CN103571964B - 基于rna和dna双外参实时定量pcr的表达校准值的检测方法 - Google Patents

基于rna和dna双外参实时定量pcr的表达校准值的检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种基于RNA和DNA双外参实时定量荧光PCR策略的基因表达校准值的检测方法，包括：选定外参基因；配制外参基因的RNA与DNA的预混合液；样品中加入预混合液，收集样品RNA和DNA；实时定量荧光PCR，检测待测基因和内参基因RNA拷贝数、内参基因DNA拷贝数以及外参基因RNA和DNA拷贝数，计算得到内参基因的表观表达水平后，再根据公式得到待测基因的表达校准值。本发明还公开了上述方法在PCR array以及表达谱芯片检测分析技术中的应用。本发明将基因的表观表达水平概念和检测方法与传统表达检测体系相结合，以更少的检测反应、更低廉的成本实现更精确的基因表达水平检测，修正由内参基因真实表达水平在不同样本间不恒定所造成的检测结果的不准确。

Description

基于RNA和DNA双外参实时定量PCR的表达校准值的检测方法
技术领域
本发明涉及分子生物学及生物信息学领域，具体涉及一种改进的、基于RNA和DNA双外参实时定量荧光PCR的基因表达校准值的检测方法。
背景技术
自从1970年克里克提出分子生物学的中心法则以来，人们对于基因的转录表达和及其调控的机制进行了大量的研究。Northern杂交方法是最早用来测定基因转录水平的方法。后来，结合逆转录和聚合酶链式反应产生的RT-PCR(reverse transcription-PCR，即：逆转录-聚合酶链式反应)提供了一种灵敏而又简便的半定量测定方法。近年来，实时定量聚合酶链式反应(简称为：qPCR)方法由于其灵敏、准确和重复性好，因此逐步成为基因表达的定量测定的主流方法。
上述方法为了减少由于RNA不稳定和逆转录的效率问题产生的误差，通常将待测基因的转录水平表示为与一个参考值(内参基因RNA水平、细胞内总RNA水平)的相对表达量。内参通常为看家基因，如：β-actin、GAPDH以及rRNA等。然而，众所周知，不同组织、或同一组织在不同条件下，细胞的总RNA量和/或内参的量并不恒定，因此，基于该前提所进行的基因转录水平检测往往不够精确。针对这一问题，我们曾经提出RNA和DNA双外参实时定量荧光PCR检测方法[1](专利号：ZL200910049306.5)，检测基因在某个时刻、某个细胞状态下的RNA和DNA的比值，确定待测基因的表观表达水平。
然而在“RNA和DNA双外参实时定量荧光PCR检测方法”中，针对每个待测基因都需要同时检测其RNA和DNA水平，因此检测反应需要加倍，成本大大增加，限制了它的可推广性。如何将“RNA和DNA双外参实时定量荧光PCR检测方法”与传统技术平台进行整合和改良，以合理的成本获得更加可靠的基因表达数据，是目前亟待解决的技术问题。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明提出的基于RNA和DNA双外参实时定量荧光PCR策略的基因表达校准值的检测方法，是在传统基因表达检测体系的基础上，运用我们曾经提出的专利“RNA和DNA双外参实时定量荧光PCR检测方法”[1](专利号：ZL200910049306.5)，增加检测原有体系中内参基因的转录产物拷贝数和基因拷贝数，以及外参基因的转录产物拷贝数和基因拷贝数，计算内参基因的表观表达水平，进而对所有待测基因的表达值进行校准，从而得到所有待测基因的表达校准值。
本发明的目的之一是提供一种改进的、基于RNA和DNA双外参实时定量荧光PCR策略的基因表达校准值的检测方法，得到待测基因的表达校准值，包括步骤如下：
1)选定外参基因，制备外参基因的RNA与DNA，配制外参基因的RNA与DNA的预混合液；其中，所述外参基因的选定原则及预混液的配制原则与专利“RNA和DNA双外参实时定量荧光PCR检测方法及其应用”(专利号：ZL200910049306.5)中的原则一致。
2)将步骤1)制备的预混合液与待测样品混合，分别抽提总RNA和总DNA；
3)总RNA进行逆转录合成第一条cDNA链；
