率)一般伴有较低的R自由值。
1.J695的CDR L3表现出不常见的顺式-反式肽键异构化
在J695晶型I中，CDR L3(残基L89-L97)在His-L95AL3与Pro-L95BL3之间含有顺式肽键(图2)。这样的顺式脯氨酸是1和2类正则CDR L3的保守结构特征。参见Chothia，C.和A.M.Lesk(1987).Canonical Structures for the Hypervariable Regions ofImmunoglobulins，J.Mol.Biol.196：901-917；Chothia，C，A.M.Lesk等，(1989)，Conformations of immunoglobulin hypervariable regions，Nature 342：877-883；Al-Lazikani，B.，A.M.Lesk等，(1997)Standardconformations for the canonical structures of immunoglobulins，J.Mol.Biol.273：927-948；Barre，S.，A.S.Greenberg等，(1994)，Structuralconservation of hypervariable regions in immunoglobulins evolution，Structural Biology 1(12)：915-920。相反，在II型中，CDR L3采取不同构象，其中His-L95AL3-Pro-L95BL3肽键采取反式构型。由这种构象切换造成的L3重排类似于首先对抗流感病毒红细胞凝集素Fab 17/9抗体(Rini，J.M.，U.Schulze-Gahmen等，(1992)，Structuralevidence for induced fit as a mechanism for antibody-antigenrecognition，Science 255(5047)：959-65)和自身抗体BV04-01(Herron，J.N.，X.M.He等，(1991)，An autoantibody to single-stranded DNA：comparison of the three-dimensional structures of the unliganded Faband a deoxynucleotide-Fab complex，Proteins 11(3)：159-75)所描述的H3的诱导适应的重排。由于这种切换，两种晶型的L3 CDR重叠不良，具有
Figure BPA00001751564500501
的r.m.s.偏差，而另外5个CDR重叠良好，具有的r.m.s.偏差。
对蛋白质数据库(Protein Data Bank)(在2003年3月28日时可以获得的453个Ab结构记录)(Berman，H.M.，T.Battistuz等，(2002)，“蛋白质数据库”(The Protein Data Bank)，Acta Cryst.D58：899-907)进行系统性算法检索以鉴别抗体整体以及特别是在CDR内反式-顺式肽键异构化的实例。本文使用的允许消除大量假顺式反式对的算法仅仅鉴别到使用J695观察到的这种现象的一个现有实例，即抗单链DNA mAb DNA-1(Tanner，J.J.，A.A.Komissarov等，(2001)，Crystal Structure of an Antigen-binding Fragment Bound toSingle-stranded DNA，J.Mol.Biol.314：807-822)。因此，据信J695是仅仅第二个在任何CDR中明确表现出采取顺式和反式两种构型的肽键的抗体，并且是第一个在CDR L3中表现出顺式-反式异构化的抗体。
2.CDR L3采取两种新的、延伸的发夹构象
在两种晶型中，J695的CDR L3采取以前未观察到的独特的延伸的发夹构象(图3)。L3不同寻常地长达12个残基，在结构表征的抗体中是目前为止观察到的最长的。L3的不寻常的长度可能允许它采取不寻常的构象。
在晶型I中CDR L3采取独特构象，尽管由于其三个残基的延伸和保守残基Gln-L90的缺乏，在95B处存在以前在1和2类正则结构中描述的保守的顺式脯氨酸(Chothia和Lesk 1987 Nature342：877-883；Chothia和Lesk 1989 Nature 342：877-883；Barre和Greenberg 1994 Structural Biology 1(12)：915-920；Al-Lasikani和Lesk1997 J.Mol.Biol.273：927-948)。L3构象也不对应于Martin和Thorton所描述的较新的正则簇中的任一种(Martin和Thornton 1996 J.Mol.Biol.263：800-815)，它也不类似于他们所记录的新的、未分簇的环结构中的任一种。额外的残基允许L3从框架延伸，并在Pro-L95BL3周围形成凸起，从而界定了抗原结合位点的一端。在这种构象中，顺式脯氨酸相对于正则类1中观察到的构象翻转，使得Cβ原子指向抗原结合位点而不是远离它(图4)。
三个紧密结合的水分子使延伸的L3构象稳定。与通常保守的Gln-L90起到类似结构作用的L3发夹中心的一个水分子与Thr-L95L3
Figure BPA00001751564500511
的侧链、Asp-L92L3
Figure BPA00001751564500512
和Ala-L95CL3
Figure BPA00001751564500513
的主链羧基氧原子及Asp-L92L3
Figure BPA00001751564500514
的酰胺氮形成氢键(图3)。位于发夹尖端的第二个水分子与Arg-L93L3的羰基氧和His-L95AL3的酰胺氮
Figure BPA00001751564500516
形成氢键，并且第三个与Tyr-L94L3的羰基氧形成氢键
Figure BPA00001751564500517
顺式肽键也帮助形成这种新结构。结合的磷酸盐(或硫酸盐)通过与Lys-L34L1的Nξ原子、Pro-L95BL3的羰基氧、Tyr-L91L3Oη、His-H35H1Nε1和His-H95H3Nδ1的直接的和水介导的相互作用与L1、L3、H2和H3CDR连接(图3)。
在晶型II中，CDR L3采取独特的也是非正则的构象，部分是由于His-L95AL3-Pro-L95BL3肽键向反式构象的异构化。通过与几个紧密结合的水分子的氢键相互作用使L3构象刚化，其方式与I型类似，但是缺少与Thr-L95L3侧链的氢键。与I型中观察到的不同的水介导相互作用包括将氢键桥接到Gln-L31L1的侧链及Thr-L95L3和His-L95AL3的几个主链原子。
3.CDR L3插入到第二Fab模拟抗原结合的结合位点中
L3从晶格中的一个分子插入到第二分子的抗原结合位点中强化了晶型II中的L3构象。这种在型I中不存在的分子间接触将L3楔入晶体学对称相关的Fab的L3′与H3′之间。这种交互的L3交换移置了在晶型I中观察到的结合的磷酸根阴离子；得到的空隙被CDR的总体向内的“收紧”、两个良好有序的水分子和Tyr-L′94L3的侧链所填充。
II型中由顺式-反式异构和紧接着的大范围晶体堆积接触(extensive crystal packing contact)的形成所引起的CDR L3尖端的重新组织可以被描述为从Arg-L93L3至His-L95AL3的残基旋转153°进入到抗原结合裂隙中。这种围绕近似地由Arg-L93L3Cα和Pro-L95BL3的吡咯烷环所定义的轴的旋转使得Thr-L95L3朝向抗原结合位点位移超过
Figure BPA00001751564500521
Tyr-L94L3的Cα原子移动
Figure BPA00001751564500522
并且其侧链旋转到结合位点中(Oη移动
Figure BPA00001751564500523
)以形成与对称相关的Tyr-L′91L3的Oη的氢键。在两种晶型之间，His-L95AL3翻转其取向。在II型中，在L3与对称相关的H2和H3 CDR之间观察到几个其他接触。相反，在晶型I中，CDR L3仅形成单一分子间接触。
因此，J695的CDR L3表现出构象异构，其允许抗体呈现出针对抗原的两个相当不同的抗原结合位点。在晶型II中观察到的分子间Ab/Ab相互作用可能模拟了Ab/Ag相互作用。
4.J695在抗原结合特征性的可变结构域界面处表现出结构改变
两种晶型中可变结构域之间的界面显著不同，其中型I类似于未结合配体的Ab，型II类似于配体结合的Ab。首先，非常短(6个残基)的CDR H3仅在型II中是有序的，采取“凸起体(bulged torso)”的构象(Morea等，1998 J.Mol.Biol 275：269-294)。正如上面讨论的，4个H3残基H96-H101的排序与可以代替与IL-12的相互作用的晶体接触的形成相偶联。通常观察到在抗原结合时H3的排序或构象变化(Stanfield和Wilson 1994 Trends Biotechnol 2(7)：275-9)。
其次，从型I到型II，VL-VH界面处包埋的溶剂可接近表面积增加38％(1,114对1,540±
Figure BPA00001751564500531
)。这样的增加同样是从未结合到抗原结合的状态的转变的特征(Stanfield等，1993 Structure15：83-93)。这种增加的约三分之二由H3的排序造成。与表面积差异相一致，型I中的VL-VH界面仅含1个氢键相互作用，其是Gln-L38与Gln-H39的侧链之间的通常包埋的相互交换，而型II中的界面有8个。VL-VH界面处的这些变化与CL-CH1界面的恒定性相反：包埋在CL与CH1之间的表面积在两种晶型中是相近的(型I：
Figure BPA00001751564500532
型II：1,757±
Figure BPA00001751564500533
范围为
Figure BPA00001751564500534
)。与可变结构域表现出的恒定性(1.8％)相比，型II的CL-CH1界面中相对大的变异性(9％)可能是由型II的某些恒定结构域中较高的无序度(由较高的温度因子所反映)造成的。
第三，相对于型I，晶型II中的Fab在将VL与VH相关联的假二次旋转轴中表现出变化。当将型II的8个VL结构域对准在型I的VL上时，则必须向型II的VH结构域施加另外的旋转以使其与型I的VH对齐。这些旋转平均为2.1±0.9°(范围为0.8-4.0°)。这样的VL-VH旋转偏斜是配体结合和未结合配体的Fab之间的差异所特有的(Stanfield等，1993 Structure 15：83-93)。这些旋转差异与弯转角度变化无关，因为8个型II的Fab中的6个具有与型I一致的弯转角度(136±5相对于135°)。
5.J695抗原结合位点具有明显带正电荷的适合于结合带负电荷的肽 的裂隙
在两种晶型中，J695CDR在轻链和重链可变结构域之间形成深裂隙，这是针对小分子半抗原的抗体更典型的结合位点(图5)。相反，大多数针对蛋白质的抗体含有具有相对平坦表面的抗原结合位点(MacCallum，R.M.，A.C.Martin等，(1996)，Antibody-antigeninteractions：contact analysis and binding site topography，J.Mol.Biol.262(5)：732-745)。在晶型I中裂隙在两端是开放的，而在型II中它在两端是封闭的。型II中CDR L3的重排封闭了裂隙的一端，且H3的排序完成裂隙的底面并封闭另一端。封闭的裂隙的宽度约为
Figure BPA00001751564500541
(VH至VL)，深度为
Figure BPA00001751564500542
(底面至CDR尖端)，和长度为
Figure BPA00001751564500543
Figure BPA00001751564500544
(H3至L3)。裂隙的底面是高度电正性的。因此，J695具有结合从IL-12的表面延伸的带负电荷的肽环所需的几何和电荷特征。
减少J695抗原结合位点的正电荷由此干扰其与带负电荷IL-12的互补性的突变(图6)引起结合效力的丧失(参见PCT公开号WO0056772A1)。造成带正电荷的裂隙的残基包括：Asn-L31L1(SEQID NO：2的32位氨基酸)、Lys-L34L1(SEQ ID NO：2的35位氨基酸)、Gln-L89L3(SEQ ID NO：2的90位氨基酸)、His-H35H1(SEQID NO：1的35位氨基酸)、Lys-H93(SEQ ID NO：1的97位氨基酸)、His-H95H3(SEQ ID NO：1的99位氨基酸)、His-H98H3(SEQ ID NO：1的102位氨基酸)、Asn-H102H3(SEQ ID NO：1的104位氨基酸)和Trp-H103(SEQ ID NO：1的105位氨基酸)。
J695前体Joe 9的CDR H3缺少这些残基中的三个。His-H95H3和His-H98H3的引入单独地引起在mAb 70-1结合方面的约5倍的改善(图2)。与L3精氨酸残基在78-34中的重新定位以提供110-11相组合引起超过50倍的改善。将不寻常定位的(Morea，V.，A.Tramontano等，(1998)，Conformations of the third hypervariable regionof the VH domain of immunoglobulins，J.Mol.Biol.275：269-294)框架残基Lys-H93添加到103-14中提供了与Joe 9相比提高1,000倍的效力。即使在高度优化的Y61突变中，这些带正电荷的残基也对IL-12结合具有可测量的影响。例如，Y61 His-H95H3突变成带负电荷的谷氨酸引起Koff速率常数提高8倍(并且根据推论，亲和性也降低)，Asn-L31L1向天冬氨酸的突变引起2.5倍的增加。因此，亲和力成熟数据、电荷互补性和简单的几何考虑因素都表明J695结合IL-12上的突出的带负电荷的环。
III.与IL-12 p70(p40/p35)结合的J695 Fab的晶体结构
制备了包含人mAb J695的Fab的多肽和包含人IL-12 p70的多肽之间的复合物。正如上面指出的，人IL-12 p70由两个亚基p40多肽链和p35多肽链构成。前体(或肽)p40链的氨基酸残基示出为SEQ ID NO：5。前体(或肽)p35链氨基酸残基被示出为SEQ ID NO：6。成熟的p40链氨基酸残基(即SEQ ID NO：5的约残基23至约残基328)与成熟的p35链氨基酸残基(即SEQ ID NO：6的约残基23至约残基213)结合以形成IL-12 p70异二聚体细胞因子。p40和p35链通过二硫键共价连接。在后面，在整个本专利申请中，使用IL-12p40和IL-12 p35多肽的成熟编号。与J695 Fab发生相互作用的具体IL-12 p40氨基酸残基在下面更详细讨论。
天然人IL-12 p40(SEQ ID NO：5)的氨基酸序列如SWISS-PROT中所定义的来获取(http://www.expasy.ch；登记名称：IL12B_HUMAN；原始登记号：P29460)。该SWISS-PROT记录中的氨基酸残基23至328对应于成熟的IL-12 p40多肽，其在本文中被称为残基1至306，如SEQ ID NO：3中所示。天然人IL-12 p35(SEQID NO：6)的氨基酸序列如SWISS-PROT中所定义的来获取(http://www.expasy.ch；登记名称：IL12A_HUMAN；原始登记号：P29459)。该SWISS-PROT记录中的氨基酸残基23至219对应于成熟的IL-12 p35多肽，在其本文中被称为残基1至197，如SEQ ID NO：4中所示。
正如实施例中所描述的，复合物在多种条件下结晶。具体来说，J695 Fab/IL-12 p70复合物以斜方空间群C2221，
Figure BPA00001751564500561
Figure BPA00001751564500563
Figure BPA00001751564500564
结晶。这种晶型以前尚未报道过。
正如下面以及在实施例中详细描述的，这里报道的C2221斜方晶胞在晶体学不对称单元中包含两分子J695 Fab和两分子IL-12p70。正如通过晶体学结构测定所显示的，采取空间群C2221的新的J695 Fab/IL-12 p70复合物晶体在晶体学不对称单元中不仅含有两分子J695 Fab和两分子IL-12 p70，而且还含有许多有序的水分子。
此外，正如本领域技术人员显而易见的，通过略微改变蛋白质或结晶条件(例如所使用的蛋白质的精确形式)，可以获得与上述斜方形式没有实质性差异的其他晶型。这些可能采取不同空间群并因此一眼看去似乎不同的其他晶型应该被看作是本文报道的晶型的等同物。
正如在实施例中所描述的，通过x-射线晶体学对这些晶体中的某些进行了研究，并获得了多肽的原子坐标。具体来说，这里报道的通过x-射线晶体学进行研究的C2221晶型具有下述优点，即揭示出J695与IL-12 p70之间的精确分子相互作用，包括两种分子在结合位点处的三维构象，以及哪些IL-12的氨基酸残基构成结合位点或表位。J695 Fab与IL-12 p70之间的一对一的复合物的晶体结构被测定并优化到在
Figure BPA00001751564500565
分辨率下自由R因子为28.7％。
IV.结合IL-12和/或IL-23的p40亚基的抗体
本发明的抗体特异性结合IL-12和/或IL-23的p40亚基，并优选地结合本文描述的p40亚基的特定结构域或部分或构象表位，例如结合包含选自成熟人p40蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO：3)的残基1-197的至少一个氨基酸的部分和/或构象表位。在优选实施方式中，本发明的抗体或其抗原结合部分与IL-12和/或IL-23的p40亚基的结合调节、例如抑制或降低IL-12和/或IL-23的p40亚基的活性和/或含p40的细胞因子的活性。例如，所述抗体或其抗原结合部分可以阻断含p40的细胞因子例如IL-12或IL-23分别与其受体例如IL-12或IL-23受体的结合。
本发明的抗体被选择或设计以结合p40亚基的特定结构域或部分，例如包含选自成熟人p40蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO：3)的残基1-197的至少一个氨基酸的部分。在一种实施方式中，本发明的抗体被选择或设计以结合p40亚基的包含选自成熟人p40蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO：3)的残基1-197的至少一个氨基酸的部分和/或构象表位。在其他实施方式中，本发明的抗体被选择或设计以结合p40亚基的包含p40亚基的环1-7的至少一个氨基酸残基的部分和/或构象表位，例如其中至少一个氨基酸残基选自成熟人p40蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO：3)的残基14-23、58-60、84-107、124-129、157-164和194-197。在其他实施方式中，抗体或其抗原结合部分被选择或设计以结合与IL-12和/或IL-23的p40亚基的结构域共有同源性的蛋白。例如，抗体可以被选择或设计以结合与IL-12和/或IL-23的p40亚基的结构域至少50％相同、至少60％相同、至少70％相同、至少80％相同、至少90％相同或至少95％、96％、97％、98％或99％相同的结构域。这样的抗体或其抗原结合部分能够结合与IL-12和/或IL-23的p40亚基的结构域在功能上类似的蛋白质结构域。
在一种实施方式中，抗体或其抗原结合部分结合代表了连续氨基酸串的蛋白质基序。在其他实施方式中，抗体或其抗原结合部分结合代表了蛋白质中的三维结构的蛋白质基序或共有序列。这样的基序或共有序列不代表连续氨基酸串，而是由IL-12和/或IL-23的p40亚基的三维折叠所产生的不连续的氨基酸排列(即“结构基序”或“非线性表位”)。这样的基序的实例是IV(C)节的表4中所描述的表位1，例如包含人p40的Tyr16、Asp87和Asp93。在一种实施方式中，本发明的抗体结合例如包含来自于IL-12和/或IL-23的p40亚基的环1-7的一个或多个氨基酸残基的非线性表位。在下面的章节中对本发明的抗体进行进一步的详细描述。
A.基于J695 Fab/IL-12 p70复合物的晶体结构的抗体
1.IL-12 p40上的接触
J695 Fab/IL-12 p70复合物的晶体结构表明，J695经由p40亚基结合IL-12；在J695与p35亚基之间不存在接触(图7)。对IL-12 p40亚基的氨基酸残基的所有指代参照SEQ ID NO：3中示出的成熟p40多肽做出。
J695 Fab与p40之间的大部分相互作用发生在p40的N-末端结构域D1中，约氨基酸残基1至197，并且更优选在成熟p40多肽的氨基酸1至107之间(未成熟序列的约残基23至130；参见SEQ IDNO：3中示出的成熟p40多肽序列)(图8)。因此，在示例性实施方式中，本发明提供了结合IL-12和/或IL-23的p40亚基的抗体，其中所述抗体结合p40亚基的包含选自SEQ ID NO：3的氨基酸残基1-197的至少一个氨基酸残基或在所述氨基酸残基的
Figure BPA00001751564500581
之内的部分和/或构象表位。在另一种实施方式中，本发明提供了结合IL-12和/或IL-23例如人IL-12和/或人IL-23的p40亚基的抗体，其中所述抗体结合p40亚基的包含选自SEQ ID NO：3的氨基酸残基1-107的至少一个氨基酸残基或在所述氨基酸残基的之内的部分和/或构象表位。
也与IL-12 p40的其他结构域形成一些相互作用。具体来说，J695结合IL-12 p40并与下列IL-12 p40氨基酸残基发生接触：Asp14，Trp15，Tyr16，Pro17，Asp18，Ala19，Pro20，Gly21，Glu22，Met23，Lys58，Glu59，Phe60，Lys84，Lys85，Glu86，Asp87，Gly88，Ile89，Trp90，Ser91，Thr92，Asp93，Ile94，Leu95，Lys96，Asp97，Gln98，Lys99，Glu100，Pro101，Lys102，Asn103，Lys104，Thr105，Phe106，Leu107，Thr124，Thr125，Ile126，Ser127，Thr128，Asp129，Arg157，Val158，Arg159，Gly160，Asp161，Asn162，Lys163，Glu164，His194，Lys195，Leu196和Lys197(图8)。这些残基分别位于p40亚基的环1-7的至少一个环中。因此，本发明还包括结合IL-12和/或IL-23的p40亚基的抗体，其中所述抗体结合p40亚基的包含环1-7的至少一个氨基酸残基的部分和/或构象表位。在示例性实施方式中，本发明提供了结合IL-12和/或IL-23的p40亚基的抗体，其中所述抗体结合p40亚基的包含环1-7的至少一个氨基酸残基或在所述氨基酸残基的
Figure BPA00001751564500591
之内的部分和/或构象表位，例如0.1、0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9或
Figure BPA00001751564500592
之内。
特别地，J695结合IL-12 p40，并与构成IL-12 p40的环1的下列IL-12 p40的氨基酸残基发生接触，即残基：Asp14，Trp15，Tyr16，Pro17，Asp18，Ala19，Pro20，Gly21，Glu22和Met23(图8)。因此，在另一种实施方式中，本发明提供了结合IL-12和/或IL-23例如人IL-12和/或人IL-23的p40亚基的抗体，其中所述抗体结合p40亚基的包含选自残基14-23的环1的至少一个氨基酸残基或在所述氨基酸残基的
Figure BPA00001751564500593
之内的部分和/或构象表位。在另外的实施方式中，抗体结合p40亚基的包含选自残基14-18的环1的至少一个氨基酸残基或在所述氨基酸残基的
Figure BPA00001751564500594
之内的部分和/或构象表位。在优选实施方式中，抗体结合p40亚基的包含选自残基14-17的环1的至少一个氨基酸残基或在所述氨基酸残基的
Figure BPA00001751564500595
之内的部分和/或构象表位。在另一种优选实施方式中，抗体结合p40亚基的包含选自残基15-17的环1的至少一个氨基酸残基或在所述氨基酸残基的
Figure BPA00001751564500596
之内的部分和/或构象表位。
晶体结构分析还表明J695结合IL-12 p40，并与构成IL-12 p40的环2的下列IL-12 p40的氨基酸残基发生接触，即残基：Lys58，Glu59和Phe60。因此，在另一种实施方式中，本发明提供了结合IL-12和/或IL-23例如人IL-12和/或人IL-23的p40亚基的抗体，其中所述抗体结合p40亚基的包含选自残基58-60的环2的至少一个氨基酸残基或在所述氨基酸残基的
Figure BPA00001751564500597
之内的部分和/或构象表位。
此外，晶体结构分析还表明J695结合IL-12 p40，并与构成IL-12p40的环3的下列IL-12 p40的氨基酸残基发生接触，即残基：Lys84，Lys85，Glu86，Asp87，Gly88，Ile89，Trp90，Ser91，Thr92，Asp93和Ile94(图8)。因此，在另一种实施方式中，本发明提供了结合IL-12和/或IL-23例如人IL-12和/或人IL-23的p40亚基的抗体，其中所述抗体结合p40亚基的包含选自残基84-94的环3的至少一个氨基酸残基或在所述氨基酸残基的
Figure BPA00001751564500601
之内的部分和/或构象表位。在另一种实施方式中，抗体结合p40亚基的包含选自残基85-93的环3的至少一个氨基酸残基或在所述氨基酸残基的
Figure BPA00001751564500602
之内的部分和/或构象表位。在另外的实施方式中，抗体结合p40亚基的包含选自残基86-89和93的环3的至少一个氨基酸残基或在所述氨基酸残基的
Figure BPA00001751564500603
之内的部分和/或构象表位。在优选实施方式中，抗体结合p40亚基的包含选自残基86、87、89和93的环3的至少一个氨基酸残基或在所述氨基酸残基的
Figure BPA00001751564500604
之内的部分和/或构象表位。
IL-12p40的氨基酸残基Asp87在与J695的结合中特别突出。它的侧链羧酸深深结合在结合位点中(图9)，与J695 Fab的I型晶体结构中观察到的结合磷酸根离子的位置相同。因此，在另外的优选实施方式中，抗体结合p40亚基的包含环3的氨基酸残基87或在所述氨基酸残基的
Figure BPA00001751564500605
之内的部分和/或构象表位。
此外，晶体结构分析表明J695结合IL-12 p40，并与构成IL-12p40的环4的下列IL-12 p40的氨基酸残基发生接触，即残基：Leu95，Lys96，Asp97，Gln98，Lys99，Glu100，Pro101，Lys102，Asn103，Lys104，Thr105，Phe106和Leu107(图8)。因此，在另一种实施方式中，本发明提供了结合IL-12和/或IL-23例如人IL-12和/或人IL-23的p40亚基的抗体，其中所述抗体结合p40亚基的包含选自残基95-107的环4的至少一个氨基酸残基或在所述氨基酸残基的
Figure BPA00001751564500606
之内的部分和/或构象表位。在另一种实施方式中，抗体结合p40亚基的包含选自残基102-104的环4的至少一个氨基酸残基或在所述氨基酸残基的
Figure BPA00001751564500607
之内的部分和/或构象表位。在优选实施方式中，抗体结合p40亚基的包含选自残基103和104的环4的至少一个氨基酸残基或在所述氨基酸残基的
Figure BPA00001751564500608
之内的部分和/或构象表位。在另一种优选实施方式中，抗体结合p40亚基的包含环4的氨基酸残基104或在所述氨基酸残基的
Figure BPA00001751564500611
之内的部分和/或构象表位。在又另一种优选实施方式中，抗体结合p40亚基的包含环4的氨基酸残基103或在所述氨基酸残基的
Figure BPA00001751564500612
之内的部分和/或构象表位。
晶体结构分析还表明J695结合IL-12 p40，并与构成IL-12 p40的环5的下列IL-12 p40的氨基酸残基发生接触，即残基：Thr124，Thr125，Ile126，Ser127，Thr128和Asp129(图8)。因此，在另一种实施方式中，本发明提供了结合IL-12和/或IL-23例如人IL-12和/或人IL-23的p40亚基的抗体，其中所述抗体结合p40亚基的包含选自残基124-129的环5的至少一个氨基酸残基或在所述氨基酸残基的
Figure BPA00001751564500613
之内的部分和/或构象表位。
晶体结构分析还表明J695结合IL-12 p40，并与构成IL-12 p40的环6的下列IL-12 p40的氨基酸残基发生接触，即残基：Arg157，Val158，Arg159，Gly160，Asp161，Asn162，Lys163和Glu164。因此，在另一种实施方式中，本发明提供了结合IL-12和/或IL-23例如人IL-12和/或人IL-23的p40亚基的抗体，其中所述抗体结合p40亚基的包含选自残基157-164的环6的至少一个氨基酸残基或在所述氨基酸残基的
Figure BPA00001751564500614
之内的部分和/或构象表位。
晶体结构分析还表明J695结合IL-12 p40，并与构成IL-12 p40的环7的下列IL-12 p40的氨基酸残基发生接触，即残基：His194，Lys195，Leu196和Lys197。因此，在另一种实施方式中，本发明提供了结合IL-12和/或IL-23例如人IL-12和/或人IL-23的p40亚基的抗体，其中所述抗体结合p40亚基的包含选自残基194-197的环7的至少一个氨基酸残基或在所述氨基酸残基的
Figure BPA00001751564500615
之内的部分和/或构象表位。
晶体结构分析进一步表明，J695与IL-12之间的大部分特异性相互作用是与下述IL-12 p40环的相互作用：环1、环3和环4。例如，J695与IL-12 p70之间的大多数特异性接触位于主要由在一级序列中不连续的4个IL-12 p40表面环(残基14-23、58-60、84-94和95-107；分别为环1、2、3和4，参见上文)构成的表位，所谓的“构象”表位中(Janeway，C，Jr.，P.Travers等，(2001)，Immunobiology：the immune system in health and disease，New York，Garland Publishing，Inc)。因此，在另一种实施方式中，本发明提供了结合IL-12和/或IL-23例如人IL-12和/或人IL-23的p40亚基的抗体，其中所述抗体结合p40亚基的包含选自残基14-23、58-60、84-94和95-107的环1-4的至少一个氨基酸残基或在所述氨基酸残基的
Figure BPA00001751564500621
之内的部分和/或构象表位。在另外的实施方式中，本发明涵盖了一种抗体，所述抗体结合p40亚基的包含选自残基14-18、85-93和102-104的环1-4的至少一个氨基酸残基或在所述氨基酸残基的
Figure BPA00001751564500622
之内的部分和/或构象表位。在进一步的实施方式中，本发明涵盖了一种抗体，所述抗体结合p40亚基的包含选自残基14-17、86-89、93和103-104的环1-4的至少一个氨基酸残基或在所述氨基酸残基的
Figure BPA00001751564500623
之内的部分和/或构象表位。在另一种实施方式中，本发明涵盖了一种抗体，所述抗体结合p40亚基的包含选自残基15-17、86-87、89、93和104的环1-4的至少一个氨基酸残基或在所述氨基酸残基的
Figure BPA00001751564500624
之内的部分和/或构象表位。
在又一种另外的实施方式中，本发明提供了结合IL-12和/或IL-23例如人IL-12和/或人IL-23的p40亚基的抗体，其中所述抗体结合p40亚基的包含选自残基14-23和58-60的环1-2的至少一个氨基酸残基或在所述氨基酸残基的
Figure BPA00001751564500625
之内的部分和/或构象表位。在另一种实施方式中，本发明涵盖了一种抗体，所述抗体结合p40亚基的包含选自残基15、17-21、23和58-60的环1-2的至少一个氨基酸残基或在所述氨基酸残基的
Figure BPA00001751564500626
之内的部分和/或构象表位。
在又一种另外的实施方式中，本发明提供了结合IL-12和/或IL-23例如人IL-12和/或人IL-23的p40亚基的抗体，其中所述抗体结合p40亚基的包含选自残基14-23的环1的至少一个氨基酸残基和选自残基58-60的环2的至少一个氨基酸残基或在所述氨基酸残基的
Figure BPA00001751564500627
之内的部分和/或构象表位。在另一种实施方式中，抗体结合p40亚基的包含选自残基14-23和84-94的环1和3的至少一个氨基酸残基或在所述氨基酸残基的
Figure BPA00001751564500631
