CN103565797B - 用于抑制运动神经元自体吞噬的医药组合物及其应用 - Google Patents

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Abstract

一种抑制运动神经元自体吞噬(autophagy)的医药组合物，其包含一有效量的活性成分，该活性成分选用以下群组：式(I)化合物、其医药可接受的盐、其医药可接受的酯、及前述的组合，其中，A为视需要具一个或多个不饱和键的C1-C5烃基，其视需要经一个或多个选用以下群组的取代基取代：-OH、＝O、及C1-C3烃基；X为H、-OH、Y为O或S，且可视需要与A键结形成一五元环；以及R1为H、或经取代或未经取代的C1-C20烃基，该烃基的一个或多个-CH2-视需要经-NH-或-O-置换。

Description

用于抑制运动神经元自体吞噬的医药组合物及其应用
技术领域
本发明关于一种用于抑制运动神经元自体吞噬(autophagy)的医药组合物及其应用，尤其关于用于延缓运动神经元退化性疾病的发病及/或治疗运动神经退化性疾病的医药组合物及其应用。
背景技术
神经元(neuron)也可称为神经细胞，是生物体神经系统的结构与功能单位之一，可借助化学信号及电信号与其它细胞进行信息传递，具有各种不同的形状和尺寸，直径可为约4微米至约100微米，结构上大致可分为细胞本体、树突(dendrite)、及轴突(axon)三部分，其中树突可将讯息带入细胞本体，而轴突则可将讯息自细胞本体传出。
神经元依其讯息传递方向及功能可区分为三种：感觉神经元(sensoryneuron)、运动神经元(motor neuron)、及连络神经元(interneuron)，其中运动神经元是控制生物体体活动的神经细胞。一般而言，存在脑中的运动神经元称为上运动神经元，而存在脑干及脊髓中的运动神经元称为下运动神经元。当运动神经元退化造成功能异常时，可能会引起肌萎缩侧索硬化症(amyotrophic lateral sclerosis，ALS)、重症肌无力、肌无力、肌肉萎缩、肌营养不良(muscular dystrophy)、多发性硬化症(multiplesclerosis)、多发性系统退化症(multiple system atrophy)、脊椎性肌肉萎缩症(spinal muscular dystrophy)等运动神经元退化性疾病。患有上述运动神经元退化性疾病的患者的身体会逐渐出现肌肉无力、萎缩、颤抖、痉挛、僵硬等症状，并可能导致发音困难、吞咽困难、呼吸衰竭等。
目前尚无法确定造成运动神经元退化性疾病的真正原因。研究指出，可能的病因包括超氧阴离子堆积而刺激自体吞噬作用过度表现所造成神经元死亡、自体免疫异常、神经元过度兴奋(例如，麸氨酸过度累积)或过度氧化、及遗传等。目前临床上用于治疗运动神经元退化性疾病的药物包括麸氨酸拮抗剂如锐力得(Riluzole)、抗氧化剂如维他命E、神经滋养因子(neurotrophic factor)及免疫调节剂(immune modulators)等，然前述药物对于疾病的治疗多无明显益处，或仅能有限地延长患者生命达3至6个月。因此，目前临床上仍需要一种可延缓运动神经元退化性疾病的发病及/或治疗运动神经退化性疾病的药物。
本发明的发明人研究后发现，本发明式(I)化合物可用于抑制运动神经元自体吞噬，减缓运动神经元死亡，故可用于延缓运动神经元退化性疾病的发病及/或治疗运动神经退化性疾病。
发明内容