4)对cDNA组分和总DNA组分分别进行实时定量荧光PCR扩增。除测定待测基因和原有检测体系中内参基因的RNA拷贝数外，进一步测定内参基因的DNA扩增产物的拷贝数、以及外参基因的RNA和DNA扩增产物的拷贝数，根据如下公式计算得到内参基因的表观表达水平：
根据上述的内参基因的表观表达水平值，按如下公式对待测基因的表达值进行校准，从而得到待测基因的表达校准值：
为了阐述该校准值(通过本发明的改进方法获得的经内参基因表观表达水平校准后的待测基因的表达校准值)的理论意义，对上式进行如下推导：
当对待测基因的表达校准值进行常规的样本间ratio计算时：
基于一个事实——与RNA表达水平比较，DNA拷贝数相对稳定，因此我们假定待测基因和内参基因的DNA拷贝数在样本间没有变化，于是上式可进一步简化成为：
也就是说，基于待测基因的表达校准值进行样本间ratio计算，其结果等同于基于待测基因的表观表达水平进行ratio计算，从理论上证明了本校准方法的可靠性。
上述步骤中，外参基因、载体的选择标准，预混合液、cDNA、引物等的制备原则和步骤，以及基因表观表达水平的计算，在专利“RNA和DNA双外参实时定量荧光PCR检测方法及其应用”(专利号：ZL200910049306.5)中均有详细描述。
相对传统基因表达检测体系，例如目前主流的qPCR方法，本发明提供了一种改进的基于RNA和DNA双外参实时定量荧光PCR的表达校准值的检测方法，只需增加测定内参基因的RNA和DNA拷贝数以及外参基因的RNA和DNA拷贝数，即可获得更加精确的待测基因表达值。相对于本申请人此前提出的专利“RNA和DNA双外参实时定量荧光PCR检测方法及其应用”(专利号：ZL200910049306.5)，本发明无需检测所有待测基因的DNA拷贝数，仅检测内参基因的表观表达水平，即可获得所有待测基因表达水平的校准值。三类方法的详细比较见下表：
本发明的另一目的是对传统基因表达检测平台进行改进，提供一种基于RNA和DNA双外参实时定量荧光PCR的表达校准值的检测方法，应用在芯片(包括cDNA芯片和寡核苷酸芯片)检测平台中，本发明包括如下步骤：
1)选定用于双外参实时定量PCR检测方法的外参基因，配制具有一定比值的外参基因RNA与外参基因DNA的预混合液；
2)将步骤2)制备的预混合液与待测样品混合，分别抽提总RNA和总DNA；
3)总RNA进行逆转录合成第一条cDNA链；
4)对总RNA组分按正常流程进行芯片表达谱实验；
5)使用实时定量荧光PCR加测芯片检测体系中内参基因的RNA和DNA扩增产物的拷贝数，以及新增外参基因的RNA和DNA扩增产物的拷贝数，计算得到内参基因的表观表达水平。
接着，根据如下公式，根据内参基因的表观表达水平值对表达谱检测平台产生的所有待测基因的表达值进行校准，从而得到待测基因的表达校准值。
目前现有的基因表达水平体系仍然普遍依赖内参基因或总RNA量的测定和归一化。采用本发明检测方法可以对公共数据资源中的已发布数据进行校准，以得到精确度提升的基因表达数据，便于实施二次挖掘。
进一步地，应用本发明检测方法时，针对缺乏原始信息、只有基因差异表达值的数据的情况下，采纳以下校准公式：
本发明检测方法是对传统基因表达检测平台的改进，应用RNA和DNA双外参实时定量荧光PCR方法，加测原有基因表达检测体系中内参基因的RNA表观表达水平，基于该值对所有待测基因的表达水平进行校准，从而得到待测基因的表达校准值。
本发明提供的是一种非诊断目的的检测方法，不依赖样品类型，可以广泛使用。本发明将基因的表观表达水平(每拷贝基因表达量)概念和检测方法与传统表达检测体系相结合，相对于发明人在先提出的“RNA和DNA双外参实时定量荧光PCR检测方法及其应用”(专利号：ZL200910049306.5)，本发明能够以更少次数的检测反应、更加低廉的成本实现更加精确的基因表达水平检测，修正由内参基因真实表达水平在不同样本间不恒定所造成的检测结果的不准确。
本发明有关的参考文献：
[1]Zhang，Y.，et al.，Transcription level of messenger RNA per gene copy determined with dual-spike-in strategy.Anal Biochem，2009.394(2)：p.202-8.
