CN103571494B - 甘露寡糖磁性微球连接荧光量子点制备磁性荧光双功能微球 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种磁性荧光双功能纳米复合微球，其特征在于所述微球具有以下组成：磁性纳米粒子，其表面包埋甘露寡糖分子（MOS），并外露甘露寡糖分子末端的功能性羟基；荧光量子点，其粒径在2～10nm，表面修饰带有羧基基团；所述磁性纳米粒子与荧光量子点通过甘露寡糖分子末端的功能性羟基与荧光量子点的羧基基团通过化学偶联连接。本发明的磁性荧光纳米微球物既具有磁性粒子的超顺磁性，又保留了量子点优异的荧光特性，通过简单的外加磁场即可进行采集和分离。这种双功能荧光磁性微粒可应用于化学分析检测、免疫检测、荧光追踪和磁性分离等领域。

Description

甘露寡糖磁性微球连接荧光量子点制备磁性荧光双功能微球

技术领域

本发明属于生物医学、分析化学、纳米材料科学、合成化学技术领域，具体涉及一种磁性荧光双功能纳米复合微球及其制备方法。

背景技术

随着医学技术的进步，对生物材料的要求的提高，具有分离功能的纳米磁性材料和优异荧光标记功能的量子点是研究较多的两类材料。近年来,磁性复合微球越来越受到人们的关注,其作为性能优异的功能高分子材料在核磁共振、固定化酶、靶向药物、细胞分离和免疫分析等方面显示出强大的生命力。

纳米磁性材料因具有良好的生物活性、超顺磁性和表面易功能化等特点而十分引人注意，它可结合各种功能分子如酶、抗体、细胞、DNA或RNA等，在磁场的作用下进行采集和分离。因而在靶向药物、酶的固定化、免疫测定、细胞的分离与分类等领域有广泛的应用。

量子点(quantumdots，又称半导体纳米晶体)，它是由II-VI族和III-V族元素组成的无机纳米颗粒，其尺度约为2～10纳米，由于量子尺寸效应和介电限域效应使它们表现具有独特的光致发光性能。量子点的发射光强是常规有机荧光染料的20倍，稳定性比常规的有机荧光染料强100倍以上，且可以经受多次激发，实现一元激发多元发射，进行不同靶向目标的多色标记。这些鲜明的特性和独特的应用功能使量子点广泛应用于免疫分析，基因分析，药物筛选，活体及细胞荧光成像等领域。

荧光材料一直以来也深受人们的关注，在在生物体系中作为荧光探针，生物芯片研究，医学领域筛选药物，医学成像，在生物医学领域有广泛的应用。随着荧光材料和磁性纳米材料研究应用的不断深入，人们对其性质将有更深的认识，对其功能将有不断的完善，为了能够一步完成现代生物医学工程领域中常用到的标记和分离的工作，使荧光材料和磁性纳米材料在生物医学研究中发挥的作用越来越大，对于同时具备荧光和磁性的复合物的研究也变得越来越为重要和紧迫，并且科学是没有止境的，此类将磁性和发光性质集一体的磁性荧光复合材料，无疑会在生物医学的研究领域（免疫检测、荧光追踪、磁性分离等）发挥巨大的应用价值。

标记和分离已经成为现代生物医学工程领域中的重要工作，如果标记和分离的工作能一步完成，必将极大地推动生物科学技术的发展。本发明因此而来。

发明内容

本发明目的在于提供一种磁性荧光双功能纳米复合微球的制备方法，通过制备磁性纳米粒子，在磁性纳米粒子表面包埋甘露寡糖分子，通过甘露寡糖分子表面的功能性基羟基连接巯基乙酸修饰后的荧光纳米材料量子点，得到具有磁性荧光双功能的纳米复合微球。

为了解决现有技术中的这些问题，本发明提供的技术方案是：

一种磁性荧光双功能纳米复合微球，其特征在于所述微球具有以下组成：

磁性纳米粒子，其表面包埋甘露寡糖分子（MOS），并外露甘露寡糖分子末端的功能性羟基；

荧光量子点，其粒径在2～10nm，表面修饰带有羧基基团；

所述磁性纳米粒子与荧光量子点通过甘露寡糖分子末端的功能性羟基与荧光量子点的羧基基团通过化学偶联连接。

优选的技术方案是：所述磁性荧光双功能纳米复合微球的粒径在20～100nm范围内。

优选的技术方案是：所述微球为规则或不规则的球形、方形以及椭圆形的颗粒。

优选的技术方案是：所述荧光量子点选自纳米级的CdTe、CdSe、InP、InAs、CdSe/CdS、CdSe/ZnS、CdSe/ZnSe、CdTe/ZnS、CdHgTe/ZnS、HgTe/HgCdS量子点的一种或两种以上的任意组合。