本发明的一目的，在于提供一种抑制运动神经元自体吞噬(autophagy)的医药组合物，其包含一有效量的活性成分，该活性成分选用以下群组：式(I)化合物、其医药可接受的盐、其医药可接受的酯、及前述的组合，
其中，A视需要具一个或多个不饱和键的C1-C5烃基，其视需要经一个或多个选用下列群组的取代基取代：-OH、＝O、及C 1-C3烃基；
X为H、-OH、
Y为O或S，且可视需要与A键结形成一五元环；以及
R1为H，或经取代或未经取代的C1-C20烃基，该烃基的一个或多个-CH2-视需要经-NH-或-O-置换。
本发明的又一目的，在于提供一种使用式(I)化合物或其医药可接受的盐或酯于制造抑制运动神经元自体吞噬的药剂的用途。
本发明的再一目的，在于提供一种于一个体中抑制运动神经元自体吞噬的方法，其包含对该个体施用一有效量的式(I)化合物及其医药可接受的盐和酯。
本发明的详细技术及较佳实施态样，将描述于以下内容，以供本发明所属领域具通常知识者据以明了本发明的特征。
附图说明
图1A为亚丁基苯酚与人类肝脏微粒体混合反应的样本进行液相层析串联质谱仪分析后的质图谱；
图1B为亚丁基苯酚于生物体中进行第一阶代谢的代谢图谱；
图1C为亚丁基苯酚于生物体中进行第二阶代谢的代谢图谱；
图2为亚丁基苯酚于延长SOD1 G93A转殖小鼠的存活率的存活曲线图；
图3为锐力得延长SOD1 G93A转殖小鼠的存活率的存活曲线图；
图4为亚丁基苯酚影响SOD1 G93A转殖小鼠的BBB评分的存活曲线图；
图5A为亚丁基苯酚延缓或避免SOD1 G93A转殖小鼠脊髓运动神经元死亡的化学组织染色图；
图5B为亚丁基苯酚延缓或避免SOD1 G93A转殖小鼠脊髓运动神经元死亡的长条图；
图6为亚丁基苯酚降低SOD1 G93A转殖小鼠的腰椎组织内的LC3-II蛋白质表现量的西方墨点照片；
图7为亚丁基苯酚抑制NSC细胞的自体吞噬作用的西方墨点分析照片。
具体实施方式
以下将具体地描述根据本发明的部分具体实施态样；但，在不背离本发明精神下，本发明尚可以多种不同形式的态样来实践，不应将本发明保护范围解释为限于说明书所陈述者。此外，除非文中有另外说明，于本申请文件中所使用的“一”、“该”及类似用语应理解为包含单数及复数形式；所谓“有效量”或“治疗有效量”，是指投予至个体时，可有效至少部分改善怀疑个体的病情的化合物数量；所谓“个体”是指哺乳动物，哺乳动物可为人类或非人动物。
细胞自体吞噬(autophagy)是细胞借助细胞内的溶酶体(lysosome)将自身的胞器或其他物质进行分解，从而调控细胞生长、细胞恒定(homeostasis)、及细胞死亡的重要机转。然如前述，已知运动神经元过度的自体吞噬作用，是造成运动神经元退化性疾病的病因之一，因此，若能抑制运动神经元自体吞噬作用，则能减缓运动神经元死亡，提供治疗运动神经元退化性疾病的功效。
本发明发明人发现，如下化合物(1)可有效抑制运动神经元自体吞噬，故可用于延缓运动神经元退化性疾病的发病及/或治疗运动神经退化性疾病：
化合物(1)即亚丁基苯酚(butylidenephthalide；BP)，在自然状态下同时包含(Z)-亚丁基苯酚((Z)-butylidenephthalide，顺式亚丁基苯酚)及(E)-亚丁基苯酚((E)-butylidenephthalide，反式亚丁基苯酚)二种异构物形式。
经确认，亚丁基苯酚在生物体内经肝脏进行第一阶(phase I)代谢或第二阶(phase II)代谢后，会产生如下化合物(2)至(14)之一或多者： 以及其中，化合物(10)中的Cys指半胱氨酸(cysteine)；化合物(11)中的Glutathione指麸胺基硫。于不受理论限制下，咸信亚丁基苯酚于生物体内抑制运动神经元自体吞噬的功效，来自上述化合物(2)至(14)的化学结构中的共同部分。