附图说明
图1质粒pPigT.7的结构示意图。
图2质粒FFa2A3IFP2的结构示意图。
图3bacmidAcA3IFP2的结构示意图。
图4IFP2DNA标准曲线。
图5Cyp6AB4在家蚕各组织中的表观转录水平图。
具体实施方式
下面结合实施例进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明，而非限制本发明的范围。在不背离发明构思的精神和范围下，本领域技术人员能够想到的变化和优点都被包括在本发明中，并且以所附的权利要求书及等同内容为保护范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法及未说明配方的试剂均为按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：试验手册(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件或者制造商建议的条件进行或配置。
本发明是对发明人在先提出的RNA和DNA双外参实时定量荧光PCR检测方法的进一步改良和应用。本发明中，应用RNA和DNA双外参实时定量荧光PCR方法，测定传统基因表达检测体系中内参基因的RNA表观表达水平，基于该值对所有待测基因的表达水平进行校准，从而得到待测基因的表达校准值。本发明检测方法包括如下步骤：选定用于双外参实时定量PCR检测方法的外参基因；制备外参基因的RNA与DNA，配制外参基因的具有一定比值RNA与DNA的预混合液；抽提样品时加入预混合液，分别收集样品中的RNA和DNA；实时定量荧光PCR，除待测基因和原有检测体系内参基因的RNA拷贝数外，只需加测内参基因的DNA拷贝数，以及外参基因的RNA和DNA拷贝数；计算得到内参基因的表观表达水平后，根据公式对待测基因表达值进行校准。本发明还公开了上述方法在PCR array以及表达谱芯片检测分析技术中的应用。
本实施例以家蚕为研究对象，使用双外参实时定量PCR方法检测方法同时检测了内参基因A3在家蚕中部丝腺、后部丝腺、脂肪体、马氏管和中肠抽提物等多种组织中的RNA和DNA拷贝数，以及各待测基因在这些组织中的RNA和DNA拷贝数。首先，采集内参基因的RNA和DNA拷贝数以及外参基因的RNA和DNA拷贝数，计算得到内参基因的表观表达水平；检测各待测基因的RNA拷贝数，用内参基因的表观表达水平对各待测基因的RNA拷贝数进行校准，获得各待测基因的表达校准值；检测各待测基因的表观表达水平，检查校准值与表观表达值的一致性；基于表达校准值计算各待测基因在组织间的表达ratio值，与基于表观表达得到的ratio值进行比较，确认其一致性。
1.实验蚕的处理：
实验蚕54A的卵由中国农业科学研究院蚕业研究所提供，催青、孵化后用人工饲料在25℃饲养。幼虫长到5龄第3天解剖，取中部丝腺、后部丝腺、脂肪体、马氏管和中肠，重蒸水洗3次后-70℃保存。
2.内参基因的选择与确定：
本实施例中，选择常用的看家基因Actin-3作为内参基因。
3.RNA和DNA外参的选择与制备：
piggyBac转座子来源于鳞翅目细胞系TN-368，由2个转座臂和一个转座酶IFP2的编码序列组成。由于IFP2不存在于家蚕中，因此被选为本实施例的外参。
将T7-IFP2表达框插入载体pUC19中制得质粒pPigT.7(4983bp，结构见图1)。用限制性内切酶Hind III将质粒pPigT.7线性化，然后用T7RNA聚合酶通过体外转录制备外参RNA，即IFP2RNA。最后用DEPC-H2O将IFP2RNA稀释成浓度为1ng/μl(即7.605×108拷贝/μl)的溶液。
