CN103592437A - 一种基于石墨烯-多壁碳-纳米金胶-壳聚糖修饰的免疫传感器 - Google Patents

一种基于石墨烯-多壁碳-纳米金胶-壳聚糖修饰的免疫传感器 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种基于石墨烯-多壁碳-纳米金胶-壳聚糖修饰的免疫传感器，其特征在于：石墨烯是良好的导电材料具有大的比表面积；多壁碳纳米管具有良好的化学稳定性，导电性和极高的机械强度，然而这两种物质溶解性都很差，需要寻找一种良好的分散剂；而壳聚糖具有良好的生物相容性与成膜性，可以增大多壁碳纳米管在溶液里的溶解性；另外，纳米金胶具有很强的导电能力，提高了电子的传输，进一步增强了石墨烯-多壁碳-纳米金胶-壳聚糖纳米复合物的导电性；另外，蛋白A可以定向固定毒死蜱抗体，可以吸附更多的毒死蜱农药，提高免疫传感器的检测限，灵敏度。因而该免疫传感器具备检测时间较短，灵敏度高，选择性稳定性好，回收率符合要求。

Description

一种基于石墨烯-多壁碳-纳米金胶-壳聚糖修饰的免疫传感器
技术领域
本发明提供一种基于石墨烯-多壁碳-纳米金胶-壳聚糖修饰的免疫传感器，属于生物传感器技术领域。
背景技术
我国是一个农业大国，在农业生产中，农药在控制农作物病虫害，保障农产品稳产、高产方面起到至关重要的作用，但是，农药的不合理使用，不仅造成了水环境、土壤、大气的污染，也导致了农产品中农药残留超标，引起人体中毒以及贸易壁垒。此外，我国每年因农药残留超标造成的经济损失巨大。随着我国人民生活水平不断提高，农产品的质量安全问题越来越受到关注，尤其果品、蔬菜中农药残留问题已经成为公众关注的焦点。当前，我国生产和使用的杀虫剂绝大多数品种为有机磷和氨基甲酸酯类农药，其中毒死蜱的生产使用逐渐增加，毒死蜱在人体中主要分布于肝脏、肾脏、脾脏等血流量较高的器官。它可以抑制胆碱酯酶活性，对人体有致畸作用，甚而对人体的中枢神经产生影响。因此，建立一种快速、灵敏、安全可靠的毒死蜱农药残留的检测方法迫在眉睫。
传统的农药残留检测主要有：光谱法（红外光谱法、荧光光谱法、紫外-可见光、化学发光法等）、色谱法（气相色谱（GC）、液相色谱（LC）、高效液相色谱（HPLC））、气-质联用（GC-MS），液-质联用（LC-MS）、酶联免疫（ELISA）等。虽然这些方法的选择性好、灵敏度高和准确度高，同时检测多种元素或化合物，但其需要昂贵的仪器设备,样品的前处理过程繁琐、费时,并且对分析人员的技术水平要求很高,不适于现场快速检测。因此,人们迫切需要快速、可靠、经济和适合于现场应用的快速检测方法。于是,廉价、快速、可信、敏感的生物传感器应运而生。与传统的分析方法相比,生物传感器具有如下特点：（1）较高的选择性，因此不需要对被测组分进行分离，即不用对样品进行预处理。（2）结构简单，体积小，使用方便，特别是便携式的生物传感器，非常有利于食品质量的市场快速评价。（3）可实现连续在线检测，使食品加工过程的质量控制变得简便。（4）响应速度快，样品用量少，与其他大型分析仪器相比，生物传感器制作成本低，且可反复使用。因此本文尝试制备一种毒死蜱残留的免疫传感器。
发明的目的在于提供一种能克服上述缺陷以及操作简单、灵敏度高、选择性好的检测毒死蜱农药残留的免疫传感器的制备方法。