因此，本发明提供一种抑制运动神经元自体吞噬(autophagy)的医药组合物，其包含一有效量的活性成分，该活性成分选用以下群组：式(I)化合物、其医药可接受的盐、其医药可接受的酯、及前述的组合，
其中，A视需要具一个或多个不饱和键的C1-C5烃基，其视需要经一或多个选用下列群组的取代基取代：-OH、＝O、及C1-C3烃基；X为H、-OH、Y为O或S，且可视需要与A键结形成一五元环；以及R1为H，或经取代或未经取代的C1-C20烃基，该烃基的一个或多个-CH2-视需要经-NH-或-O-置换。所述运动神经元，包含上运动神经元(如脑运动神经元)及下运动神经元(如脑干运动神经元及脊髓运动神经元)。
较佳地，于式(I)化合物中，A为C1-C5烷基或烯基，其视需要经一或多个选用下列群组的取代基取代：-OH、＝O、及C1-C3烷基；R1为H，或经取代或未经取代的C1-C10烃基，该烃基的一个或多个-CH2-视需要经-NH-或-O-置换。更佳地，A为
R1为H、
于本发明医药组合物的一实施态样中，该式(I)化合物选用由上述化合物(1)至(14)所组成的群组。较佳地，该式(I)化合物为化合物(1)(即，亚丁基苯酚)，尤以下式化合物为佳：
(即，(Z)-亚丁基苯酚)。
由于本发明医药组合物具有抑制运动神经元自体吞噬的功效，可减缓运动神经元死亡，故可用于延缓运动神经元退化性疾病的发病及/或治疗运动神经退化性疾病。其中，所述运动神经退化性疾病，包含任何与运动神经元自体吞噬相关的疾病，例如包含但不限于肌萎缩侧索硬化症、重症肌无力、肌无力、肌肉萎缩、肌营养不良、多发性硬化症、多发性系统退化症、以及脊椎性肌肉萎缩症等。
于本发明医药组合物的一具体实施态样中，其用于治疗肌萎缩侧索硬化症。肌萎缩侧索硬化症又称渐冻人症，患者会出现渐进性的肌肉萎缩，通常在发病后2至5年会造成患者四肢瘫痪、吞咽困难、甚至呼吸衰竭。研究指出，肌萎缩侧索硬化症可能与神经元过度兴奋(例如，麸氨酸过度累积)有关，因此目前临床上主要使用麸氨酸拮抗剂，锐力得(Riluzole)，来治疗肌萎缩侧索硬化症，以延长病患的存活率。相较于锐力得，本发明的医药组合物可通过抑制运动神经元自体吞噬，而更有效地延缓运动神经元退化性疾病的发病及/或治疗运动神经退化性疾病，提高肌萎缩侧索硬化症患者的存活率。
本发明医药组合物可呈任何形式，并以任何合宜的方式施用。举例言之，但不以此为限，该医药组合物可以口服、皮下、鼻腔或静脉内等投药方式施用至个体上。其中，由于口服投药剂型便于病人按时自行服用，故本发明组合物较佳呈口服剂型。视使用形式及用途而定，可于本发明医药组合物中包含一医药上可接受的载剂。
以制备适于口服投药的剂型为例，可于本发明医药组合物中含有不会不利影响所含活性成分的活性的医药可接受载剂，例如：溶剂、油性溶剂、稀释剂、安定剂、吸收延迟剂、崩散剂、乳化剂、抗氧化剂、黏合剂、润滑剂、吸湿剂等。可利用任何合宜的方法，将该组合物制成适于口服投药的剂型，例如：锭剂、胶囊剂、颗粒剂、散剂、流浸膏剂、溶液剂、糖浆剂、悬液剂、乳剂、及酊剂等等。
至于适于皮下或静脉内注射的剂型，则可于本发明医药组合物中含有一或多种例如等张溶液、盐类缓冲液(如磷酸盐缓冲液或柠檬酸盐缓冲液)、增溶剂、乳化剂、以及其他载剂等成分，以制成如静脉输注液、乳剂静脉输注液、干粉注射剂、悬液注射剂、或干粉悬液注射剂等。