之内的部分和/或构象表位。在另外的实施方式中，抗体结合p40亚基的包含选自残基14-23的环1的至少一个氨基酸残基和选自残基84-94的环3的至少一个氨基酸残基或在所述氨基酸残基的之内的部分和/或构象表位。
在进一步的实施方式中，本发明提供了结合IL-12和/或IL-23例如人IL-12和/或人IL-23的p40亚基的抗体，其中所述抗体结合p40亚基的包含选自残基14-23和95-107的环1和4的至少一个氨基酸残基或在所述氨基酸残基的
Figure BPA00001751564500633
之内的部分和/或构象表位。在另外的实施方式中，抗体结合p40亚基的包含选自残基14-23的环1的至少一个氨基酸残基和选自残基95-107的环4的至少一个氨基酸残基或在所述氨基酸残基的
Figure BPA00001751564500634
之内的部分和/或构象表位。
在进一步的实施方式中，本发明提供了结合IL-12和/或IL-23例如人IL-12和/或人IL-23的p40亚基的抗体，其中所述抗体结合p40亚基的包含选自残基84-94和95-107的环3和4的至少一个氨基酸残基或在所述氨基酸残基的
Figure BPA00001751564500635
之内的部分和/或构象表位。在另外的实施方式中，抗体结合p40亚基的包含选自残基84-94的环3的至少一个氨基酸残基和选自残基95-107的环4的至少一个氨基酸残基或在所述氨基酸残基的
Figure BPA00001751564500636
之内的部分和/或构象表位。
实验测定的J695与IL-12 p70之间的组合位点与关于哪些p40残基调节J695的结合的已知数据、特别是J695与来自于各种不同来源例如人、恒河猴、狗、大鼠或小鼠IL-12的IL-12 p40或IL-12 p70之间的已知的交叉反应性或所述交叉反应性的缺乏的已知数据(图11)相一致。例如，结合位点处两个关键氨基酸残基在人IL-12与大鼠或小鼠IL-12之间不是保守的，即IL-12 p40的氨基酸残基Tyr16(环1)和Asp87(环3)。这两个残基的改变，即Tyr16Arg(大鼠)或Tyr16Thr(小鼠)和Asp87Asn(大鼠或小鼠)，如在大鼠或小鼠IL-12中或在人/大鼠嵌合蛋白中发现的(参见下文)，基本上消除了与J695的结合。
此外，IL-12 p40的氨基酸残基Gln98、Lys99和Glu100的缺失，如在大鼠或小鼠IL-12 p40中发现的，改变了环3和环4的形状，并因此改变了上面提到的关键残基对J695的正确呈递。观察到的组合位点也与J695与任何IL-12 p70、IL-12 p40或IL-23 p40/p19异二聚体的已知结合(都具有基本上相等的亲和性)相一致(图7)。最后，观察到的晶体学组合位点也与来自J695的亲和成熟的已知诱变数据(即对J695前体抗体进行的该突变影响IL-12结合效能)(如PCT公开号WO0056772A1中所描述的，在此以其全文引为参考)相一致。
在本发明的一种实施方式中，结合IL-12和/或IL-23的p40亚基的抗体或抗原结合部分结合不连续或构象表位。在一种实施方式中，本发明提供了结合IL-12和/或IL-23的p40亚基的抗体，其中所述抗体结合p40亚基的包含选自环1-7的氨基酸残基(即SEQ ID NO：3的氨基酸序列的氨基酸残基14-23、58-60、84-107、124-129、157-164和194-197)的至少两个氨基酸残基或在所述氨基酸残基的之内的构象表位。在一种实施方式中，抗体结合p40亚基的包含选自环1的氨基酸残基(即氨基酸残基14-23)的至少两个氨基酸残基的构象表位。在一种实施方式中，抗体结合p40亚基的包含选自环2的氨基酸残基(即氨基酸残基58-60)的至少两个氨基酸残基的构象表位。在一种实施方式中，抗体结合p40亚基的包含选自环3的氨基酸残基(即氨基酸残基84-94)的至少两个氨基酸残基的构象表位。在一种实施方式中，抗体结合p40亚基的包含选自环4的氨基酸残基(即氨基酸残基95-107)的至少两个氨基酸残基的构象表位。在一种实施方式中，抗体结合p40亚基的包含选自环5的氨基酸残基(即氨基酸残基124-129)的至少两个氨基酸残基的构象表位。在一种实施方式中，抗体结合p40亚基的包含选自环6的氨基酸残基(即氨基酸残基157-164)的至少两个氨基酸残基的构象表位。在一种实施方式中，抗体结合p40亚基的包含选自环7的氨基酸残基(即氨基酸残基194-197)的至少两个氨基酸残基的构象表位。
在另一种实施方式中，抗体结合p40亚基的包含选自环1-7的氨基酸残基的两个或更多氨基酸残基的构象表位，其中所述两个或更多氨基酸残基中的至少两个位于不同的环中。应该理解，位于不同的环中的至少两个氨基酸残基可以来自于环的任何组合，例如环1和2、环1和3、环1和4、环1和5、环1和6、环1和7、环2和3、环2和4、环2和5、环2和6、环2和7、环3和4、环3和5、环3和6、环3和7、环4和5、环4和6、环4和7、环5和6、环5和7或环6和7。
例如，在一种实施方式中，抗体结合p40亚基的包含选自环1的氨基酸序列的至少一个氨基酸残基和选自环2的氨基酸残基的至少一个氨基酸残基的构象表位。在一种实施方式中，抗体结合p40亚基的包含选自环1的氨基酸序列的至少一个氨基酸残基和选自环3的氨基酸残基的至少一个氨基酸残基的构象表位。在一种实施方式中，抗体结合p40亚基的包含选自环1的氨基酸序列的至少一个氨基酸残基和选自环4的氨基酸残基的至少一个氨基酸残基的构象表位。在一种实施方式中，抗体结合p40亚基的包含选自环2的氨基酸序列的至少一个氨基酸残基和选自环3的氨基酸残基的至少一个氨基酸残基的构象表位。在一种实施方式中，抗体结合p40亚基的包含选自环2的氨基酸序列的至少一个氨基酸残基和选自环4的氨基酸残基的至少一个氨基酸残基的构象表位。在一种实施方式中，抗体结合p40亚基的包含选自环3的氨基酸序列的至少一个氨基酸残基和选自环4的氨基酸残基的至少一个氨基酸残基的构象表位。应该理解，p40亚基的构象表位可以包含位于不同的环中的至少两个氨基酸残基，其中所述不同的环可以是环1、2、3、4、5、6和7的任何组合。
2.J695上的接触
所有J695互补性决定区(CDR)都接触IL-12p40。具体来说，IL-12的结合主要通过整个J695结合位点的6个区域发生，所述区域被确认为“位点”，如下面和图8中所描述的。
位点1包含3个芳香族残基(Phe、Tyr、Trp或His)，其中两个位于CDR H1中(Phe-H27和Tyr-H32)，一个位于CDR H3中(His-H98)，使得这三个残基的Cβ原子形成维度约为
Figure BPA00001751564500661
(两个H1残基之间)、和
Figure BPA00001751564500663
(各H1残基与H3残基之间)的三角形。位点1的氨基酸残基形成口袋，IL-12p40的残基Tyr16和Pro17插入到其中，它们在此处与J695形成大量范德华相互作用。从本文确定的J695/IL-12 p70晶体结构可以明显看出，一个或多个芳香族残基可以取代Phe-H27、Tyr-H32或His-H98(例如分别对应于SEQ IDNO：1的氨基酸残基27、32和102)而保留或甚至提高J695的结合特性。
位点2包含选自Lys、Arg、Tyr、Asn和Gln的三个残基，其中CDR L1(Lys-L34)、L3(Tyr-L91)和H3(包括H3之前的3个框架残基；Lys-H93)中各一个残基，使得这三个残基的Cβ原子形成维度约为
Figure BPA00001751564500664
(L1与L3残基之间)、
Figure BPA00001751564500665
(L1与H3残基之间)和
Figure BPA00001751564500666
(L3与H3残基之间)的三角形。J695位点2的氨基酸残基形成口袋，IL-12 p40的残基Asp87插入到其中；3个J695氨基酸与Asp87侧链羧酸形成特异性互补电荷和氢键相互作用(图9)。从本文确定的J695/IL-12 p70晶体结构可以明显看出，选自Lys、Arg、Tyr、Asn和Gln的一个或多个残基可以取代Lys-L34(例如对应于SEQ ID NO：2的氨基酸残基35)、Tyr-L91(例如对应于SEQ ID NO：2的氨基酸残基92)或Lys-H93(例如对应于SEQ ID NO：1的氨基酸残基97)而保留或甚至提高J695的结合特性。
位点3包含两个芳香族残基(Phe、Tyr、Trp或His)，两者都位于CDR L3中(Tyr-L91和His-L95A)，使得这两个残基的Cβ原子相隔约
Figure BPA00001751564500667
位点3的氨基酸残基形成口袋，IL-12 p40的残基Ile89插入到其中，它在此处与J695发生大量范德华相互作用。从本文确定的J695/IL-12 p70晶体结构可以明显看出，一个或多个芳香族残基可以取代Tyr-L91或His-L95A(例如分别对应于SEQ ID NO：2的氨基酸残基92和97)而保留或甚至提高J695的结合特性。
位点4包含选自Tyr、Ser、Thr、Asn和Gln的两个残基，CDR L2(Tyr-L50)和H3(Ser-H97)中各一个残基，使得这两个残基的Cβ原子相隔约
Figure BPA00001751564500671
J695位点4的氨基酸残基形成口袋，IL-12 p40的残基Asp14插入到其中；2个J695氨基酸与Asp14侧链羧酸形成特异性互补电荷和氢键相互作用。从本文确定的J695/IL-12 p70晶体结构明显看出，选自Tyr、Ser、Thr、Asn和Gln的一个或多个残基可以取代Tyr-L50(例如对应于SEQ ID NO：2的氨基酸残基51)或Ser-H97(例如对应于SEQ ID NO：1的氨基酸残基101)而保留或甚至提高J695的结合特性。
位点5包含J695的整个CDR L3(对应于SEQ ID NO：2的氨基酸残基90-101)，其具有下列特征：(i)CDR L3的长度等于或大于12个氨基酸残基(它在J695中为12个氨基酸残基长)；(ii)CDR L3的90位的氨基酸残基不是Gln(它在J695中是Ser)；(iii)CDR L3的94位的氨基酸残基是芳香族的(它在J695中是Tyr)；(iv)CDR L3的95A位的氨基酸残基选自Phe、Tyr、Trp、His、Asp、Glu、Asn和Gln(它在J695中是His)；CDR L3的95B位的氨基酸残基是Pro。
位点5的氨基酸残基形成β-发夹环，其从J695结合位点的中心向外扩展以接触IL-12 p40的残基Lys102、Asn103和Lys104。上述各个特征对CDR L3的多产性结合构象或与IL-12的结合特异性相互作用有贡献。从本文确定的J695/IL-12 p70的晶体结构明显看出，可以制备进行一个或多个下列变化的CDR L3变异体而保留或甚至提高J695的结合特性，即(i)CDR L3长度大于12个氨基酸残基，(ii)用不同芳香族残基取代Tyr-L94，或(iii)用选自Phe、Tyr、Trp、His、Asp、Glu、Asn和Gln的残基取代His-L95A。
位点6包含选自Tyr、Ser、Thr、Asn、Gln、Lys和Arg的两个残基，其中两个残基都在CDR H2中(Arg-H52和Tyr-H52A)，使得这两个残基的Cβ原子相隔约
Figure BPA00001751564500672
J695的位点6的氨基酸残基形成IL-12 p40的残基Asp93抵靠的壁；两个J695氨基酸与Asp93侧链羧酸形成特异性互补电荷和氢键相互作用。从本文确定的J695/IL-12 p70晶体结构明显看出，选自Tyr、Ser、Thr、Asn、Gln、Lys和Arg的一个或多个残基可以取代Arg-H52或Tyr-H52A(例如分别对应于SEQ ID NO：1的氨基酸残基52或53)而保留或甚至提高J695的结合特性。
此外，从本文确定的J695/IL-12 p70晶体结构明显看出，不是所有上述6个位点对于结合IL-12 p40或其他含p40的细胞因子来说都是需要的。具体来说，具有选自上述位点1、位点2、位点3、位点4、位点5和位点6的至少一个结合位点而具有如上所述允许的位点变化的抗体可以表现出与J695相比保持或甚至提高的结合特性。类似地，具有选自上述位点1至6的2、3、4、5或6个结合位点而具有如上所述允许的位点变化的抗体可以表现出与J695相比保持或甚至提高的结合特性。
因此，一个方面，本发明提供了结合IL-12和/或IL-23的p40亚基的抗体，其中所述抗体包含SEQ ID NO：1的重链可变区氨基酸序列和SEQ ID NO：2的轻链可变区氨基酸序列，其中除了SEQ IDNO：1的氨基酸残基27、32、52、53、97、101和102和SEQ ID NO：2的氨基酸残基35、51和90-101之外的任一可变区残基独立地被不同的氨基酸取代。
另一方面，本发明提供了结合IL-12和/或IL-23的p40亚基的抗体，其中所述抗体包含SEQ ID NO：1的重链可变区氨基酸序列和SEQ ID NO：2的轻链可变区氨基酸序列，其中SEQ ID NO：1的可变区氨基酸残基27、32、52、53、97、101和102和SEQ ID NO：2的可变区氨基酸残基35、51和90-101的一个或多个独立地被不同的氨基酸残基取代。在这一方面的一种实施方式中，SEQ ID NO：1的可变区氨基酸残基27、32和102的一个或多个独立地被芳香族残基取代。在其他实施方式中，SEQ ID NO：1的可变区氨基酸残基97和SEQ ID NO：2的可变区氨基酸残基35和92的一个或多个独立地被选自Lys、Arg、Tyr、Asn和G1n的氨基酸残基取代。在另外的实施方式中，SEQ ID NO：2的可变区氨基酸残基92和97的一个或多个独立地被芳香族氨基酸残基取代。在又另一种实施方式中，SEQ IDNO：1的可变区氨基酸残基101和SEQ ID NO：2的可变区氨基酸残基51的一个或多个独立地被选自Tyr、Ser、Thr、Asn和Gln的氨基酸残基取代。在进一步的实施方式中，SEQ ID NO：2的可变区氨基酸残基91独立地被Gln之外的任何氨基酸残基取代。在另一种实施方式中，SEQ ID NO：2的可变区氨基酸残基95独立地被不同的芳香族氨基酸残基取代。在又另一种实施方式中，SEQ ID NO：2的可变区氨基酸残基97被选自Phe、Tyr、Trp、His、Asp、Glu、Asn和Gln的氨基酸残基取代。在再另一种实施方式中，SEQ ID NO：2的可变区氨基酸残基90-101的一个或多个独立地被至少一个或多个不同的氨基酸取代，其中所述抗体的CDRL3长度大于或等于12个氨基酸残基。
在另外的实施方式中，本发明提供了结合IL-12和/或IL-23的p40亚基的抗体，其中所述抗体包含SEQ ID NO：1的重链可变区氨基酸序列和SEQ ID NO：2的轻链可变区氨基酸序列，其中所述抗体具有一个或多个下述取代：(a)SEQ ID NO：2的可变区氨基酸残基90-101的一个或多个独立地被至少一个或多个不同的氨基酸取代，其中所述抗体的CDRL3长度大于或等于12个氨基酸残基；(b)SEQID NO：2的可变区氨基酸残基91被Gln之外的任何氨基酸残基取代；(c)SEQ ID NO：2的可变区氨基酸残基95被不同的芳香族氨基酸残基取代；或(d)SEQ ID NO：2的可变区氨基酸残基97被选自Phe、Tyr、Trp、His、Asp、Glu、Asn和Gln的氨基酸残基取代。在另一种实施方式中，SEQ ID NO：1的可变区氨基酸残基52和53的一个或多个独立地被选自Tyr、Ser、Thr、Asn、Gln、Lys和Arg的氨基酸残基取代。
在相关的方面，本发明提供了用于改变结合IL-12和/或IL-23的p40亚基的抗体的活性的方法，其中所述抗体包含SEQ ID NO：1的重链可变区氨基酸序列和SEQ ID NO：2的轻链可变区氨基酸序列。在本发明的这一方面的一种实施方式中，所述方法包括将SEQ IDNO：1的可变区氨基酸残基27、32、52、53、97、101和102和SEQID NO：2的氨基酸残基35、51和90-101的一个或多个用不同的氨基酸残基取代，从而改变结合IL-12和/或IL-23的p40亚基的抗体的活性。在另外的实施方式中，将SEQ ID NO：1的可变区氨基酸残基27、32和102的一个或多个独立地用芳香族残基取代。在进一步的实施方式中，将SEQ ID NO：1的可变区氨基酸残基97和SEQ ID NO：2的可变区氨基酸残基35和92的一个或多个用选自Lys、Arg、Tyr、Asn和Gln的氨基酸残基取代。在又另一种实施方式中，将SEQ IDNO：2的可变区氨基酸残基92和97的一个或多个独立地用芳香族氨基酸残基取代。在再另一种实施方式中，将SEQ ID NO：1的可变区氨基酸残基101和SEQ ID NO：2的可变区氨基酸残基51的一个或多个独立地用选自Tyr、Ser、Thr、Asn和Gln的氨基酸残基取代。在另一种实施方式中，将SEQ ID NO：2的可变区氨基酸残基91用Gln之外的任何氨基酸残基取代。在另外的实施方式中，将SEQ IDNO：2的可变区氨基酸残基95用不同的芳香族氨基酸残基取代。在另一种实施方式中，将SEQ ID NO：2的可变区氨基酸残基97用选自Phe、Tyr、Trp、His、Asp、Glu、Asn和Gln的氨基酸残基取代。在另一种实施方式中，将SEQ ID NO：2的可变区氨基酸残基90-101的一个或多个独立地用至少一个或多个不同的氨基酸取代，并且其中所述抗体的CDRL3的长度大于或等于12个氨基酸残基。
在另一种实施方式中，本发明提供了用于改变结合IL-12和/或IL-23的p40亚基的抗体的活性的方法，其中所述抗体包含SEQ IDNO：1的重链可变区氨基酸序列和SEQ ID NO：2的轻链可变区氨基酸序列，其中所述抗体具有一个或多个下述取代：(a)SEQ ID NO：2的可变区氨基酸残基90-101的一个或多个独立地被至少一个或多个不同的氨基酸取代，并且其中所述抗体的CDRL3的长度大于或等于12个氨基酸残基；(b)SEQ ID NO：2的可变区氨基酸残基91被Gln之外的任何氨基酸残基取代；(c)SEQ ID NO：2的可变区氨基酸残基95被不同的芳香族氨基酸残基取代；或(d)SEQ ID NO：2的可变区氨基酸残基97被选自Phe、Tyr、Trp、His、Asp、Glu、Asn和Gln的氨基酸残基取代。在另一种实施方式中，SEQ ID NO：1的可变区氨基酸残基52和53的一个或多个独立地被选自Tyr、Ser、Thr、Asn、Gln、Lys和Arg的氨基酸残基取代。
B.根据J695 Fab/IL-12 p70复合物结构对J695做出的其他有用的改变
尽管如上所详细描述的，J695与IL-12形成大量特异性的相互作用，但对J695结合位点做出的另外的改变将提供与J695相比可能表现出保留或甚至提高的结合特性的变体抗体。尤其是，在J695与IL-12 p40之间结合位点处存在大的空隙。p40的结合仅仅部分填充结合位点的深裂隙而仍留下未填充的空隙(图9，箭头)，特别是在J695 CDR H2和L3与p40的环3和4之间。因此，解决这一空隙或其他缺陷的变异体将是有益的。这些抗体变异体预期通过4种机制表现出改进的特性：(i)形成与IL-12 p40的额外的特异性相互作用；(ii)填充存在于J695与IL-12 p40之间的空隙；(iii)限制IL-12 p40在结合到变异体抗体结合位点后的移动；或(iv)将变异体抗体预组织成多产结合构象。这四种机制的一些组合也可能产生治疗上更加有效的抗体。具体来说，可以如下所述单独或组合地对J695氨基酸序列进行5组变异。
首先，具有选自上述位点1、位点2、位点3、位点4、位点5和位点6的至少两个结合位点并另外在CDR H1的33位(例如对应于SEQ ID NO：1的氨基酸残基33)具有选自Phe、Tyr、Trp、His、Met、Val、Leu、Ile、Pro、Ala、Ser、Thr、Asn、Gln、Arg和Lys的氨基酸残基的抗体可能表现出与J695相比保留或甚至提高的结合特性。具体来说，该位置处的突变Gly-H33-Lys预期填充J695与IL-12p40氨基酸残基Glu88之间的空隙，并且LysH33和Glu88预期形成附加的盐桥相互作用。
其次，具有选自上述位点1、位点2、位点3、位点4、位点5和位点6的至少两个结合位点并另外在CDR H2的50位(例如对应于SEQ ID NO：1的氨基酸残基50)具有选自Phe、Tyr、Trp、His、Met、Gln、Arg和Lys的氨基酸残基的抗体可能表现出与J695相比保留或甚至提高的结合特性。具体来说，该位置处的突变Phe-H50-Tyr和Phe-H50-Trp预期填充J695与IL-12 p40氨基酸残基Thr92和Lys 104之间的空隙。
第三，具有选自上述位点1、位点2、位点3、位点4、位点5和位点6的至少两个结合位点并另外在CDR H2的56位(例如对应于SEQ ID NO：1的氨基酸残基57)具有选自Phe、Tyr、Trp、His、Met、Val、Leu、Ile、Pro、Ala、Ser、Thr、Asp、Glu、Asn和Gln的氨基酸残基的抗体可能表现出与J695相比保留或甚至提高的结合特性。具体来说，该位置处的突变Asn-H56-Ile和Asn-H56-Trp预期填充J695与IL-12 p40氨基酸残基Asp97和Lys 104之间的空隙，并限制IL-12 p40在结合抗体后的移动。此外，该位置处的突变Asn-H56-Ser和Asn-H56-Thr预期还另外通过在Ser Oγ(Thr中的Oγ1)与Arg Nε之间形成氢键将ArgH52预组织到多产结合构象中。
第四，具有选自上述位点1、位点2、位点3、位点4、位点5和位点6的至少两个结合位点并另外在CDR H2的95位(例如对应于SEQ ID NO：1的氨基酸残基99)具有选自Phe、Tyr、Trp、His、Met、Arg和Lys的氨基酸残基的抗体可能表现出与J695相比保留或甚至提高的结合特性。具体来说，该位置处的突变His-H95-Tyr和His-H95-Trp预期填充J695与IL-12p40氨基酸残基Glu86之间的空隙，并限制IL-12 p40在结合抗体后的移动。此外，该位置处的突变His-H95-Tyr预期还另外在Tyr Oη与Glu86的羰基氧之间形成氢键。
第五，具有选自上述位点1、位点2、位点3、位点4、位点5和位点6的至少两个结合位点并另外在CDR L1的32位(例如对应于SEQ ID NO：2的氨基酸残基33)具有选自Phe、Tyr、Trp、His、Gln和Lys的氨基酸残基的抗体可能表现出与J695相比保留或甚至提高的结合特性。具体来说，该位置处的突变Thr-L32-Tyr和Thr-L32-Trp预期填充J695与IL-12 p40氨基酸残基Gly88之间的空隙。
因此，一个方面，本发明还提供了结合IL-12和/或IL-23的p40亚基的抗体，其中所述抗体包含SEQ ID NO：1的重链可变区氨基酸序列和SEQ ID NO：2的轻链可变区氨基酸序列，其中SEQ ID NO：1的可变区氨基酸残基33、50、57和99以及SEQ ID NO：2的可变区氨基酸残基33的一个或多个独立地被不同氨基酸残基取代。在一种实施方式中，SEQ ID NO：1的可变区氨基酸残基33被选自Phe、Tyr、Trp、His、Met、Val、Leu、Ile、Pro、Ala、Ser、Thr、Asn、Gln、Arg和Lys的氨基酸残基取代。在另一种实施方式中，SEQ ID NO：l的可变区氨基酸残基33被Lys取代。在进一步的实施方式中，SEQ IDNO：1的可变区氨基酸残基50被选自Phe、Tyr、Trp、His、Met、Gln、Arg和Lys的氨基酸残基取代。在再另一种实施方式中，SEQ IDNO：1的可变区氨基酸残基50被Tyr或Trp取代。
在另一种实施方式中，SEQ ID NO：1的可变区氨基酸残基57被选自Phe、Tyr、Trp、His、Met、Val、Leu、Ile、Pro、Ala、Ser、Thr、Asp、Glu、Asn和Gln的氨基酸残基取代。在另一种实施方式中，SEQ ID NO：1的可变区氨基酸残基57被Ile或Trp取代。在又另一种实施方式中，SEQ ID NO：1的可变区氨基酸残基57被Ser或Thr取代。在进一步的实施方式中，SEQ ID NO：1的可变区氨基酸残基99被选自Phe、Tyr、Trp、His、Met、Arg和Lys的氨基酸残基取代。在另一种实施方式中，SEQ ID NO：1的可变区氨基酸残基99被Tyr或Trp取代。在另外的实施方式中，SEQ ID NO：2的可变区氨基酸残基33被选自Phe、Tyr、Trp、His、Gln和Lys的氨基酸残基取代。在进一步的实施方式中，SEQ ID NO：2的可变区氨基酸残基33被Tyr或Trp取代。
另一方面，本发明提供了能够发生竞争性结合、即竞争性抑制本文描述的任何抗体的抗体。因此，在另一种实施方式中，本发明包含与本文中描述的任何抗体物质竞争对IL-12和/或IL-23的p40亚基的结合的抗体。
另一方面，本发明提供了改变结合IL-12和/或IL-23的p40亚基的抗体的活性的方法，其中所述抗体包含SEQ ID NO：1的重链可变区氨基酸序列和SEQ ID NO：2的轻链可变区氨基酸序列，所述方法包括将SEQ ID NO：1的可变区氨基酸残基33、50、57和99以及SEQID NO：2的可变区氨基酸残基33的一个或多个用不同的氨基酸残基取代，从而改变结合IL-12和/或IL-23的p40亚基的抗体的活性。在该方法的一种实施方式中，SEQ ID NO：1的可变区氨基酸残基33被选自Phe、Tyr、Trp、His、Met、Val、Leu、Ile、Pro、Ala、Ser、Thr、Asn、Gln、Arg和Lys的氨基酸残基取代。在另一种实施方式中，SEQ ID NO：1的可变区氨基酸残基33被Lys取代。在另外的实施方式中，SEQ ID NO：1的可变区氨基酸残基50被选自Phe、Tyr、Trp、His、Met、Gln、Arg和Lys的氨基酸残基取代。在进一步的实施方式中，SEQ ID NO：1的可变区氨基酸残基50被Tyr或Trp取代。在另一种实施方式中，SEQ ID NO：1的可变区氨基酸残基57被选自Phe、Tyr、Trp、His、Met、Val、Leu、Ile、Pro、Ala、Ser、Thr、Asp、Glu、Asn和Gln的氨基酸残基取代。在另外的实施方式中，SEQ ID NO：1的可变区氨基酸残基57被Ile或Trp取代。在再另一种实施方式中，SEQ ID NO：1的可变区氨基酸残基57被Ser或Thr取代。在又另一种实施方式中，SEQ ID NO：1的可变区氨基酸残基99被选自Phe、Tyr、Trp、His、Met、Arg和Lys的氨基酸残基取代。在另一种实施方式中，SEQ ID NO：1的可变区氨基酸残基99被Tyr或Trp取代。在进一步的实施方式中，SEQ ID NO：2的可变区氨基酸残基33被选自Phe、Tyr、Trp、His、Gln和Lys的氨基酸残基取代。在又另一种实施方式中，SEQ ID NO：2的可变区氨基酸残基33被Tyr或Trp取代。
在进一步的方面中，本发明提供并涵盖了本文中所描述的抗体，包括按照本文描述的任何方法产生的抗体。例如，在本文描述的任何抗体实施方式中，抗体以1x10-3M-1或以下的Koff或者1x10-10M或以下的Kd结合IL-12和/或IL-23的p40亚基。此外，在本发明所涵盖的任何抗体实施方式中，抗体中和IL-12和/或IL-23的p40亚基的生物活性。本发明所涵盖的抗体的功能特征在下面的部分V(C)中进一步讨论。
在再进一步的方面中，本发明的抗体不是本领域中现有的并且固有地结合本说明书中确定的表位的任一抗体。例如，在一种实施方式中，本发明的抗体不是U.S.6,914,128中所描述的抗体，例如不是抗体Y61或J695(如U.S.6,914,129中所描述的，在此以其全文引为参考)。
C.基于其他抗IL-12抗体的表位确定的抗体
使用大鼠/人IL-12 p40嵌合蛋白(或“嵌合体”)途径确定其他抗IL-12抗体的表位。表达并纯化了在特定位置处掺有某些大鼠IL-12 p40氨基酸残基的主要为人IL-12 p40的分子。使用表面等离子体共振结合分析来测定这些嵌合体以及IL-12对照蛋白(例如人和大鼠IL-12 p40和/或p70)与一组抗体(例如下面进一步描述的J695、C8.6.2或C 11.5.14)的结合。此外，类似地表达、纯化和分析了在特定位置处掺有某些人IL-12 p40氨基酸残基的主要为大鼠的IL-12p40的嵌合体。
1.人/大鼠和大鼠/人IL-12 p40嵌合体的制备
在位于IL-12 p40内的几个不同位点中发现了在IL-12 p40嵌合体中突变的特定氨基酸残基。所测试的人/大鼠IL-12 p40嵌合体列于表1中，和大鼠/人IL-12 p40嵌合体列于表2中。
表1.制备并用于抗体结合测试的主要为人IL-12 p40的嵌合体
人嵌合体 相对于大鼠p40序列突变的残基 位点
1 Y16R 7a
2 D87N 7b
3 D93E 7c
4 D87N&D93E 7b，7c
5 D87N&P101F 7b，11
6 40-47 8
7 40-47&97-101 8，11
8 97-101 11
9 G35D&G61L 9，10
10 157-164 12
11 无(对照) N/A
表2.制备并用于抗体结合测试的主要为大鼠IL-12 p40的嵌合体
大鼠嵌合体 相对于人p40序列突变的残基 位点
A R16Y 7a
B N87D 7b
C E93D 7c
D R16Y，N87D，E93D 7
如下所述进行用于制备嵌合体的表达质粒的克隆和构建。编码人IL-12p40(购自于InvivoGen，CA，目录号porf-hill2)亚基的cDNA通过Expand Polymerase试剂盒(Roche)使用引物5′-CAC CAT GGGTCA CCA GCA GTT GGT C-3′(SEQ ID NO：7)和5′-ACC CTG GAAGTA CAG GTT TTC ACT GCA GGG CAC AGA TGC CCA TTC GC-3′(SEQ ID NO：8)进行PCR扩增。使用Gateway BP反应(Invitrogen)将得到的1009bp产物克隆到pENTR/D-TOPO中。按照制造商的说明，使用Quick-Change XL定点诱变试剂盒，利用pENTR/D-hIL-12p40质粒作为模板并使用表2.1中列出的寡核苷酸引物进行定点诱变。所需突变的存在通过DNA测序来验证。在突变后，使用Gateway LR反应将野生型hIL-12p40和突变体亚克隆到哺乳动物表达载体pcDNA DEST40中，以制备pcDNA DEST40-hIL-12p40及其变异体。
IL-12p40嵌合蛋白质通过瞬时转染到HEK293.F细胞中进行表达。将HEK293.F细胞在250mL锥形瓶(Corning，NY)中，在Freestyle293表达培养基(Invitrogen)中，在8％CO2和37℃下进行培养。对于各种构建体，在100mL锥形瓶中，以30mL的规模使用293fectin用30μg质粒DNA转染30x106个细胞。将细胞在37℃下、在加湿的8％CO2气氛中振摇温育。72hr后，收集细胞，并通过Western印迹分析上清液中分泌的IL-12p40。将含有hIL-12p40的上清液直接用于下面描述的后续结合分析中。
表2.1.引物列表：正向引物(F)和反向引物(R)
Figure BPA00001751564500771
Figure BPA00001751564500781
2.人/大鼠和大鼠/人嵌合体形成IL-12p40上的7个另外的位点
由IL-12 p40嵌合体定义和描绘的7个另外的“位点”以在图11中与几个IL-12 p40的氨基酸序列的比对的关系示出，并在图6、12和13中以相对于IL-12 p70(和结合的J695)的三维结构的关系示出。这些位点在下面更详细地描述，并概述在下面的表3中。
位点7包含人IL-12 p40的氨基酸残基Tyr16、Asp87和Asp93。这些残基位于IL-12 p40的结构域1的两个不同的表面环上(Yoon，C，S.C.Johnston等，(2000)，Charged residues dominate a uniqueinterlocking topography in the heterodimeric cytokine interleukin-12，The EMBO Journal 19(14)：3530-3521)。单独来看，位点7的残基限定了不连续(或构象)表位，如由J695/IL-12 p70复合物的晶体结构所揭示的。位点7可以被认为由3个子位点，即子位点7a(Tyr16)、子位点7b(Asp87)和子位点7c(Asp93)构成。
位点8包含人IL-12 p40的氨基酸残基Leu40、Asp41、Gln42、Ser43、Ser44、Glu45、Val46和Leu47。这些残基在IL-12 p40的结构域1上形成表面环(Yoon，C，S.C.Johnston等，(2000)，Chargedresidues dominate a unique interlocking topography in the heterodimericcytokine interleukin-12，The EMBO Journal 19(14)：3530-3521)。单独来看，位点8的残基限定了连续(或线性)表位。
位点9包含人IL-12 p40的氨基酸残基Gly35。该残基位于IL-12p40的结构域1的表面环上(Yoon，C，S.C.Johnston等，(2000)，Charged residues dominate a unique interlocking topography in theheterodimeric cytokine interleukin-12，The EMBO Journal 19(14)：3530-3521)，位于位点8的环的一侧上(与位点10相反的一侧；参见下文)。单独来看，位点9的残基限定了连续(或线性)表位。