其技术方案为：一种基于石墨烯-多壁碳-纳米金胶-壳聚糖修饰的免疫传感器，其特征在于：制备出一种新型的纳米复合物石墨烯-多壁碳-纳米金胶-壳聚糖，利用蛋白A定向固定毒死蜱单克隆抗体，BSA封闭。
所述的一种基于石墨烯-多壁碳-纳米金胶-壳聚糖修饰的免疫传感器，其特征在于：金电极(d=1mm)的清洗，免疫传感器敏感界面的构建及过程表征(制备纳米复合物石墨烯-多壁碳-纳米金胶-壳聚糖，循环伏安图以及阻抗图谱)，免疫传感器工作曲线的建立，免疫传感器性能的检测，免疫传感器对实际样品的检测。
所述的一种基于石墨烯-多壁碳-纳米金胶-壳聚糖修饰的免疫传感器，其特征在于：实验条件的优化，主要包括免疫传感器的修饰及表征过程，有关实验参数的优化（纳米复合物中硫堇的浓度、测试底液的pH、孵育时间等）；所制备出电流型免疫传感器的工作曲线；免疫传感器性能检测包括重现性、稳定性、特异性、再生性以及免疫传感器对蔬菜样品加标回收率的测定。所制备的免疫传感器的工作曲线为：y=9.5676lgC(ng/mL)+18.164(R2=0.9976)，其检测限为0.037ng/mL；免疫传感器性能检测包括特异性、稳定性、重现性、再生性以及免疫传感器对多种果蔬样品回收率的测定。
其制备原理为：免疫生物传感器以免疫生物分子作为识别元件，通过固定化技术将免疫蛋白结合到感受器表面，发生免疫识别反应后，生成的免疫复合物与产生的物理或化学信号相关联，由换能器将其转化为与待测物质浓度(或活度)有关的可定量或者可处理的物理化学信号，再通过二次仪表放大并且输出信号，从而实现对待测物质的检测。本发明利用石墨烯具有良好的导电性，可以提供大的比表面积为纳米材料提高附着位置，提高固定量；功能化的多壁碳纳米管，具有羧基（-COOH），可以提供大的外部表面面积，且可以促进电子转移；壳聚糖富含氨基（-NH2），是石墨烯及多壁碳纳米管很好的分散剂，具有较高的成膜性及生物相容性；纳米金胶的比表面积大、导电性良好，是传感器修饰过程广泛使用的材料，其可以通过Au-S、Au-N键与其他物质结合。从而制备出石墨烯-多壁碳-纳米金胶-壳聚糖纳米复合物；而作为蛋白A可以与与抗体的Fc端结合以便定向固定抗体。用牛血清蛋白（BSA）封闭抗体上的非特异性结合位点，即可制备得到一种新型的、便捷的免疫传感器。
为达到以上目的，采取以下技术方案实现：一种基于石墨烯-多壁碳-纳米金胶-壳聚糖修饰的免疫传感器，其特征在于：(1)电流型免疫传感器制备前裸金电极的清洗、活化和性能测试，如果测试循环伏安曲线中的峰电位差在120mV以下，氧化峰和还原峰对称，则所述金电极可使用，否则要重新返回清洗步骤中，直到符合要求。(2)清洗好的金电极电沉积纳米金后表面滴涂分散均匀的石墨烯-多壁碳-纳米金胶-壳聚糖纳米复合物。（3）再将蛋白A定向固定毒死蜱单克隆抗体的Fc端。（4）修饰上毒死蜱单克隆抗体后用牛血清白蛋白(BSA)封闭非特异性结合位点。电流型免疫传感器制备结束后，放入冰箱里4℃保存备用。
为达到以上目的，采取以下技术方案实现：一种基于石墨烯-多壁碳-纳米金胶-壳聚糖修饰的免疫传感器，其特征在于：(1)配置一系列的毒死蜱标准液，进行循环伏安扫描，得到抑制率，进一步得出上述制备的电流型免疫传感器的工作曲线、检测范围和检测限；(2)配置一系列经常混合使用的农药溶液，以检测所制备电流型免疫传感器的选择性；(3)通过在冰箱中放置一段时间再次测量，以验证上述免疫传感器的稳定性；⑷通过甘氨酸-HCl缓冲液(pH2.8)解离毒死蜱农药，以免疫检测其再生性能；(5)对实际果蔬样品进行分析得出该免疫传感器的回收率。