本发明医药组合物可视需要另含有调味剂、调色剂、着色剂等添加剂，以提高所得药剂服用时的口适感及视觉感受；另可添加合宜用量的保存剂、防腐剂、抗菌剂、抗真菌剂等，以改善所得药剂的储存性。此外，视需要地，可于本发明医药组合物并含一或多种其他活性成分，例如抗氧化剂(如维他命E)、神经滋养因子(neurotrophic factor)、免疫调节剂(immune modulators)等，以进一步加强本发明医药组合物的功效或增加制剂配方的运用灵活性与调配度，只要该其他活性成分对式(I)化合物或其盐或酯的效益没有不利的影响即可。
可以一日一次、一日多次、或数日一次等不同投药频率施用本发明医药组合物，端视投予个体的需求而异。举例言之，当使用于人体以抑制运动神经元自体吞噬时，组合物的用量，以式(I)化合物计，为每天约30毫克/公斤体重至约2,000毫克/公斤体重，较佳为每天约100毫克/公斤体重至约1,000毫克/公斤体重，其中，该单位『毫克/公斤体重』指每公斤体重个体所须的投药量。但，对于急性患者而言，其用量可视实际需要而酌增，例如增加至数倍或数十倍。于使用本发明医药组合物以治疗肌萎缩侧索硬化症的一实施态样中，于组合物中含有(Z)-亚丁基苯酚作为活性成分，且组合物的用量以(Z)-亚丁基苯酚计，为约500毫克/公斤体重。
本发明也提供一种使用式(I)化合物及其医药可接受的盐和酯于制造药剂的用途，其中该药剂用于抑制运动神经元自体吞噬。该药剂可经由抑制运动神经元自体吞噬，而延缓运动神经元退化性疾病的发病及/或治疗运动神经退化性疾病，例如，用于治疗以下疾病或延缓其发病：侧索硬化症、重症肌无力、肌无力、肌肉萎缩、肌营养不良、多发性硬化症、多发性系统退化症、脊椎性肌肉萎缩症、及前述的组合。该药剂的剂型、用量以及视需要含有的其他成分，均如上述关于医药组合物的说明。
本发明另提供一种于一个体中抑制运动神经元自体吞噬的方法，其包含对该个体施用一有效量的活性成分，该活性成分选用以下群组：式(I)化合物、其医药可接受的盐、其医药可接受的酯、及前述的组合。其中，该活性成分的施用型态与剂量，均如上述关于医药组合物的说明。
故此以下列具体实施态样以进一步例示说明本发明。其中所述各实施态样仅提供作为说明，而非用以限制本发明的范畴。
[实施例1]亚丁基苯酚的代谢产物鉴定
已知药物在生物体的肝脏内的药物代谢途径主要可区分为第一阶(phase I)代谢及第二阶(phase II)代谢二类，第一阶代谢主要为药物的氧化还原反应或水解反应，第二阶代谢则主要由细胞色素P450单加氧酶(cytochrome P450(CYP 450)monoxygenase)系统进行代谢反应。本实施例分别借助在体外(in vitro)将亚丁基苯酚与肝脏微粒体(microsomes)或经冷冻保存的肝脏细胞(cryopreserved hepatocytes)混合反应，以模拟亚丁基苯酚于生物体肝脏内进行第一阶代谢及第二阶代谢，并以液相层析串联质谱仪(LC-MS/MS)分析反应后溶液中的产物，以确认代谢产物及代谢图谱(profile)。实验步骤如下：
(1)第一阶代谢试验
分别将2微莫耳浓度的亚丁基苯酚与含有人类、大鼠、或狗的肝脏微粒体(0.5毫克/毫升)的磷酸钾缓冲液(100毫莫耳浓度，pH 7.4)混合，于37℃下反应10分钟后，添加经预热的辅因子(2毫莫耳浓度NADPH及3毫莫耳浓度MgCl2)，于37℃下反应60分钟，接着添加三倍体积的含有0.1％甲酸的乙腈以终止反应。将样本以13,000转/分钟的转速离心5分钟，取上清液进行液相层析串联质谱仪分析，以分析代谢物。
(2)第二阶代谢试验