位点10包含人IL-12 p40的氨基酸残基Gly61。该残基位于IL-12p40的结构域1的表面环上(Yoon，C，S.C.Johnston等，(2000)，Charged residues dominate a unique interlocking topography in theheterodimeric cytokine interleukin-12，The EMBO Journal 19(14)：3530-3521)，位于位点8的环的一侧上(与位点9相反的一侧；参见上文)。单独来看，位点10的残基定义了连续(或线性)表位。
位点11包含人IL-12 p40的氨基酸残基Asp97、Gln98、Lys99、Glu100和Pro101。这些残基在IL-12 p40的结构域1上形成表面环(Yoon，C，S.C.Johnston等，(2000)，Charged residues dominate aunique interlocking topography in the heterodimeric cytokineinterleukin-12，The EMBO Journal 19(14)：3530-3521)。单独来看，位点11的残基限定了连续(或线性)表位。
位点12包含人IL-12 p40的氨基酸残基Arg157、Val158、Arg159、Gly160、Asp161、Asn162、Lys163和Glu164。这些残基在IL-12 p40的结构域2上形成(无序的)表面环(Yoon，C，S.C.Johnston等，(2000)，Charged residues dominate a unique interlocking topographyin the heterodimeric cytokine interleukin-12，The EMBO Journal 19(14)：3530-3521)；该环在本文描述的J695 Fab/IL-12 p70复合结构中是有序的。单独来看，位点12的残基限定了连续(或线性)表位。
表3：位点7-12的概述
Figure BPA00001751564500801
大鼠/人IL-12 p40嵌合体与各种抗体的结合通过表面等离子体共振来分析。具体来说，通过首先用100mM N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)和400mM N-乙基-N′-(3-二甲基氨基丙基)-碳二亚胺盐酸盐(EDC)将基质上的羧基活化，将抗体经游离胺基共价连接到Biacore芯片葡聚糖基质上。这在4个不同流动池上完成。将在pH 4.5的乙酸钠中稀释的约50微升各种抗体(25μg/mL)通过活化的生物传感器注射，并使蛋白质上的游离胺直接结合活化的羧基。通常，5000个共振单位被固定化。通过注入1M乙醇胺使未反应的基质EDC-酯失活。
为了确定几种不同单克隆抗体针对IL-12p40上清液样品的表位模式，进行了直接结合分析。将重组人IL-12p40(100nM)的等分试样以25mL/min的流速通过Biacore葡聚糖芯片生物传感器表面上共价固定的抗体注射。在注射抗原之前和紧接其之后，使HBS-EP缓冲液单独流过各个流动池。获取基线与对应于配体注入完成后约30秒的时间点之间的净信号差用于表示最终结合值(约500-2500RU)。以共振单位(RU)测量响应。只有在第一探针与靶分子的结合快速且强的情况下，才宣示正的成对结合传感图(positive pair-wise binding sensorgram)。使用10mM HCl(5min接触时间)将有共价固定抗体偶联的表面完全再生，并在20个循环内保留其完全的结合能力。
通过表面等离子体共振对人/大鼠和大鼠/人IL-12 p40嵌合体获得的结合数据的概况总结在下面的表3.1中。
表3.1.使用具有相应大鼠p40残基的突变的人IL-12 p40嵌合体获得的表面等离子体共振结合数据的总结。
Figure BPA00001751564500811
*嵌合体列于表3中。数据总结为：“ND”，没有测量到数据；“-”，无效应；“±”弱效应(略微更快的koff)；“+”，强效应(快得多的koff)；“++”，极强效应(没有观察到显著结合)。
3.如通过人/大鼠IL-12 p40嵌合体的结合分析确定的7个另外 的IL-12 p40表位的描绘和定义
使用上述的嵌合体和表面等离子体共振方法，描绘并定义了在晶体学确定的J695表位(如上面部分II-V中所述)之外的7个另外的IL-12p40表位。使用嵌合体和表面等离子体共振方法确认的表位1包含落于晶体学确定的J695表位内的氨基酸残基，并因此证实了晶体学确定的J695表位。抗体/嵌合体结合数据概述在上面的表3.1中。这些表位包含IL-12 p40表面上的如上所述的一个或多个抗原性“位点”。这些位点在图11中相对于与几种IL-12 p40的氨基酸序列的比对示出，在图6、12和13中相对于IL-12 p70(及结合的J695)的三维结构示出。另外6个表位、即表位2、3.1或3.2、4a、4b、4c和5示意性地显示在图14中。所有8个表位、即表位1-5(即表位1、2、3.1或3.2、4a、4b、4c和5)概述在表4中并在下面详细描述。
表4.通过使用具有相应的大鼠p40残基的突变的人IL-12 p40嵌合体获得的表面等离子体共振结合数据确定的表位的概述
Figure BPA00001751564500821
表位1.在表位1处结合IL-12 p40的抗体包括：J695(如PCT公开号WO0056772 A1中所述)。在位点7a(Tyr16)和7b(Asp87)处的突变消除了结合；在位点7c(Asp93)处的突变具有较小效应。该生物化学确定的表位与通过晶体学观察到的相一致。
表位2.在表位2处结合IL-12 p40的抗体包括：人源化单克隆抗体8E1.1。抗体8E11.1的描述至少可以在US 7,700,739中发现，在此以其全部内容、特别是抗体8E11.1的描述引为参考。位点7a(Tyr16)、7b(Asp87)和11(Asp97、Gln98、Lys99、Glu100和Pro101)处的突变对结合具有强效应；位点7c(Asp93)处的突变具有较弱效应。表位2明显与表位1相关，但是位点11处的突变对8E1.1的结合而不是J695结合的强效应将两个表位区分开。
表位3.在表位3处结合IL-12 p40的抗体包括：人源化单克隆抗体1A6.1。抗体1A6.1的描述至少可以在US 7,700,739中发现，在此以其全部内容、特别是抗体1A6.1的描述引为参考。位点9(Gly35)和10(Gly61)处的突变一起对结合具有强效应。这两个残基仅一起突变。单独地，不可能确定表位3由一个甘氨酸还是由另一个甘氨酸还是由两者所限定。但是，位点8(Leu40、Asp41、Gln42、Ser43、Ser44、Glu45、Val46和Leu47)处的突变完全缺乏效应，结合IL-12p40的三维结构的知识，表明表位3由与位点9以及在最小尺寸抗体结合位点的情况下(Davies，D.R.，E.A.Padlan等，1990，Antibody-antigen complexes，Annu Rev Biochem 59：439-73；Davies，D.R.和G.H.Cohen 1996，Interactions of protein antigens with antibodies，Proc Natl Acad Sci U S A 93(1)：7-12)位点9(Gly35)周围位点8远端的其他残基即表位3.1、或与位点10(Gly61)和位点10周围位点8远端的其他残基即表位3.2的结合所限定，而不是与这两者结合。真正的表位3是3.1和3.2中的一个或另一个，而不是两者。
表位4.在表位4处结合IL-12 p40的抗体包括参比鼠抗体C8.6.2(D′Andrea，A.，M.Rengaraju等，(1992)，Production of natural killercell stimulatory factor(interleukin 12)by peripheral blood mononuclearcells，J.Exp.Med.176：1387-1398)和三种人源化单克隆抗体，即3G7.2、1D4.1和1D4.7。抗体3G7.2、1D4.1和1D4.7的描述至少可以在US 7,700,739中发现，在此以其全部内容、特别是抗体3G7.2、1D4.1和1D4.7的描述引为参考。位点8(Leu40、Asp41、Gln42、Ser43、Ser44、Glu45、Val46和Leu47)处的突变强烈影响结合，并且位点9(Gly35)或位点10(Gly61)处的突变具有弱或强的效应。同样从IL-12 p40的三维结构的知识得知，由于位点8两侧为位点9和10，因此这些抗体中的任一种的结合可以是与位点8和9、位点8和10或者位点8、9和10。因此，表位4实际上限定了一族相关的、部分重叠的表位，即表位4a(位点8和9)、表位4b(位点8和10)和表位4c(位点8、9和10)。抗体C8.6.2、3G7.2、1D4.1和1D4.7各自可以结合选自表位4a、4b和4c的列表中的任一表位；它们不限于结合相同的表位。
表位5.在表位5处结合IL-12 p40的抗体包括参比鼠类抗体C11.5.14(D′Andrea，A.，M.Rengaraju等，(1992)，Production ofnatural killer cell stimulatory factor(interleukin 12)by peripheral bloodmononuclear cells，J.Exp.Med.176：1387-1398)。位点12(Arg157、Val158、Arg159、Gly160、Asp161、Asn162、Lys163和Glu164)处的突变消除了C11.5.14的结合，且位点11处的突变具有弱的效应(Asp97、Gln98、Lys99、Glu100和Pro101)。这些限定了表位5的源自于嵌合体的结合结果与通过在硫氧还蛋白/鞭毛蛋白融合蛋白上的“FLITRX”肽展示所确定的以前确定的C11.5.14表位相一致(Lu，Z.，K.S.Murray等，(1995)，Expression of thioredoxin random peptidelibraries on the Escherichia coli cell surface as functional fusions toflagellin：a system designed for exploring protein-protein interactions，Biotechnology(NY)13(4)：366-72)。
因此，另外的方面，本发明提供了结合IL-12和/或IL-23的p40亚基的抗体，其中所述抗体结合构象表位。在一种实施方式中，所述构象表位包含选自SEQ ID NO：3的氨基酸序列的氨基酸残基16、87和93的至少一个氨基酸残基(例如表位1，包含位点7a-c)。在另一种实施方式中，抗体结合氨基酸残基16(即位点7a)。应该理解，在某些实施方式中，当指称结合表位(例如构象表位)的本发明抗体时，本发明是指仅仅结合抗原例如IL-12和/或IL-23的p40亚基的线性氨基酸序列中构成所述表位的那些特定残基而不是其他残基的抗体。
另一方面，本发明提供了结合IL-12和/或IL-23的p40亚基的抗体，其中所述抗体结合包含选自SEQ ID NO：3的氨基酸序列的氨基酸残基16、87和93的至少一个氨基酸残基的构象表位(例如表位1，包含位点7a-c)和US 2009/0202549中描述的任何表位，所述专利公开在此以其全文引为参考。
在另外的方面，本发明提供了结合IL-12和/或IL-23的p40亚基的抗体，其中所述抗体结合包含选自SEQ ID NO：3的氨基酸残基97、98、99、100和101的至少一个氨基酸残基的构象表位(例如表位2，包含位点7a、7b和11)。另一方面，本发明提供了结合IL-12和/或IL-23的p40亚基的抗体，其中所述抗体结合包含选自SEQ ID NO：3的氨基酸残基16、87、93、97、98、99、100和101的至少一个氨基酸残基的构象表位(例如表位2，包含位点7a、7b及11和7c)。
在另外的方面，本发明提供了结合IL-12和/或IL-23的p40亚基的抗体，其中所述抗体结合包含选自SEQ ID NO：3的氨基酸残基35和36的至少一个氨基酸残基的构象表位(例如表位3，包含位点9或10)。在一种实施方式中，抗体结合IL-12和/或IL-23的p40亚基，所述抗体结合包含SEQ ID NO：3的氨基酸残基35或氨基酸残基36的构象表位(例如表位3，包含位点9或10)。在相关的方面，本发明提供了结合IL-12和/或IL-23的p40亚基的抗体，其中所述抗体结合包含SEQ ID NO：3的氨基酸残基93并进一步包含氨基酸残基35或氨基酸残基36的构象表位(例如表位3，包含位点9或10和7c)。
在另外的方面，本发明提供了结合IL-12和/或IL-23的p40亚基的抗体，其中所述抗体结合包含选自SEQ ID NO：3的氨基酸残基40-47和35的至少一个氨基酸残基的构象表位(例如表位4a，包含位点8和9)。在相关方面，本发明提供了结合IL-12和/或IL-23的p40亚基的抗体，其中所述抗体结合包含选自SEQ ID NO：3的氨基酸残基40-47和61的至少一个氨基酸残基的构象表位(例如表位4b，包含位点8和10)。在进一步的相关方面，本发明提供了结合IL-12和/或IL-23的p40亚基的抗体，其中所述抗体结合包含选自SEQ IDNO：3的氨基酸残基40-47、35和62的至少一个氨基酸残基的构象表位(例如表位4c，包含位点8、9和10)。
在另外的方面，本发明提供了结合IL-12和/或IL-23的p40亚基的抗体，其中所述抗体结合包含选自SEQ ID NO：3的氨基酸残基157-164的至少一个氨基酸残基的构象表位(例如表位5，包含位点12)。
在一种实施方式中，抗体不结合下列一个或多个表位：(a)包含选自SEQ ID NO：3的氨基酸序列的残基16、87和97-101的至少一个氨基酸残基的构象表位(例如表位2，包含位点7a、7b和11)；(b)包含选自SEQ ID NO：3的氨基酸序列的残基35和61的至少一个氨基酸残基的构象表位(例如表位3，包含位点9或10)；(c)包含选自SEQ ID NO：3的氨基酸序列的残基40-47、35和61的至少一个氨基酸残基的构象表位(例如表位4a-c，包含位点8、9和/或10)；以及(c)包含选自SEQ ID NO：3的氨基酸序列的残基157-164的至少一个氨基酸残基的连续表位(例如表位5，包含位点12)。
4.通过人/大鼠IL-12 p40嵌合体的结合分析与J695 Fab/IL-12 p70晶体结构的知识结合所确定的另外的IL-12 p40结合位点的说明
从上述使用人/大鼠IL-12 p40嵌合体获得的表面等离子体共振结合数据与J695 Fab/IL-12 p70的晶体结构所提供的这些位点的三维配置的知识相结合可以确定另外的结合位点。这些另外的抗体结合位点示出在图15中。
例如，如上面在针对表位3.1和3.2所述的，人源化单克隆抗体1A6.1结合位点9(Gly35)或位点10(Gly61)，但是不同时结合两者，因为在抗体组合位点的尺寸和形状已知的情况下，同时的结合与位点8(Leu40、Asp41、Gln42、Ser43、Ser44、Glu45、Val46和Leu47)处的突变完全缺乏对结合的效应不一致(Davies，D.R.，E.A.Padlan等，1990，Antibody-antigen complexes，Annu Rev Biochem 59：439-73；Davies，D.R.和G.H.Cohen 1996，Interactions of proteinantigens with antibodies，Proc Natl Acad Sci U S A 93(1)：7-12)。
因此，抗体1A6.1结合位点9和位点9(Gly35)周围位点8远端的其他残基、即表位3.1；或者，抗体1A6.1结合位点10和位点10(Gly61)周围位点8远端的其他残基、即表位3.2。这些大部分位于IL-12 p40的表面暴露环上的“其他残基”如下所定义：
位点13，其位于位点9附近但在位点8远端，包含IL-12 p40的氨基酸残基Pro31、Glu32、Glu33、Asp34、Ile36、Thr37、Trp38和Thr39。
位点14，其位于位点9附近但在位点8远端，包含IL-12 p40的氨基酸残基Gly48、Ser49、Gly50、Lys51、Thr52、Leu53和Thr54。
位点15，其位于位点9附近但在位点8远端，包含IL-12 p40的氨基酸残基Gly64、Gln65、Thr67、Lys68、His69、Lys70、Gly71、Gly72、Glu73、Val74、Leu75、Ser76和His77。
位点16，其位于位点10附近但在位点8远端，包含IL-12 p40的氨基酸残基Ile55、Gln56、Val57、Ly58、Glu59、Phe60、Asp62、Ala63和Tyr66。
位点17，其位于位点10附近但在位点8远端，包含IL-12 p40的氨基酸残基Thr124、Thr125、Ile126、Ser127、Thr128、Asp129、Leu130和Thr131。
位点18，其位于位点10附近但是在位点8远端，包含IL-12 p40的氨基酸残基His194、Lys195、Leu196和Lys197。
因此，本发明还提供了一类抗体，其结合位点9但不结合位点8，并且另外结合选自位点13、位点14和位点15的一个或多个位点。此外，本发明提供了一类抗体，其结合位点10但不结合位点8，并且另外结合选自位点16、位点17和位点18的一个或多个位点。此外，由于这些位点9、10和13-17的三维配置，本发明还提供了结合位点9但不结合位点8，并且另外结合选自位点13、位点14、位点15、位点16、位点17和位点18的一个或多个位点的抗体。本发明还提供了结合位点10但不结合位点8，并且另外结合选自位点13、位点14、位点15、位点16、位点17和位点18的一个或多个位点的抗体。
D.工程化和修饰的抗体
抗体的VH和/或VL序列按照本发明的方法制备，并可用作起始材料以工程化改造修饰的抗体，该修饰抗体与起始抗体相比可以具有改变的性质。可以通过改变一个或两个原始可变区(即VH和/或VL)内(例如一个或多个CDR区内和/或一个或多个框架区内)的一个或多个残基对抗体进行工程化。附加地或可选地，可以通过改变恒定区内的残基对抗体进行工程化，例如以改变抗体的效应子功能。
可以进行的一种类型的可变区工程化是CDR嫁接。抗体主要通过位于6个重链和轻链互补决定区(CDR)中的氨基酸残基与靶抗原相互作用。因为这一原因，CDR内的氨基酸序列在单个抗体之间比CDR外的序列具有更高多样性。由于CDR序列负责大部分抗体-抗原相互作用，因此有可能通过构建包括嫁接到来自具有不同性质的不同抗体的框架序列上的来自于特定天然存在抗体的CDR序列的表达载体来表达模拟特定天然存在抗体的性质的重组抗体(参见例如Riechmann，L.等，(1998)Nature 332：323-327；Jones，P.等，(1986)Nature 321：522-525；Queen，C.等，(1989)Proc.Natl.Acad.See.US.A.86：10029-10033；Winter的美国专利号5,225,539，以及Queen等的美国专利号5,530,101、5,585,089、5,693,762和6,180,370)。
抗体的框架序列可以从包括种系抗体基因序列的公共DNA数据库或已发表的参考文献获得。例如，人重链和轻链可变区基因的种系DNA序列可以在“VBase”人种系序列数据库(可以在英特网上mrc-cpe.cam.ac.uk/vbase网址处获得)以及下述文献中找到：Kabat，E.A.等，(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest，第五版，U.S.Department of Health and Human Services，NIH出版号91-3242；Tomlinson，I.M.等，(1992)，The Repertoire of HumanGermline VH Sequences Reveals about Fifty Groups of VH Segmentswith Different Hypervariable Loops，J.Mol.Biol.227：776-798；和Cox，J.P.L.等，(1994)A Directory of Human Germ-line VH SegmentsReveals a Strong Bias in their Usage，Eur.J.Immunol.24：827-836，各所述文献的内容在此明确引为参考。作为另一个实例，人重链和轻链可变区基因的种系DNA序列可以在Genbank数据库中发现。
在一种实施方式中，本发明的结合IL-12/IL-23的p40亚基的抗体包含源自于种系序列的VH3家族的重链可变区和源自于种系序列的Vλ1家族的轻链可变区。此外，专业技术人员会认识到，VH3家族重链序列的任何成员可以与Vλ1家族轻链序列的任何成员组合。
使用本领域技术人员公知的被称为Gapped BLAST的一种序列相似性检索方法(Altschul等，(1997)Nucleic Acids Research25：3389-3402)，将抗体蛋白序列针对汇编的蛋白序列进行比较。BLAST是一种启发式算法，其中抗体序列与数据库序列之间的统计学显著的比对可能含有被比对字段的高分序对(HSP)。其分值不能通过延长或修剪来提高的片段对被称为命中(hit)。简单来说，将VBASE来源(vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/vbasel/list2.php)的核苷酸序列翻译，并保留FR1至FR3框架区之间并包括它们的区域。数据库序列具有98个残基的平均长度。除去在整个蛋白质长度上精确匹配的复本序列。使用blastp程序以缺省的标准参数(除了将低复杂度过滤器关闭之外)并使用BLOSUM62取代矩阵，用于产生序列匹配的前5位命中的过滤器，对蛋白质进行BLAST检索。将核苷酸序列在所有6个框中进行翻译，并将在数据库序列的匹配区段中没有终止密码子的框当作潜在的命中。进而使用BLAST程序tblastx对其进行验证，所述程序将抗体序列在所有6个框中翻译，并将那些翻译与在所有6个框中动态翻译的VBASE核苷酸序列进行比较。其他人种系序列数据库，例如可以从IMGT(http://imgt.cines.fr)获得的，可以如上所述与VBASE类似地进行检索。
同一性是抗体序列与蛋白质数据库之间在整个序列长度上精确的氨基酸匹配。阳性(同一性+取代匹配)不是相同的，而是由BLOSUM62取代矩阵指导氨基酸取代。如果抗体序列以相同的同一性与数据库序列中的两个匹配，具有最高阳性的命中将被决定作为匹配序列命中。
确认的VH CDR1、CDR2和CDR3序列以及VL CDR1、CDR2和CDR3序列可以被嫁接到具有与框架序列所来源的种系免疫球蛋白基因中发现的相同序列的框架区上，或者CDR序列可以被嫁接到与种系序列相比含有一个或多个突变的框架区上。例如，已发现在某些情况下，将框架区内的残基进行突变以维持或提高抗体的抗原结合能力是有益的(参见例如Queen等的美国专利号5,530,101、5,585,089、5,693,762和6,180,370)。
另一种类型的可变区修饰是突变VH和/或VLCDR1、CDR2和/或CDR3区域内的氨基酸残基，从而改善目标抗体的一种或多种结合性质(例如亲和性)。可以进行定点诱变或PCR介导的诱变来引入突变，并且可以在本领域已知的体外或体内分析中评估对抗体结合的影响或其他感兴趣的功能性质。例如，可以将本发明的抗体突变以产生文库，然后可以对其与IL-12/IL-23的p40亚基的结合进行筛选。优选地引入保守修饰(如上面讨论的)。突变可以是氨基酸置换、添加或缺失，但优选为置换。此外，通常CDR区内不超过1、2、3、4或5个残基发生改变。
另一种类型的框架修饰涉及对框架区内或甚至一个或多个CDR区内的一个或多个残基进行突变以移除T细胞表位，从而降低抗体的潜在的免疫原性。这种方法也被称为“去免疫化”，并进一步详细描述在Carr等的美国专利公开号20030153043中。
在框架或CDR区内进行的修饰之外或作为替代，可以对本发明的抗体进行工程化以在Fc区内包含修饰，通常用于改变抗体的一种或多种功能性质、例如血清半衰期、补体结合、Fc受体结合和/或抗原依赖性细胞毒性。此外，本发明的抗体可以被化学修饰(例如可以将一种或多种化学部分附接于抗体上)或进行修饰以改变其糖基化而再改变抗体的一种或多种功能性质。这些实施方式各自在下面进一步详细描述。Fc区中的残基的编号是Kabat的EU指数。
在一种实施方式中，对CH1的铰链区进行修饰以便改变例如增加或减少铰链区中半胱氨酸残基的数目。这种方法进一步描述在Bodmer等的美国专利号5,677,425中。改变CH1的铰链区中半胱氨酸残基的数目是为了例如便于轻链和重链的组装或提高或降低抗体的稳定性。
在另一种实施方式中，将抗体的Fc铰链区进行突变以降低抗体的生物半衰期。更具体来说，在Fc-铰链片段的CH2-CH3结构域界面区中引入一个或多个氨基酸突变，以使得抗体相对于天然的Fc-铰链结构域SpA结合具有减弱的链球菌蛋白A(SpA)结合。这种方法进一步详细描述在Ward等的美国专利号6,165,745中。
在另一种实施方式中，对抗体进行修饰以增加其生物半衰期。可能使用各种方法。例如，如Ward的美国专利号6,277,375中所述，可以引入一个或多个下列突变：T252L，T254S，T256F。或者，为了增加生物半衰期，抗体可以在CH1或CL区内改变以包含从IgG的Fc区CH2结构域的两个环获得的补救受体结合表位，如Presta等的美国专利号5,869,046和6,121,022中所述。只要抗体与IL-12/IL-23的p40亚基的结合不受影响，这些策略将是有效的。
在再其它的实施方式中，通过用不同氨基酸残基替代至少一个氨基酸残基来改变Fc区以改变抗体的效应子功能。例如，可以将选自氨基酸残基234、235、236、237、297、318、320和322的一个或多个氨基酸用不同氨基酸残基替代，以使得抗体对效应子配体具有改变的亲和性但保留亲本抗体的抗原结合能力。与其亲和性被改变的效应子配体可以是例如Fc受体或补体的C1成分。这种方法进一步详细描述在Winter等的美国专利号5,624,821和5,648,260中。
在另一个实例中，可以将选自氨基酸残基329、331和322的一个或多个氨基酸用不同的氨基酸残基替代，以使得抗体具有改变的C1q结合和/或降低或消除的补体依赖性细胞毒性(CDC)。这种方法进一步详细描述在Idusogie等的美国专利6,194,551中。
在另一个实例中，改变231和239位氨基酸中的一个或多个氨基酸残基从而改变抗体固定补体的能力。这种方法进一步描述在Bodmer等的PCT公布号WO 94/29351中。
在又另一个实例中，通过改变下列位置处的一个或多个氨基酸对Fc区进行修饰以提高抗体介导抗体依赖性细胞毒性(ADCC)的能力和/或提高抗体对Fcγ受体的亲和性：238，239，248，249，252，254，255，256，258，265，267，268，269，270，272，276，278，280，283，285，286，289，290，292，293，294，295，296，298，301，303，305，307，309，312，315，320，322，324，326，327，329，330，331，333，334，335，337，338，340，360，373，376，378，382，388，389，398，414，416，419，430，434，435，437，438或439。这种方法进一步描述在Presta的PCT公布WO 00/42072中。此外，人IgG1上对FcγR1、FcγRII、FcγRIII和FcRn的结合位点已被作图，并且具有改进的结合的变异体已被描述(参见Shields，R.L.等，(2001)J.Biol.Chem.276：6591-6604)。256、290、298、333、334和339位处的特定突变已证明改善与FcγRIII的结合。此外，下列组合突变体已显示改善FcγRIII结合：T256A/S298A、S298A/E333A、S298A/K224A和S298A/E333A/K334A。
在又另一种实施方式中，如在此以其全文引为参考的国际PCT申请号PCT/US08/73569(PCT公布号WO 2009/026274)中所描述的，通过引入半胱氨酸残基对本发明的抗体的C-末端进行修饰。这样的修饰包括但不限于替代全长重链序列的C-末端处或附近的现有氨基酸残基，以及向全长重链序列的C-末端引入含半胱氨酸的延伸。在优选实施方式中，含有半胱氨酸的延伸包含序列丙氨酸-丙氨酸-半胱氨酸(从N-端到C-端)。
在优选实施方式中，这样的C-末端半胱氨酸修饰的存在为伴体分子例如治疗剂或标志物分子的偶联提供了位置。具体来说，由于C-末端半胱氨酸修饰，反应性巯基的存在可用于利用如下面详细描述的二硫键物头偶联伴体分子。抗体与伴体分子以这种方式偶联允许提高对特定连接位点的控制。此外，通过在C-末端处或附近引入连接位点，可以对偶联进行优化以使得它降低或消除对抗体功能性质的干扰，并允许简化偶联制剂的分析和质量控制。
在又另一种实施方式中，对抗体的糖基化进行改变。例如，可以制备脱糖基化抗体(即抗体缺少糖基化)。可以改变糖基化以例如增加抗体对抗原的亲和性。这样的糖修饰可以通过例如改变抗体序列中的一个或多个糖基化位点来实现。例如，可以进行导致一个或多个可变区构架糖基化位点消除的一个或多个氨基酸置换从而消除该位点处的糖基化。这样的去糖基化可能增加抗体对抗原的亲和性。这样的方法进一步详细描述在Co等的美国专利号5,714,350和6,350,861中。用于改变糖基化的其他方法进一步详细描述在Hanai等的美国专利号7,214,775、Presta的美国专利号6,737,056、Presta的美国公布号20070020260、Dickey等的PCT公布号WO/2007/084926、Zhu等的PCT公布号WO/2006/089294和Ravetch等的PCT公布号WO/2007/055916中，其各自在此以其全文引为参考。
此外或可选地，可以制备具有改变的糖基化类型的抗体，例如具有减少的岩藻糖残基量的低岩藻糖基化抗体或具有提高的分叉GlcNac结构的抗体。这样改变的糖基化模式已被证明提高抗体的ADCC能力。这样的糖修饰可以通过例如在具有改变的糖基化机制的宿主细胞中表达抗体来实现。具有改变的糖基化机制的细胞在本领域中已被描述，并可以作为用于在其中表达本发明的重组抗体的宿主细胞从而产生具有改变的糖基化的抗体。例如，细胞系Ms704、Ms705和Ms709缺少岩藻糖基转移酶基因FUT8(α(1，6)岩藻糖基转移酶)，使得在Ms704、Ms705和Ms709细胞系中表达的抗体在它们的糖中缺乏岩藻糖。通过使用两种置换型载体靶向破坏CHO/DG44细胞中的FUT8基因产生了Ms704、Ms705和Ms709FUT8-/-细胞系(参见Yamane等的美国专利公布号20040110704和Yamane-Ohnuki等，(2004)Biotechnol Bioeng 87：614-22)。作为另一个实例，Hanai等的EP 1,176,195描述了具有功能性破坏的FUT8基因(编码岩藻糖转移酶)的细胞系，从而通过减少或消除α-1，6键相关的酶以使得在这样的细胞系中表达的抗体表现出低岩藻糖化。Hanai等也描述了具有对于向结合抗体的Fc区的N-乙酰葡萄糖胺添加岩藻糖的低酶活性或不具有所述酶活性的细胞系，例如大鼠骨髓瘤细胞系YB2/0(ATCC CRL 1662)。Presta的PCT公开WO 03/035835描述了变体CHO细胞系Lec13细胞，其具有降低的将岩藻糖连接于Asn(297)连接的糖上的能力，也引起在该宿主细胞中表达的抗体的低岩藻糖化(也参见Shields，R.L.等，(2002)J.Biol.Chem.277：26733-26740)。Umana等的PCT公开WO 99/54342描述了被工程化以表达糖蛋白修饰的糖基转移酶(例如β(1，4)-N-乙酰葡糖胺基转移酶III(GnTIII))的细胞系，以使得在工程化细胞系中表达的抗体表现出提高的分叉GlcNac结构，其引起抗体的ADCC活性增加(也参见Umana等，(1999)Nat.Biotech.17：176-180)。或者，可以使用岩藻糖苷酶切掉抗体的岩藻糖残基。例如，岩藻糖苷酶α-L-岩藻糖苷酶从抗体移除岩藻糖残基(Tarentino，A.L.等，(1975)Biochem.14：5516-23)。
另外地或可选地，可以制备具有改变的糖基化类型的抗体，其中所述改变涉及抗体的唾液酸化水平。这样的改变描述在Dickey等的PCT公布号WO/2007/084926和Ravetch等的PCT公布号WO/2007/055916中，二者在此以其全文引为参考。例如，可以使用唾液酸酶例如产脲节杆菌(Arthrobacter ureafacens)唾液酸酶的酶促反应。这样的反应的条件总体描述在美国专利号5,831,077中，在此以其全文引为参考。适合的酶的其他非限制性实例是神经氨酸苷酶和N-糖苷酶F，如分别在Schloemer等，J.Virology，15(4)，882-893(1975)和Leibiger等，Biochem J.，338，529-538(1999)中所述的。脱唾液酸化的抗体可以使用亲和层析进一步纯化。或者，可以利用提高唾液酸化水平的方法，例如通过使用唾液酸转移酶。这样的反应的条件总体描述在Basset等，Scandinavian Journal of Immunology，51(3)，307-311(2000)中。