为了使外参DNA与被跟踪标定的DNA在各种处理过程(酒精沉淀，RNA的反转录，用于芯片测定时的DNA随机引物延伸等)中行为一致，本实施例选用含IFP2的bacmidAcA3IFP2(～134kb)(结构见图2)作为外参DNA。含IFP2的bacmidAcA3IFP2的制备方法为：将质粒FFa2A3IFP2(将A3-IFP2表达框插入载体pFFa2中制得，结构见图2)转入bacmid AcΔEGT得到bacmid AcA3IFP2(结构见图3)。
通过实时定量PCR方法，以Hind III线性化的pPigT7为标准，检测AcA3IFP2的浓度，检测方法如下：实时定量PCR用SYBR Premix Ex Taq kit(TakaRa Biotechnology(Dalian)Co.Ltd.)在95℃下变性1min，然后在95℃5sec，55℃10sec，72℃10sec循环50次，然后收集荧光信号。荧光数据收集的温度77℃。检测结果如图4所示，经过计算可知AcA3IFP2DNA外参的浓度为9.341×106拷贝/μl。
将等体积的外参IFP2RNA和AcA3IFP2混合，2μl混合液中含DNA外参9.341×106拷贝，RNA外参7.605×108拷贝，二者之比为1：81.4。将它们加到100mg家蚕组织匀浆液中。
4.待测样品处理：
依产品说明书用TRNzol-A+Total RNA试剂(Tiangen Biotech Co.，LTD Beijing，China)分别抽提家蚕各组织的总RNA和DNA，步骤如下：
将待检测组织研磨后将1ml抽提液加到100mg组织样品中，同时加2μl IFP2RNA和AcA3IFP2的预混合液，使之充分混合，裂解细胞并且溶解细胞内含物。在12,000rpm的转速下离心15min，分别收集RNA和DNA部分。
总RNA部分用DNase I处理后进行逆转录，合成第一条cDNA链。20μl反应体系：4μl5×反应缓冲液，1μg总RNA，4种dNTP各0.5mM，25单位RNasin(核酸酶抑制剂)，1μl50μM(dN)6，2μl10μM oligo(dT15)及200单位M-MuLV逆转录酶(200U/μl；TaKaRa)。
5.实时定量PCR引物：
为减少由不同引物和扩增片段带来的实验系统误差，本实施例中对同一基因测定其RNA和DNA的拷贝数时采用相同的引物对，并设计在同一外显子中。扩增产物的长度在144bp到152bp之间。针对内参基因A3和隔待测基因和IFP2的引物见表1。
表1实时定量PCR引物
5、实时定量PCR的条件如下：
实时定量PCR用SYBR Premix Ex Taq kit(TakaRa Biotechnology(Dalian)Co.Ltd.)在95℃下变性1min，然后在95℃5sec，55℃10sec，72℃10sec循环50次，然后收集荧光信号。荧光数据收集的温度依据扩增产物而定(具体温度参见表1)。
6、实时定量PCR检测的数据处理及实验结果：
在用实时定量PCR测定了内参基因的RNA和DNA拷贝数后，计算内参基因的RNA与DNA之比，并用实时定量PCR测定的外参基因的RNA与DNA之比进行归一化，再乘以预混合液中外参基因的RNA与DNA之比(81.4)进行归一化。
其中，第一步归一化的目的是用于去除诸如酒精沉淀、逆转录效率和PCR等技术上的问题；第二步归一化的目的是用于去除RNA和DNA样品处理过程带来的差别。通过上述两步归一化，可以准确地计算出某组织中的待测基因在某个条件下，每个拷贝的表达水平。计算公式如下：
PCR扩增时样品中初始拷贝数越高，则荧光信号强度超过阈值(T)时的扩增圈数C(T)就越小；C(T)值与初始拷贝数的对数成线性关系：C(T)＝a×lg(copy)+b，a和b分别是直线方程的斜率和截距。根据数学运算lg(copy1/copy2)＝(C(T)1-C(T)2)÷a.