分别将含有5x105个人类、大鼠、或狗的解冻后的肝脏细胞的威廉姆斯E培养液(William’s E medium)添加至12孔培养盘中培养6小时，添加0.5毫升亚丁基苯酚(50微莫耳浓度)至培养盘中，并于37℃、95％相对湿度、及5％CO2下培养6小时后，添加2毫升100％乙腈以终止反应，收集样本并充分混合，于4℃下以4500xg离心10分钟后，取收集上清液进行干燥，接着进行液相层析串联质谱仪分析，以分析代谢物。
(3)液相层析串联质谱仪分析
将样本溶于乙腈/0.1％甲酸，于4℃下以4500xg离心10分钟并将样本取至自动取样瓶(autosampler vials，Agilent公司，美国)。液相层析质谱仪系统包含具有1200SL HPLC系统(Agilent公司，美国)的ABSCIEX5500Q TRAPTM系统、高效液相层析仪(HPLC)管柱3.5微莫耳浓度，4.6x75毫米)、及自动取样机(Agilent公司，美国)，以正离子电洒模式，于5.5千伏特、550℃下以氮气作为辅助气体进行质谱分析。使用双溶剂(溶剂A：0.1％甲酸；溶剂B：含0.1％甲酸的甲醇)系统以0.8毫升/分钟定速进行HPLC。HPLC梯度系统设定为0至2分钟：10％溶剂B；2至7分钟：10％溶剂B至95％溶剂B；7至12分钟：95％溶剂B；12至14分钟：95％溶剂B至10％溶剂B；14至20分钟：10％溶剂B；实验全长为20分钟。将20微升等分试样(aliquots)注入液相层析串联质谱仪系统进行分析。接着，以LightSightTM软体分析液相层析串联质谱图的主要信号峰及各个信号峰相较于亚丁基苯酚的质谱图所显示的质量偏移(mass shift)，以分析样品中所含代谢物，并鉴定亚丁基苯酚于生物体中的生物转化路径及其代谢图谱，结果如表1、表2、图1A、图1B及图1C所示。
图1A所示为亚丁基苯酚(质谱仪分析的m/z为189.1)与人类肝脏微粒体混合反应后，样本进行质谱仪分析后的片段产物图谱，显示m/z为171.2amu、153.1amu、143.0amu、128.0amu、及115.0amu等主要信号峰。表1
表1所示为亚丁基苯酚与肝脏微粒体混合反应(即，第一阶代谢)后的代谢产物的种类与利用软体分析所得的生物转化路径，结果显示亚丁基苯酚在与大鼠、狗、及人类的肝脏微粒体混合反应后，皆可反应形成本发明化合物(2)至(9)，显示亚丁基苯酚在不同生物体中经肝脏代谢后皆会产生相似的代谢物。图1B所示为亚丁基苯酚与肝脏微粒体混合反应后所形成的代谢图谱及化合物(2)至(9)的化学结构。表2
表2所示为亚丁基苯酚与冷冻保存的肝脏细胞混合反应(即，第二阶代谢)后之代谢产物的种类与利用软体分析所得的生物转化路径，结果显示，亚丁基苯酚在与大鼠、狗、及人类的冷冻保存的肝脏细胞混合反应后，可反应形成本发明化合物(11)至(14)，显示亚丁基苯酚在不同生物体中经肝脏代谢后会产生相似的代谢物。图1C所示为亚丁基苯酚与冷冻保存的肝脏细胞混合反应后，所形成的代谢图谱及化合物(11)至(14)的化学结构。
[实施例2]活体内试验：亚丁基苯酚延长基因转殖小鼠的存活率
已知在肌萎缩侧索硬化症的病患中，约有20％会发生铜/锌超氧化物歧化酶(SOD1)的基因突变，其中以G93A突变位点最多，利用基因转殖技术转入经突变的人类SOD1 G93A的转殖小鼠(于此称『SOD1 G93A转殖小鼠』)，因具有与人相似的发病特点而成临床上用于研究肌萎缩侧索硬化症的动物模型，此基因转殖小鼠会于出生后约第90±5天开始发病，于出生后约第125±5天死亡。
