CN103589733B - 皮肤特异表达绵羊β-catenin基因的表达盒、重组质粒以及它们的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种皮肤特异表达绵羊β-catenin基因的表达盒、重组质粒以及它们的应用。本发明提供了一种DNA分子，自上游至下游依次包括人皮肤特异性启动子K14和β-catenin基因。所述β-catenin基因编码序列表的序列2所示的β-catenin蛋白。所述人皮肤特异性启动子K14具体可如序列表的序列1自5’末端第12至2011位核苷酸所示。本发明提供了相应的表达盒和重组质粒，能够在动物皮肤中特异驱动β-catenin基因表达，促进皮肤毛囊生长，在不损害个体正常生长的前提下提高动物的产毛量和产毛品质。
Description
技术领域
本发明涉及一种皮肤特异表达绵羊β-catenin基因的表达盒、重组质粒以及它们的应用。
背景技术
毛囊是控制毛发生长的一个复杂的皮肤附属结构，在胚胎期形成，主要由毛乳头、毛母质、内根鞘、外根鞘、隆突区和毛干等结构组成。毛囊形态发生的信号起源于真皮，随后一系列的信号分子穿梭于上皮细胞和真皮细胞之间，介导这两个细胞群体之间的相互作用，促使上皮细胞和真皮细胞的增殖、分化、迁移及其之间相互连接的一系列活动，最终形成完整的毛囊。毛发的生长是一个周期性过程，分为生长期、退行期和静止期。各个时期的发动和持续时间因绵羊品种而异，毛囊干细胞的分化在毛囊周期性变化过程中起了重要作用。毛囊的各性状决定了羊毛的产量和品质，毛囊的周期性变化引起了绵羊羊毛的脱落，因此了解毛囊的性状及其周期性变化规律是提高羊毛产量和品质的重要基础。
Catenins是与钙黏着蛋白结合形成复合物的一种蛋白家族，分为α、β、δ、γ4个亚型。其中β-catenin是一种具有双重功能的蛋白，最早是由德国细胞生物学家WaltBirchmeier发现。β-catenin既可以作为一种黏附分子参与细胞之间的黏附连接，又可以经由WNT信号通路参与调节基因的转录。在没有WNT配体存在的情况下，大部分的β-catenin与钙黏着蛋白结合参与细胞间的黏附连接，少部分的β-catenin与Axin、APC、CKI和GSK-3β结合形成复合物。CKI首先引起β-catenin第45位残基磷酸化，此反应又进一步催化GSK-3β对β-catenin33、37、41位残基发生磷酸化作用，被磷酸化标记的β-catenin被泛素连接酶β-Trcp蛋白识别进而泛肽化，最终进入泛素降解途径降解，胞浆中游离的β-catenin水平极低；WNT信号传入时，WNT蛋白与FRZ胞外结合，在LRP协同作用下，Dvl被募集至细胞膜附近，Dvl促使GSK-3β磷酸化，使其从Axin复合物上脱落，从而避免进入泛素降解途径。脱落的β-catenin在胞浆中聚集，达到一定浓度时，通过核孔进入细胞核。在细胞核内，β-catenin与Tcf/Lef结合，促进靶基因的激活转录。实验表明β-catenin作为信号分子穿梭于上皮细胞和表皮细胞之间，介导二者之间的相互作用，在毛囊形成过程中扮演重要的角色。胚胎期干扰β-catenin基因的表达，将不会形成正常的毛囊结构；在出生后干扰β-catenin基因的表达则导致在第一个毛发周期之后毛发脱落，不会进入下一个生长周期；敲除掉β-catenin基因之后，毛囊干细胞也不会分化形成毛囊细胞。反之，在胚胎期增加β-catenin的表达水平能够引起毛囊数目的增加，而且会诱导毛发由静止期提前进入生长期。然而，β-catenin在毛囊形成和周期性变化过程中的作用方式和作用机理还不是很明确。
发明内容
本发明的目的是提供一种皮肤特异表达绵羊β-catenin基因的表达盒、重组质粒以及它们的应用。
本发明提供了一种DNA分子，自上游至下游依次包括人皮肤特异性启动子K14和β-catenin基因。
所述β-catenin基因编码序列表的序列2所示的β-catenin蛋白。
所述β-catenin基因具体可如序列表的序列1自5’末端第2226至4571位核苷酸所示。