C(T)＝a×lg(copy)+b，
C(T)1＝a×lg(copy1)+b………………………………………………………………(1)
C(T)2＝a×lg(copy2)+b………………………………………………………………(2)
(1)式-(2)式可得：
C(T)1-C(T)2＝a×(lgcopy1-lgcopy2)
所以可得：lg(copy1/copy2)＝[C(T)1-C(T)2]÷a
即：
第一步归一：
第二步归一：
由于IFP2基因的RNA与IFP2基因的DNA的初始含量之比为81.4，因此经过两步归一步骤后可知，
同时因为：
可得：
A3基因在后部丝腺测定结果计算步骤如下：
三次RNA测定的C(T)值的平均为23.101，
三次DNA测定的C(T)值的平均为31.452，
A3基因PCR扩增反应的a值是-3.120，
lg(A3mRNA/A3DNA)＝(23.101-31.452)÷(-3.120)＝2.675
(A3mRNA/A3DNA)＝102.675＝473.15
外参IFP2在后部丝腺测定结果：
四次RNA测定的C(T)值的平均为20.27625，
六次DNA测定的C(T)值的平均为29.6242，
外参IFP2PCR扩增反应的a值是-3.6882，
lg(IFP2RNA/IFP2DNA)＝(20.27625-29.6242)÷(-3.6882)＝2.535
(IFP2RNA/IFP2DNA)＝102.535＝342.77
A3基因在后部丝腺的表观表达水平＝473.15÷342.77×81.4＝112.35
1)根据以下公式，分别计算内参基因A3和待测基因GAPDH以及28S rRNA在五种组织(中部丝腺、后部丝腺、脂肪体、马氏管、中肠)中的表观表达水平。
实验数据及结果见下表2。
表2家蚕5种组织中A3，GAPDH，28S rRNA的表观表达水平
组织 A3 GAPDH 28S rRNA
中部丝腺 112.35 10.620 5463.7
后部丝腺 1207.6 166.64 8849.4
脂肪体 522.12 11780 95425
马氏管 400.70 142.41 2872.5
中肠 9.9050 6.3244 2121.2
如表2所示，家蚕中部丝腺、后部丝腺、脂肪体、马氏管和中肠等组织中A3基因的表观转录水平与各组织的能量代谢的能力相关，变化非常大，在后部丝腺中内参基因A3的表观表达水平最高，达到中肠抽提物的上百倍。这一实验结果与申请人在专利“RNA和DNA双外参实时定量荧光PCR检测方法及其应用”(专利号：ZL200910049306.5)公开的实验结果相符。上述证明，通过本发明方法获得的表达校准值表现基因在组织中的表达比传统方法中使用内参基因的RNA拷贝数归一化其他基因的表达更能反映出基因在组织中的真实转录状况。
2)根据以下公式，根据内参基因A3的表观表达水平值对待测基因GAPDH、Cyp6AB4的在脂肪体和马氏管中的表达值进行校准，得到待测基因GAPDH、Cyp6AB4的表达校准值。
3)采纳专利ZL200910049306.5的“双外参实时定量PCR”策略，同时采集基因GAPDH、Cyp6AB4在脂肪体和马氏管中的RNA和DNA拷贝数，计算其表观表达值，计算方法同内参基因。
Cyp6AB4是近年克隆的一种家蚕细胞色素P450，检测结果如图5中所示，Cyp6AB4在各组织的表观转录水平显示Cyp6AB4主要在马氏管和脂肪体中表达，且其表达在这两组织间存在差异。
4)基于表达校准值计算GAPDH、Cyp6AB4在组织间的表达ratio值，与基于表观表达得到的ratio值进行比较，确认其一致性。