本实施例即采用前述SOD1 G93A转殖小鼠作为研究对象，进行活体内(in vivo)试验：在SOD1 G93A转殖小鼠出生后第60天开始定时口服投予亚丁基苯酚(购自景明化工)，每天1次，每次剂量500毫克/公斤体重，其中，该单位「毫克/公斤体重」是指每公斤体重所须的投药量。于第30天给药后开始观察，观察亚丁基苯酚是否可以延长SOD1 G93A转殖小鼠的存活天数(即，大于125天)，结果显示于图2及表3。
表3
如图2及表3所示，于出生后第60天开始每天口服亚丁基苯酚的实验组SOD1 G93A转殖小鼠平均约存活149±4.39天，相较于未投予亚丁基苯酚的控制组(存活约127±6.11天)的寿命延长了约22±2天。根据参考文献指出，如图3所示(图片得自于Combined riluzole and sodiumphenylbutyrate therapy in transgenic amyotrophic lateral sclero sis mice.Amyotrophic Lateral Sclerosis.2009；该文献全文并于此处以供参考)，以传统用于治疗肌萎缩侧索硬化症的药物，锐力得(Riluzole)，治疗SOD1 G93A转殖小鼠，小鼠可存活至约140天。前述结果显示，相较于传统药物锐力得，本发明医药组合物可更有效地延长肌萎缩侧索硬化症的病患的存活率。
[实施例3]活体内试验：亚丁基苯酚延缓肌萎缩侧索硬化症的发病
在SOD 1G93A转殖小鼠出生后第60天开始定时口服投予亚丁基苯酚，每天1次，每次剂量500毫克/公斤体重。于投药后第30天开始利用神经行为学评分法(BBB评分；Basso，Beattie，and Bresnahan(BBB)Locomotor Rating Scale)观察小鼠后肢，其中正常小鼠后肢评分为21分；发病的SOD1 G93A转殖小鼠的后肢评分会从21分开始往下降至0分，评分愈低显示小鼠运动功能愈异常，以此后肢评分表来记录投药的疗效。
如图4所示，在出生后第60天开始每天口服投予亚丁基苯酚的实验组SOD1 G93A转殖小鼠中，小鼠的后肢评分大约在第125天至第135天之间开始缓慢下降(由21分降至16分)，在约第135天后，开始急遽下降(由16分降至0分)；而在未投予亚丁基苯酚的控制组小鼠中，小鼠的后肢评分大约在出生第110天后，即开始急遽下降(由19分降至0分)。前述结果显示，亚丁基苯酚确实可有效延缓肌萎缩侧索硬化症的发病。
[实施例4]组织化学染色试验：亚丁基苯酚可延缓或避免脊髓运动神经元死亡
在SOD1 G93A转殖小鼠出生后第60天开始定时口服投予亚丁基苯酚，每天1次，每次剂量500毫克/公斤体重。于实验组的SOD1 G93A转殖小鼠濒死前，牺牲小鼠取其脊髓组织，进行组织化学染色(hematoxylin and eosin stain)，以显微镜观察、计算脊髓运动神经元的数目，并与未投药的控制组进行比较。
如图5A、图5B、及表4所示，在出生后第60天开始每天口服投予亚丁基苯酚的实验组SOD1 G93A转殖小鼠的脊髓运动神经元数目，明显多于控制组的小鼠(实验组24颗，控制组3颗)。前述结果显示，亚丁基苯酚可有效延缓或避免SOD1 G93A转殖小鼠脊髓运动神经元的死亡，延长SOD1 G93A转殖小鼠的存活率。
表4
  运动神经元数目
  控制组   3±3.1
  实验组(n-BP，500毫克/公斤体重)   24±4.2
[实施例5]西方墨点法：亚丁基苯酚可抑制自体吞噬作用