本发明所设想的本发明抗体的另一种修饰是聚乙二醇化。可以将抗体聚乙二醇化以例如增加抗体的生物(例如血清)半衰期。为了将抗体聚乙二醇化，通常将抗体或其片段与聚乙二醇(PEG)，例如PEG的反应性酯或醛衍生物，在其中使一个或多个PEG基团变得与抗体或抗体片段连接的条件下进行反应。优选地，聚乙二醇化通过酰化反应或烷基化反应使用反应性PEG分子(或类似的反应性水溶性聚合物)来进行。当在本文中使用时，术语“聚乙二醇”意图涵盖已被用于衍生化其他蛋白质的任何形式的PEG，例如单(C1-C10)烷氧基-或芳氧基-聚乙二醇或聚乙二醇-马来酰亚胺。在某些实施方式中，待进行聚乙二醇化的抗体是脱糖基化抗体。将蛋白质聚乙二醇化的方法在本领域中是已知的，并可应用于本发明的抗体。参见例如Nishimura等的EP 0 154 316和Ishikawa等的EP 0 401384。同样地，这里描述的聚乙二醇化方法也适用于下面描述的本发明的类肽分子。
E.抗体片段和抗体模拟物
本发明不限于传统抗体，而是可以通过使用抗体片段和抗体模拟物来实施。正如下面详细描述的，现在已经开发了广泛种类的抗体片段和抗体模拟物技术，它们在本领域中广为人知。尽管许多这些技术例如域抗体、纳米抗体和UniBody利用传统抗体结构的片段或其他修饰，但也存在替代技术例如Adnectin、亲合抗体、DARPin、抗运载蛋白、Avimer、Versabody、适体和SMIPS，它们尽管模拟传统抗体结合，但是利用通过不同机制产生并起作用的结合结构。这些替代结构中的一些综述在Gill和Damle(2006)17：653-658中。
域抗体(dAb)是抗体的最小功能性结合单元，对应于人抗体的重链可变区(VH)或轻链可变区(VL)。域抗体具有约13kDa的分子量。Domantis已经开发了完全人VH和VL dAb的一系列大且高度功能性的文库(各文库中超过100亿个不同序列)，并使用这些文库选择对治疗性靶标特异性的dAb。与许多常规抗体相反，域抗体在细菌、酵母和哺乳动物细胞系统中表达良好。域抗体及其生产方法的其他详细情况可以参考美国专利6,291,158、6,582,915、6,593,081、6,172,197、6,696,245、美国系列号2004/0110941、欧洲专利申请号1433846和欧洲专利0368684和0616640、WO05/035572、WO04/101790、WO04/081026、WO04/058821、WO04/003019和WO03/002609来获得，其每个在此以其全文引为参考。
纳米抗体是抗体源的治疗性蛋白，其包含天然存在的重链抗体的独特结构和功能性质。这些重链抗体含有单一可变结构域(VHH)和两个恒定结构域(CH2和CH3)。重要的是，克隆和分离的VHH结构域是带有原始重链抗体的全部抗原结合能力的极为稳定的多肽。纳米抗体与人抗体的VH结构域高度同源，并且可以进一步人源化而没有任何活性损失。重要的是，纳米抗体具有低的免疫原潜力，这已在使用纳米抗体前导化合物的灵长动物研究中得到证实。
纳米抗体将常规抗体的优点与小分子药物的重要特征相结合。与常规抗体相似，纳米抗体显示出高的靶特异性、对它们的靶标的高亲和性和低的固有毒性。然而，与小分子药物相似，它们能够抑制酶并容易接近受体裂隙。此外，纳米抗体极为稳定，可以通过注射之外的手段施用(参见例如WO 04/041867，在此以其全文引为参考)，并且易于制造。纳米抗体的其他优点包括由于其尺寸小而识别不常见或隐藏的表位，由于其独特的三维结构而以高亲和性和选择性结合到蛋白质靶标的空穴或活性位点中，药物形式的灵活性，半衰期调制以及药物发现的方便性和快速。
纳米抗体由单一基因编码，并且在几乎所有原核和真核宿主中高效产生，例如大肠杆菌(参见例如U.S.6,765,087，在此以其全文引为参考)、霉菌(例如曲霉或木霉)和酵母(例如酿酒酵母、克鲁维酵母、汉逊酵母或毕赤酵母)(参见例如U.S.6,838,254，在此以其全文引入作为参考)。生产工艺可以缩放，并且生产了数公斤数量的纳米抗体。由于纳米抗体与常规抗体相比表现出优越的稳定性，因此它们可以配制成储存期限长的即用型溶液。
纳米克隆(Nanoclone)方法(参见例如WO 06/079372，在此以其全文引为参考)是基于B-细胞的自动高通量选择产生针对所需靶标的纳米抗体的专门方法，并可用于本发明的情形中。
UniBody是另一种抗体片段技术，但是这种技术是基于移除IgG4抗体的铰链区。铰链区的缺失产生尺寸基本上为传统IgG4抗体尺寸的一半并具有IgG4抗体的单价结合区而不是二价结合区的分子。还公知，IgG4抗体是惰性的并且不与免疫系统相互作用，这对于不希望免疫应答的疾病治疗来说可能是有利的，并且这一优点传给了UniBody。例如，UniBody可以起到抑制或沉默但不杀死它们所结合的细胞的作用。另外，结合癌细胞的UniBody不刺激它们增殖。此外，由于UniBody的尺寸约为传统IgG4抗体的一半，因此它们可以在较大的实体肿瘤上显示出较好的分布而具有潜在有利的效能。UniBody以与完整IgG4抗体相似的速率从身体清除，并能以与完整抗体相似的对其抗原的亲和性结合。UniBody的其他详细情况可以通过参考专利申请WO2007/059782来获得，在此以其全文引为参考。
Adnectin分子是源自于纤连蛋白的一个或多个结构域的工程化结合蛋白。纤连蛋白天然存在于人体中。它作为不溶性糖蛋白二聚体存在于细胞外基质中，并且也起到连接蛋白的作用。它也作为二硫键连接的二聚体以可溶形式存在于血浆中。纤连蛋白的血浆形式由肝脏细胞(肝细胞)合成，ECM形式由软骨细胞、巨噬细胞、内皮细胞、成纤维细胞和上皮的某些细胞制造(参见Ward M.和Marcey，D.，callutheran.edu/Academic_Programs/Departments/BioDev/omm/fibro/fibro.htm)。正如前面提到的，纤连蛋白可以天然起到细胞粘附分子的作用，或者它可以通过在细胞外基质中进行接触来介导细胞的相互作用。纤连蛋白通常由3种不同的蛋白质模块即I型、II型和III型模块制成。对于纤连蛋白的结构和功能的综述参见Pankov和Yamada(2002)J Cell Sci.；115(Pt 20)：3861-3；Hohenester和Engel(2002)21：115-128以及Lucena等，(2007)Invest Clin.48：249-262。
在优选实施方式中，adnectin分子通过改变由分布在两个β折叠之间的多个β链构成的天然蛋白从纤连蛋白III型结构域衍生。取决于来源组织，纤连蛋白可以含有多个III型结构域，其可以被命名为例如1Fn3、2Fn3、3Fn3等。10Fn3结构域含有整联蛋白结合基序，并且还含有3个连接β链的环。这些环可以被认为是对应于IgG重链的抗原结合环，并且它们可以通过下面讨论的方法进行改变以特异性结合目标靶例如IL-12/IL-23的p40亚基。优选地，可用于本发明目的的纤连蛋白III型结构域是与编码可以从蛋白质数据库(PDB，rcsb.org/pdb/home/home.do)以登记号1ttg访问的纤连蛋白III型分子结构的序列表现出至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或至少95％的序列同一性的序列。Adnectin分子也可以从10Fn3相关分子的聚合物而不是简单的单体10Fn3结构产生。
尽管天然的10Fn3结构域通常结合整联蛋白，但适合于变成adnectin分子的10Fn3蛋白被改变以便结合目标抗原，例如IL-12/IL-23的p40亚基。在一种实施方式中，10Fn3分子的改变包含对β链的至少一个突变。在优选实施方式中，连接10Fn3分子的β链的环区域被改变以结合IL-12/IL-23的p40亚基。
10Fn3中的改变可以通过本领域中已知的任何方法来进行，所述方法包括但不限于易错PCR、定点诱变、DNA改组或本文中已经提及的其他类型的重组诱变方法。在一个实例中，编码10Fn3序列的DNA的变异体可以在体外直接合成，并随后在体外或体内转录并翻译。或者，可以使用标准方法从基因组分离或克隆天然的10Fn3序列(如在例如美国专利申请号20070082365中所进行的)，且然后使用本领域已知的诱变方法来突变。
在一种实施方式中，可以将靶蛋白例如IL-12/IL-23的p40亚基固定在固相支持物例如柱树脂或微量滴定板的孔中。然后将靶与潜在结合蛋白的文库进行接触。文库可以包含通过10Fn3序列的诱变/随机化或通过10Fn3环区域(不是β链)的诱变/随机化而从野生型10Fn3衍生的10Fn3克隆或adnectin分子。在优选实施方式中，文库可以是通过在下述文献中描述的技术产生的RNA-蛋白质融合文库：Szostak等，美国系列号09/007,005和09/247,190；Szostak等，WO989/31700；以及Roberts&Szostak(1997)94：12297-12302。该文库也可以是DNA-蛋白质文库(例如描述在Lohse美国系列号60/110,549、美国系列号09/459,190和WO 00/32823中)。然后将融合文库与固定的靶标(例如IL-12/IL-23的p40亚基)一起温育，并清洗固相支持物以除去非特异性结合部分。然后在严格条件下洗脱紧密结合物，并使用PCR来扩增遗传信息或产生结合分子的新文库以重复所述过程(使用或不使用另外的诱变)。选择/诱变过程可以重复直到获得与靶具有足够亲和性的结合物。可以使用由Adnexus，Briston-Myers Squibb company所采用的PROfusionTM技术对在本发明中使用的Adnectin分子进行工程化。PROfusion技术在上面提到的技术(例如Roberts&Szostak(1997)94：12297-12302)的基础上建立。产生改变的10Fn3结构域的文库和选择可用于本发明的适合的结合物的方法充分描述在下面的美国专利和专利申请文献中，其在此引为参考：美国专利号7,115,396，6,818,418，6,537,749，6,660,473，7,195,880，6,416,950，6,214,553，6623926，6,312,927，6,602,685，6,518,018，6,207,446，6,258,558，6,436,665，6,281,344，7,270,950，6,951,725，6,846,655，7,078,197，6,429,300，7,125,669，6,537,749，6,660,473，以及美国专利申请号20070082365，20050255548，20050038229，20030143616，20020182597，20020177158，20040086980，20040253612，20030022236，20030013160，20030027194，20030013110，20040259155，20020182687，20060270604，20060246059，20030100004，20030143616和20020182597。在筛选步骤之前，纤连蛋白III型结构域例如10Fn3中多样性的产生可以使用本领域中已知的其他方法例如噬菌体展示、核糖体展示或酵母表面展示来实现，例如Lipovsek等，(2007)Journal of Molecular Biology 368：1024-1041；Sergeeva等，(2006)Adv Drug Deliv Rev.58：1622-1654；Petty等，(2007)TrendsBiotechnol.25：7-15；Rothe等，(2006)Expert Opin Biol Ther.6：177-187；和Hoogenboom(2005)Nat Biotechnol.23：1105-1116。
本领域技术人员应该认识到，上面引用的方法可用于从优选的10Fn3结构域之外的蛋白质产生抗体模拟物。可用于通过上面引用的方法产生抗体模拟物的其他分子包括但不限于人纤连蛋白模块1Fn3-9Fn3和11Fn3-17Fn3，以及来自于非人类动物和原核生物的相关Fn3模块。此外，也可以使用来自于具有与10Fn3的序列同源性的其他蛋白质例如腱生蛋白和粗纤维调节素的Fn3模块。具有免疫球蛋白样折叠(但是具有与VH结构域无关的序列)的其他示例性蛋白质包括N-钙粘蛋白、ICAM-2、肌联蛋白、GCSF受体、细胞因子受体、糖苷酶抑制剂、E-钙粘蛋白和抗生素色蛋白。具有相关结构的其他结构域可以源自于髓磷脂膜粘附分子P0、CD8、CD4、CD2、I类MHC、T-细胞抗原受体、CD1、VCAM-1的C2和I组结构域、肌球蛋白结合蛋白C的I-组免疫球蛋白折叠、肌球蛋白结合蛋白H的I-组免疫球蛋白折叠、端蛋白的I-组免疫球蛋白折叠、telikin、NCAM、颤搐蛋白、神经胶质蛋白、生长激素受体、红细胞生成素受体、催乳素受体、GC-SF受体、γ-干扰素受体、β-半乳糖苷酶/葡萄糖苷酸酶、β-葡萄糖苷酸酶和转谷氨酰胺酶。或者，可以利用包括一个或多个免疫球蛋白样折叠的任何其他蛋白质来产生adnectin样结合部分。这样的蛋白质可以例如使用SCOP程序来鉴别(Murzin等，J.Mol.Biol.247：536(1995)；Lo Conte等，Nucleic Acids Res.25：257(2000)。
适体是本发明所涵盖的另一种类型的抗体模拟物。适体通常为结合特定分子靶标的小核苷酸聚合物。适体可以是单链或双链核酸分子(DNA或RNA)，尽管基于DNA的适体最常见是双链的。对于适体核酸来说没有限定的长度；然而，适体分子长度最通常在15至40个核苷酸之间。
适体通常形成决定它们对靶分子的亲和性的复杂三维结构。适体与简单抗体相比能够提供许多优点，这主要是因为它们可以进行工程化并可以几乎完全地在体外扩增。此外，适体通常诱导很少或不诱导免疫反应。
适体可以使用各种技术来产生，但最初是使用体外选择(Ellington和Szostak.(1990)Nature.346(6287)：818-22)和SELEX方法(通过指数富集的配体系统性进化)(Schneider等，1992，J MolBiol.228(3)：862-9，其内容在此引为参考)开发的。制造和使用适体的其他方法已被发表，包括Klussmann，The AptamerHandbook：Functional Oligonucleotides and Their Applications，ISBN：978-3-527-31059-3；Ulrich等，2006.Comb Chem High ThroughputScreen 9(8)：619-32；Cerchia和de Franciscis.2007.Methods Mol Biol.361：187-200；Ireson和Kelland.2006.Mol Cancer Ther.2006 5(12)：2957-62；美国专利号5582981、5840867、5756291、6261783、6458559、5792613、6111095和美国专利申请号11/482,671、11/102,428、11/291,610和10/627,543，其全部在此引为参考。
SELEX方法显然是最流行的，并且在三个基础步骤中进行。首先，从候选核酸分子文库对于与特定分子靶标的结合进行选择。其次，将对靶具有足够亲和性的核酸与非结合物分离。第三，对结合的核酸进行扩增，形成第二文库，并重复所述过程。在每次重复时，选择对靶分子具有越来越高的亲和性的适体。SELEX方法更充分地描述在下面的出版物中，在此将其引为参考：Bugaut等，2006.4(22)：4082-8；Stoltenburg等，2007 Biomol Eng.2007 24(4)：381-403；和Gopinath.2007.Anal Bioanal Chem.2007.387(1)：171-82。
本发明的“适体”还包括从肽而不是核苷酸形成的适体分子。肽适体与核苷酸适体共有许多性质(例如小尺寸和以高亲和性结合靶分子的能力)，并且它们可以通过与用于产生核苷酸适体的方法具有相似原理的选择方法来产生，例如Baines和Colas.2006.DrugDiscov Today.11(7-8)：334-41；和Bickle等，2006.Nat Protoc.1(3)：1066-91，其在此引为参考。
亲和抗体(Affibody)分子代表了基于源自于葡萄球菌蛋白A的IgG结合结构域之一的58个氨基酸残基的蛋白结构域的一类新的亲和蛋白。这个三螺旋束的结构域已被用作构建组合噬菌粒文库的支架，从其可以使用噬菌体展示技术选择靶向于所需分子的亲和抗体变体(Nord K，Gunneriusson E，Ringdahl J，Stahl S，Uhlen M，NygrenPA，Binding proteins selected from combinatorial libraries of anα-helical bacterial receptor domain，Nat Biotechnol 1997；15：772-7；Ronmark J，Gronlund H，Uhlen M，Nygren PA，Human immunoglobulinA(IgA)-specific ligands from combinatorial engineering of protein A，Eur J Biochem 2002；269：2647-55)。亲和抗体分子的简单、强固的结构与其低分子量(6kDa)相结合使它们适合于广泛的各种应用，例如作为检测试剂(Ronmark J，Hansson M，Nguyen T等，Constructionand characterization of affibody-Fc chimeras produced in Escherichiacoli，J Immunol Methods 2002；261：199-211)和抑制受体相互作用(Sandstorm K，Xu Z，Forsberg G，Nygren PA，Inhibition of theCD28-CD80 co-stimulation signal by a CD28-binding Affibody liganddeveloped by combinatorial protein engineering，Protein Eng 2003；16：691-7)。亲合抗体及其生产方法的其他详细情况可以参考美国专利号5,831,012来获得，在此以其全文引为参考。
DARPin(设计的锚蛋白重复序列蛋白)是被开发以利用非抗体多肽的结合能力的抗体模拟DRP(设计的重复序列蛋白)技术的一个实例。重复序列蛋白例如锚蛋白或富含亮氨酸的重复序列蛋白是遍在的结合分子，其与抗体不同，在细胞内和细胞外出现。它们独特的模块式构造以重复的结构单元(重复序列)为特征，所述结构单元堆叠在一起形成表现出可变和模块式靶结合表面的延长重复结构域。基于这种模块性，可以产生具有高度多样化的结合特异性的多肽组合文库。这种策略包括表现出可变表面残基的自身相容重复序列的共有设计以及它们随机组装成重复结构域。
DARPin可以以非常高的产率在细菌表达系统中产生，并且它们属于已知的最稳定的蛋白质。已经选择了针对广泛的靶蛋白质包括人受体、细胞因子、激酶、人蛋白酶、病毒和膜蛋白的高特异性、高亲和性的DARPin。可以获得亲和性在个位数纳摩尔至皮摩尔范围内的DARPin。
DARPin已被用于广泛应用中，包括ELISA、夹心ELISA、流式细胞术分析(FACS)、免疫组织化学(IHC)、芯片应用、亲和纯化或Western印迹。DARPin也被证明在细胞内区室中具有高度活性，例如作为与绿色荧光蛋白(GFP)融合的细胞内标志物蛋白。DARPin还用于抑制病毒进入，其IC50在pM范围内。DARPin不仅可理想地阻断蛋白质-蛋白质相互作用，而且还抑制酶。蛋白酶、激酶和转运蛋白已被成功抑制，最通常为别构抑制模式。在肿瘤上非常快速且特异性的富集以及非常有利的肿瘤-血液比率使得DARPin良好地适合于体内诊断或治疗性方法。
关于DARPin和其他DRP技术的其他信息可以在美国专利申请公布号2004/0132028和国际专利申请公布号WO 02/20565中发现，二者在此以其全文引为参考。
抗运载蛋白(anticalin)是另外的抗体模拟技术，然而在这种情况下结合特异性源自于载脂蛋白，它是在人体组织和体液中天然且丰富地表达的一类低分子量蛋白质。载脂蛋白已经进化成执行与化学上敏感或不溶性化合物的生理转运和储存相关的各种体内功能。载脂蛋白具有强固的固有结构，包含高度保守的β-桶(β-barrel)，其支撑蛋白质一个末端处的4个环。这些环形成了结合口袋的入口，并且在分子的这一部分中的构象差异导致了单个载脂蛋白之间的结合特异性的变异。
尽管由保守的β-折叠框构架所支撑的高变环的总体结构令人联想到免疫球蛋白，但载脂蛋白在尺寸上与抗体有显著差异，其由160-180个氨基酸的单一多肽构成，仅比单一免疫球蛋白结构域略大。
将载脂蛋白克隆并对它们的环进行工程化以产生抗运载蛋白。已经产生了结构上多样的抗运载蛋白文库，并且抗运载蛋白展示允许对结合功能进行选择和筛选，然后在原核或真核系统中进行可溶性蛋白质的表达和生产以用于进一步分析。研究已成功地证实，可以开发出对于事实上能够分离的任何人靶蛋白特异性的抗运载蛋白，并且可以获得纳摩尔范围内或更高的结合亲和性。
抗运载蛋白也可以采取双重靶向蛋白的形式，即所谓的Duocalin。Duocalin结合在使用标准制备方法容易地产生的一个单体蛋白中的两个单独的治疗靶标，同时保持靶特异性和亲和性而不论其两个结合结构域的结构取向。
通过单一分子调节多个靶标在已知涉及一个以上致病因子的疾病中是特别有利的。此外，二价或多价结合形式例如Duocalin在靶向于疾病中的细胞表面分子、介导对信号传导途径的激动效应或通过细胞表面受体的结合和簇集诱导增强的内化效应中具有重要潜能。此外，Duocalin的高固有稳定性与单体抗运载蛋白相当，从而为Duocalin提供了灵活的配制和递送可能性。
关于抗运载蛋白的其他信息可以在美国专利号7,250,297和国际专利申请公布号WO 99/16873中找到，二者在此以其全文引为参考。
可用于本发明的情形中的另一种抗体模拟技术是Avimer。Avimer通过体外外显子改组和噬菌体展示从一大类人体细胞外受体结构域演化而来，产生了具有结合和抑制性质的多结构域蛋白。已显示，连接多个独立的结合结构域产生了亲和力，并且与常规的单表位结合蛋白质相比导致亲和性和特异性的提高。其他潜在优点包括在大肠杆菌中简单和高效地产生多靶标特异性分子、提高的热稳定性和对蛋白酶的抗性。已经获得了针对多种靶标的具有亚纳摩尔亲和性的Avimer。
关于Avimer的其他信息可以在美国专利申请公布号2006/0286603、2006/0234299、2006/0223114、2006/0177831、2006/0008844、2005/0221384、2005/0164301、2005/0089932、2005/0053973、2005/0048512、2004/0175756中找到，它们全部在此以其全文引为参考。
Versabody是可用于本发明的情形中的另一种抗体模拟技术。Versabody是具有超过15％的半胱氨酸的3-5kDa的小蛋白质，其形成高的二硫化物密度的支架，从而代替了典型蛋白质所具有的疏水核心。构成疏水核心的大量疏水氨基酸被少数二硫化物替代产生了更小的、更加亲水(聚集和非特异性结合更低)、对蛋白酶和热更有抗性的蛋白质，并且由于对MHC呈递贡献最大的残基是疏水的，因此具有更低的T-细胞表位密度。众所周知，所有这四种性质都影响免疫原性，并且它们合在一起预期将引起免疫原性的大大降低。
Versabody的灵感来自于由水蛭、蛇、蜘蛛、蝎子、蜗牛和海葵产生的天然的可注射生物药品，其已知表现出出人意料低的免疫原性。从所选择的天然蛋白质家族开始，通过设计和通过筛选，将尺寸、疏水性、蛋白水解性抗原的加工和表位密度最小化至远低于天然可注射蛋白的平均值的水平。
由于Versabody的结构，这些抗体模拟物提供了通用的形式，其包括多价性、多特异性、多样化的半衰期机制、组织靶向模块和缺少抗体Fc区。此外，Versabody以高的产率在大肠杆菌中制造，并且由于它们的亲水性和小尺寸，Versabody是高度可溶的并且可以配制成高浓度。Versabody热稳定性异常高(它们可以被煮沸)并提供长的储存期限。
关于Versabody的其他信息可以在美国专利申请公布号2007/0191272中找到，在此以其全文引为参考。
SMIPTM(小模块式免疫药品-Trubion Pharmaceuticals)被工程化改造以维持并优化靶结合、效应子功能、体内半衰期和表达水平。SMIP由三种不同的模块式结构域构成。首先，它们含有结合结构域，其可以由赋予特异性的任何蛋白(例如细胞表面受体、单链抗体、可溶性蛋白等)构成。其次，它们含有铰链结构域，其起到结合结构域与效应结构域之间的柔性接头的作用，并且也帮助控制SMIP药物的多聚化。最后，SMIP含有效应结构域，其可以源自于多种分子，包括Fc结构域或其他特殊设计的蛋白质。设计的模块性允许用多种不同的结合、铰链和效应结构域进行SMIP的简单构建，因而允许快速且可定制的药物设计。
关于SMIP的更多信息，包括如何设计它们的实例，可以在Zhao等，(2007)Blood 110：2569-77和下面的美国专利申请号中找到：20050238646、20050202534、20050202028、20050202023、20050202012、20050186216、20050180970和20050175614。
上面提供的抗体片段和抗体模拟技术的详细描述不意图作为可用于本说明书的情形中的所有技术的详尽列表。例如并且不限于此，在本发明的情形中可以使用多种另外的技术，包括替代的基于多肽的技术，例如在此以其全文引为参考的Qui等，Nature Biotechnology，25(8)921-929(2007)中所描述的互补性决定区的融合体，以及基于核酸的技术，例如全部在此引为参考的美国专利号5,789,157、5,864,026、5,712,375、5,763,566、6,013,443、6,376,474、6,613,526、6,114,120、6,261,774和6,387,620中所描述的RNA适体技术。
F.抗体的物理性质
本发明的结合IL-12/IL-23的p40亚基的抗体可以通过各种物理性质来进一步表征。可以根据这些物理性质使用各种测定法来检测和/或区分不同类的抗体。
在某些实施方式中，本发明的抗体可以在轻链或重链可变区中含有一个或多个糖基化位点。可变区中存在一个或多个糖基化位点可能引起抗体免疫原性的增加或由于抗原结合变化而造成的抗体pK的改变(Marshall等，(1972)Annu Rev Biochem 41：673-702；GalaFA和Morrison SL(2004)J Immunol 172：5489-94；Wallick等，(1988)J Exp Med 168：1099-109；Spiro RG(2002)Glycobiology 12：43R-56R；Parekh等，(1985)Nature 316：452-7；Mimura等，(2000)Mol Immunol37：697-706)。已知糖基化发生在含有N-X-S/T序列的基序处。可变区糖基化可以使用Glycoblot分析来测试，其切割抗体以产生Fab，然后使用测量高碘酸盐氧化和席夫碱形成的分析法来测试糖基化。或者，可变区糖基化可以使用Dionex光色谱法(Dionex-LC)来测试，其将糖从Fab上切下成为单糖并分析单个糖的含量。在某些情况下，获得不含可变区糖基化的抗体可能是优选的。这可以通过选择在可变区中不含糖基化基序的抗体，或通过使用本领域公知的标准技术将糖基化基序中的残基突变来实现。
各抗体具有独特的等电点(pI)，但是一般来说抗体落于6至9.5之间的pH范围内。IgG1抗体的pI通常落于7-9.5的pH范围内，IgG4抗体的pI通常落于6-8的pH范围内。抗体可能具有该范围之外的pI。尽管其效应在总体上是未知的，但据推断具有正常范围之外的pI的抗体在体内条件下可能具有一定的伸展和不稳定性。等电点可以使用毛细管等电聚焦分析来测试，所述方法产生pH梯度并可以利用激光聚焦以提高准确性(Janini等，(2002)Electrophoresis23：1605-11；Ma等，(2001)Chromatographia 53：S75-89；Hunt等，(1998)J Chromatogr A 800：355-67)。在某些情况下，使抗体具有落于正常范围内的pI值是优选的。这可以通过选择具有正常范围内的pI的抗体或通过使用本领域公知的标准方法使带电荷表面残基突变来实现。
各抗体具有指示热稳定性的熔解温度(Krishnamurthy R和Manning MC(2002)Curr Pharm Biotechnol 3：361-71)。较高的热稳定性表明较高的体内抗体总体稳定性。抗体的熔解温度可以使用例如差示扫描量热术的技术来测量(Chen等，(2003)Pharm Res 20：1952-60；Ghirlando等，(1999)Immunol Lett 68：47-52)。TM1指示了抗体初始伸展的温度。TM2指示了抗体完全伸展的温度。一般来说，本发明的抗体的TM1优选高于60℃，优选地高于65℃，甚至更优选地高于70℃。或者，抗体的热稳定性可以使用圆二色性来测量(Murray等，(2002)J.Chromatogr Sci 40：343-9)。
在优选实施方式中，不快速降解的抗体可能是合乎需要的。抗体的片段化可以使用毛细管电泳(CE)和MALDI-MS来测量，如本领域中公知的(Alexander AJ和Hughes DE(1995)Anal Chem67：3626-32)。
在另一种优选实施方式中，选择具有极小聚集效应的抗体。聚集可能导致引发不想要的免疫反应和/或改变的或不利的药代动力学性质。一般来说，具有25％或以下、优选地20％或以下、甚至更优选地15％或以下、甚至更优选地10％或以下、甚至更优选地5％或以下的聚集的抗体是可接受的。聚集可以通过本领域公知的几种技术来测量，包括尺寸排阻柱(SEC)高效液相色谱(HPLC)和鉴别单体、二聚体、三聚体或多聚体的光散射。
V.本发明的抗体的产生
A.本发明的多克隆抗体的产生
本发明的多克隆抗体可以通过本领域公知的多种技术来产生。多克隆抗体源自于不同的B-细胞系，并因此可能识别同一抗原上的多个表位。多克隆抗体通常通过用目标抗原例如IL-12/IL-23的p40亚基免疫适合的哺乳动物来生产。通常用于产生多克隆抗体的动物是鸡、山羊、豚鼠、仓鼠、马、小鼠、大鼠、绵羊以及最常用的兔。产生多克隆抗体的标准方法在本领域中是广为人知的，并且可以与本发明的方法组合(例如research.cm.utexas.edu/bkitto/Kittolabpage/Protocols/Immunology/PAb.html；美国专利号4,719,290、6,335,163、5,789,208、2,520,076、2,543,215和3,597,409，其全部内容在此引为参考)。
B.本发明的单克隆抗体的产生
本发明的单克隆抗体(mAb)可以通过多种技术来产生，包括常规的单克隆抗体方法例如Kohler和Milstein(1975)Nature 256：495中的标准体细胞杂交技术。尽管体细胞杂交方法是优选的，但原则上可以使用用于产生单克隆抗体的其他技术，例如B淋巴细胞的病毒或致癌基因转化。应该指出，可以产生针对IL-12/IL-23的p40亚基上的任何表位(包括本文中描述的任何构象、不连续或线性表位)的抗体(单克隆的或多克隆的)或其抗原结合部分。
本领域中已知的几种方法可用于特异性地选择特异性结合目标不连续表位的抗体或其抗原结合片段。例如，在此以其全文引为参考的美国公布号2005/0169925中所公开的技术允许选择结合蛋白质序列内的两个不同肽的抗体。这样的方法可按照本发明用于特异性地靶向本文中公开的构象和不连续表位。如果构象表位是蛋白质二级结构，这样的结构通常容易在较小的肽(例如＜50个氨基酸)中形成。因此，用较小的肽免疫动物可能捕获某些构象表位。或者，可以将包含构象表位的两个小肽(例如表5中示出的肽)通过柔性接头(例如聚二醇或一段极性的不带电的氨基酸)连接。接头允许肽探索各种不同的相互作用取向。用这种构建体进行免疫，然后进行适当筛选可以鉴别针对构象表位的抗体。在优选实施方式中，可以通过用IL-12/IL-23的p40亚基的特定结构域(例如在上面章节11(A)和11(C)中描述的表位，包括上面表3中描述的位点和表4中描述的表位)免疫动物并随后筛选结合目标表位的抗体来产生针对特定构象或线性表位的肽。在一种实施方式中，可以使用冷冻电子显微术(Jiang等，(2008)Nature 451，1130-1134，Joachim(2006)Oxford University Press ISBN：0195182189)来鉴别被本发明的抗体或抗原结合片段结合的表位。在另一种实施方式中，可以将IL-12/IL-23的p40亚基或其结构域与结合的抗体或其抗原结合片段一起结晶，并通过X-射线晶体学进行分析以确定所结合的准确表位。此外，可以通过将IL-12/IL-23序列的p40亚基的部分用来自于小鼠或另一物种的相应序列代替对表位进行作图。针对目标表位的抗体将选择性地结合人序列区域，并因此可以对目标表位进行连续作图。这种基于嵌合体的表位作图的技术已在各种情形中被成功用于鉴定表位(参见Henriksson和Pettersson(1997)Journal of Autoimmunity.10(6)：559-568；Netzer等，(1999)J Biol Chem.1999 Apr 16；274(16)：11267-74；Hsia等，(1996)Mol.Microbiol.19，53-63，其全部内容在此引为参考)。