优选的技术方案是：所述磁性纳米粒子为超顺磁、顺磁或铁磁性的金属、金属合金或金属氧化物纳米粒子。

优选的技术方案是：所述磁性纳米粒子选自Fe₃O₄、γ-Fe₂O₃、MeFe₂O₃、NiCoFe、FeCo和NiFe的纳米磁性粒子，其中Me为Co、Mn、Ni。

本发明的另一目的在于提供一种所述磁性荧光双功能纳米复合微球的制备方法，其特征在于所述方法包括以下步骤：

（1）制备表面修饰带有羧基基团的荧光量子点，粒径为2-10nm；

（2）制备磁性纳米粒子；

（3）磁性纳米粒子表面包埋甘露寡糖分子（MOS），得到表面带有功能性羟基的甘露寡糖磁性微粒；

（4）使表面带有功能性羟基的甘露寡糖磁性微粒连接上带羧基的荧光量子点，得到磁性荧光双功能纳米复合微球。

优选的技术方案是：所述方法步骤（3）中磁性纳米粒子表面包埋甘露寡糖分子（MOS）是在油包水体系中合成的，所用包覆体系为W/O相。

优选的技术方案是：所述方法步骤（3）中磁性纳米粒子表面包埋甘露寡糖分子（MOS）按照以下步骤进行：

（1）将磁性纳米粒子与甘露寡糖分子（MOS）溶液混合均匀后形成作为水相的A液；

（2）以液体石蜡为油相，以Span-80为乳化剂，将Span-80溶于液体石蜡中，作为B液；

（3）将A液缓慢滴加到B液中，搅拌形成初乳；然后加入环氧氯丙烷,并升温后继续搅拌,调节pH至碱性获得表面包埋甘露寡糖分子（MOS）的磁性纳米粒子。

优选的技术方案是：表面修饰带有羧基基团的荧光量子点为水溶性的，与表面修饰后的磁性纳米粒子连接所用体系为水相。

本发明得到的磁性荧光双功能微球属于生物医学、分析化学、纳米材料科学、合成化学技术领域。本发明的磁性荧光双功能纳米复合微球，它由磁性纳米粒子表面包埋甘露寡糖分子，通过甘露寡糖分子末端的功能性羟基连接2-10nm的荧光纳米材料量子点。

其中荧光纳米材料量子点至少为CdTe、CdSe、InP、InAs、CdSe/CdS、CdSe/ZnS、CdSe/ZnSe、CdTe/ZnS之一。磁性纳米材料为：超顺磁、顺磁或铁磁性的金属或金属氧化物。包埋磁性纳米粒子的反应试剂为：甘露寡糖、环氧氯丙烷、石油醚、Span-80，溶剂为液体石蜡。荧光纳米量子点为水溶性的，磁性纳米材料是在水相合成的。得到的磁性荧光双功能纳米复合微球为规则或不规则的球形、方形以及椭圆形的颗粒。合成的磁性荧光双功能纳米复合微球的直径分布在20至50纳米。

本发明磁性荧光双功能纳米复合微球的具体的制备方法如下：

（1）制备荧光量子点，粒径为2-10nm；

（2）制备磁性纳米粒子；

（3）在磁性纳米粒子表面反向包埋甘露寡糖，得到表面带有羟基的甘露寡糖磁性微粒；

（4）将得到的表面带有功能性羟基的磁性微粒分别连接上CdSe/CdS、CdTe量子点,得到磁性荧光双功能微球。

本发明中甘露寡糖磁性微粒、磁性微粒、表面反向包埋甘露寡糖分子的磁性纳米粒子、表面包埋甘露寡糖分子的磁性纳米粒子具有同等含义。

包覆后的磁性微粒为水溶性的，甘露寡糖磁性微粒是在油包水体系中合成的，所用包覆体系为W/O相。带羧基修饰后的荧光量子点为水溶性的，磁性荧光纳米粒子是在水相中合成的。