所述人皮肤特异性启动子K14具体可如序列表的序列1自5’末端第12至2011位核苷酸所示。
所述DNA分子具体可如序列表的序列2自5’末端第12至4728位核苷酸所示。
所述DNA分子中，在所述β-catenin基因的下游还可具有IRES序列和荧光标记基因。
所述IRES序列具体可如序列表的序列1自5’末端第4735至5319位核苷酸所示。
所述荧光标记基因具体可为序列表的序列1自5’末端第5323至6039位核苷酸所示的EGFP基因。
所述DNA分子具体可如序列表的序列2自5’末端第12至6039位核苷酸所示。
含有以上任一所述DNA分子的质粒也属于本发明的保护范围。所述质粒具体可为序列表的序列1所示的质粒。序列1中自5’末端第12至2011位核苷酸为人皮肤特异性启动子K14，第2217至2225位核苷酸为Kozak序列，第2226至4571位核苷酸为β-catenin基因，第4572至4728位核苷酸为β-catenin基因的3’UTR区域，第4735至5319位核苷酸为IRES序列，第5323至6039位核苷酸为EGFP基因。
本发明还保护以上任一所述DNA分子或所述质粒的应用；所述应用为如下（a）或（b）或（c）或（d）：（a）表达β-catenin基因；（b）制备用于促进动物皮肤毛囊进入生长期的产品；（c）促进动物皮肤毛囊进入生长期；（d）制备在动物皮肤中表达β-catenin基因的产品。所述动物具体可为C57BL/6J小鼠或绵羊（具体可为细毛羊，如敖汉细毛羊）。所述表达β-catenin基因具体可为在动物皮肤中特异表达β-catenin基因。所述β-catenin基因编码序列表的序列2所示的β-catenin蛋白。所述β-catenin基因具体可如序列表的序列1自5’末端第2226至4571位核苷酸所示。
启动子是基因表达调控中最为关键的一个调控因子，决定了基因的转录与否。启动子的种类有很多，组织特异性启动子除了具备启动子的基本元件之外还有一些调控特异表达的序列。在特异性表达启动子的调控下，外源基因能够只在特定的组织表达。本发明提供了相应的表达盒和重组质粒，能够在动物皮肤中特异驱动β-catenin基因表达，促进皮肤毛囊生长，在不损害个体正常生长的前提下提高动物的产毛量和产毛品质。
附图说明
图1为pIRES2-EGFP质粒的结构示意图。
图2为实施例1的步骤一的2中PCR扩增产物的1%琼脂糖凝胶电泳图；M为分子量标记，1至4为PCR扩增产物。
图3为实施例1的步骤一的7中PCR扩增产物的1%琼脂糖凝胶电泳图；M为分子量标记，1至5为PCR扩增产物。
图4为重组质粒K14-β-catenin-IRES-EGFP的结构示意图。
图5为β-catenin基因的在不同组织中的相对表达量（部分结果）。
图6为溶解曲线。
图7为阳性鼠59-2荧光下观察的结果。
图8为阳性鼠59-2和非阳性鼠石蜡切片和HE染色后的照片。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。pIRES2-EGFP质粒（结构示意图见图1）：北京天恩泽基因科技有限公司，CAT#:80501-2。C57BL/6J小鼠：上海南方模式生物科技发展有限公司。
实施例1、质粒的构建和应用
一、皮肤特异表达绵羊β-catenin基因的重组质粒的构建
1、提取人血液组织的基因组DNA。
2、以步骤1的基因组DNA为模板，用K14F和K14R组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。
K14F：5′-CATTAATATCCCTGCAGAAGAAGGAGAC-3′；
K14R：5′-ATAAGCGCTGGCTGAGTGAAGAGAAGG-3′。
PCR反应程序：95℃预变性5min；95℃变性30s、57℃退火30s、72℃延伸2min，30个循环；72℃再延伸10min。
PCR扩增产物的1%琼脂糖凝胶电泳图见图2。可观察到2000bp左右的特异性条带。
3、用限制性内切酶AseI和AfeI双酶切步骤2的PCR扩增产物，回收酶切产物。