如果IL-12/IL-23的p40亚基的目标结构域被糖基化，可以产生其抗体或其抗原结合部分(以及本发明的其他抗体模拟物)以使得它们结合相关氨基酸和/或糖残基。人IL-12/23的p40亚基含有10个半胱氨酸残基和4个潜在的N-连接的糖基化位点。IL-12/23的p40亚基的糖基化模式至少进一步描述在：Yoon等，2000 EMBO 19(14)：3530-3541；Gubler等，1991Proc.Natl.Acad.Sci.USA88：4143-4147；和Brunda等，1994 J.Leukocyte Biol.55：280-288中，其各个的全部内容在此引为参考。因此，设想了可以产生也结合可能连接于本文中确认的任何表位的糖残基的抗体或其抗原结合部分(以及本发明的其他部分)。为此目的，可以在动物细胞中产生目标抗原性肽以使得其获得正确的糖基化且然后可以使用该糖基化的抗原性肽免疫动物。适合用于产生糖基化肽的细胞和技术在本领域中是已知的，并在下面进一步描述(参见例如可以从GlycoFi，Inc.，Lebanon，NH and BioWa；Princeton，NJ获得的技术)。肽的正确糖基化可以使用任何标准方法例如等电聚焦(IEF)、酸水解(以确定单糖组成)、化学或酶促切割以及质谱(MS)以鉴别聚糖来测试。也可以使用由Procognia(procognia.com)提供的技术，其使用基于凝集素的阵列来加速聚糖分析。具体来说，O-糖基化可以特别地使用例如还原性碱切割或“β消去”、肽作图、液相色谱和质谱法或这些技术的任何组合来检测。
用于制备杂交瘤的优选动物系统是鼠类系统。小鼠中产生杂交瘤非常成熟的方法。用于分离免疫过的脾细胞以用于融合用的免疫方案和技术在本领域中是已知的。融合伴体(例如鼠骨髓瘤细胞)和融合程序也是已知的。
本发明的嵌合或人源化抗体可以根据如上所述制备的鼠单克隆抗体的序列来制备。可以从目标鼠杂交瘤获得编码免疫球蛋白重链和轻链的DNA，并使用标准分子生物学技术将其工程化以包含非鼠类(例如人)免疫球蛋白序列。例如，为了产生嵌合抗体，可以使用本领域已知的方法将鼠可变区连接到人恒定区上(参见例如Cabilly等的美国专利号4,816,567)。为了产生人源化抗体，可以使用本领域已知的方法将鼠CDR区插入到人框架中(参见例如Winter的美国专利号5,225,539和Queen等的美国专利号5,530,101、5,585,089、5,693,762和6,180,370)。或者，可以根据人和非人序列的知识，在DNA或蛋白质水平上设计人源化抗体。这样的抗体可以直接化学合成，或者可以合成DNA并将其在体外或体内表达以产生人源化抗体。
在优选实施方式中，本发明的抗体是人单克隆抗体。这样的针对本文所描述的IL-12/IL-23的p40亚基的结构域或表位的人单克隆抗体可以使用携带人免疫系统而不是小鼠系统的部分的转基因或转染色体小鼠来产生。这些转基因和转染色体小鼠包括在本文中分别被称为HuMAb小鼠和KM小鼠TM的小鼠，并且在本文中被合称为“人Ig小鼠”。
HuMAb小鼠
Figure BPA00001751564501111
(Medarex，Inc.)含有编码未重排的人重链(μ和γ)和κ轻链的免疫球蛋白序列的人免疫球蛋白微基因座，以及具有使内源性μ和κ链基因座失活的靶向突变(参见例如Lonberg等，(1994)Nature 368(6474)：856-859)。因此，该小鼠表现出小鼠IgM或κ的表达降低，并且响应于免疫，引入的人重链和轻链转基因发生类别转换和体细胞突变以产生高亲和性人IgGκ单克隆抗体(Lonberg，N.等，(1994)，同上；综述在Lonberg，N.(1994)Handbookof Experimental Pharmacology，113：49-101；Lonberg，N.和Huszar，D.(1995)Intern.Rev.Immunol.13：65-93；以及Harding，F.和Lonberg，N.(1995)Ann.N.Y.Acad.Sci.764：536-546)。HuMab小鼠的制备和使用以及这样的小鼠所携带的基因组修饰进一步描述在Taylor，L.等，(1992)Nucleic Acids Research 20：6287-6295；Chen，J.等，(1993)International Immunology 5：647-656；Tuaillon等，(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：3720-3724；Choi等，(1993)Nature Genetics 4：117-123；Chen，J.等，(1993)EMBO J.12：821-830；Tuaillon等，(1994)J.Immunol.152：2912-2920；Taylor，L.等，(1994)International Immunology 6：579-591；以及Fishwild，D.等，(1996)Nature Biotechnology 14：845-851，它们所有的内容在此具体地以其全文引为参考。进一步参见Lonberg和Kay的美国专利号5,545,806、5,569,825、5,625,126、5,633,425、5,789,650、5,877,397、5,661,016、5,814,318、5,874,299和5,770,429；Surani等的美国专利号5,545,807；Lonberg和Kay的PCT公布号WO 92/03918、WO 93/12227、WO94/25585、WO 97/13852、WO 98/24884和WO 99/45962；以及Korman等的PCT公布号WO 01/14424。
在另一种实施方式中，可以使用在转基因或转染色体上携带人免疫球蛋白序列的小鼠，例如携带人重链转基因和人轻链转染色体的小鼠，来产生本发明的人抗体。被称为“KM小鼠TM”的这种小鼠详细描述在Ishida等的PCT公布WO 02/43478中。
此外，在本领域中还可以获得表达人免疫球蛋白基因的替代转基因动物系统，并可将其用于产生本发明的抗体。例如，可以使用被称为Xenomouse(Abgenix，Inc.)的替代转基因系统；这样的小鼠描述在例如Kucherlapati等的美国专利号5,939,598、6,075,181、6,114,598、6,150,584和6,162,963中。
此外，在本领域中还可以获得表达人免疫球蛋白基因的替代转染色体动物系统，并可将其用于产生本发明的抗体。例如，可以使用被称为“TC小鼠”的携带人重链转染色体和人轻链转染色体两者的小鼠；这样的小鼠描述在Tomizuka等，(2000)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97：722-727中。此外，携带人重链和轻链转染色体的奶牛在本领域中已被描述(Kuroiwa等，(2002)Nature Biotechnology20：889-894)并可用于产生本发明的抗体。
本发明的人单克隆抗体也可以使用用于筛选人免疫球蛋白基因文库的噬菌体展示方法来制备。这样的用于分离人抗体的噬菌体展示方法在本领域中已建立。参见例如：Ladner等的美国专利号5,223,409、5,403,484和5,571,698，Dower等的美国专利号5,427,908和5,580,717，McCafferty等的美国专利号5,969,108和6,172,197，以及Griffiths等的美国专利号5,885,793、6,521,404、6,544,731；6,555,313、6,582,915和6,593,081。在一种实施方式中，本发明的人单克隆抗体可以使用如在US 6,914,128中描述的噬菌体展示技术来制备，所述专利的全部内容在此引为参考。在另一种实施方式中，本发明的人单克隆抗体可以从人抗体库制备，例如在US 6,914,128中所描述的，其全部内容在此引为参考。
本发明的人单克隆抗体也可以使用SCID小鼠来制备，在所述小鼠中人免疫细胞已被重构以使得在免疫时可以产生人抗体应答。这样的小鼠描述在例如Wilson等的美国专利号5,476,996和5,698,767中。
在另一种实施方式中，本发明的抗体可以使用公知的噬菌体展示技术来产生，如在Marks，J.D.等((1991).J.Mol.Biol.222，581)、Nissim，A.等((1994).EMBO J.13，692)和美国专利号6,794,132、6562341、6057098、5821047和6512097中所描述的。
在进一步的实施方式中，本发明的抗体可以使用酵母细胞表面展示技术来发现，如在例如美国专利号6,423,538、6,300,065、6,696,251、6,699,658中所述的。
生产本发明的人单克隆抗体的杂交瘤的产生
为了产生生产本发明的人单克隆抗体的杂交瘤，可以从被免疫的小鼠分离脾细胞和/或淋巴结细胞，并与适合的永生化细胞系例如小鼠骨髓瘤细胞系融合。对得到的杂交瘤可以筛选抗原特异性抗体的产生。例如，可以使用50％PEG将来自于免疫小鼠的脾脏淋巴细胞的单细胞悬液与六分之一数目的P3X63-Ag8.653非分泌型小鼠骨髓瘤细胞(ATCC，CRL 1580)融合。或者，来自于免疫小鼠的脾脏淋巴细胞的单细胞悬液可以使用基于电场的电融合方法，使用CytoPulse大腔室细胞融合电穿孔仪(CytoPulse Sciences，Inc.，GlenBurnie Maryland)来融合。将细胞以约2x105接种于平底微量滴定板中，然后在含有20％胎儿克隆血清、18％“653”条件化培养基、5％三甲氧唑辛(origen)(IGEN)、4mM L-谷氨酰胺、1mM丙酮酸钠、5mM HEPES、0.055mM 2-巯基乙醇、50单位/ml的青霉素、50mg/ml链霉素、50mg/ml庆大霉素和1X HAT(Sigma；HAT在融合后24小时添加)的选择培养基中温育2周。在约2周后，将细胞在用HT替代HAT的培养基中培养。然后可以通过ELIS筛选单个孔的人单克隆IgM和IgG抗体。一旦发生广泛的杂交瘤生长后，通常可以在10-14天后观察培养基。可以将分泌抗体的杂交瘤重新接种，再次筛选，并且如果仍然对人IgG为阳性，则可以将所述单克隆抗体通过有限稀释法亚克隆至少两次。然后可以将稳定的亚克隆在体外培养以在组织培养基中产生少量抗体用于鉴定。
为了纯化人单克隆抗体，可以将所选择的杂交瘤生长在两升转瓶中用于单克隆抗体的纯化。可以将上清液过滤并浓缩，然后使用蛋白A-琼脂糖(Pharmacia，Piscataway，N.J.)进行亲和层析。洗脱的IgG可以通过凝胶电泳和高效液相色谱来检查以确保纯度。可以将缓冲溶液交换到PBS中，并且可以使用1.43的消光系数通过OD280来测定浓度。可以将单克隆抗体分成等分试样并储存在-80℃下。
生产本发明的单克隆抗体的转染瘤的产生
本发明的抗体也可以使用例如本领域公知的重组DNA技术和基因转染方法的组合在宿主细胞转染瘤(一种杂交瘤类型)中产生(例如Morrison，S.(1985)Science 229：1202)。
例如，为了表达抗体或其抗体片段，可以通过标准的分子生物学技术(例如使用表达目标抗体的杂交瘤的PCR扩增或cDNA克隆)来获得编码部分或全长轻链和重链的分离的核酸分子例如DNA，并且可以将该DNA插入到表达载体中以使所述基因与转录和翻译控制序列可操作连接。
短语“核酸分子“包括DN分子和RNA分子。核酸分子可以是单链或双链的，但优选为双链DNA。
当在本文中用于指称编码结合hIL-12的抗体或抗体部分(例如VH、VL、CDR3)(包括“分离的抗体”)的核酸时，短语“分离的核酸分子”包括其中编码所述抗体或抗体部分的核苷酸序列不含编码结合hIL-12之外的抗原的抗体或抗体部分的其他核苷酸序列的核酸分子，所述其他序列可能在人基因组DNA中天然地侧邻所述核酸。因此，例如，本发明的编码抗IL-12抗体的VH区的分离的核酸不含编码结合IL-12之外的抗原的其他VH区的其他序列。短语“分离的核酸分子”还意图包括编码二价的、双特异性抗体(例如其中VH和VL区不含双特异性抗体的序列之外的其他序列的双特异性抗体)的序列。
术语“载体”包括能够转运已与其相连的另一核酸的核酸分子。一种类型的载体是“质粒”，其是指另外的DNA片段可以接合到其中的圆形双链DNA环。另一种类型的载体是病毒载体，其中另外的DNA片段可以接合到病毒基因组中。某些载体能够在它们所引入的宿主细胞中自主复制(例如具有细菌复制原点的细菌载体和游离体哺乳动物载体)。其他载体(例如非游离体哺乳动物载体)可以在引入宿主细胞之后整合到宿主细胞的基因组中，并因此与宿主基因组一起复制。此外，某些载体能够指导与它们可操作地连接的基因的表达。这样的载体在本文中被称为“重组表达载体”(或简称“表达载体”)。一般来说，在重组DNA技术中使用的表达载体通常采取质粒的形式。在本说明书中，“质粒”和“载体”可互换使用，因为质粒是最常用的载体形式。然而，本发明意图包括起到等同作用的这类其他形式的表达载体，例如病毒载体(例如复制缺陷型反转录病毒、腺病毒和腺相关病毒)。
在本文中，术语“可操作地连接的”是指抗体基因接合到载体中以使得载体内的转录和翻译控制序列起到它们调控抗体基因的转录和翻译的预期功能。表达载体和表达控制序列被选择以与所使用的表达宿主细胞相容。可以将抗体轻链基因和抗体重链基因插入到单独的载体中，或者更通常地，将两个基因插入到同一表达载体中。抗体基因通过标准方法插入到表达载体中(例如互补的限制性位点接合到抗体基因片段和载体上，或者如果不存在限制性位点的话进行平端接合)。通过将抗体的轻链和重链可变区插入到已经编码所需同种型的重链恒定区和轻链恒定区的表达载体中以使得VH片段可操作连接到载体中的CH片段上并且VK片段可操作连接到载体中的CL片段上，所述抗体的轻链和重链可变区可用于产生任何抗体同种型的全长抗体基因。另外地或者替代地，重组表达载体可以编码促进抗体链从宿主细胞分泌的信号肽。可以将抗体链基因克隆在载体中以使得信号肽同框连接到抗体链基因的氨基末端。信号肽可以是免疫球蛋白信号肽或异源的信号肽(即来自于非免疫球蛋白蛋白的信号肽)。
除了抗体链基因之外，本发明的重组表达载体携带控制抗体链基因在宿主细胞中表达的调控序列。短语“重组宿主细胞”(或简称“宿主细胞”)包括其中已经引入重组表达载体的细胞。应该理解，这样的术语不仅意指称特定的对象细胞，而且指这样的细胞的后代。因为在后续的代中可能发生由于突变或环境影响而造成的某些修饰，因此这样的后代可能事实上与亲代细胞不相同，但仍然包括在本文中使用的术语“宿主细胞”的范围之内。在某些实施方式中，宿主细胞可以是真核细胞或原核细胞。
术语“调控序列”意图包括启动子、增强子和控制抗体链基因的转录或翻译的其他表达控制元件(例如多腺苷化信号)。这样的调控序列描述在例如Goeddel(Gene Expression Technology.Methodsin Enzymology 185，Academic Press，San Diego，CA(1990))中。本领域技术人员会认识到，表达载体的设计(包括调控序列的选择)可能取决于多种因素，如待转化的宿主细胞的选择、所需的蛋白质表达水平等。用于哺乳动物宿主细胞表达的优选调控序列包括在哺乳动物细胞中指导高水平蛋白质表达的病毒元件，例如源自于细胞肥大病毒(CMV)、猿病毒40(SV40)、腺病毒(例如腺病毒主要晚期启动子(AdMLP))和多瘤病毒的启动子和/或增强子。或者，可以使用非病毒的调控序列，例如遍在蛋白启动子或β-球蛋白启动子。此外，也可以使用由来自于不同来源的序列构成的调控元件，例如SRα启动子系统，其含有来自于SV40早期启动子和人T细胞白血病病毒1型的长末端重复序列的序列(Takebe，Y.等，(1988)Mol.Cell.Biol.8：466-472)。
除了抗体链基因和调控序列之外，本发明的重组表达载体可以携带其他序列，例如调控载体在宿主细胞中的复制的序列(例如复制原点)和选择标记基因。选择标记基因便于选择其中已引入载体的宿主细胞(参见例如Axel等的美国专利号4,399,216、4,634,665和5,179,017)。例如，选择标记基因通常赋予其中已引入载体的宿主细胞对药物例如G418、潮霉素或氨甲喋呤的抗性。优选的选择标记基因包括二氢叶酸还原酶(DHFR)基因(用于dhfr-宿主细胞中，使用氨甲喋呤选择/扩增)和neo基因(用于G418选择)。
为了表达轻链和重链，通过标准技术将编码重链和轻链的表达载体转染到宿主细胞中。术语“转染”的各种不同形式意图涵盖通常用于将外源DNA引入到原核或真核宿主细胞中的广范围的各种技术，例如电穿孔、磷酸钙沉淀、DEAE-葡聚糖转染等。尽管在理论上可以在任一原核或真核宿主细胞中表达本发明的抗体，但在真核细胞中、最优选地在哺乳动物宿主细胞中表达抗体是最优选的，因为这样的真核细胞、特别是哺乳动物细胞与原核细胞相比更可能组装并分泌正确折叠和具有免疫活性的抗体。已报道，抗体基因的原核表达对于生产高产率的活性抗体来说是无效的(Boss，M.A.和Wood，C.R.(1985)Immunology Today 6：12-13)。
综上所述，本发明的另一方面涉及可用于本发明的抗体和抗体片段的重组表达的核酸、载体和宿主细胞组合物。在一种实施方式中，本发明的特征在于分离的核酸，其编码J695的CDR和/或J695的全重链和/或轻链可变区。因此，在一种实施方式中，本发明提供了编码抗体重链可变区的分离的核酸，其编码如SEQ ID NO：1的氨基酸序列中示出的J695重链CDR3。在一种实施方式中，编码抗体重链可变区的核酸还编码如SEQ ID NO：1的氨基酸序列中示出的J695重链CDR2。在另一种实施方式中，编码抗体重链可变区的核酸还编码如SEQ ID NO：1的氨基酸序列中示出的J695重链CDR1。在另一种实施方式中，分离的核酸编码包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列的抗体重链可变区(J695的完整VH区)。在各种不同实施方式中，核酸编码的抗体重链可变区还包含如本文中所述，例如在上面章节11(A)(2)和11(B)中所描述的一个或多个置换。
在其他实施方式中，本发明提供了编码抗体轻链可变区的分离的核酸，其编码如SEQ ID NO：2的氨基酸序列中示出的J695轻链CDR3。在一种实施方式中，编码抗体轻链可变区的核酸还编码如SEQ ID NO：2的氨基酸序列中示出的J695轻链CDR2。在一种实施方式中，编码抗体轻链可变区的核酸还编码如SEQ ID NO：2的氨基酸序列中示出的J695轻链CDR1。在另一种实施方式中，分离的核酸编码包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列的抗体轻链可变区(J695的完整VL区)。在各种不同实施方式中，核酸编码的抗体轻链可变区还包含如本文中所述，例如在上面章节11(A)(2)和11(B)中所描述的一个或多个置换。
本发明还提供了编码抗体重链和抗体轻链两者的重组表达载体。例如，在一种实施方式中，本发明提供了重组表达载体，其编码：a)具有包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列的可变区的抗体重链；以及b)具有包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列的可变区的抗体轻链，并且还包含如本文中所述，例如在上面章节11(A)(2)和11(B)中所描述的一个或多个置换。
本发明还提供了其中已引入本发明的一种或多种重组表达载体的宿主细胞。此外，本发明提供了通过将本发明的宿主细胞在适合的培养基中培养直至合成本发明的重组人抗体来合成本发明的重组人抗体的方法。所述方法还可以包括从培养基分离所述重组人抗体。
用于表达本发明的重组抗体的优选的哺乳动物宿主细胞包括中国仓鼠卵巢(CHO细胞)(包括dhfr-CHO细胞，其描述在Urlaub和Chasin，(1980)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77：4216-4220中，与DHFR选择标记一起使用，例如在R.J.Kaufman和P.A.Sharp(1982)Mol.Biol.59：601-621中所描述的)、NSO骨髓瘤细胞、COS细胞和SP2细胞。特别地，与NSO骨髓瘤细胞一起使用的另一种优选表达系统是GS基因表达系统，其公开在WO 87/04462、WO 89/01036和EP 338,841中。当编码抗体基因的重组表达载体被引入到哺乳动物宿主细胞中时，通过将宿主细胞培养一段足以允许抗体在宿主细胞中表达或者更优选地足以允许抗体分泌到宿主细胞生长的培养基中的时间来产生抗体。抗体可以使用标准的蛋白质纯化方法从培养基回收。
C.结合IL-12和/或IL-23的p40亚基的抗体的表征
本发明提供了与IL-12和/或IL-23的p40亚基特异性结合的抗IL-12和/或IL-23的p40亚基的抗体(在本文中也分别被称为IL-12p40抗体和IL-23p40抗体)。当在本文中使用时，“特异性结合”IL-12和/或IL-23的p40亚基的抗体是指以1x10-7M或以下、更优选地5x10-8M或以下、更优选地1x10-8M或以下、更优选地5x10-9M或以下、更优选地1x10-9M或以下、更优选地5x10-10M或以下、更优选地1x10-10M或以下和更优选地1x10-11M或以下的Kd结合IL-12和/或IL-23的p40亚基的抗体。
当在本文中使用时，术语“基本上不结合”蛋白质或细胞是指不结合或不以高亲和性结合蛋白质或细胞，即以1x10-6M或以上、更优选地1x10-5M或以上、更优选地1x10-4M或以上、更优选地1x10-3M或以上、甚至更优选地1x10-2M或以上的Kd结合蛋白质或细胞。。
本发明提供的抗IL-12的p40亚基和/或抗IL-23的抗体任选地可以通过与IL-12和/或IL-23的p40亚基的高亲和性结合来表征。抗体对抗原的亲和性或亲和力可以使用任何适合的方法通过实验来测定(参见例如Berzofsky等，Antibody-Antigen Interactions，InFundamental Immunology，Paul，W.E.，Ed.，Raven Press：New York，N.Y.(1984)；Kuby，Janis Immunology，W.H.Freeman and Company：New York，N.Y.(1992)；以及其中描述的方法)。如果在不同条件(例如盐浓度、pH)下测量，测量到的特定抗体-抗原相互作用的亲和性可能不同。因此，亲和性和其他抗原结合参数(例如Ka)的测量优选地使用抗体和抗原的标准化溶液以及标准化缓冲液例如本文中描述的缓冲液来进行。评估抗体对IL-12/IL-23的p40亚基的结合能力的标准分析方法在本领域中是已知的，包括例如ELISA、Western印迹和RIA。抗体的结合动力学(例如结合亲和性)也可以通过本领域中已知的标准分析方法，例如通过ELISA、Scatchard和Biacore分析来评估。
当在本文中使用时，术语“Kd”是指特定抗体-抗原相互作用的解离常数，并且表示为摩尔浓度(M)。抗体的Kd值可以使用本领域中公认的方法来测定。用于测定抗体的Kd的优选方法是使用表面等离子体共振，优选地使用生物传感器系统例如Biacore
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系统。
抗体的解离速率常数(koff)可以通过表面等离子体共振来测定。一般来说，表面等离子体共振分析使用BIAcore系统(PharmaciaBiosensor，Piscataway，N.J.)通过表面等离子体共振(SPR)来测量配体(例如固定在生物传感器基质上的重组人IL-12)与分析物(溶液中的抗体)之间的实时结合相互作用。表面等离子体共振分析也可以通过将分析物(生物传感器基质上的抗体)固定并呈递配体(例如溶液中的重组IL-12)来进行。
短语“表面等离子体共振”包括允许例如使用BIAcore系统(Pharmacia Biosensor AB，Uppsala，Sweden and Piscataway，N.J.)，通过检测生物传感器基质内的蛋白质浓度的变化来分析实时生物特异性相互作用的光学现象。对于进一步的描述，参见Jonsson，U.等，(1993)Ann.Biol.Clin.51：19-26；Jonsson，U.等，(1991)Biotechniques 11：620-627；Johnsson，B.等，(1995)J.Mol.Recognit.8：125-131；以及Johnnson，B.等，(1991)Anal.Biochem.198：268-277。
在某些实施方式中，本发明提供的抗体可以以广范的亲和性(Kd)结合IL-12(例如人IL-12)和/或IL-23(例如人IL-23)的p40亚基。在一种实施方式中，本发明的抗体以高亲和性结合人IL-12和/或IL-23的p40亚基。例如，抗体可以以等于或低于约10-7M、例如但不限于0.1-9.9(或其间的任何范围或值)x10-7、10-8、10-9、10-10、10-11、10-12、10-13或其间的任何范围或值的Kd结合人IL-12和/或人IL-23的p40亚基。在一种实施方式中，本发明的抗体以等于或低于约1x10-6M的Kd结合IL-12和/或IL-23的p40亚基。在一种实施方式中，本发明的抗体以等于或低于约1x10-7M的Kd结合IL-12和/或IL-23的p40亚基。在一种实施方式中，本发明的抗体以等于或低于约1x10-8M的Kd结合IL-12和/或IL-23的p40亚基。在一种实施方式中，本发明的抗体以等于或低于约1x10-9M的Kd结合IL-12和/或IL-23的p40亚基。在一种实施方式中，本发明的抗体以等于或低于约1x10-10M的Kd结合IL-12和/或IL-23的p40亚基。在一种实施方式中，本发明的抗体以等于或低于约1x10-11M的Kd结合IL-12和/或IL-23的p40亚基。在一种实施方式中，本发明的抗体以等于或低于约1x10-12M的Kd结合IL-12和/或IL-23的p40亚基。在一种实施方式中，本发明的抗体以等于或低于约1x10-13M的Kd结合IL-12和/或IL-23的p40亚基。在各种实施方式中，本发明的抗体以5x10-8M或以下的Kd、1x10-8M或以下的Kd、5x10-9M或以下的Kd、1x10-9M或以下的Kd、5x10-10M或以下的Kd、或1x10-10M或以下的Kd，结合含p40亚基的细胞因子例如IL-12和/或IL-23。
在某些其他的实施方式中，本发明提供的抗体可以如通过表面等离子体共振测定的以0.1s-1或以下的koff速率常数结合IL-12(例如人IL-12)和/或IL-23(例如人IL-23)的p40亚基。在一种实施方式中，分离的IL-12、IL-23和/或IL-2和/或IL-23的p40亚基的抗体或其抗原结合部分以1x10-2s-1或以下的koff速率常数与IL-12、IL-23和/或IL-12和/或IL-23的p40亚基解离。在更优选实施方式中，分离的IL-12、IL-23和/或IL-2和/或IL-23的p40亚基的抗体或其抗原结合部分以1x10-3s-1或以下的koff速率常数与IL-12、IL-23和/或它们的p40亚基解离。在更优选实施方式中，分离的IL-12、IL-23和/或IL-2和/或IL-23的p40亚基的抗体或其抗原结合部分以1x10-4s-1或以下的koff速率常数与IL-12、IL-23和/或其p40亚基解离。在更优选实施方式中，分离的IL-12、IL-23和/或IL-2和/或IL-23的p40亚基的抗体或其抗原结合部分以1x10-5s-1或以下的koff速率常数与IL-12和/或IL-23和/或其p40亚基解离。
在各种实施方式中，本发明的抗体或其抗原结合部分就中和性的。本发明提供的抗体或其抗原结合部分的中和活性可以使用本文中描述的几种适合的体外分析中的一种或多种来评估。“中和抗体”(或“中和IL-12和/或IL-23的p40亚基的活性的抗体”或“中和IL-12和/或IL-23活性的抗体”)包括其与IL-12和/或IL-23的p40亚基的结合导致IL-12和/或IL-23的p40亚基的生物活性(例如IL-12和/或IL-23的生物活性)受到抑制的抗体。生物活性的这种抑制可以通过测量IL-12/23的p40亚基和/或IL-12和/或IL-23的生物活性的一种或多种指标(例如植物凝集素母细胞增殖分析(PHA分析)中人植物凝集素母细胞增殖的抑制、IL-12诱导的人母细胞的γ-干扰素产生的抑制(IFN-γ分析)或IL-12(或IL-23)受体结合分析(RBA分析)中受体结合的抑制)来评估，例如，如在US 6,914,128中详细描述的，其全部内容在此引为参考。IL-12/23的p40亚基和/或IL-12和/或IL-23的生物活性的这些指标可以通过本领域中已知的几种标准体外或体内分析方法中的一种或多种来评估。
可以评估抗IL-12/IL-23的p40亚基的抗体抑制PHA母细胞增殖(其增殖由IL-12刺激)的能力。在标准分析法中，将抗IL-12/IL-23的p40亚基的抗体的连续稀释液在微量滴定板(U型底，96孔，Costar，Cambridge，MA)中与100ml RPMI完全培养基中的230pg/ml hIL-12在37℃和5％CO2下预温育1小时。将PHA母细胞分离，清洗一次，并重悬浮在RPMI完全培养基中至细胞密度为3x105个细胞/ml。向抗体/hIL-12混合物加入PHA母细胞(100ml，3x104个细胞)，在37℃和5％CO2下温育3天，并用0.5mCi/孔的(3H)-胸腺嘧啶(Amersham，Arlington Heights，IL)标记4-6小时。利用细胞收获器(Tomtec，Orange，CT)将培养物内含物收获在玻璃纤维滤器上，并通过液闪计数来测量细胞DNA中的(3H)-胸腺嘧啶掺入。
因此，在一种实施方式中，本发明的抗体结合IL-12和/或IL-23的p40亚基，并在体外植物凝集素母细胞增殖分析(PHA分析)中以1x10-6M或以下的IC50抑制植物凝集素母细胞增殖。在一种实施方式中，本发明的抗体结合IL-12和/或IL-23的p40亚基，并在体外植物凝集素母细胞增殖分析(PHA分析)中以1x10-7M或以下的IC50抑制植物凝集素母细胞增殖。在一种实施方式中，本发明的抗体或其抗原结合部分结合IL-12和/或IL-23的p40亚基，并在体外PHA分析中以1x10-8M或以下的IC50抑制植物凝集素母细胞增殖。在一种实施方式中，本发明的抗体或其抗原结合部分结合IL-12和/或IL-23的p40亚基，并在体外PHA分析中以1x10-9M或以下的IC50抑制植物凝集素母细胞增殖。在一种实施方式中，本发明的抗体或其抗原结合部分结合IL-12和/或IL-23的p40亚基，并在体外PHA分析中以1x10-10M或以下的IC50抑制植物凝集素母细胞增殖。在一种实施方式中，本发明的抗体或其抗原结合部分结合IL-12和/或IL-23的p40亚基，并在体外PHA分析中以1x10-11M或以下的IC50抑制植物凝集素母细胞增殖。在一种实施方式中，本发明的抗体或其抗原结合部分结合IL-12和/或IL-23的p40亚基，并在体外PHA分析中以1x10-12M或以下的IC50抑制植物凝集素母细胞增殖。
抗IL-12/IL-23的p40亚基的抗体抑制PHA母细胞的IFNγ产生(所述产生由IL-12诱导)的能力可以如下所述进行分析。将各种浓度的抗IL-12/IL-23的p40亚基的抗体在微量滴定板(U型底，96孔，Costar)中与100ml RPMI完全培养基中的200-400pg/ml hIL-12在37℃和5％CO2下预温育1小时。将PHA母细胞分离，清洗一次，并重悬浮在RPMI完全培养基中至细胞密度为1x107个细胞/ml。向抗体/hIL-12混合物加入PHA母细胞(100μl的1x106个细胞)，并在37℃和5％CO2下温育18小时。在温育后，从各个孔抽出150μl无细胞上清液，并通过ELISA(内源γ-干扰素ELISA，Endogen，Cambridge，MA)测量产生的人IFN-γ的水平。
因此，在其他实施方式中，本发明的抗体结合IL-12和/或IL-23的p40亚基，并以约1.0x10-8M的IC50值抑制IL-12诱导的人母细胞的γ-干扰素产生。在一种实施方式中，本发明的抗体结合IL-12和/或IL-23的p40亚基，并以约1.0x10-9M的IC50值抑制IL-12诱导的人母细胞的γ-干扰素产生。在一种实施方式中，本发明的抗体结合IL-12和/或IL-23的p40亚基，并以约1.0x10-10M的IC50值抑制IL-12诱导的人母细胞的γ-干扰素产生。在一种实施方式中，本发明的抗体结合IL-12和/或IL-23的p40亚基，并以约1.0x10-11M的IC50值抑制IL-12诱导的人母细胞的γ-干扰素产生。在一种实施方式中，本发明的抗体结合IL-12和/或IL-23的p40亚基，并以约1.0x10-12M的IC50值抑制IL-12诱导的人母细胞的γ-干扰素产生。
抗IL-12/IL-23的p40亚基的抗体抑制IL-23活性的能力可以使用已知方法和分析，例如本领域中已知的(参见例如www.copewithcytokines.de，在IL-23之下，IL-23蛋白的描述和参考文献，IL-23分析法和IL-12分析法，其内容在此以其全文引为参考)和本文中所描述的方法和分析法来进行分析。例如，已显示人IL-23刺激PHA母T细胞和记忆T-细胞的IFN-γ产生，并且也显示其诱导两种细胞类型的增殖。因此，抗IL-12/IL-23的p40亚基的抗体抑制PHA母细胞的IFNγ产生(所述产生由IL-23刺激)的能力可以如上对于IL-12的情形所描述的进行分析。此外，可以如上对于IL-12的情形所述的来评估抗IL-12/IL-23的p40亚基的抗体抑制PHA母细胞增殖(所述增殖由IL-23刺激)的能力。IL-23和IL-12都激活相同的信号传导分子，包括JAK2、TYK2和STAT1、STAT3、STAT4和STAT5。与IL-12相比，对IL-23响应时STAT4活化明显更弱，并且形成不同的DNA结合STAT复合物。IL-23结合IL-12受体的β-1亚基但不结合β-2亚基，从而激活PHA母T-细胞中的STAT蛋白之一，即STAT4。因此，可以分析抗IL-12/IL-23的p40亚基的抗体在PHA母T-细胞中抑制STAT4激活的能力(参见例如在Parham等，Journal of Immunology 168(11)：5699-5708 2002中描述的分析法，其全部内容在此引为参考)。Shimozato等(Immunology 117(1)：22-28(2006))已报道，在脾细胞中IL-23的功能、特别是IL-23诱导的细胞因子(例如IFN-γ)产生，受到竞争结合IL-23受体的IL-12-p40的p40亚基的抑制。因此，可以分析抗IL-12/IL-23的p40亚基的抗体在脾细胞中抑制细胞因子例如IFN-γ的活化的能力，例如，如在Shimozato等的文章中所述的，其全部内容在此引为参考。