相对于现有技术中的方案，本发明的优点是：

本发明公开了一种磁性荧光双功能微球及其制备方法，该双功能微球主要通过在磁性纳米粒子表面包埋上甘露寡糖分子，通过分子末端的功能羟基成功的连接了荧光纳米材料量子点，得到了具有磁性荧光双功能的纳米微球。本发明的磁性荧光纳米微球物既具有磁性粒子的超顺磁性，又保留了量子点优异的荧光特性，通过简单的外加磁场即可进行采集和分离。这种双功能荧光磁性微粒可应用于化学分析检测、免疫检测、荧光追踪和磁性分离等领域。

附图说明

下面结合附图及实施例对本发明作进一步描述：

图1为甘露寡糖分子结构示意图；

图2为磁性纳米粒子和量子点连接的原理路线图；

图3为巯基乙酸修饰CdSe/CdS量子点后的透射电镜照片；

图4为磁性荧光双功能纳米复合微球的透射电镜照片；

图5为磁性荧光纳米复合微球和量子点的荧光光谱图；

图6为量子点（a）和磁性荧光双功能纳米复合微球(b)的荧光显微镜照片；

图7为室温下由振动样品磁强计得到的磁化率曲线；其中a为Fe₃O₄；

b为磁性荧光双功能纳米复合物。

具体实施方式

以下结合具体实施例对上述方案做进一步说明。应理解，这些实施例是用于说明本发明而不限于限制本发明的范围。实施例中采用的实施条件可以根据具体厂家的条件做进一步调整，未注明的实施条件通常为常规实验中的条件。

实施例1Fe₃O₄/CdSe/CdS磁性荧光双功能纳米复合微球的制备

1、制备荧光量子点，控制粒径为2-10nm。

本实施例进行硒化镉外包裹硫化镉（CdSe/CdS）的合成及修饰，具体制备方法如下：

通过文献方法（Diao,X.L.;Xia,Y.S.;Zhang,T.L.;Li,Y.;Zhu,C.Q.J.Anal.Bioanal.Chem.2007,388,1191），采用油相合成CdSe量子点。将一定量的CdO加入到油酸和液体石蜡中放入三颈瓶加热搅拌，在150℃时候CdO溶解生成均匀淡黄色的Cd溶液。将Se粉放入液体石蜡中快速搅拌，加热到220℃（在另一只三口烧瓶中），溶液先变成橘红色然后变成红色。将Cd溶液轻轻地注射到Se溶液中，同时快速搅拌，当注射完后温度降到210℃，最后温度维持在220℃。同时称取一定量S粉，NaHB₄固体溶于30ml的无水乙醇加到圆底烧瓶中，通入N₂加热搅拌。大约十分钟后将生成的H₂S气体通入前面生成的CdSe溶液中，继续加热搅拌半个小时后即生成CdSe/CdSQDs。

取一定量上述量子点于小烧杯中,加入30mL正己烷,置于磁力搅拌器上搅拌,至CdSe/CdS全部溶解。将溶液用高速离心机进行离心分离,留取上层清液。取过量的巯基乙酸加入清液中,继续搅拌30min。静置得到红色巯基乙酸稳定的CdSe/CdS沉淀，移去上清，并用正己烷洗涤2～3次。将沉淀风干后溶于乙醇溶液,即得到水溶性的红色透明CdSe/CdS溶液。

2、制备磁性纳米粒子。

本实施例用化学共沉淀法制备Fe₃O₄纳米粒子，具体方法如下：

通过文献方法（Hong,R.-Y.;Wang,J.;Li,J.-H.;Li,H.-Z.Chin.J.ProcessEng.2004,4,472）。分别配制浓度为0.5mol/L的FeCl₃和FeSO₄溶液,按Fe^3＋与Fe^2＋物质的量比约为1.75∶1将两种盐溶液混合均匀倒入三口瓶,边搅拌边通氮气,同时快速加入氨水至黑色胶状物质生成。继续搅拌15min,缓慢滴加氨水,调节pH值为9,继续反应30min后停止。将产品静置一周,在80℃熟化30min后,停止加热,搅拌下冷却加入40mL的10%PEG溶液,待降至室温后,用磁铁收集,并用蒸馏水充分洗涤,真空干燥。

3、甘露低聚糖（MOS）磁性微球的制备

将0.5g已制备好的磁性Fe₃O₄纳米颗粒与50mL一定浓度的甘露低聚糖溶液（甘露低聚糖的分子结构如图1所示）混合均匀后进行超声分散,配成A液；量取4mL的Span-80加入到液体石蜡中,充分搅拌混匀,配成B液;再将A液缓慢滴加到B液中,剧烈搅拌十分钟左右,然后加入一定量的环氧氯丙烷,升温至60℃后，继续搅拌反应60min,用NaOH溶液调节pH至11,再升高至70℃继续反应30min,得到产物,用磁铁收集。用石油醚和蒸馏水反复充分洗涤,于60℃真空干燥,即得甘露低聚糖（MOS）磁性微球。