本发明制备了新型纳米材料石墨烯-多壁碳-纳米金胶-壳聚糖复合物，该纳米复合物膜有良好的化学稳定性，导电性和极高的机械强度，够促进电化学反应中电子的传递，提高电极上的响应电流，改善电极表面的微环境，因而可以作为载体材料。另外，蛋白A可以与抗体的Fc端结合，从而实现抗体的定向固定。该免疫传感器检测时间较短，灵敏度高，选择性稳定性好，再生能力强，回收率符合要求以及可以用于实际样品的检测。
所述免疫传感器的制备工艺如下：(1)首先将金电极放入Piranha溶液(H2O2与浓H2SO4体积比1∶3)、硝酸（HNO3与H2O的体积比1:1）、无水乙醇、去离子水中分别超声清洗5min清洗，于0.5MH2SO4溶液中活化后用氮气吹干；(2)将2.5μL石墨烯-多壁碳-纳米金胶-壳聚糖纳米复合物修饰到清洗好的裸金电极修饰上，烘干；（3）修饰2μL100μg/mL蛋白A，然后用PH=7.5的PBS缓冲液冲洗，氮气吹干；（4）修饰2.5μL10μg/mL毒死蜱抗体，4℃孵育12h；（5）将上述制备好的电极最后浸入2.5%的BSA溶液中室温下静置1h，以封闭电极上非特异性结合位点，室温下晾干，免疫传感器制作完成，保存在4℃条件下备用。
附图说明
图1免疫传感器制过程的组装图。
图2纳米复合物石墨烯-多壁碳-壳聚糖和石墨烯-多壁碳-纳米金胶-壳聚糖的扫描电镜图。
图3免疫传感器修饰过程的循环伏安图。
图4免疫传感器的工作曲线图。
具体实施方式
实施例：(1)金电极的清洗：金电极修饰前，首先浸入“piranha”溶液(H2O2与浓H2SO4体积比1∶3)中浸泡15min，用水清洗干净，接下来用0.3μm、30nm的Al2O3浆在麂皮上抛光至镜面，抛光后用去离子水洗去除表面污物，再移入超声水浴中清洗，每次5min，重复二次，然后依次用6mol/L的HNO3、无水乙醇和去离子水超声清洗，氮气环境下干燥。(2)石墨烯-多壁碳-纳米金胶-壳聚糖纳米复合物的制备：将0.5g壳聚糖溶于100mL 1.0%的醋酸溶液中，室温下搅拌3h，配成0.5% CS溶液，室温下磁力搅拌1h，使壳聚糖完全溶解；称取4.0mg石墨烯和4.0mg多壁碳纳米管加入10.0mL上述得到的壳聚糖溶液中，在室温下超声分散，直至得到稳定的黑色分散液(石墨烯-多壁碳-壳聚糖纳米复合材料)；再将制备好的10.0mL的纳米金胶加入已混合好的上述溶液中，再在室温下超声分散12h至完全溶解，最终得到了石墨烯-多壁碳-纳米金胶-壳聚糖纳米复合物。(3)金电极的活化：彻底清洗后，电极在0.5mol/LH2SO4溶液中用循环伏安法活化，扫描范围1.0V～-1.0V，反复扫描直至达到稳定的循环伏安图为止。(4)将2.5μL石墨烯-多壁碳-纳米金胶-壳聚糖纳米复合物修饰到清洗好的裸金电极修饰上，烘干；（5）修饰2μLμg/mL蛋白A，然后用PH=7.5的PBS缓冲液冲洗，氮气吹干；(6)修饰2.5μL 10μg/mL毒死蜱抗体，4℃孵育12h；(7)将上述制备好的电极最后浸入2.5%的BSA溶液中室温下静置1h，以封闭电极上非特异性结合位点，室温下晾干，免疫传感器制作完成，保存在4℃条件下备用。