在另一种实施方式中，本发明的抗体或其抗原结合部分具有低毒性。特别地，其中单个组分例如可变区、恒定区和框架单独地和/或共同地具有低免疫原性的抗体或其抗原结合部分可用于本发明中。可以在本发明中使用的抗体任选地特征在于其以可测量的症状改善和低的和/或可接受的毒性长期治疗患者的能力。低的或可接受的免疫原性和/或高亲和性以及其他适宜的性质可能对获得的治疗效果有贡献。“低免疫原性”在本文中被定义为在少于约75％或优选地少于约50％的被治疗患者中引起显著的HAHA、HACA或HAMA反应，或在被治疗患者中引起低的滴度(使用双抗原酶免疫分析法测量时低于约300，优选地低于约100)(Elliott等，Lancet 344：1125-1127(1994)，在此以其全文引为参考)。“低免疫原性”也可以被定义为在使用本发明的抗IL-12和/或抗IL-23的抗体治疗的患者中，针对所述抗体的可滴定的抗体水平的发生率，其为在治疗期间对于推荐的治疗过程使用推荐剂量治疗的患者中发生率低于25％、优选地低于10％。
可以例如通过标准的ELISA测试本发明的抗体与IL-12和/或IL-23的p40亚基(例如在本文的章节IV(A)、IV(C)和/或表3和表4中所描述的部分、结构域、位点或表位)的结合。简单来说，将微量滴定板用PBS中的0.25μg/ml的纯化p40亚基(或优选的p40结构域)包被，然后用PBS中的5％牛血清白蛋白封闭。向各个孔加入抗体的稀释液(例如来自于免疫小鼠例如用p40亚基结构域免疫的小鼠的血清稀释液)，并在37℃下温育1-2小时。将板用PBS/Tween洗涤，然后与偶联到碱性磷酸酶上的第二试剂(例如对于人抗体来说，山羊抗人IgG Fc特异性多克隆试剂)在37℃下温育1小时。在清洗后，将板用pNPP底物(1mg/ml)显色，并在405-650的OD处进行分析。优选地，将显示出最高滴度的小鼠用于融合。
如上所述的ELISA分析法也可用于筛选显示出与免疫原的阳性反应性的杂交瘤。对以高亲和力结合例如IL-12和/或IL-23的p40亚基(例如在本文的章节IV(A)、IV(C)和/或表3和表4中所描述的部分、结构域、位点或表位)的杂交瘤进行亚克隆和进一步鉴定。可以选择来自于各杂交瘤的保留了亲代细胞的反应性(通过ELISA测定)的一个克隆用于制备5-10个小管的细胞库，其储存在-140℃，并用于抗体纯化。
为了纯化抗IL-12和/或IL-23的p40亚基的抗体，可以将所选杂交瘤生长在两升转瓶中用于单克隆抗体的纯化。可以将上清液过滤并浓缩，然后使用蛋白A-琼脂糖(Pharmacia，Piscataway，N.J.)进行亲和层析。洗脱的IgG可以通过凝胶电泳和高效液相色谱来检查以确保纯度。可以将缓冲溶液交换到PBS中，并且可以使用1.43的消光系数通过OD280来测定浓度。可以将单克隆抗体分成等分试样并储存在-80℃下。
为了确定所选择的单克隆抗体是否结合独特的表位，可以使用可商购试剂(Pierce，Rockford，IL)对各抗体进行生物素化。可以如上所述使用包被有IL-12和/或IL-23的p40亚基(例如在本文的章节IV(A)、IV(C)和/或表3和表4中所描述的部分、结构域、位点或表位)的ELISA板进行利用未标记的单克隆抗体和生物素化的单克隆抗体的竞争研究。生物素化mAb的结合可以使用链亲合素-碱性磷酸酶探针来检测。
为了确定纯化的抗体的同种型，可以使用针对特定同种型抗体特异性的试剂来进行同种型ELISA。例如，为了确定人单克隆抗体的同种型，可以将微量滴定板的孔用1μg/ml的抗人免疫球蛋白抗体在4℃下包被过夜。在用1％BSA封闭后，可以将板与1μg/ml或以下的测试单克隆抗体或纯化的同种型对照在环境温度下反应1至2小时。然后可以将孔与人IgG1或人IgM特异性碱性磷酸酶偶联探针进行反应。如上所述对板进行显色和分析。
可以通过Western印迹进一步测试抗IL-12和/或IL-23的p40亚基的人IgG与本文描述的IL-12和/或IL-23的p40亚基或其结构域的反应性。简单来说，可以制备IL-12和/或IL-23的p40亚基(例如在本文的章节IV(A)、IV(C)和/或表3和表4中所描述的部分、结构域、位点或表位)并对其进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳。在电泳后，将分离的抗原转移到硝酸纤维素膜上，用10％胎牛血清封闭，并用待测试的单克隆抗体探测。可以使用抗人IgG碱性磷酸酶抗体检测人IgG的结合，并使用BCIP/NBT底物片(SigmaChem.Co.，St.Louis，Mo.)显色。
可以使用表位作图来确定本发明的抗体或其抗原结合片段的结合位点。有几种方法可用于进一步进行构象表位的作图。例如，可以使用在Timmerman等(Mol Divers.2004；8(2)：61-77)中公开的方法。Timmerman等能够使用两种新的技术，即结构域扫描(DomainScan)和基质扫描(Matrix Scan)，成功地对不连续/构象表位作图。也可以使用在Ansong等(J Thromb Haemost.2006.4(4)：842-7)中公开的技术。Ansong等使用亲和性指导的质谱对R8B12抗体所识别的不连续表位进行作图。此外，可以使用成像技术例如蛋白质断层成像术将结合靶RTK的抗体或肽可视化。蛋白质断层成像术以前被用于了解分子相互作用，被用于显示通过结合EGFR的结构域III并由此将EGFR锁定在非易曲且无活性的构象中而起作用的抑制性抗体(Lammerts等，Proc Natl Acad Sci U S A.2008.105(16)：6109-14)。更传统的方法例如定点诱变也可以应用于不连续表位的作图。可以将据认为参与不连续表位的氨基酸区域选择性地突变，并测定与本发明的抗体及其抗原结合片段的结合。当任一区域突变时抗体结合的失能可能表明结合依赖于两个氨基酸片段。正如上面提到的，某些线性表位特征在于必须存在以与本发明的部分结合的特定三维结构。可以通过在IL-12和/或IL-23的p40亚基处于其天然或折叠的状态时以及再次在IL-12和/或IL-23的p40亚基被变性时测定抗体的结合来发现这样的表位。只在折叠的状态下观察到结合发生表明所述表位是以特定折叠结构为特征的线性表位或仅存在于折叠蛋白中的不连续表位。
VI.包含本发明的抗体的药物组合物和药物施用
本发明的抗体和抗体部分可以掺入到适合于施用给受试者的药物组合物中。通常，药物组合物包含本发明的抗体或抗体部分以及药学上可接受的载体。当在本文中使用时，“药学上可接受的载体”包括生理上相容的任何和所有溶剂、分散介质、包衣、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。药学上可接受的载体的实例包括水、盐水、磷酸盐缓冲盐水、右旋糖、甘油、乙醇等中的一种或多种及其组合。在许多情况下，在组合物中包含等渗剂，例如糖类、多元醇如甘露醇、山梨醇或氯化钠是优选的。药学上可接受的载体还可以包含少量辅助性物质例如润湿剂或乳化剂、防腐剂或缓冲剂，其增加抗体或抗体部分的储存期限或有效性。
本发明的抗体和抗体部分可以掺入到适合于肠胃外给药的药物组合物中。优选地，将抗体或抗体部分制备成含有0.1-250mg/ml抗体的注射溶液。注射溶液可以由火石或琥珀玻璃小瓶、安瓿或预装填注射器中的液体或冻干剂型构成。缓冲剂可以是pH 5.0至7.0(最适为pH 6.0)的L-组氨酸(1-50mM)，最适为5-10mM。其他适合的缓冲剂包括但不限于琥珀酸钠、柠檬酸钠、磷酸钠或磷酸钾。可以使用浓度为0-300mM(对于液体剂型来说最适为150mM)的氯化钠来改变溶液的毒性。对于冻干剂型来说，可以包括低温保护剂，主要是0-10％蔗糖(最适为0.5-1.0％)。其他适合的低温保护剂包括海藻糖和乳糖。对于冻干剂型来说可以包含膨胀剂，主要为1-10％甘露醇(最适为24％)。在液体和冻干剂型两者中可以使用稳定剂，主要为1-50mM L-甲硫氨酸(最适为5-10mM)。其他适合的膨胀剂包括甘氨酸、精氨酸，可以包含0-0.05％聚山梨醇酯-80(最适为0.005-0.01％)。其他表面活性剂包括但不限于聚山梨醇酯20和BRIJ表面活性剂。
在优选实施方式中，药物组合物包括剂量为约0.01mg/kg-10mg/kg的抗体。更优选的抗体剂量包括每隔一周施用1mg/kg，或每周施用0.3mg/kg。
本发明的组合物可以采取多种形式。这些形式包括例如液体、半固体和固体剂型，例如液体溶液(例如可注射和可输注溶液)、分散液或悬液、片剂、丸剂、粉剂、脂质体和栓剂。优选的形式取决于目标给药方式和治疗应用。典型的优选组合物采取可注射或可输注溶液的形式，例如与使用其他抗体进行人体被动免疫接种时所使用的类似的组合物。优选给药方式是肠胃外(例如静脉内、皮下、腹膜内、肌肉内)。在优选实施方式中，抗体通过静脉内输注或注射来给药。在另一种优选实施方式中，抗体通过肌肉内或皮下注射来给药。
治疗性组合物通常必须是无菌的并且在制造和储存条件下稳定的。组合物可以配制成溶液、微乳液、分散剂、脂质体或适合于高药物浓度的其他有序结构。可以通过将活性化合物(即抗体或抗体部分)以所需量掺入到(如果需要)具有上面列举的成分之一或组合的适宜溶剂中，然后进行过滤除菌来制备无菌可注射溶液。一般来说，通过将活性化合物掺入到含有基本分散介质和上面列举的所需其他成分的无菌介质中来制备分散剂。在用于制备无菌注射溶液的无菌冻干粉剂的情形中，优选的制备方法是真空干燥和喷雾干燥，其从先前过滤除菌的溶液产生活性成分加上任何其他所需成分的粉剂。可以例如通过使用包衣例如卵磷脂、在分散剂的情况下通过维持所需粒径以及通过使用表面活性剂来维持溶液的适当流动性。可以通过在组合物中包含延迟吸收的试剂例如单硬脂酸盐和明胶产生可注射组合物的延长吸收。
本发明的抗体和抗体部分可以通过本领域已知的多种方法来给药，尽管对于许多治疗应用来说，优选的给药途径/方式是皮下注射、静脉内注射或输注。正如专业技术人员将认识到的，给药途径和/或方式根据所需的结果而变化。在某些实施方式中，活性化合物可以与保护化合物以防止快速释放的载体一起制备，例如受控释放制剂，包括植入物、透皮贴片和微胶囊递送系统。可以使用生物可降解、生物相容性聚合物，例如乙烯-乙酸乙烯酯、聚酸酐、聚乙醇酸、胶原蛋白、聚原酸酯和聚乳酸。制备这样的制剂的许多方法是有专利的或本领域技术人员公知的。参见例如Sustained and ControlledRelease Drug Delivery Systems，J.R.Robinson，ed.，Marcel Dekker，Inc.，New York，1978。
在某些实施方式中，本发明的抗体或抗体部分可以口服给药，例如与惰性稀释剂或可同化的可食用载体一起。也可以将化合物(以及如果需要，其他成分)包封在硬壳或软壳明胶胶囊中，压制成片剂或直接掺入到受试者的饮食中。对于口服治疗性施用来说，可以将化合物与赋形剂合并，并以可服用片剂、口含片剂、锭剂、胶囊、酏剂、悬液、糖浆、薄片等的形式使用。为了通过肠胃外给药之外的方式施用本发明的化合物，可能必需将用防止其失活的材料包覆化合物或将化合物与所述材料共施用。
也可以将补充活性化合物掺入到组合物中。在某些实施方式中，本发明的抗体或抗体部分与可用于治疗其中IL-12和/或IL-23活性有害的障碍的一种或多种另外的治疗药剂共同配制和/或共同施用。例如，本发明的抗IL-12、抗IL-23和/或抗p40抗体或抗体部分可以与结合其他靶标的一种或多种另外的抗体(例如结合其他细胞因子或结合细胞表面分子的抗体)共同配制和/或共同施用。此外，本发明的一种或多种抗体可以与两种或更多种上述治疗药剂组合使用。这样的组合治疗可以有利地利用较低剂量的所施用治疗剂，从而避免了与各种单一治疗相关的可能毒性或并发症。专业技术人员会认识到，当本发明的抗体作为组合疗法的部分使用时，与抗体单独给药于受试者时相比，较低的抗体剂量可能是合乎需要的(例如，通过使用组合疗法可能获得协同治疗效应，其进而允许使用较低抗体剂量获得所需治疗效果)。
白介素12和/或23在与涉及免疫和炎性因素的多种疾病相关的病理学中发挥关键作用。这些疾病包括但不限于类风湿性关节炎、骨关节炎、幼年慢性关节炎、莱姆关节炎、银屑病性关节炎、反应性关节炎、脊椎关节病、系统性红斑狼疮、克罗恩病、溃疡性结肠炎、炎性肠病、胰岛素依赖性糖尿病、甲状腺炎、哮喘、过敏性疾病、银屑病、皮炎硬皮病、特应性皮炎、移植物抗宿主病、器官移植排斥、与器官移植相关的急性或慢性免疫疾病、肉样瘤病、动脉粥样硬化、播散性血管内凝血、川畸病、Grave′s病、肾病综合征、慢性疲劳综合征、韦格纳肉芽肿、Henoch-Schoenlein紫癜、肾微小性血管炎、慢性活动性肝炎、葡萄膜炎、脓毒性休克、中毒休克综合征、脓毒症综合征、恶病质、传染病、寄生虫病、获得性免疫缺陷综合征、急性横向骨髓炎、亨廷顿舞蹈病、帕金森氏病、阿尔兹海默氏病、中风、原发性胆汁性肝硬化、溶血性贫血、恶性肿瘤、心力衰竭、心肌梗塞、阿狄森氏病、散发性I型多腺缺乏和II型多腺缺乏、Schmidt′s综合征、成人(急性)呼吸窘迫综合征、脱发、斑形脱发、血清反应阴性关节病、关节病、Reiter′s病、银屑病性关节病、溃疡性结肠关节病、肠病性滑膜炎、衣原体、耶尔森氏菌和沙门氏菌相关关节病、脊椎关节病、动脉粥样化疾病/动脉硬化、特应性过敏症、自身免疫性大疱病、寻常性天疱疮、落叶性天疱疮、类天疱疮、线性IgA病、自身免疫性溶血性贫血、Coombs阳性溶血性贫血、获得性恶性贫血、青少年恶性贫血、肌痛性大脑炎/Royal Free病、慢性粘膜皮肤念珠菌病、巨细胞关节炎、原发性硬化性肝炎、起因不明自身免疫性肝炎、获得性免疫缺陷病综合征、获得性免疫缺陷相关疾病、丙型肝炎、常见的各种免疫缺陷(常见的各种血丙种球蛋白减少症)、膨胀心肌病、女性不孕症、卵巢衰竭、卵巢功能早衰、纤维变性肺病、起因不明的纤维组织形成牙槽炎、炎症后间质性肺病、间质性肺炎、与间质性肺病相关的结缔组织疾病、与肺病相关的混合结缔组织疾病、与间质性肺病相关的系统性硬化、与间质性肺病相关的类风湿性关节炎、与肺病相关的系统性红斑狼疮、与肺病相关的皮肤肌炎/多肌炎、与肺病相关的Sjogren′s病、与肺病相关的强直性脊柱炎、结节性血管炎弥散肺病、与肺病相关的含铁血黄素沉着病、药物诱导的间质性肺病、辐射纤维化、闭塞性细支气管炎、慢性嗜酸性肺炎、淋巴细胞浸润性肺病、传染病后间质性肺病、痛风性关节炎、自身免疫性肝炎、1型自身免疫性肝炎(典型自身免疫性或狼疮样肝炎)、2型自身免疫性肝炎(抗-LKM抗体肝炎)、自身免疫介导的低血糖、具有黑色棘皮症的B型胰岛素抵抗、甲状旁腺机能减退、与器官移植相关的急性免疫疾病、与器官移植相关的慢性免疫疾病、骨关节炎、原发性硬化性胆管炎、特发性白细胞减少、自身免疫中性白细胞减少、肾病NOS、肾小球肾炎、肾微小性血管炎、莱姆病、盘形红斑狼疮、特发性男性不孕症或NOS、精液自身免疫、多发性硬化症(所有亚型)、胰岛素依赖型糖尿病、交感神经眼炎、结缔组织疾病继发性高血压、Goodpasture′s综合征、结节性多动脉炎的肺表现、急性风湿热、类风湿性脊柱炎、Still′s病、系统性硬化症、Takayasu′s病/动脉炎、自身免疫性血小板减少、特发性血小板减少、自身免疫性甲状腺病、甲状腺机能亢进、甲状腺肿性自身免疫性甲状腺机能减退(Hashimoto′s病)、萎缩性自身免疫性甲状腺机能减退、原发性粘液水肿、晶状体原性葡萄膜炎、原发性血管炎和白癫风。本发明的人抗体和抗体部分可用于治疗自身免疫性疾病，特别是与炎症相关的自身免疫性疾病，包括类风湿性脊柱炎、过敏症、自身免疫性糖尿病、自身免疫性葡萄膜炎。
因此，在某些方面，本发明提供了用于治疗疾病或障碍的方法，所述方法包括施用有效量的本文描述的任一抗体或其组合，并且其中所述抗体或抗体组合有效地改善所述疾病或障碍。在某些实施方式中，本发明的抗体与药学上可接受的载体和/或赋形剂一起施用。
优选地，本发明的抗体或其抗原结合部分可用于治疗类风湿性关节炎、克罗恩病、多发性硬化症、胰岛素依赖性糖尿病和银屑病，如在下面更详细地描述的。
本发明的人抗体或抗体部分也可以与可用于治疗自身免疫性疾病和炎性疾病的一种或多种另外的治疗剂一起施用。本发明的抗体或其抗原结合部分可以单独或组合地使用以治疗这样的疾病。应该理解，本发明的抗体或其抗原结合部分可以单独或与另外的药剂例如治疗剂组合使用，所述另外的药剂由专业技术人员根据预期目的来选择。例如，另外的药剂可以是本领域公认可用于治疗本发明的抗体所治疗的疾病或病症的治疗剂。另外的药剂也可以是为治疗性组合物提供有益属性的药剂，例如影响组合物粘度的药剂。
还应该理解，意图包括在本发明内的组合是可用于其预期目的的组合。下面提出的药剂是出于示例性目的而不意图是限制性的。作为本发明的部分的组合可以是本发明的抗体和选自下面列表的药剂的至少一种另外的药剂。组合也可以包括一种以上另外的药剂，例如两种或三种另外的药剂，只要该组合使得所形成的组合物能够执行其预期的功能即可。
因此，在另外的实施方式中，本发明的抗体任选地还可以包含有效量的选自下列至少之一的至少一种化合物或蛋白质：抗感染药物，心血管(CV)系统药物，中枢神经系统(CNS)药物，自主神经系统(ANS)药物，呼吸道药物，胃肠(Gl)道药物，激素药物，用于流体或电解质平衡的药物，血液学药物，抗肿瘤药物，免疫调节药物，眼、耳或鼻药物，局部药物，营养药物等。这样的药物在本领域中是公知的，包括本文提出的各药物的制剂、适应症、剂量和施用(参见例如Nursing 2001 Handbook of Drugs，21st edition，Springhouse Corp.，Springhouse，Pa.，2001；Health Professional′s DrugGuide 2001，ed.，Shannon，Wilson，Stang，Prentice-Hall，Inc，UpperSaddle River，N.J.；Pharmcotherapy Handbook，Wells等主编，Appleton&Lange，Stamford，Conn.，其各在此以其全文引为参考)。
优选的组合是非甾类抗炎药，也被称为NSAIDS，包括如布洛芬的药物。其他优选的组合是皮质甾醇类药物包括泼尼松龙；当与本发明的抗IL-12抗体组合治疗患者时，可以通过逐渐减少所需的甾类剂量来减轻或甚至消除甾类使用的公知的副作用。可以与本发明的抗体或抗体部分组合用于类风湿性关节炎的治疗剂的非限制性实例包括下列药剂：细胞因子抑制性抗炎药(CSAID)，针对其他人细胞因子或生长因子例如TNF、LT、IL-1、IL-2、IL-6、IL-7、IL-8、IL-15、IL-16、IL-18、EMAP-II、GM-CSF、FGF和PDGF的抗体或拮抗剂。本发明的抗体或其抗原结合部分可以与针对细胞表面分子例如CD2、CD3、CD4、CD8、CD25、CD28、CD30、CD40、CD45、CD69、CD80(B7.1)、CD86(B7.2)、CD90或它们的配体包括CD 154(gp39或CD40L)的抗体组合。
治疗剂的优选组合可以在自身免疫和随后的炎性级联中的不同点进行干扰；优选的实例包括TNF拮抗剂，如嵌合、人源化或人TNF抗体，D2E7(1996年2月9日提交的美国申请系列号08/599,226)、cA2(RemicadeTM)、CDP 571、抗TNF抗体片段(例如CDP870)和可溶性p55或p75 TNF受体、其衍生物(p75TNFRIgG(EnbrelTM)或p55TNFRIgG(Lenercept))、可溶性IL-13受体(sIL-13)以及TNFα转化酶(TACE)抑制剂；类似地，出于同样原因，IL-1抑制剂(例如白介素-1-转化酶抑制剂例如Vx740或IL-1RA等)可能是有效的。其他优选组合包括白介素11、抗P7抗体和p-选择蛋白糖蛋白配体(PSGL)。再另一种优选组合是可能与IL-12的功能并行、依赖于该功能或与其协调地起作用的自身免疫反应的其他关键参与者；特别优选的是IL-18拮抗剂，包括IL-18抗体或可溶性IL-18受体或IL-18结合蛋白。已显示，IL-12和IL-18具有交叉但不同的功能，并且针对两者的拮抗剂的组合可能最为有效。再另一种优选组合是非耗竭性抗CD4抑制剂。再其它的优选组合包括辅助刺激途径CD80(B7.1)或CD86(B7.2)的拮抗剂，包括抗体、可溶性受体或拮抗性配体。
本发明的抗体或其抗原结合部分也可以与多种药剂组合，所述药剂例如甲氨蝶呤、6-MP、硫唑嘌呤、柳氮磺吡啶、美沙拉嗪、奥沙拉嗪、氯奎宁/羟氯喹、青霉胺、金硫苹果酸盐(aurothiomalate)(肌肉内和口服)、硫唑嘌呤、秋水仙碱、皮质类固醇(口服、吸入和局部注射)、β-2肾上腺素受体激动剂(沙丁胺醇、特布他林、沙美特罗)、黄嘌呤类(茶碱、氨茶碱)、色甘酸盐、奈多罗米、酮替芬、异丙托溴铵和氧托溴铵、环孢菌素、FK506、雷帕霉素、麦考酚酸莫酯、来氟米特、NSAID例如布洛芬、皮质类固醇类例如泼尼松龙、磷酸二酯酶抑制剂、腺苷激动剂、抗血栓形成剂、补体抑制剂、肾上腺素能药剂、干扰通过促炎性细胞因子例如TNFα或IL-1进行信号传导的药剂(例如IRAK、NIK、IKK、p38或MAP激酶抑制剂)、IL-1β转化酶抑制剂(例如Vx740)、抗P7抗体、p-选择蛋白糖蛋白配体(PSGL)、TNFα转化酶(TACE)抑制剂、T-细胞信号传导抑制剂例如激酶抑制剂、金属蛋白酶抑制剂、柳氮磺吡啶、硫唑嘌呤、6-巯基嘌呤类、血管紧张素转化酶抑制剂、可溶性细胞因子受体及其衍生物(例如可溶性p55或p75TNF受体和衍生物p75TNFRIgG(EnbrelTM)和p55TNFRIgG(Lenercept)、sIL-1RI、sIL-1RII、sIL-6R、可溶性IL-13受体(sIL-13))和抗炎性细胞因子(例如IL-4、IL-10、IL-11、IL-13和TGFβ)。优选的组合包括甲氨蝶呤或来氟米特，以及在中度或重度类风湿性关节炎病例中包括环孢菌素。
可以与本发明的抗体或抗体部分组合用于炎性肠病的治疗剂的非限制性实例包括下列：布地奈德，表皮生长因子，皮质类固醇类，环孢菌素，柳氮磺吡啶，氨基水杨酸酯类，6-巯基嘌呤，硫唑嘌呤，甲硝哒唑，脂氧合酶抑制剂，美沙拉嗪，奥沙拉嗪，巴柳氮，抗氧化剂，血栓烷抑制剂，IL-1受体拮抗剂，抗IL-1a单克隆抗体，抗IL-6单克隆抗体，生长因子，弹性蛋白酶抑制剂，吡啶基-咪唑化合物，针对其他人细胞因子或生长因子例如TNF、LT、IL-1、IL-2、IL-6、IL-7、IL-8、IL-15、IL-16、IL-18、EMAP-II、GM-CSF、FGF和PDGF的抗体或拮抗剂。本发明的抗体或其抗原结合部分可以与针对细胞表面分子例如CD2、CD3、CD4、CD8、CD25、CD28、CD30、CD40、CD45、CD69、CD90或它们的配体的抗体组合。本发明的抗体或其抗原结合部分也可以与多种药剂组合，所述药剂例如甲氨蝶呤、环孢菌素、FK506、雷帕霉素、麦考酚酸莫酯、来氟米特、NSAID例如布洛芬、皮质类固醇类例如泼尼松龙、磷酸二酯酶抑制剂、腺苷激动剂、抗血栓形成剂、补体抑制剂、肾上腺素能药剂、干扰通过促炎性细胞因子例如TNFα或IL-1进行信号传导的药剂(例如IRAK、NIK、IKK、p38或MAP激酶抑制剂)、IL-1β转化酶抑制剂(例如Vx740)、抗P7抗体、p-选择蛋白糖蛋白配体(PSGL)、TNFα转化酶(TACE)抑制剂、T-细胞信号传导抑制剂例如激酶抑制剂、金属蛋白酶抑制剂、柳氮磺吡啶、硫唑嘌呤、6-巯基嘌呤类、血管紧张素转化酶抑制剂、可溶性细胞因子受体及其衍生物(例如可溶性p55或p75 TNF受体、sIL-1 RI、sIL-1RII、sIL-6R、可溶性IL-13受体(sIL-13))和抗炎性细胞因子(例如IL-4、IL-10、IL-11、IL-13和TGFβ)。
可以与本发明的抗体或抗原结合部分组合用于克罗恩病的治疗药剂的优选实例包括下列药剂：TNF拮抗剂例如抗TNF抗体，D2E7(1996年2月9日提交的美国申请系列号08/599,226)、cA2(RemicadeTM)、CDP 571、抗TNF抗体片段(例如CDP870)、TNFR-Ig构建体(p75TNFRIgG(EnbrelTM)和p55TNFRIgG(Lenercept))、抗P7抗体、p-选择蛋白糖蛋白配体(PSGL)、可溶性IL-13受体(sIL-13)和PDE4抑制剂。本发明的抗体或其抗原结合部分可以与皮质类固醇例如布地奈德和地塞米松组合。本发明的抗体或其抗原结合部分也可以与诸如柳氮磺吡啶、5-氨基水杨酸和奥沙拉嗪的药剂，以及干扰促炎性细胞因子例如IL-1的合成或作用的药剂例如IL-1转化酶抑制剂(如Vx740)和IL-1ra组合。本发明的抗体或其抗原结合部分也可以与T细胞信号传导抑制剂例如酪氨酸激酶抑制剂6-巯基嘌呤类一起使用。本发明的抗体或其抗原结合部分可以与IL-11组合。
可以与本发明的抗体或抗原结合部分组合用于多发性硬化症的治疗药剂的非限制性实例包括下列药剂：皮质类固醇类，泼尼松龙，甲泼尼龙，硫唑嘌呤，环磷酰胺，环孢菌素，甲氨蝶呤，4-氨基吡啶，替扎尼定，干扰素-β1a(Avonex，Biogen)，干扰素-β1b(Bseron，Chiron/Berlex)，Copolymer 1(Cop-1，Copaxone，Teva PharmaceuticalIndustries，Inc.)，高压氧，静脉内免疫球蛋白，克拉利平(clabribine)，针对其他人细胞因子或生长因子例如TNF、LT、IL-1、IL-2、IL-6、IL-7、IL-8、IL-15、IL-16、IL-18、EMAP-II、GM-CSF、FGF和PDGF的抗体或拮抗剂。本发明的抗体或其抗原结合部分可以与针对细胞表面分子例如CD2、CD3、CD4、CD8、CD25、CD28、CD30、CD40、CD45、CD69、CD90或它们的配体的抗体组合。本发明的抗体或其抗原结合部分也可以与多种药剂组合，所述药剂例如甲氨蝶呤、环孢菌素、FK506、雷帕霉素、麦考酚酸莫酯、来氟米特、NSAID例如布洛芬、皮质类固醇类例如泼尼松龙、磷酸二酯酶抑制剂、腺苷激动剂、抗血栓形成药剂、补体抑制剂、肾上腺素能药剂、干扰通过促炎性细胞因子例如TNFα或IL-1进行信号传导的药剂(例如IRAK、NIK、IKK、p38或MAP激酶抑制剂)、IL-1β转化酶抑制剂(例如Vx740)、抗P7抗体、p-选择蛋白糖蛋白配体(PSGL)、TACE抑制剂、T-细胞信号传导抑制剂例如激酶抑制剂、金属蛋白酶抑制剂、柳氮磺吡啶、硫唑嘌呤、6-巯基嘌呤类、血管紧张素转化酶抑制剂、可溶性细胞因子受体及其衍生物(例如可溶性p55或p75TNF受体、sIL-1 RI、sIL-1RII、sIL-6R、可溶性IL-13受体(sIL-13))和抗炎性细胞因子(例如IL-4、IL-10、IL-11、IL-13和TGFβ)。
可以与抗体或抗原结合部分组合用于多发性硬化症的治疗剂的优选实例包括干扰素-β例如IFNβ1a和IFNβ1b、克帕松(Copaxone)、皮质类固醇类、IL-1抑制剂、TNF抑制剂及针对CD40配体和CD80的抗体。
本发明的药物组合物可以包括“治疗有效量”或“预防有效量”的本发明的抗体或抗体部分。“治疗有效量”是指在必需的剂量和时间长度下有效获得所需治疗结果的量。抗体或抗体部分的治疗有效量可以随着多种因素而变化，例如个体的疾病状态、年龄、性别和体重，抗体或抗体部分在个体中引发所需反应的能力。治疗有效量也是抗体或抗体部分的任何有毒或有害效应被治疗上有益的效应超过的量。“预防有效量”是指在所必需的剂量和时间长度下有效获得所需预防结果的量。通常，由于预防剂量在疾病之前或疾病的较早阶段时在受试者中使用，因此预防有效量将低于治疗有效量。
可以调整剂量方案以提供最佳的所需响应(例如治疗或预防反应)。例如，可以施用单一大剂量，可以在一段时间内施用几个分剂量，或者可以按照治疗情况的迫切性所指示的成比例地减少或增加剂量。特别有利的是配制单位剂量形式的肠胃外组合物，以便于施用和剂量均匀性。当在本文中使用时，单位剂量形式是指适合作为单一剂量用于待治疗的哺乳动物受试者的物理上离散的单元；各单元含有据计算产生所需治疗效果的预定量的活性化合物及所需的制药载体。本发明的单位剂量形式的规格由下列因素决定或直接取决于它们：(a)活性化合物的独特特性和需获得的特定治疗或预防效果，以及(b)在配制这样的活性化合物以实现个体治疗灵敏度的领域中固有的限制。
本发明的抗体或抗体部分的治疗或预防有效量的示例性而非限制性的范围是0.01-20mg/kg，更优选为1-10mg/kg，甚至更优选为0.3-1mg/kg。应该指出，剂量值可以随着待改善的病症的类型和严重性而变。还应该理解，对于任何特定受试者来说，应该按照个体的需要和给药或监督组合物给药的人员的专业判断，随时间调整具体的剂量方案，并且本文中提出的剂量范围仅仅是示例性的，不意图限制所要求保护的组合物的范围或实践。
在一种实施方式中，本发明的抗体包含在美国申请系列号12/625,057(专利公布号US 2010-0172862A2)中所公开的药物组合物中，其全部内容在此引为参考。
VII.本发明的抗体的用途
由于其结合IL-12、IL-23和/或p40亚基的能力，可以使用常规免疫分析例如酶联免疫吸附分析(ELISA)、放射免疫分析(RIA)或组织免疫组织化学，将本发明的抗体或其部分(例如其片段的抗原结合部分)用于检测IL-12、IL-23和/或p40亚基(例如在生物样品例如血清或血浆中的)。
因此，另一方面，本发明提供了用于检测生物样品中的IL-12、IL-23和/或p40亚基的方法，所述方法包括将生物样品与本发明的抗体或抗体部分相接触，并检测结合IL-12、IL-23和/或p40亚基的抗体(或抗体部分)或者未结合的抗体(或抗体部分)从而检测生物样品中的IL-12、IL-23和/或p40亚基。抗体用可检测物质直接或间接标记以便于结合或未结合的抗体的检测。合适的可检测物质包括各种酶、辅基、荧光物质、发光物质和放射活性物质。适合的酶的实例包括辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或乙酰胆碱酯酶；合适的辅基复合物的实例包括链亲合素/生物素和亲和素/生物素；合适的荧光物质的实例包括伞形酮、荧光素、荧光素异硫氰酸酯、罗丹明、二氯三嗪胺荧光素、丹磺酰氯或藻红蛋白；发光物质的实例包括鲁米诺；且合适的放射活性物质的实例包括125I、131I、35S或3H。
作为对抗体进行标记的替代方案，可以通过利用以可检测物质标记的重组(“r”)IL-12和/或rIL-23和/或rp40标准品和未标记的抗IL-12和/或抗IL-23和/或抗p40亚基的抗体的竞争免疫分析测定生物流体中的IL-12、IL-23和/或p40亚基。在这种分析中，将生物样品、标记的rIL-12和/或rIL-23和/或rp40标准品及抗hIL-12和/或抗IL-23和/或抗p40亚基抗体合并，并测定结合未标记抗体的标记的rIL-12和/或rIL-23和/或rp40标准品的量。生物样品中IL-12和/或IL-23和/或p40亚基的量分别与结合抗IL-12和/或抗IL-23和/或抗p40抗体的标记的rIL-12和/或rIL-23和/或rp40亚基标准品的量成反比。
本发明所涵盖的抗体(包括Y61和J695)也可用于检测来自于人类以外的物种的IL-12，特别是来自于灵长类的IL-12和/或IL-23和/或p40。例如，Y61可用于检测食蟹猴和恒河猴中的IL-12。J695可用于检测食蟹猴、恒河猴和狒狒中的IL-12。然而，没有抗体与小鼠或大鼠IL-12交叉反应。
本发明的抗体和抗体部分能够在体外和体内中和IL-12、IL-23和/或IL-12和/或IL-23的p40亚基的活性。因此，本发明的抗体和抗体部分可用于抑制IL-12和/或IL-23和/或p40的活性，例如在含有它们的细胞培养物中、在人类受试者中或在具有与本发明的抗体交叉反应的IL-12和/或IL-23和/或p40的其他哺乳动物受试者(例如灵长类如狒狒、食蟹猴和恒河猴)中。在一种实施方式中，本发明提供了分离的人抗体或其抗原结合部分，其中和人IL-12、IL-23和/或IL-12和/或IL-23的p40亚基以及选自狒狒IL-12、IL-23和/或IL-12和/或IL-23的p40亚基，狨IL-12、IL-23和/或IL-12和/或IL-23的p40亚基，黑猩猩IL-12、IL-23和/或IL-12和/或IL-23的p40亚基，食蟹猴IL-12、IL-23和/或IL-12和/或IL-23的p40亚基及恒河猴IL-12、IL-23和/或IL-12和/或IL-23的p40亚基的至少一种另外的灵长类IL-12、IL-23和/或IL-12和/或IL-23的p40亚基的活性，但是不中和小鼠IL-12、IL-23和/或IL-12和/或IL-23的p40亚基的活性。优选地，所述IL-12、IL-23和/或IL-12和/或IL-23的p40亚基是人IL-12、IL-23和/或IL-12和/或IL-23的p40亚基。例如，在含有或怀疑含有人IL-12、IL-23和/或人IL-12和/或IL-23的p40亚基的细胞培养物中，可以向培养基中添加本发明的抗体或抗体部分以抑制所述培养基中人IL-12、IL-23和/或人IL-12和/或IL-23的p40亚基的活性。