在SOD1 G93A转殖小鼠出生后第60天开始定时口服投予亚丁基苯酚，每天1次，每次剂量500毫克/公斤体重。研究指出，SOD1 G93A转殖小鼠在发病末期会因自体吞噬作用明显增加而造成脊髓神经元凋零(可参见In vivo optical imaging of motor neuron autophagy in a mousemodel of amyotrophic lateral sclerosis.Autophagy 7：9，1-8；September 2011，该文献全文并于此处以供参考)。因此，于本实施例中，实验组的SOD1G93A转殖小鼠濒死前，牺牲小鼠取其脊椎组织并萃取蛋白质，利用西方墨点法，分析蛋白质内的自体吞噬作用的生物标记(biomarker)：LC3-II，以测定小鼠的腰椎运动神经元是否发生自体吞噬，其中实验以β-肌动蛋白作为内控制组。
如图6所示，相较于未投药的控制组小鼠，实验组的颈椎、胸椎及腰椎组织内的LC3-II蛋白质及磷酸化LC3-II蛋白质(pLC3-II)表现量则明显降低。前述结果显示，亚丁基苯酚于生物体内可专一性地抑制运动神经元的自体吞噬，且可经由抑制运动神经元自体吞噬作用，而延缓肌萎缩侧索硬化症的发病，以及延长小鼠存活天数，并达到治疗肌萎缩侧索硬化症的功效。
[实施例6]细胞实验：亚丁基苯酚可抑制自体吞噬作用
利用可分化成小鼠运动神经元细胞的NSC(neural stem cell)神经干细胞进行细胞实验，以模拟小鼠的运动神经元细胞。
将NSC细胞培养于一10公分直径的培养皿中，待细胞增生至约六分满后，以磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗细胞，接着加入不同浓度的亚丁基苯酚处理12小时后，再以过氧化氢(2500微莫耳浓度毫升)处理12小时，以刺激细胞进行自体吞噬作用。接着，收集细胞并萃取蛋白质，再利用硫酸十二酯钠-聚丙烯胶体电泳法(SDS-PAGE)及西方墨点法分析NSC细胞中的LC3-II蛋白质的表现程度。西方墨点实验结果于图7。
如图7所示，当亚丁基苯酚浓度为10微克/毫升时，亚丁基苯酚可经由抑制自体吞噬作用(降低LC3-II蛋白质表现量)而保护NSC细胞，避免过氧化氢对细胞造成的伤害。
上述实施例仅用以例示说明本发明的原理及功效，而非用于限制本发明。任何熟于此项技艺的人士均可在不违背本发明的技术原理及精神的情况下，对上述实施例进行修改及变化，皆应当属于本发明要求保护的范围。

Claims (7)

1.一种使用亚丁基苯酚（butylidenephthalide，BP）于制造抑制运动神经元自体吞噬（autophagy）的药剂的用途。
2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，该亚丁基苯酚（BP）为（Z）-亚丁基苯酚（（Z）-butylidenephthalide）。
3.如权利要求1所述的用途，其特征在于，该药剂是用于抑制脊髓运动神经元的自体吞噬。
4.如权利要求1所述的用途，其特征在于，该药剂是用于延缓运动神经元退化性疾病的发病及/或治疗运动神经退化性疾病。
5.如权利要求1所述的用途，其特征在于，该药剂是用于治疗肌萎缩侧索硬化症及/或延缓其发病。
6.如权利要求1所述的用途，其特征在于，该药剂的用量，以亚丁基苯酚（BP）计，为每天30毫克/公斤体重至2,000毫克/公斤体重。
7.如权利要求1所述的用途，其特征在于，该药剂的用量，以亚丁基苯酚（BP）计，为每天100毫克/公斤体重至1,000毫克/公斤体重。
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