4、用限制性内切酶AseI和AfeI双酶切pIRES2-EGFP质粒，回收约4700bp的载体骨架。
5、将步骤3的酶切产物和步骤4的载体骨架连接，得到重组质粒K14-IRES-EGFP。重组质粒K14-IRES-EGFP中，人皮肤特异性启动子K14取代了pIRES2-EGFP质粒原有的CMV启动子（组成型启动子）。
6、提取敖汉细毛羊皮肤的总RNA并反转录为cDNA。
7、以步骤6的cDNA为模板，用JDF和JDR组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。
JDF：5′-CGGAGACGGAGCAAGGT-3′；
JDR：5′-GCAAGCAAAGTCAGTACCAT-3′。
PCR反应程序：95℃预变性5min；95℃变性30s、56℃退火30s、72℃延伸2min40s，33个循环；72℃再延伸10min。
PCR产物的1%琼脂糖凝胶电泳图见图3，可观察到2700bp左右的特异性条带。
8、以步骤7的PCR扩增产物为模板，用F和R组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。
F：5′-TCCCCGCGGCGGAGACGGAGCAAGGT-3′；
R：5′-CGCGGATCCGCAAGCAAAGTCAGTACCAT-3′。
9、用限制性内切酶SacII和BamHI双酶切步骤8的PCR扩增产物，回收酶切产物。
10、用限制性内切酶SacII和BamHI双酶切重组质粒K14-IRES-EGFP，回收约6700bp的载体骨架。
11、将步骤9的酶切产物和步骤10的载体骨架连接，得到重组质粒K14-β-catenin-IRES-EGFP。
重组质粒K14-β-catenin-IRES-EGFP的测序结果见序列表的序列1。序列1中自5’末端第12至2011位核苷酸为人皮肤特异性启动子K14，第2217至2225位核苷酸为Kozak序列，第2226至4571位核苷酸为β-catenin基因，第4572至4728位核苷酸为β-catenin基因的3’UTR区域，第4735至5319位核苷酸为IRES序列，第5323至6039位核苷酸为EGFP基因。
重组质粒K14-β-catenin-IRES-EGFP的结构示意图见图4。
重组质粒K14-β-catenin-IRES-EGFP导入动物后，在人皮肤特异性启动子K14的驱动下，β-catenin基因在皮肤组织中特异表达，由于IRES序列的存在，EGFP基因同时表达（EGFP是一种突变型的GFP，产生的荧光是普通GFP的35倍，可在多种异源生物中表达且无细胞毒性）。本发明提供的重组质粒，可以通过原核注射方法制备转基因动物，能够得到皮肤特异性高表达的动物家系。
二、应用步骤一制备的重组质粒在小鼠皮肤中特异表达绵羊β-catenin基因
1、用限制性内切酶Ase1酶切重组质粒K14-β-catenin-IRES-EGFP，得到线性化质粒。
2、取C57BL/6J小鼠（雄）和C57BL/6J小鼠（雌）的受精卵480枚，注射步骤3得到的线性化质粒，然后移植到24只假孕母鼠的输卵管中（每只假孕母鼠注射20枚受精卵），11只母鼠怀孕（受精卵的移植成功率为45.83%），共获得93只子代小鼠。
3、分别提取步骤2得到的各个子代小鼠的尾部组织，提取基因组DNA，用JDF和JDR组成的引物对进行PCR鉴定，然后将PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳。
PCR反应体系：10×PCRBuffer2.5μl，ExTaq0.3μl，dNTP2.5μl，基因组DNA1.0μl，JDF0.5μl，JDR0.5μl，ddH2O17.7μl。
PCR反应程序：95℃预变性5min；95℃变性30s、60℃退火30s、72℃延伸3min，35个循环；72℃再延伸10min。
如果显示2800bp左右的特异性条带，该小鼠为阳性小鼠。
93只子代小鼠中，10只为阳性小鼠，阳性率为10.75%。
将阳性小鼠命名为Founder鼠，即首建鼠F0。