在另一种实施方式中，本发明提供了用于在患有其中IL-12、IL-23和/或IL-12和/或IL-23的p40亚基的活性有害的障碍的受试者中抑制IL-12、IL-23和/或IL-12和/或IL-23的p40亚基的活性的方法。已证明，IL-12、IL-23和/或IL-12和/或IL-23的p40亚基参与广范的障碍的病理生理(Windhagen等，(1995)J.Exp.Med.182：1985-1996；Morita等，(1998)Arthritis and Rheumatism.41：306-314；Bucht等，(1996)Clin.Exp.Immunol.103：347-367；Fais等，(1994)J.Interferon Res.14：235-238；Pyrronchi等，(1997)Am.J.Path.150：823-832；Monteleone等，(1997)Gastroenterology.112：1169-1178；以及Berrebi等，(1998)Am.J.Path 152：667-672；Pyrronchi等，(1997)Am.J.Path.150：823-832)。本发明提供了用于在患有这样的障碍的受试者中抑制IL-12、IL-23和/或IL-12和/或IL-23的p40亚基的活性的方法，所述方法包括向受试者施用本发明的抗体或抗体部分以使受试者中IL-12、IL-23和/或IL-12和/或IL-23的p40亚基的活性被抑制。优选地，所述IL-12、IL-23和/或IL-12和/或IL-23的p40亚基是人IL-12、IL-23和/或IL-12和/或IL-23的p40亚基，并且所述受试者是人类受试者。或者，所述受试者可以是表达与本发明的抗体交叉反应的IL-12、IL-23和/或IL-12和/或IL-23的p40亚基的哺乳动物。再进一步，受试者可以是其中已引入人IL-12、人IL-23和/或人IL-12和/或IL-23的p40亚基的哺乳动物(例如通过施用人IL-12、人IL-23和/或人IL-12和/或IL-23的p40亚基，或通过表达人IL-12、人IL-23和/或人IL-12和/或IL-23的p40亚基的转基因)。本发明的抗体可以施用于人类受试者以用于治疗性目的(在下面进一步讨论)。此外，本发明的抗体可以施用于表达与所述抗体交叉反应的IL-12、IL-23和/或IL-12和/或IL-23的p40亚基的非人类哺乳动物以用于兽医学目的或作为人体疾病的动物模型。对于后者来说，这样的动物模型可用于评估本发明的抗体的治疗效能(例如测试给药剂量和时间过程)。
当在本文中使用时，短语“其中IL-12、IL-23和/或IL-12和/或IL-23的p40亚基的活性有害的障碍”意图包括其中在患有所述障碍的受试者中IL-12、IL-23和/或IL-12和/或IL-23的p40亚基的存在已被显示或怀疑造成该障碍的病理生理，或者是造成所述障碍恶化的因素的疾病和其他障碍。因此，其中IL-12、IL-23和/或IL-12和/或IL-23的p40亚基的活性有害的障碍是其中IL-12、IL-23和/或IL-12和/或IL-23的p40亚基的活性的抑制预计将改善所述障碍的症状和/或进展的障碍。这样的障碍可以例如通过患有所述障碍的受试者的生物流体中IL-12、IL-23和/或IL-12和/或IL-23的p40亚基的浓度增加(例如在受试者的血清、血浆、滑液等中IL-12、IL-23和/或IL-12和/或IL-23的p40亚基的浓度增加)来证实，所述浓度增加可以例如使用如上所述的抗IL-12、抗IL-23和/或抗IL-12和/或IL-23的p40亚基的抗体来检测。其中IL-12、IL-23和/或IL-12和/或IL-23的p40亚基的活性有害的障碍具有大量实例。在一种实施方式中，抗体或其抗原结合部分可用于治疗本文描述的疾病或障碍的疗法中。在另一种实施方式中，抗体或其抗原结合部分可用于制造本文描述的疾病或障碍的治疗药物。
在另外的方面，本发明提供了用于筛选调节IL-12、IL-23和/或IL-12和/或IL-23的p40亚基的表达、量和/或活性中的至少一种和/或生物样品中IL-12、IL-23和/或IL-12和/或IL-23的p40亚基的表达、量和/或活性中的至少一种的药剂的方法，所述方法包括提供待测试样品例如细胞、组织、器官或待研究的个体；提供本发明的抗体，其中所述抗体含有可检测标记或可以通过具有可检测标记的第二分子进行检测；用测试试剂例如小分子化合物或生物聚合物处理所述测试样品；将测试样品与所述抗体相接触；以及检测和/或测量IL-12、IL-23和/或IL-12和/或IL-23的p40亚基的表达、量和/或活性和/或所述样品中IL-12、IL-23和/或IL-12和/或IL-23的p40亚基的表达、量和/或活性，其中IL-12、IL-23和/或IL-12和/或IL-23的p40亚基的表达、量和/或活性中的至少一种的增加或降低，和/或与未处理样品相比IL-12、IL-23和/或IL-12和/或IL-23的p40亚基的表达、量和/或活性中的至少一种的增加或降低指示了能够调节IL-12、IL-23和/或IL-12和/或IL-23的p40亚基的表达、量和/或活性中的至少一种和/或样品中IL-12、IL-23和/或IL-12和/或IL-23的p40亚基的表达、量和/或活性中的至少一种的药剂。
下面进一步描述本发明的抗体和抗体部分在几种非限制性的具体障碍的治疗中的用途：
类风湿性关节炎
已表明，白介素-12在炎性疾病例如类风湿性关节炎中发挥作用。已在来自于类风湿性关节炎患者的滑液中检测到可诱导的IL-12p40信使，并且也已显示IL-12存在于类风湿性关节炎患者的滑液中(参见例如Morita等，(1998)Arthritis and Rheumatism 41：306-314)。已发现，IL-12阳性细胞存在于类风湿性关节炎滑膜的衬里下层(sublining layer)中。本发明的人抗体和抗体部分可用于治疗例如类风湿性关节炎、青少年类风湿性关节炎、莱姆关节炎、类风湿性脊柱炎、骨关节炎和痛风性关节炎。通常将抗体或抗体部分全身性施用，尽管对于某些障碍来说抗体或抗体部分的局部施用可能是有益的。本发明的抗体或抗体部分也可以与可用于治疗自身免疫疾病的一种或多种另外的治疗剂一起施用。
在类风湿性关节炎的胶原蛋白诱导关节炎(CIA)鼠模型中，在关节炎之前用抗IL-12 mAb(大鼠抗小鼠IL-12单克隆抗体，C17.15)治疗小鼠显著抑制了疾病的发作，且降低了疾病的发病率和严重性。在关节炎发作后早期用抗IL-12 mAb治疗降低了严重性，但是在疾病发作后较晚用抗IL-12 mAb治疗小鼠对疾病严重性具有极小影响。
克罗恩病
白介素-12也在炎性肠病克罗恩病中发挥作用。在患有克罗恩病的患者的肠粘膜中发生IFN-γ和IL-12的增高的表达(参见例如Fais等，(1994)J.Interferon Res.14：235-238；Pyrronchi等，(1997)Amer.J.Pathol.150：823-832；Monteleone等，(1997)Gastroenterology 112：1169-1178；Berrebi等，(1998)Amer.J.Pathol.152：667-672)。已显示，抗IL-12抗体在结肠炎的小鼠模型，例如TNBS诱导的结肠炎IL-2敲除小鼠中以及最近在IL-10敲除小鼠中抑制疾病。因此，本发明的抗体和抗体部分可用于炎性肠病的治疗。
多发性硬化症
已表明白介素-12作为多发性硬化症的关键介质。在患有多发性硬化症的患者的病灶中，可以证实诱导的IL-12 p40信使或IL-12本身的表达(Windhagen等，(1995)J.Exp.Med 182：1985-1996；Drulovic等，(1997)J.Neurol.Sci.147：145-150)。患有多发性硬化症的慢性进行性患者具有高的IL-12循环水平。使用来自于多发性硬化症患者的T-细胞和抗原呈递细胞(APC)进行的研究揭示出引起Th1型免疫反应的一系列自持性免疫相互作用是进行性多发性硬化症的基础。T细胞的IFN-γ分泌增加引起APC产生IL-12的增加，其维持了引起Th1型免疫激活的慢性状态和疾病的循环(Balashov等，(1997)Proc.Natl.Acad.Sci.94：599-603)。已使用小鼠和大鼠多发性硬化症的实验性变态反应性脑脊髓炎(EAE)模型来研究IL-12在多发性硬化症中的作用。在小鼠的多发性硬化症复发缓解型EAE模型中，用抗IL-12 mAb进行预治疗延迟麻痹并降低临床评分。在麻痹高峰或在随后的缓解期间用抗IL-12 mAb治疗降低临床评分。因此，本发明的抗体或其抗原结合部分可用于在人体中改善与多发性硬化症相关的症状。
胰岛素依赖型糖尿病
已表明白介素-12是胰岛素依赖型糖尿病(IDDM)的重要介质。在NOD小鼠中通过施用IL-12诱导IDDM，并且抗IL-12抗体在IDDM的过继转移模型中是保护性的。早期发作的IDDM患者通常经历所谓的“蜜月期”，在此期间一些残留的胰岛细胞功能得以维持。这些残留的胰岛细胞产生胰岛素并比施用的胰岛素更好地调控血糖水平。用抗IL-12抗体治疗这些早期发作的患者可以阻止胰岛细胞的进一步破坏，从而维持内源性胰岛素源。
银屑病
已表明白介素-12是银屑病中的关键介质。银屑病涉及与TH 1型细胞因子表达状况相关的急性和慢性皮肤病变(Hamid等，(1996)J.Allergy Clin.Immunol.1：225-231；Turka等，(1995)Mol.Med.1：690-699)。在患病人体皮肤样品中检测到IL-12 p35和p40 mRNA。因此，本发明的抗体或其抗原结合部分可用于改善慢性皮肤障碍例如银屑病。抗体或其抗原结合部分也可用于治疗各种形式的银屑病，例如斑块型银屑病和慢性银屑病。抗体或其抗原结合部分也可用于治疗不同严重程度的银屑病，例如中度至重度银屑病。
本发明通过下面的实施例进行进一步说明，所述实施例不应以任何方式解释为限制性的。所有引用的参考文献，包括在整个本申请中引用的文献参考、授权的专利和公布的专利申请的内容，在此明确通过引用引入。还应该理解，所有表格的内容通过引用引入。
实施例
本发明通过下面的实施例进行进一步说明，所述实施例不应被解释为进一步限制。在整个本申请中引用的所有图和所有参考文献、专利和公布的专利申请的内容以及附图，在此明确地通过引用以其全文引入。
实施例1：蛋白质表达和纯化
A.人单克隆抗体J695的制备和分析
J695由在1,000升生物反应器中培养的重组中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系ALP905分泌(参见例如PCT公布号WO0056772A1)。在通过过滤移除CHO细胞后，使用阳离子交换、阴离子交换和疏水相互作用层析纯化mAb。将J695在5mM L-组氨酸、5mM L-甲硫氨酸、0.5％蔗糖、2％D-甘露糖醇、0.005％聚山梨醇酯-80，pH 6.0中浓缩至71.8mg/ml，并冷冻在-80℃。Biacore、PHA母细胞和RB分析按照PCT公布号WO0056772A1中所述进行，其全部内容在此引为参考。
B.J695 Fab片段的制备
将J695用20mM磷酸盐、2.5mM半胱氨酸·HCl、10mM EDTA，pH 7.0稀释至20mg/ml，然后在含有1％的固定木瓜蛋白酶(目录号20341，Pierce Endogen，Rockford，IL)和2.5mM半胱氨酸·HCl的溶液中在37℃消化过夜。通过离心(15min，3200g)除去木瓜蛋白酶，并将用一份20mM NaH2PO4、150mM NaCl，pH 7稀释的上清液在4℃下通过在相同缓冲液中平衡的Hi-trap蛋白A柱(目录号17-0402-03，Amersham Biosciences，Piscataway，NJ)。Fab被在流过液中分离，通过离心(目录号UFV4BGC25，Millipore Corporation，Bedford，MA)浓缩至4mg/ml，并透析至20mM HEPES、150mMNaCl、0.1mM EDTA，pH 7.0中。将Fab进一步浓缩至55mg/ml用于结晶。Fab浓度在6M盐酸胍、20mM NaH2PO4、150mM NaCl，pH 7.0中通过280nm处的UV吸光度来测定(ε＝0.67M-1cm-1)(Gill，S.C.和P.H.von Hippel(1989)，“Calculation of protein extinctioncoefficients from amino acid sequence data.”Anal.Biochem.182(2)：319-326)。
C.J695Fab/IL-12 p70复合物的制备
IL-12 p70从稳定的CHO细胞系表达。将细胞上清液通过由Q-Sepharose Fast Flow、CM-Sepharose Fast Flow、Phenyl SepharoseHigh Substitution Fast Flow、Spiral Cartridge Concentrator和SephacrylS-200 High Resolution构成的几个柱进行纯化。最终柱缓冲液是pH7.4的PBS，其是最终的IL-12 p70储存缓冲液。与如上所述产生的J695 Fab的复合物通过将等摩尔量的Fab与IL-12 p70混合来形成，然后通过尺寸排阻层析分离复合物。
实施例2：蛋白质结晶
A.晶型I的J695 Fab的结晶
使用悬滴气相扩散法来结晶J695 Fab。将J695 Fab(1μl)与1μl储液(25％PEG 4000，0.1M柠檬酸钠，pH 5.6，0.2M(NH4)2SO4)混合并在18℃下平衡。宝石样晶体在7天内形成至0.125x0.125x0.05mm的维度。这些晶体在本文中被称为“晶型I”。
B.晶型II的J695 Fab的结晶
使用悬滴气相扩散法来结晶J695 Fab。将J695 Fab(1μl)与1μl储液(12％PEG 4000，0.1M Tris，pH 8.5)混合并在4℃下平衡。片状晶体在7天内生长至0.25x0.05x0.025mm的维度。这些晶体在本文中被称为“晶型II”。
C.J695 Fab/IL-12 p70复合物的结晶
使用悬滴气相扩散法来结晶J695 Fab/IL-12 p70复合物。将复合物(1μl)与1μl储液(16％PEG 4K，10％2-丙醇，0.1M Na HEPESpH 7.5，0.2M(NH4)2SO4)混合并在18℃下平衡。储液中的添加剂(6％二噁烷或4.3％木糖醇)改善衍射。晶体是带有刻蚀末端的细长矩形片。
实施例3：晶型I的J695 Fab的晶体结构的测定
A.J695 Fab I型晶体的低温保护和快速冷却
将如上所述在25％PEG 4000、0.1M柠檬酸钠，pH 5.6、0.2M(NH4)2SO4存在下生长的I型晶体收获在含有增加量的甘油(5-15％)的母液溶液中，然后在液氮中快速冷冻。将晶体储存在液氮冷冻器中直至收集x-射线衍射数据。
B.J695 Fab I型晶体(晶体1)的X-射线衍射数据收集
在National Synchrotron Light Source(NSLS)，BrookhavenNational Laboratory，Upton，NY处，使用ADSC Quantum 210检测器在束线X26C
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处通过分辨率达
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的旋转方法收集来自于J695Fab I型晶体(晶体1)的X-射线衍射数据。在数据收集期间，使用Oxford Cryosystems Cryostream冷却器将Fab晶体维持在100K的温度下。对于各个数据帧(总共240个)，将晶体旋转0.5°。将数据用HKL2000软件套装(Otwinowski，Z.和W.Minor(1997).Processing of X-ray Diffraction Data Collected in Oscillation Mode.New York，Academic Press)处理。在确定晶体取向后，使用DENZO将数据积分(在空间群P212121中，
Figure BPA00001751564501484
Figure BPA00001751564501485
Figure BPA00001751564501486
晶胞信息概述在表5中)，使用SCALEPACK标度并合并，置于绝对标度上，并使用TRUNCATE缩减到结构因子幅度。进一步的数据操作使用CCP4程序套装(Collaborative Computational Project 4(1994)“The CCP4 Suite：Programs for Protein Crystallography.”ActaCrystallogr D Biol Crystallogr 50：760-763)来进行。将5％的独特反射以随机方式分配到“自由”集用于计算自由R-因子(Rfree)(Briinger，A.T.(1992).“The free R value：a novel statistical quantity for assessingthe accuracy of crystal structures.”Nature 355：472-474)；剩余的95％反射构成“工作”集用于计算R-因子(R)。X-射线衍射数据概述在表6中。
C.J695 Fab I型晶体结构(晶体1)的分子置换方案
使用CNX通过分子置换解析晶型I的J695 Fab的结构(Briinger，A.T.，P.D.Adams等，(1998).“Crystallography&NMR system(CNS)：A new software system for macromolecularstructure determination.”Acta Crystallogr.D54：905-921)。基于晶胞体积和Fab分子量(46,608Da)，预期I型的每个不对称单元含有1个Fab(45％溶剂，
Figure BPA00001751564501487
)(Matthews，B.W.(1968).“Solvent content of protein crystals.”J Mol Biol 33：491-7)。将5％的随机选择的反射用于在整个优化中的交叉验证(Briinger，A.T.(1992).“The free R value：a novel statistical quantity for assessingthe accuracy of crystal structures.”Nature 355：472-474)。在几个同源Fab检索模型中，只有一个具有类似于J695的弯角(PDB登记号8fab，Strong，R.K.，R.Campbell等，(1991).“Three-dimensionalstructure of murine anti-p-azophenylarsonate Fab 36-71.1.X-raycrystallography，site-directed mutagenesis，and modeling of the complexwith hapten.”Biochemistry 30：3739-3748)，继承的；刚性体优化进一步改变弯角。平移函数表明正确的空间群是P212121。在检索模型与J695之间不保守的残基被截短至丙氨酸，并移除CDR。使用CNX进行模拟退火、Powell最小化和组温度因子(group temperaturefactor)优化(Briinger，A.T.，P.D.Adams等，(1998).“Crystallography&NMR system(CNS)：A new software system formacromolecular structure determination.”Acta Crystallogr.D54：905-921)。在优化后，使用可视化程序O(Jones，T.A.，J.Y.Zou等，(1991).“Improved methods for building蛋白models in electrondensity maps and the location of errors in these models.”ActaCrystallogr.A47：110-119)，将正确的侧链原子和CDR残基构建在正SigmaA-加权(Read，R.J.(1986).“Improved Fourier coefficientsfor maps using phases from partial structures with errors.”ActaCrystallogr.A42：140-149)的Fo-Fc电子密度(2σ)的区域内。CDRH3表现为无序的并且不能建模。添加可选的侧链构象，并在REFMAC中使用各向异性温度因子对模型进行进一步优化(Murshudov，G.N.，A.A.Vagin等，(1997).“Refinement ofmacromolecular structures by the maximum-likelihood method.”ActaCrystallogr.D53：240-255)。添加水原子并将模型优化至最终的Rcryst/Rfree 16.4/19.7％。使用Procheck(Laskowski，R.A.，M.W.MacArthur等，(1993).“PROCHECK：a program to check thestereochemical quality of protein structures.”J.Appl.Crystallogr.26：283-291)和Whatcheck(Hooft，R.W.W.，G.Vriend等，(1996).“Errors in protein structures.”Nature 381：272)评估模型的质量。优化统计数据报告在表7中。
实施例4：晶型II的J695 Fab的晶体结构的测定
A.J695 Fab II型晶体的低温保护和快速冷却
将如上所述在12％PEG 4000、0.1M Tris，pH 8.5存在下生长的II型晶体收获在含有增加量的甘油(5-15％)的母液溶液中，然后在液氮中快速冷冻。将晶体储存在液氮冷冻器中直至收集x-射线衍射数据。
B.来自于J695 Fab II型晶体(晶体2)的X-射线衍射数据收集
在National Synchrotron Light Source(NSLS)，BrookhavenNational Laboratory，Upton，NY处，使用ADSC Quantum 210检测器，在束线X26C
Figure BPA00001751564501501
处通过分辨率达
Figure BPA00001751564501502
的旋转方法收集来自于J695 Fab II型晶体(晶体2)的X-射线衍射数据。在数据收集期间，使用Oxford Cryosystems Cryostream冷却器将Fab晶体维持在100K的温度下。对于各个数据帧(总共360个)，将晶体旋转0.5°。将数据用HKL2000软件套装(Otwinowski，Z.和W.Minor(1997).Processing of X-ray Diffraction Data Collected in Oscillation Mode.New York，Academic Press)处理。在确定晶体取向后，使用DENZO将数据积分(以空间群P21，
Figure BPA00001751564501503
Figure BPA00001751564501504
Figure BPA00001751564501505
β＝105.5°；晶胞信息概述在表5中)，使用SCALEPACK标度并合并，置于绝对标度上，并使用TRUNCATE缩减到结构因子幅度。进一步的数据操作使用CCP4程序套装(Collaborative ComputationalProject 4(1994)“The CCP4 Suite：Programs forProtein Crystallography.”Acta Crystallogr D Biol Crystallogr50：760-763)来进行。将5％的独特反射以随机方式分配到“自由”集用于计算自由R-因子(Rfree)(Briinger，A.T.(1992).“The freeR value：a novel statistical quantity for assessing the accuracy of crystalstructures.”Nature 355：472-474)；剩余的95％反射构成“工作”集用于计算R-因子(R)。X-射线衍射数据概述在表6中。
C.J695 Fab II型晶体结构(晶体2)的分子置换方案
通过分子置换解析晶型II的J695 Fab的结构。基于晶胞体积和Fab分子量(46,608Da)，预期II型每个不对称单元含有8至6个Fab(50-63％溶剂，
Figure BPA00001751564501511
)(Matthews，B.W.(1968).“Solvent content of protein crystals.”J Mol Biol 33：491-7)。将5％的随机选择的反射用于整个优化中的交叉验证(Briinger，A.T.(1992).“The free R value：a novel statistical quantity for assessingthe accuracy of crystal structures.”Nature 355：472-474)。使用大部分优化的I型结构作为检索模型来解析II型结构的最初尝试没有成功。似乎存在与原始Patterson图(native Patterson map)中的非原始峰(off-origin peak)一致的假平移对称性(其关联可能方案对)，但是CNX(Briinger，A.T.，P.D.Adams等，(1998).“Crystallography&NMR system(CNS)：A new software system for macromolecularstructure determination.”Acta Crystallogr.D54：905-921)、AMORE(Navaza，J.(1994).“AMoRe：an automated package formolecular replacement.”Acta Crystallog.A50：157-163)和EPMR(Kissinger，C.R.，D.K.Gehlhaar等，(2001).EPMR：A program forcrystallographic molecular replacement by evolutionary search.La Jolla，CA，Agouron Pharmaceuticals，Inc)没有提供确定的方案。MOLREP(Vagin，A.A.和A.Teplyakov(1997).“MOLREP：an automatedprogram for molecular replacement.”J.Appl.Crystallogr.30：1022-1025)能够定位8个Fab，其组合在空间群P21中在下产生32.3％的关联系数和55.4％的R-因子。这种方案揭示出两个Fab粗略地沿着<011>以反平行方式对齐，通过平行于[100]的假并矢彼此相关。第二Fab对绕相同的并矢排列，但是移位～1/2a。这种四聚Fab集合体通过平移矢量[～1/2a，～1/2c]重复以得到不对称单元中的另外4个Fab。
在刚性体优化后，SigmaA-加权图谱(Read，R.J.(1986).“Improved Fourier coefficients for maps using phases from partialstructures with errors.”Acta Crystallogr.A42：140-149)的检查揭示出两个Fab中无序的恒定结构域；将这些结构域移除，并使用SOLVE对电子密度图进行溶剂扁平化(Terwilliger，T.C.和J.Berenedzen(1999).“Automated MAD and MIR structure solution.”Acta Cryst.D.55：849-861)。使用各向同性B-因子在REFMAC中的优化(Murshudov，G.N.，A.A.Vagin等，(1997).“Refinement ofmacromolecular structures by the maximum-likelihood method.”ActaCrystallogr.D53：240-255)与在O中的重建(Jones，T.A.，J.Y.Zou等，(1991).“Improved methods for building protein models in electrondensity maps and the location of errors in these models.”ActaCrystallogr.A47：110-119)交替进行。将恒定结构域和CDR重建在正电子密度(2σ)中。两个相对无序的恒定结构域具有
Figure BPA00001751564501521
和
Figure BPA00001751564501522
Figure BPA00001751564501523
的平均B-因子。添加水原子并将模型优化至最终Rcryst/Rfree为19.5/25.9％。使用Procheck(Laskowski，R.A.，M.W.MacArthur等，(1993).“PROCHECK：a program to check the stereochemical qualityof protein structures.”J.Appl.Crystallogr.26：283-291)和Whatcheck(Hooft，R.W.W.，G.Vriend等，(1996).“Errors in proteinstructures.”Nature 381：272)评估模型的质量。优化统计报告在表7中。
D.在蛋白质数据库中分析抗体结构中的反式-顺式肽键异构体
试图鉴定在蛋白质数据库中存在的Ab结构中所有出现的肽键反式-顺式异构化。为汇编所有可获得的Ab结构的列表而进行的蛋白质数据库(到2003年3月28日以前)的深度检索得到了453条记录。所述检索得到由Dr.Andrew C.R.Martin博士维持的总计列表的协助(http://www.bioinf.org.uk/abs/)。首先，对这组453个Ab结构进行人工检索，以寻找在含有顺式肽键的结构的PDB标题中存在的CISPEP标记。将含有顺式肽键的所有Ab结构按照相关结构进行分组。组由相关抗体(突变体)、不同接合状态或晶型的Ab和单一晶型的Ab的多个拷贝构成。然后对组进行人工分析以确定顺式肽键是否包含脯氨酸残基，以及一个组成员中存在的顺式脯氨酸在其它组成员中是否保守。然而，当认识到由CISPEP标记给出的PDB记录的注释是不可靠的时，这一分析被视为是不完全的。
然后使用下列计算机算法对这453个PDB记录进行重新检索：在所有453个PDB记录中为所有肽键测量肽键ω扭转角的值。如果ω为0±20°，肽键被认为是顺式的，否则是反式的。这一步骤使用MOLEMAN2程序(Kleywegt，G.J.(1995).MOLEMAN2：manipulationand analysis of PDB files.Uppsala，Sweden，Dept.of Cell andMolecular Biology，Uppsala University，Biomedical Centre，Box 596，SE-751 24)。
提取各个被确认的顺式肽键(在各PDB记录中)侧邻的氨基酸序列(对于总共8个残基±3个残基，包括定义肽键的2个残基)。
在各PDB记录中，对各顺式肽键的这一查询序列与453条记录的整个集合中存在的所有8残基序列进行比较。适当的校正操作链末端和中断。检索还包括从中提取查询序列的PDB记录，以考虑到在同一晶体结构中Ig结构域的多个拷贝的(共同)可能性。
如果至少6/8的残基相同，并且如果匹配序列中中央肽键是反式而不是顺式的，匹配被认为是显著的。
以这种方式确定的匹配代表高度同源或相同的8氨基酸的序列，其代表了453条PDB记录的集中具有顺式和反式中央肽键的序列。正如预期的，发现了几种抗体在恒定结构域中包含顺式-反式脯氨酸异构化(J695在其恒定结构域中含有几个顺式脯氨酸，其不表现出构型异构)。分析集中于CDR内的顺式-反式脯氨酸异构。
顺式/反式对的目测检查揭示出，除了J695之外，仅有一个是无疑地正确的。该在先实例是单链DNA结合的mAb DNA-1(PDB记录li8m；
Figure BPA00001751564501531
分辨率)，其在不对称单元中含有2个Fab(Tanner，J.J.，A.A.Komissarov等，(2001).“Crystal Structure of anAntigen-binding片段Bound to Single-stranded DNA.”J.Mol.Biol.314：807-822)。Fab1 CDR H3中的ArgH98H3-ProH99H3肽键是反式的，而在Fab2中它是顺式的。在所述晶体中，dT5寡聚脱氧核苷酸不对称地结合在两个Fab之间，特别是通过CDR H3。DNA-1 H3表现得比其他CDR更具柔性，正如它在单一晶型内或多个晶型之间可以采取的大量构象所显示的(Tanner，J.J.(2003).PersonalCommunication)。
分析发现了报道的几种抗体在CDR中含有顺式-反式的脯氨酸异构化，通常在CDR L3的95位处。然而，对所有相关结构的详细检查总是揭示出目标区域中的结构错误。
实施例5：J695 Fab/IL-12 p70复合物的晶体结构的确定
A.J695 Fab/IL-12 p70复合物晶体的低温保护和快速冷却
将如上所述在16％PEG 4K、10％2-丙醇、0.1M Na HEPES pH7.5、0.2M(NH4)2SO4存在下生长的J695 Fab/IL-12 p70复合物晶体收获在含有增加量的葡萄糖(5-15％)的母液溶液中，然后在液氮中快速冷冻。将晶体储存在液氮冷冻器中，直至收集x-射线衍射数据。
B.来自于J695 Fab/IL-12 p70复合物晶体(晶体3)的X-射线衍射数据收集