表3-1脂肪体和马氏管中GAPDH的表观表达水平、基于内参基因A3的表达校准值以及组织间的表达ratio值
GAPDH的表达 脂肪体 马氏管 ratio(马氏管/脂肪体)
表观表达水平 11780 142.41 0.01210
表达校准值 11764.52 142.40 0.01210
表3-2脂肪体和马氏管中Cyp6AB4的表观表达水平、基于内参基因A3的表达校准值以及组织间的表达ratio值
Cyp6AB4的表达 脂肪体 马氏管 ratio(马氏管/脂肪体)
表观表达水平 42.001 139.140 3.3130
表达校准值 41.999 139.123 3.3125
如表3-1和表3-2所示，在脂肪体中，基因GAPDH、Cyp6AB4表观转录水平分别为11780，42.001，基于内参基因A3的表达校准值分别为11764.52，41.999。在马氏管中，基因GAPDH、Cyp6AB4表观转录水平分别为142.41，139.140，基于内参基因A3的表达校准值分别为142.40，139.123。以上结果显示，本发明生成的表达校准值与待测基因的表观表达值的一致性。
基于表观表达水平计算所得的基因GAPDH、Cyp6AB4在马氏管与脂肪体间的表达ratio值(ratio(马氏管/脂肪体))分别为0.01210，3.3130；基于表达校准值计算所得的基因GAPDH、Cyp6AB4在马氏管与脂肪体间的表达ratio值(ratio(马氏管/脂肪体))分别为0.1210，3.3125。以上结果显示，基于表观表达水平和基于表达校准值计算所得的ratio值的一致性。
以上实例显示，根据本发明得到的表达校准值与待测基因的表观表达值具有的一致性，以及基于这两者计算所得的ratio值的一致性，充分印证了本发明检测方法的可行性和可靠性。

Claims (2)

1.基于RNA和DNA双外参实时定量PCR的表达校准值的非诊断目的的检测方法，其特征在于，所述检测方法无需检测待测基因的DNA拷贝数，所述检测方法包括如下步骤：
1)选定外参基因，配制外参基因的RNA与DNA的预混合液；
2)将步骤1)制备的预混合液与待测样品混合，分别抽提总RNA和总DNA；
3)总RNA进行逆转录合成第一条cDNA链；
4)对cDNA组分和总DNA组分分别进行实时定量荧光PCR扩增，测定扩增后的待测基因的RNA扩增产物拷贝数、内参基因的RNA扩增产物拷贝数、内参基因的DNA扩增产物的拷贝数、以及外参基因的RNA和DNA扩增产物的拷贝数；
根据如下公式计算得到内参基因的表观表达水平：
根据上述内参基因的表观表达水平值，按如下公式计算得到待测基因的表达校准值：
其中，所述方法减少检测反应的次数，实现基因表达水平检测。
2.如权利要求1所述的检测方法，应用于芯片检测平台，其特征在于，包括如下步骤：
1)选定外参基因，配制外参基因的RNA与DNA的预混合液；
2)将步骤1)制备的预混合液与待测样品混合，分别抽提总RNA和总DNA；
3)总RNA进行逆转录合成第一条cDNA链；
4)对总RNA组分进行芯片表达谱实验；
5)使用实时定量荧光PCR加测芯片检测体系中内参基因的RNA和DNA扩增产物的拷贝数，以及新增外参基因的RNA和DNA扩增产物的拷贝数，按权利要求1中的公式计算得到内参基因的表观表达水平，进一步得到表达谱检测平台产生的所有待测基因的表达校准值。
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