4、将性成熟的Founder鼠（8周龄）与8周龄的C57BL/6J小鼠交配，得到的子代鼠即为F1代鼠。
5、将步骤4得到的F1代鼠（2周龄）剪尾并提取基因组DNA，用JDF和JDR组成的引物对进行PCR鉴定，如果1%琼脂糖凝胶电泳显示2800bp左右的特异性条带，该小鼠为阳性小鼠。F1代小鼠中共获得38只F1代阳性鼠。
6、分别取步骤5得到的各个F1代阳性鼠的皮肤、肌肉和肺脏组织，提取总RNA并反转录为cDNA，通过荧光定量PCR检测各个组织中绵羊β-catenin基因的表达量。
用于检测β-catenin基因的引物对如下：
β-catenin-F：5′-AGCGTCGTACATCTATGGG-3′；
β-catenin-R：5′-ATAATCCTGTGGCTTGACC-3′。
用于检测持家基因Actin引物如下：
Actin-F：5′-TTGCTGACAGGATGCAGAAGGAGA-3′；
Actin-R：5′-ACTCCTGCTTGCTGATCCACATCT-3′。
荧光定量PCR反应体系（20μl）：RealMasterMix(SYBRTMGreenI)10μl，上游引物和下游引物各1μl，cDNA1μl，ddH2O7μl。各个试剂购自加拿大新产业科技公司。
PCR反应程序：95℃预变性3min；95℃变性10s、58℃退火10s、72℃延伸30s，PlateRead，40个循环；95℃10s、65℃5s、95℃5s，PlateRead。
38只F1代阳性鼠的肌肉组织和肺脏组织中均未检测到β-catenin基因的表达。38只F1代阳性鼠的皮肤组织中均可以检测到β-catenin基因的表达。
β-catenin基因的在不同组织中的相对表达量（部分结果）见图5。
溶解曲线见图6。
7、分别剪取步骤5得到的各个F1代阳性鼠的尾部组织，放入1.5ml离心管中，置于荧光下观察。
38只F1代阳性鼠均可观察到小鼠尾部发出绿色荧光。阳性鼠59-2的结果见图7（Wt为C57BL/6J小鼠）。
8、分别取阳性鼠59-2和同窝出生的非阳性鼠的背部皮肤，进行石蜡切片和HE染色，照片见图8（A为阳性鼠59-2，B为非阳性鼠）。阳性鼠59-2的毛囊已经开始进入生长期，而非阳性鼠的毛囊大部分处于静止期。
Claims (7)
1.一种DNA分子，自上游至下游依次包括人皮肤特异性启动子K14和β-catenin基因；所述β-catenin基因如序列表的序列1自5’末端第2226至4571位核苷酸所示；所述人皮肤特异性启动子K14如序列表的序列1自5’末端第12至2011位核苷酸所示。
2.如权利要求1所述的DNA分子，其特征在于：所述DNA分子如序列表的序列1自5’末端第12至4728位核苷酸所示。
3.如权利要求1或2所述的DNA分子，其特征在于：所述DNA分子中，在所述β-catenin基因的下游还具有IRES序列和荧光标记基因。
4.如权利要求3所述的DNA分子，其特征在于：所述IRES序列如序列表的序列1自5’末端第4735至5319位核苷酸所示。
5.如权利要求3所述的DNA分子，其特征在于：所述DNA分子如序列表的序列1自5’末端第12至6039位核苷酸所示。
6.含有权利要求1至5中任一所述DNA分子的质粒。
7.权利要求1至5中任一所述DNA分子或权利要求6所述质粒的应用；所述应用为如下(a)或(b)或(c)或(d)：(a)表达β-catenin基因；(b)制备用于促进动物皮肤毛囊进入生长期的产品；(c)促进动物皮肤毛囊进入生长期；(d)制备在动物皮肤中表达β-catenin基因的产品；所述应用为非疾病诊断治疗应用。
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| β-catenin对绒山羊毛囊发育的影响;崔凯等;《中国畜牧兽医学会养羊学分会2012年全国养羊生产与学术研讨会议论文集》;20121231;第82页左栏倒数第1段-第83页左栏倒数第2段 * |
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