在工业大分子晶体学联合会合作评估团队(IndustrialMacromolecular Crystallography Association Collaborative AccessTeam)(IMCA-CAT)束线17-BM和17-IDAdvancedPhoton Source(APS)，Argonne National Laboratory，Argonne，IL，使用MAR CCD检测器通过达到
Figure BPA00001751564501542
分辨率的旋转方法收集来自于单一J695Fab/IL-12 p70复合物晶体(晶体3)的X-射线衍射数据。在数据收集期间，使用Oxford Cryosystems Cryostream冷却器将复合物晶体维持在100K温度下。对于各个数据帧(总共258个)，晶体旋转0.5°。在确定晶体取向后，使用MOSFLM(Leslie，A.G.W.(1992).“Recent changes to the MOSFLM package for processing filmand image plate data.”CCP4 and ESF-EACMB Newsletter on ProteinCrystallography 26)将数据积分(以空间群C2221，
Figure BPA00001751564501543
Figure BPA00001751564501551
Figure BPA00001751564501552
晶胞信息概述在表5中)，使用SCALA标度并合并(Evans，P.R.(1997).“SCALA.”Joint CCP4and ESF-EACBM Newsletter 33：22-24)，置于绝对标度上，并使用TRUNCATE缩减到结构因子幅度。进一步的数据操作使用CCP4程序套装(Collaborative Computational Project 4(1994)“The CCP4 Suite：Programs for Protein Crystallography.”Acta Crystallogr D BiolCrystallogr 50：760-763)进行。将5％的独特反射以随机方式分配到“自由”集用于计算自由R-因子(Rfree)(Briinger，A.T.(1992).“The free R value：a novel statistical quantity for assessing theaccuracy of crystal structures.”Nature 355：472-474)；剩余的95％反射构成“工作”集用于计算R-因子(R)。X-射线衍射数据概述在表6中。
C.J695 Fab/IL-12 p70复合物晶体结构(晶体3)的分子置换方案
通过分子置换解析J695 Fab/IL-12 p70复合物的结构。基于晶胞体积以及Fab和IL-12 p70的分子量(46,608和～70,000Da)，预期所述晶体每个不对称单元含有2个Fab/p70复合物(～61％溶剂，
Figure BPA00001751564501554
)(Matthews，B.W.(1968).“Solvent content of proteincrystals.”J Mol Biol 33：491-7)。自身旋转函数显示出两个非晶体学的双重旋转轴，其极性旋转角度[θ，Φ，χ]等于[9.77，90.00，180.00]和[80.23，90.00，180.00]，各自约为晶体学双重轴强度的三分之一，与具有从晶体学c轴朝向b轴的双重轴～10°偏离定向的非晶体学二聚体一致。似乎不存在假平移对称，这与在原始Patterson图中缺乏非原始峰一致。使用CNX(Briinger，A.T.，P.D.Adams等，(1998).“Crystallography&NMR system(CNS)：A new software system formacromolecular structure determination.”Acta Crystallogr.D54：905-921)、AMORE(Navaza，J.(1994).“AMoRe：an automatedpackage for molecular replacement.”Acta Crystallog.A50：157-163)、EPMR(Kissinger，C.R.，D.K.Gehlhaar等，(2001).EPMR：Aprogram for crystallographic molecular replacement by evolutionarysearch.La Jolla，CA，Agouron Pharmaceuticals，Inc)和MOLREP(Vagin，A.A.and A.Teplyakov(1997).“MOLREP：an automated program formolecular replacement.”J.Appl.Crystallogr.30：1022-1025)来解析结构的最初尝试没有成功。J695 Fab/IL-12 p70复合物的结构最终利用PHASER(Storoni，L.C，A.J.McCoy等，(2004).“Likelihood-enhanced fast rotation functions.”Acta Crystallogr DBiol Crystallogr 60(Pt 3)：432-8)，在空间群C2221中，使用(优化的)J695 Fab I型和IL-12 p70(PDB记录lf45；(Yoon，C，S.C.Johnston等，(2000).“Charged residues dominate a uniqueinterlocking topography in the heterodimeric cytokine interleukin-12.”The EMBO Journal 19(14)：3530-3521)坐标作为检索模型来解析。首先，放置两个Fab拷贝，从而提供1250的明显正确的log概率增益(LLG)。IL-12 p70分子单独的放置更有疑问，因而产生两可的结果(LLG 130，仅仅一个分子；第二p70分子不能定位)。如上所确定的放置两个Fab后，p70检索另外提供了大大改进的LLG(2150)，这与正确方案相一致。p70的这种明确的放置也与上面当单独使用p70时所确定的两可的放置相一致。
使用REFMAC(Murshudov，G.N.，A.A.Vagin等，(1997).“Refinement of macromolecular structures by the maximum-likelihoodmethod.”Acta Crystallogr.D53：240-255)进行刚性体优化。将5％的随机选择的反射用于在整个优化中的交叉验证(Briinger，A.T.(1992).“The free R value：a novel statistical quantity for assessingthe accuracy of crystal structures.”Nature 355：472-474)。使用来自于
Figure BPA00001751564501561
分辨率的数据，将10个结构域(各个Fab免疫球蛋白[Ig]结构域以及IL-12p40和p35)优化至Rfree/R＝0.401/0.413。SigmaA加权图(Read，R.J.(1986).“Improved Fourier coefficients for mapsusing phases from partial structures with errors.”Acta Crystallogr.A42：140-149)的检查揭示出两个Fab分子背靠背放置，其中一个Fab结合位点主要结合IL-12 p40结构域1(N-末端结构域)。该图也显示出第二个IL-12分子的密度。
将刚性体优化的模型保持固定，重新运行PHASER，从而对第二个IL-12 p70进行检索。这一过程是成功的，提供了2926的提高的LLG。在PHASER内的优化提供了3562的最终LLG。使用REFMAC重复刚性体优化，这时具有16个结构域(8个Fab Ig结构域，6个p40Ig样结构域和2个p35结构域)，提供了Rfree/R＝0.400/0.409
Figure BPA00001751564501571
使用各向同性B-因子的连续位置优化(REFMAC)与在O中的重建(Jones，T.A.，J.Y.Zou等，(1991).“Improved methods for building protein models in electron densitymaps and the location of errors in these models.”Acta Crystallogr.A47：110-119)交替进行，提供了最终的Rfree/R＝0.287/0.216。使用Procheck(Laskowski，R.A.，M.W.MacArthur等，(1993).“PROCHECK：aprogram to check the stereochemical quality of protein structures.”J.Appl.Crystallogr.26：283-291)和Whatcheck(Hooft，R.W.W.，G.Vriend等，(1996).“Errors in protein structures.”Nature 381：272)评估模型的质量。优化统计报告在表7中。
表5.J695 Fab和J695 Fab/IL-12 p70复合物晶体的晶体学晶胞信息的概述
Figure BPA00001751564501572
表6.Fab和J695 Fab/IL-12 p70复合物晶体的X-射线衍射数据统计的概述
Figure BPA00001751564501573
Figure BPA00001751564501581
*括号中为最高分辨率壳。
表7.J695 Fab和J695 Fab/IL-12p70复合物晶体的晶体学优化统计的概述
Figure BPA00001751564501582
参考引用
在整个本申请中引用的所有引用的参考文献(包括文献参考、专利、专利申请和网址)的全部内容以及附图在此明确地通过引用以其全文引入。除非另有指明，否则本发明的实施将使用本领域公知的常规抗体产生技术。
等同
应该理解，提供本文中描述的详细实施例和实施方式仅仅是出于示例性说明的目的，绝不应被当作对本发明是限制性的。本领域技术人员可以根据本发明提出各种修改或变化，它们包含在本申请的精神和范围之内，并被认为在随附的权利要求书的范围之内。例如，可以改变成分的相对量以优化所需效果，可以加入其他成分和/或可以用类似成分替换所描述的一种或多种成分。与本发明的系统、方法和过程相关的其他有利特征和功能性从随附的权利要求书是显而易见的。此外，使用不超过常规的实验，本领域技术人员将会认识到或能够确定本文描述的本发明的特定实施方式的许多等同物。这样的等同物意图被下面的权利要求书所涵盖。
Figure IPA00001751563900011
Figure IPA00001751563900031
Figure IPA00001751563900051
Figure IPA00001751563900061
Figure IPA00001751563900071
Figure IPA00001751563900081
Figure IPA00001751563900091
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Figure IPA00001751563900111
Figure IPA00001751563900121
Figure IPA00001751563900131

Claims (49)

1.一种结合IL-12和/或IL-23的p40亚基的分离的抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体结合p40亚基的包含选自SEQ ID NO：3的氨基酸序列的残基1-197的至少一个氨基酸残基或在所述氨基酸残基的之内的部分。
2.权利要求1的分离的抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体结合p40亚基的包含选自SEQ ID NO：3的氨基酸序列的残基1-107的至少一个氨基酸残基或在所述氨基酸残基的
Figure FPA00001751564400012
之内的部分。
3.权利要求1的分离的抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体结合p40亚基的包含p40亚基的环1-7的至少一个氨基酸残基或在所述氨基酸残基的
Figure FPA00001751564400013
之内的部分，其中所述至少一个氨基酸残基选自SEQ ID NO：3的氨基酸序列的残基14-23、58-60、84-107、124-129、157-164和194-197。
4.权利要求3的分离的抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体结合p40亚基的包含选自残基14-23的环1的至少一个氨基酸残基或在所述氨基酸残基的
Figure FPA00001751564400014
之内的部分。
5.权利要求4的分离的抗体或其抗原结合部分，
其中所述抗体结合p40亚基的包含选自残基14-18的环1的至少一个氨基酸残基或在所述氨基酸残基的
Figure FPA00001751564400015
之内的部分；
其中所述抗体结合p40亚基的包含选自残基14-17的环1的至少一个氨基酸残基或在所述氨基酸残基的
Figure FPA00001751564400016
之内的部分；或者
其中所述抗体结合p40亚基的包含选自残基15-17的环1的至少一个氨基酸残基或在所述氨基酸残基的
Figure FPA00001751564400017
之内的部分。
6.权利要求3的分离的抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体结合p40亚基的包含选自残基58-60的环2的至少一个氨基酸残基或在所述氨基酸残基的之内的部分。
7.权利要求3的分离的抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体结合p40亚基的包含选自残基84-94的环3的至少一个氨基酸残基或在所述氨基酸残基的
Figure FPA00001751564400022
之内的部分。
8.权利要求7的分离的抗体或其抗原结合部分，
其中所述抗体结合p40亚基的包含选自残基85-93的环3的至少一个氨基酸残基或在所述氨基酸残基的
Figure FPA00001751564400023
之内的部分；
其中所述抗体结合p40亚基的包含选自残基86-89和93的环3的至少一个氨基酸残基或在所述氨基酸残基的之内的部分；
其中所述抗体结合p40亚基的包含选自残基86、87、89和93的环3的至少一个氨基酸残基或在所述氨基酸残基的
Figure FPA00001751564400025
之内的部分；或者
其中所述抗体结合p40亚基的包含环3的氨基酸残基87或在所述氨基酸残基的之内的部分。
9.权利要求3的分离的抗体或其抗原结合部分，
其中所述抗体结合p40亚基的包含选自残基95-107的环4的至少一个氨基酸残基或在所述氨基酸残基的之内的部分；或者
其中所述抗体结合p40亚基的包含选自残基102-104的环4的至少一个氨基酸残基或在所述氨基酸残基的
Figure FPA00001751564400028
之内的部分。
10.权利要求3的分离的抗体或其抗原结合部分，
其中所述抗体结合p40亚基的包含选自残基124-129的环5的至少一个氨基酸残基或在所述氨基酸残基的
Figure FPA00001751564400029
之内的部分；
其中所述抗体结合p40亚基的包含选自残基157-164的环6的至少一个氨基酸残基或在所述氨基酸残基的
Figure FPA00001751564400031
之内的部分；或者
其中所述抗体结合p40亚基的包含选自残基194-197的环7的至少一个氨基酸残基或在所述氨基酸残基的
Figure FPA00001751564400032
之内的部分。
11.权利要求3的分离的抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体结合p40亚基的包含选自残基14-23、58-60、84-94和95-107的环1-4的至少一个氨基酸残基或在所述氨基酸残基的
Figure FPA00001751564400033
之内的部分。
12.权利要求11的分离的抗体或其抗原结合部分，
其中所述抗体结合p40亚基的包含选自残基14-18、85-93和102-104的环1-4的至少一个氨基酸残基或在所述氨基酸残基的
Figure FPA00001751564400034
之内的部分；
其中所述抗体结合p40亚基的包含选自残基14-17、86-89、93和103-104的环1-4的至少一个氨基酸残基或在所述氨基酸残基的
Figure FPA00001751564400035
之内的部分；或者
其中所述抗体结合p40亚基的包含选自残基15-17、86-87、89、93和104的环1-4的至少一个氨基酸残基或在所述氨基酸残基的
Figure FPA00001751564400036
之内的部分。
13.权利要求3的分离的抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体结合p40亚基的包含选自残基14-23和58-60的环1-2的至少一个氨基酸残基或在所述氨基酸残基的
Figure FPA00001751564400037
之内的部分。
14.权利要求13的分离的抗体或其抗原结合部分，
其中所述抗体结合p40亚基的包含选自残基15、17-21、23和58-60的环1-2的至少一个氨基酸残基或在所述氨基酸残基的
Figure FPA00001751564400038
之内的部分；或者
其中所述抗体结合p40亚基的包含选自残基14-23的环1的至少一个氨基酸残基和选自残基58-60的环2的至少一个氨基酸残基或在所述氨基酸残基的
Figure FPA00001751564400041
之内的部分。
15.权利要求3的分离的抗体或其抗原结合部分，
其中所述抗体结合p40亚基的包含选自残基14-23和84-94的环1和3的至少一个氨基酸残基或在所述氨基酸残基的
Figure FPA00001751564400042
之内的部分；或者
其中所述抗体结合p40亚基的包含选自残基14-23的环1的至少一个氨基酸残基和选自残基84-94的环3的至少一个氨基酸残基或在所述氨基酸残基的
Figure FPA00001751564400043
之内的部分。
16.权利要求3的分离的抗体或其抗原结合部分，
其中所述抗体结合p40亚基的包含选自残基14-23和95-107的环1和4的至少一个氨基酸残基或在所述氨基酸残基的
Figure FPA00001751564400044
之内的部分；或者
其中所述抗体结合p40亚基的包含选自残基14-23的环1的至少一个氨基酸残基和选自残基95-107的环4的至少一个氨基酸残基或在所述氨基酸残基的
Figure FPA00001751564400045
之内的部分。
17.权利要求3的分离的抗体或其抗原结合部分，
其中所述抗体结合p40亚基的包含选自残基84-94和95-107的环3和4的至少一个氨基酸残基或在所述氨基酸残基的
Figure FPA00001751564400046
之内的部分；或者
其中所述抗体结合p40亚基的包含选自残基84-94的环3的至少一个氨基酸残基和选自残基95-107的环4的至少一个氨基酸残基或在所述氨基酸残基的
Figure FPA00001751564400047
之内的部分。
18.一种分离的抗体或其抗原结合部分，其与权利要求1的抗体或其抗原结合部分竞争结合。
19.权利要求1的分离的抗体或其抗原结合部分，其不是抗体Y61或J695。
20.一种结合IL-12和/或IL-23的p40亚基的分离的抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体包含SEQ ID NO：1的重链可变区氨基酸序列和SEQ ID NO：2的轻链可变区氨基酸序列，其中除了SEQ IDNO：1的氨基酸残基27、32、52、53、97、101和102及SEQ ID NO：2的氨基酸残基35、51和90-101之外的任一可变区残基独立地被不同的氨基酸取代。
21.一种结合IL-12和/或IL-23的p40亚基的分离的抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体包含SEQ ID NO：1的重链可变区氨基酸序列和SEQ ID NO：2的轻链可变区氨基酸序列，其中SEQ ID NO：1的氨基酸残基27、32、52、53、97、101和102及SEQ ID NO：2的氨基酸残基35、51和90-101的一个或多个可变区氨基酸残基独立地被不同的氨基酸残基取代。
22.权利要求21的分离的抗体或其抗原结合部分，
其中SEQ ID NO：1的可变区氨基酸残基27、32和102的一个或多个独立地被芳香族残基取代；
其中SEQ ID NO：1的可变区氨基酸残基97和SEQ ID NO：2的可变区氨基酸残基35和92的一个或多个独立地被选自Lys、Arg、Tyr、Asn和Gln的氨基酸残基取代；
其中SEQ ID NO：2的可变区氨基酸残基92和97的一个或多个独立地被芳香族残基取代；
其中SEQ ID NO：1的可变区氨基酸残基101和SEQ ID NO：2的可变区氨基酸残基51的一个或多个独立地被选自Tyr、Ser、Thr、Asn和Gln的氨基酸残基取代；
其中SEQ ID NO：2的可变区氨基酸残基91被Gln之外的任何氨基酸残基取代；
其中SEQ ID NO：2的可变区氨基酸残基95被不同的芳香族氨基酸残基取代；
其中SEQ ID NO：2的可变区氨基酸残基97被选自Phe、Tyr、Trp、His、Asp、Glu、Asn和Gln的氨基酸残基取代；
其中SEQ ID NO：2的可变区氨基酸残基90-101的一个或多个独立地被至少一个或多个不同的氨基酸取代，并且其中抗体的CDRL3的长度大于或等于12个氨基酸残基；
其中所述抗体具有一个或多个下述取代：
(a)SEQ ID NO：2的可变区氨基酸残基90-101的一个或多个独立地被至少一个或多个不同的氨基酸取代，并且其中抗体的CDRL3的长度大于或等于12个氨基酸残基；
(b)SEQ ID NO：2的可变区氨基酸残基91被Gln之外的任何氨基酸残基取代；
(c)SEQ ID NO：2的可变区氨基酸残基95被不同的芳香族氨基酸残基取代；或者
(d)SEQ ID NO：2的可变区氨基酸残基97被选自Phe、Tyr、Trp、His、Asp、Glu、Asn和Gln的氨基酸残基取代；或者
其中SEQ ID NO：1的可变区氨基酸残基52和53的一个或多个独立地被选自Tyr、Ser、Thr、Asn、Gln、Lys和Arg的氨基酸残基取代。
23.一种结合IL-12和/或IL-23的p40亚基的分离的抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体包含SEQ ID NO：1的重链可变区氨基酸序列和SEQ ID NO：2的轻链可变区氨基酸序列，其中SEQ ID NO：1的可变区氨基酸残基33、50、57和99及SEQ ID NO：2的可变区氨基酸残基33的一个或多个独立地被不同的氨基酸残基取代。
24.权利要求23的分离的抗体或其抗原结合部分，
其中SEQ ID NO：1的可变区氨基酸残基33被选自Phe、Tyr、Trp、His、Met、Val、Leu、Ile、Pro、Ala、Ser、Thr、Asn、Gln、Arg和Lys的氨基酸残基取代；
其中SEQ ID NO：1的可变区氨基酸残基50被选自Phe、Tyr、Trp、His、Met、Gln、Arg和Lys的氨基酸残基取代；
其中SEQ ID NO：1的可变区氨基酸残基57被选自Phe、Tyr、Trp、His、Met、Val、Leu、Ile、Pro、Ala、Ser、Thr、Asp、Glu、Asn和Gln的氨基酸残基取代；
其中SEQ ID NO：1的可变区氨基酸残基99被选自Phe、Tyr、Trp、His、Met、Arg和Lys的氨基酸残基取代；或者
其中SEQ ID NO：2的可变区氨基酸残基33被选自Phe、Tyr、Trp、His、Gln和Lys的氨基酸残基取代。
25.权利要求24的分离的抗体或其抗原结合部分，
其中SEQ ID NO：1的可变区氨基酸残基33被Lys取代；
其中SEQ ID NO：1的可变区氨基酸残基50被Tyr或Trp取代；
其中SEQ ID NO：1的可变区氨基酸残基57被Ile或Trp取代；
其中SEQ ID NO：1的可变区氨基酸残基57被Ser或Thr取代；
其中SEQ ID NO：1的可变区氨基酸残基99被Tyr或Trp取代；或者
其中SEQ ID NO：2的可变区氨基酸残基33被Tyr或Trp取代。
26.权利要求20、21和23任一项的抗体或其抗原结合部分，其不是抗体J695或Y61。
27.一种分离的抗体或抗原结合部分，其与权利要求20、21和23任一项的抗体或其抗原结合部分竞争结合。
28.一种改变结合IL-12和/或IL-23的p40亚基的分离的抗体或其抗原结合部分的活性的方法，其中所述抗体或其抗原结合部分包含SEQ ID NO：1的重链可变区氨基酸序列和SEQ ID NO：2的轻链可变区氨基酸序列，所述方法包括用不同氨基酸残基独立地取代SEQID NO：1的可变区氨基酸残基27、32、52、53、97、101和102及SEQ ID NO：2的可变区氨基酸残基35、51和90-101的一个或多个，由此改变结合IL-12和/或IL-23的p40亚基的抗体或其抗原结合部分的活性。
29.权利要求28的方法，
其中SEQ ID NO：1的可变区氨基酸残基27、32和102的一个或多个独立地被芳香族残基取代；
其中SEQ ID NO：1的可变区氨基酸残基97及SEQ ID NO：2的可变区氨基酸残基35和92的一个或多个独立地被选自Lys、Arg、Tyr、Asn和Gln的氨基酸残基取代；
其中SEQ ID NO：2的可变区氨基酸残基92和97的一个或多个独立地被芳香族残基取代；
其中SEQ ID NO：1的可变区氨基酸残基101及SEQ ID NO：2的可变区氨基酸残基51的一个或多个独立地被选自Tyr、Ser、Thr、Asn和Gln的氨基酸残基取代；
其中SEQ ID NO：2的可变区氨基酸残基91被Gln之外的任何氨基酸残基取代；
其中SEQ ID NO：2的可变区氨基酸残基95被不同的芳香族氨基酸残基取代；
其中SEQ ID NO：2的可变区氨基酸残基97被选自Phe、Tyr、Trp、His、Asp、Glu、Asn和Gln的氨基酸残基取代；
其中SEQ ID NO：2的可变区氨基酸残基90-101的一个或多个独立地被至少一个或多个不同的氨基酸取代，并且其中抗体的CDRL3的长度大于或等于12个氨基酸残基；
其中所述抗体或其抗原结合部分具有一个或多个下述取代：
(a)SEQ ID NO：2的可变区氨基酸残基90-101的一个或多个独立地被至少一个或多个不同的氨基酸取代，并且其中抗体的CDRL3的长度大于或等于12个氨基酸残基；
(b)SEQ ID NO：2的可变区氨基酸残基91被Gln之外的任何氨基酸残基取代；
(c)SEQ ID NO：2的可变区氨基酸残基95被不同的芳香族氨基酸残基取代；或者
(d)SEQ ID NO：2的可变区氨基酸残基97被选自Phe、Tyr、Trp、His、Asp、Glu、Asn和Gln的氨基酸残基取代；或者
其中SEQ ID NO：1的可变区氨基酸残基52和53的一个或多个独立地被选自Tyr、Ser、Thr、Asn、Gln、Lys和Arg的氨基酸残基取代。
30.一种改变结合IL-12和/或IL-23的p40亚基的分离的抗体或其抗原结合部分的活性的方法，其中所述抗体或其抗原结合部分包含SEQ ID NO：1的重链可变区氨基酸序列和SEQ ID NO：2的轻链可变区氨基酸序列，所述方法包括用不同氨基酸残基独立地取代SEQID NO：1的可变区氨基酸残基33、50、57和99及SEQ ID NO：2的可变区氨基酸残基33的一个或多个，由此改变结合IL-12和/或IL-23的p40亚基的抗体或其抗原结合部分的活性。
31.权利要求30的方法，
其中SEQ ID NO：1的可变区氨基酸残基33被选自Phe、Tyr、Trp、His、Met、Val、Leu、Ile、Pro、Ala、Ser、Thr、Asn、Gln、Arg和Lys的氨基酸残基取代；
其中SEQ ID NO：1的可变区氨基酸残基50被选自Phe、Tyr、Trp、His、Met、Gln、Arg和Lys的氨基酸残基取代；
其中SEQ ID NO：1的可变区氨基酸残基57被选自Phe、Tyr、Trp、His、Met、Val、Leu、Ile、Pro、Ala、Ser、Thr、Asp、Glu、Asn和Gln的氨基酸残基取代；
其中SEQ ID NO：1的可变区氨基酸残基99被选自Phe、Tyr、Trp、His、Met、Arg和Lys的氨基酸残基取代；或者
其中SEQ ID NO：2的可变区氨基酸残基33被选自Phe、Tyr、Trp、His、Gln和Lys的氨基酸残基取代。
32.权利要求31的方法，
其中SEQ ID NO：1的可变区氨基酸残基33被Lys取代；
其中SEQ ID NO：1的可变区氨基酸残基50被Tyr或Trp取代；
其中SEQ ID NO：1的可变区氨基酸残基57被Ile或Trp取代；
其中SEQ ID NO：1的可变区氨基酸残基57被Ser或Thr取代；
其中SEQ ID NO：1的可变区氨基酸残基99被Tyr或Trp取代；或者
其中SEQ ID NO：2的可变区氨基酸残基33被Tyr或Trp取代。
33.一种分离的抗体或其抗原结合部分，其按照权利要求28或30的方法产生。
34.一种结合IL-12和/或IL-23的p40亚基的分离的抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体结合包含选自SEQ ID NO：3的氨基酸序列的氨基酸残基16、87和93的至少一个氨基酸残基或在所述氨基酸残基的
Figure FPA00001751564400101
之内的构象表位。
35.权利要求34的分离的抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体结合氨基酸残基16。
36.权利要求1、20、21、23和34任一项的分离的抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体以1x10-3M-1或以下的Koff或者1x10-10M或以下的Kd结合IL-12和/或IL-23的p40亚基。
37.权利要求1、20、21、23和34任一项的分离的抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体中和IL-12和/或IL-23的p40亚基的生物活性。
38.一种药物组合物，其包含权利要求37的抗体或其抗原结合部分以及药学上可接受的载体或赋形剂。
39.权利要求38的药物组合物，其还包括至少一种另外的生物活性药剂。
40.一种分离的核酸，其编码权利要求1、20、21、23和34任一项的抗体或其抗原结合部分。
41.一种分离的核酸载体，其包含与至少一个转录调控核酸序列可操作地连接的权利要求40的核酸。
42.一种宿主细胞，其包含权利要求41的核酸载体。
43.权利要求42的宿主细胞，其中所述宿主细胞是真核宿主细胞或原核宿主细胞。
44.一种用于在受试者中诊断至少一种IL-12和/或IL-23相关病症的方法，所述方法包括将来自所述受试者的生物样品与权利要求1、20、21、23和34任一项的抗体或其抗原结合部分相接触，并测量样品中存在的IL-12和/或IL-23的p40亚基的量，其中与正常或对照相比，检测到样品中IL-12和/或IL-23的p40亚基的水平升高或降低指示IL-12和/或IL-23相关病症的存在或不存在，由此诊断所述受试者中至少一种IL-12和/或IL-23相关的病症。
45.权利要求44的方法，其中所述抗体或其抗原结合部分含有可检测标记或通过具有可检测标记的第二分子检测。
46.一种用于鉴别调节生物样品中IL-12和/或IL-23的表达、水平和/或活性中至少一种的药剂的方法，所述方法包括将所述样品与权利要求1、20、21、23和34任一项的抗体或其抗原结合部分相接触，并检测样品中IL-12和/或IL-23的表达、水平和/或活性，其中与未处理样品相比，IL-12和/或IL-23的表达、水平和/或活性中至少一种的增加或降低指示能够调节IL-12和/或IL-23的表达、水平和/或活性中至少一种的药剂，由此鉴别调节样品中IL-12和/或IL-23的表达、水平和/或活性中至少一种的药剂。
47.权利要求46的方法，其中所述抗体或其抗原结合部分含有可检测标记或可以通过具有可检测标记的第二分子检测。
48.一种用于在患有其中IL-12和/或IL-23的活性有害的障碍的受试者中抑制IL-12和/或IL-23的活性的方法，所述方法包括向所述受试者施用权利要求1、20、21、23和34任一项的抗体或其抗原结合部分，以便抑制所述受试者中IL-12和/或IL-23的活性。
49.一种用于治疗患有其中IL-12和/或IL-23的活性有害的障碍的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用权利要求1、20、21、23和34任一项的抗体或其抗原结合部分，由此治疗所述受试者。
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