(8)从壳聚糖-石墨烯与壳聚糖-多壁碳的浓度比例、测试底液pH、孵育时间三方面对所制备的免疫传感器的实验条件进行优化，壳聚糖-石墨烯与壳聚糖-多壁碳的浓度比例为1:3-3:1，pH的范围为5.5-8.5，孵育时间的范围为5-40min。(9)配置0.1-1.0×105ng/mL的毒死蜱标准溶液，将上述制备好的免疫传感器分别浸入不同浓度的毒死蜱标准溶液，在常温下孵育30min，检测免疫反应前后电流变化得到其工作曲线。(10)将免疫传感器在久效磷、西维因、克百威、3-羟基克百威等干扰物存在的情况下对100ng/mL的毒死蜱进行测试，以检测其选择性；选5根于相同条件下制备好的免疫传感器检测其重现性；连续7天依次检测相同浓度的毒死蜱溶液以检测其稳定性；将免疫后的传感器用甘氨酸-HCl缓冲液(pH2.8)解离毒死蜱农药5min后再次免疫，检测其再生能力。(11)把蔬菜彻底清洗干净并用去离子水清洗3次，喷洒上一定浓度的农药，放置24h后，用10mL丙酮/0.1MpH7.5磷酸盐缓冲溶液(1/9,v/v)做溶剂超声处理20min，然后再离心10min(10000rpm)，得到的上清液用来检测实际样品的回收率，其回收率可以达到87.4%-104.0%。
此种免疫传感器检测农药毒死蜱残留的检测方法操作工艺简单，检测时间较短，灵敏度高，选择性好，稳定性高，再生能力好和回收率符合要求，符合我国农药残留快速检测技术发展和国际化要求。

Claims (2)

1.一种基于石墨烯-多壁碳-纳米金胶-壳聚糖修饰的免疫传感器，其特征在于：制备了石墨烯-多壁碳-纳米金胶-壳聚糖纳米复合材料，制备步骤为：
将0.5g壳聚糖溶于100mL 1.0%的醋酸溶液中，室温下搅拌3h，配成0.5%CS溶液，室温下磁力搅拌1h，使壳聚糖完全溶解；称取4.0mg石墨烯和4.0mg多壁碳纳米管加入10.0mL上述得到的壳聚糖溶液中，在室温下超声分散，直至得到稳定的黑色分散液(石墨烯-多壁碳-壳聚糖纳米复合材料)；再将制备好的10.0mL的纳米金胶加入已混合好的上述溶液中，再在室温下超声分散12h至完全溶解，最终得到了石墨烯-多壁碳-纳米金胶-壳聚糖纳米复合物。
2.如权利要求1所述的一种基于石墨烯-多壁碳-纳米金胶-壳聚糖修饰的免疫传感器，其特征在于：制备了石墨烯-多壁碳-纳米金胶-壳聚糖纳米复合材料修饰的免疫传感器的制备，制备步骤为：
首先将金电极放入Piranha溶液(H2O2与浓H2SO4体积比1∶3)、硝酸（HNO3与H2O的体积比1:1）、无水乙醇、去离子水中分别超声清洗5min清洗，于0.5MH2SO4溶液中活化后用氮气吹干；(2)将2.5μL石墨烯-多壁碳-纳米金胶-壳聚糖纳米复合物修饰到清洗好的裸金电极修饰上，烘干；（3）修饰2μL100μg/mL蛋白A，然后用PH=7.5的PBS缓冲液冲洗，氮气吹干；（4）修饰2.5μL10μg/mL毒死蜱抗体，4℃孵育12h；（5）将上述制备好的电极最后浸入2.5%的BSA溶液中室温下静置1h，以封闭电极上非特异性结合位点，室温下晾干，免疫传感器制作完成，保存在4℃条件下备用。
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