4、甘露低聚糖磁性微球（MOS/Fe₃O₄）连接上CdSe/CdS量子点，原理如图2所示。

取半小瓶水相量子点，加入100μl的EDC（1-乙基-3-(3-二甲氨丙基)碳二亚胺盐酸盐）反应5min后，再加入100μl的DMAP（4-二甲氨基吡啶）和45μl的在水中超声五分钟后的甘露低聚糖磁性微球胶体。盖上瓶盖，置于数显恒温摇床中反应8h。

实施例2Fe₃O₄/CdTe磁性荧光双功能纳米复合微球的制备

具体步骤大致同实施例1，区别主要在于所用的量子点为巯基乙酸修饰后的CdTe。

（1）巯基乙酸修饰后的CdTe的制备方法如下：

1、Te前体的制备

分别取80mgTe粉、50mgNaBH₄加入到小瓶中，封闭瓶口，用针筒注入1ml蒸馏水。用生胶带密封瓶口，然后在瓶塞上插入一个针头使反应产生的H₂排出去。将小瓶在0℃反应8小时，可以观察到黑色Te粉消失,上层为无色NaHTe溶液,下层为Na₂B₄O₇白色沉淀。

2、Cd前体的制备

取0.2854g(1.25×10^-3mol)CdCl₂·2.5H₂O溶于100ml蒸馏水加入三口烧瓶中，快速搅拌下加入219μl巯基乙酸(TGA)。混合均匀后用1mol/LNaOH调节调节溶液PH值至8-11。用N₂将溶液在密闭体系中脱氧30min。

3、CdTe量子点的制备

在适当的搅拌速度下，向溶液中加入新制备的无氧NaHTe溶液，将反应液加热到96℃,冷凝回流。各反应物的摩尔比为Cd²⁺﹕NaHTe﹕TGA=1﹕2.4﹕0.5。反应120min后停止加热。将得到的产品冷却，然后加入无水乙醇使量子点絮凝出来，过滤，将固体溶于水即得到纯净的CdTeQDs。

取一定量上述量子点于小烧杯中,加入30mL正己烷,置于磁力搅拌器上搅拌,至CdTeQDs全部溶解。将溶液用高速离心机进行离心分离,留取上层清液。取过量的巯基乙酸加入清液中,继续搅拌30min。静置得到巯基乙酸稳定的CdTe沉淀,移去上清,并用正己烷洗涤2～3次。将沉淀风干后溶于乙醇溶液,即得到水溶性的透明CdTe溶液

（2）甘露低聚糖磁性微球（MOS/Fe₃O₄）连接上CdTe量子点，原理如图2所示。

取半小瓶水相量子点，加入100μl的EDC（1-乙基-3-(3-二甲氨丙基)碳二亚胺盐酸盐）反应5min后，再加入100μl的DMAP（4-二甲氨基吡啶）和45μl的在水中超声五分钟后的甘露低聚糖磁性微球胶体。盖上瓶盖，置于数显恒温摇床中反应8h。

实施例3Fe₃O₄/CdSe/CdS磁性荧光双功能纳米复合微球的性能研究

本实施例以实施例1得到的Fe₃O₄/CdSe/CdS磁性荧光双功能纳米复合微球为例研究获得的纳米复合微球的一些性能。经透射电镜、荧光光谱分析、荧光量子产率计算、磁性能测定研究了荧光磁性双功能微球的发光性能与磁性能等。

图3所示为巯基乙酸修饰CdSe/CdS量子点后的透射电镜照片，图4所示为Fe₃O₄/CdSe/CdS磁性荧光双功能纳米复合微球的透射电镜照片。

用TEM对CdSe/CdSQDs和磁性荧光双功能纳米复合微球的表观形貌以及颗粒大小进行分析。由图3可见，CdSe/CdSQDs在水中的分散性较好，形状近似为球形且平均尺寸在3nm左右。图4为磁性荧光双功能纳米复合微球的TEM图像，可以观察到在树状分子修饰后的Fe₃O₄表面均匀的连接了一层CdSe/CdSQDs，其平均粒径依次为20-30nm左右。

图5为CdSe/CdSQDs和磁性荧光双功能纳米复合微球的荧光光谱。量子点与磁性粒子复合前后的荧光发射光谱均呈对称分布且半峰宽较窄，当激发波长为400nm时，CdSe/CdSQDs溶液的发射峰在600nm处，而与磁性粒子连接后，其溶液的发射峰都发生了约25nm红移。图6为量子点（a）和磁性荧光双功能纳米复合微球(b)的荧光显微镜照片。

用振动样品磁强计（VSM）测定了产品的磁性能。室温下Fe₃O₄和磁性荧光双功能纳米复合微球的磁化曲线如图7所示。由曲线可以看出，样品无剩磁和矫顽力，展现出了典型的超顺磁性。Fe₃O₄纳米颗粒的饱和磁化强度为48.07emu/g，而磁性荧光双功能纳米复合微球的饱和磁化强度分别为30.40emu/g。其磁性能减弱，这是Fe₃O₄表面无磁性的功能性基团本身对样品的磁性也有一定的影响。

上述实例只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人是能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所做的等效变换或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种磁性荧光双功能纳米复合微球，其特征在于所述微球具有以下组成：

磁性纳米粒子，其表面包埋甘露寡糖分子MOS，并外露甘露寡糖分子末端的功能性羟基；

荧光量子点，其粒径在2～10nm，表面修饰带有羧基基团；

所述磁性纳米粒子与荧光量子点通过甘露寡糖分子末端的功能性羟基与荧光量子点的羧基基团通过化学偶联连接；

所述荧光量子点选自纳米级的CdTe、CdSe、InP、InAs、CdSe/ZnS、CdSe/ZnSe、CdTe/ZnS、CdHgTe/ZnS、HgTe/HgCdS量子点的一种或两种以上的任意组合；

所述磁性纳米粒子选γ-Fe₂O₃、MeFe₂O₃、NiCoFe、FeCo和NiFe的纳米磁性粒子，其中Me为Co、Mn、Ni；

所述微球通过如下步骤制备得到：

(1)制备表面修饰带有羧基基团的荧光量子点，粒径为2-10nm；

(2)制备磁性纳米粒子；

(3)磁性纳米粒子表面包埋甘露寡糖分子MOS，得到表面带有功能性羟基的甘露寡糖磁性微粒；

(4)使表面带有功能性羟基的甘露寡糖磁性微粒连接上带羧基的荧光量子点，得到磁性荧光双功能纳米复合微球。

2.根据权利要求1所述的磁性荧光双功能纳米复合微球，其特征在于所述磁性荧光双功能纳米复合微球的粒径在20～100nm范围内。

3.根据权利要求1或2所述的磁性荧光双功能纳米复合微球，其特征在于所述微球为规则或不规则的球形、方形以及椭圆形的颗粒。

4.根据权利要求1所述的磁性荧光双功能纳米复合微球，其特征在于所述磁性纳米粒子为超顺磁、顺磁或铁磁性的金属、金属合金或金属氧化物纳米粒子。

5.一种权利要求1～4任意一项所述磁性荧光双功能纳米复合微球的制备方法，其特征在于所述方法包括以下步骤：

(1)制备表面修饰带有羧基基团的荧光量子点，粒径为2-10nm；

(2)制备磁性纳米粒子；

(3)磁性纳米粒子表面包埋甘露寡糖分子MOS，得到表面带有功能性羟基的甘露寡糖磁性微粒；

(4)使表面带有功能性羟基的甘露寡糖磁性微粒连接上带羧基的荧光量子点，得到磁性荧光双功能纳米复合微球。

6.根据权利要求5的方法，其特征在于所述方法步骤(3)中磁性纳米粒子表面包埋甘露寡糖分子MOS是在油包水体系中合成的，所用包覆体系为W/O相。

7.根据权利要求5的方法，其特征在于所述方法步骤(3)中磁性纳米粒子表面包埋甘露寡糖分子MOS按照以下步骤进行：

(1)将磁性纳米粒子与甘露寡糖分子MOS溶液混合均匀后形成作为水相的A液；

(2)以液体石蜡为油相，以Span-80为乳化剂，将Span-80溶于液体石蜡中，作为B液；

(3)将A液缓慢滴加到B液中，搅拌形成初乳；然后加入环氧氯丙烷,并升温后继续搅拌,调节pH至碱性获得表面包埋甘露寡糖分子MOS的磁性纳米粒子。

8.根据权利要求5的方法，其特征在于表面修饰带有羧基基团的荧光量子点为水溶性的，与表面修饰后的磁性纳米粒子连接所用体系为水相。