CN103562380A - 防除对植物的病原病毒感染的重组alsv - Google Patents

Abstract

本发明提供一种重组苹果潜隐球形病毒(ALSV)，其是保有1种或2种以上的植物病原病毒的基因组RNA或其cDNA的部分片段的重组苹果潜隐球形病毒(ALSV)，可以将植物病原性病毒作为对象而制作出分别对各种植物病原性病毒发挥出干扰效果的重组病毒，另外，本发明提供一种在增殖的过程中不存在强毒化危险性的、新的防除植物病原病毒感染的方法。

Description

防除对植物的病原病毒感染的重组ALSV

技术领域

本发明涉及作为防除病原类对农作物等植物的感染的防除剂的成分等而言有用的重组ALSV。

背景技术

1.苹果潜隐球形病毒

苹果潜隐球形病毒(Apple latent spherical virus：ALSV)是由2段一条链RNA基因组(RNA1、RNA2)和3种衣壳蛋白(Vp25、Vp20、Vp24)构成的直径为25nm的球形病毒(非专利文献1)。ALSV虽然是从苹果分离到的病毒，但它是一种具有比较广的宿主范围的病毒且对昆诺阿藜(Chenopodium quinoa、キノア)表现出退绿症状，以模式植物拟南芥属(シロイヌナズナ)为代表，对烟草属植物(烟草(タバコ)、烟草本塞姆氏(ベンサミアナタバコ)、金钟柏(オキシデンタリス)、地黄(グルチノ一ザ))、番茄、葫芦科植物(黄瓜、甜瓜、西葫芦、丝瓜)、豆科植物(大豆、小豆、豌豆)、蔷薇科果树植物(苹果、西洋梨、日本梨、桃)等许多种植物都能进行无病征感染。本发明人等已经构建了ALSV的感染性cDNA克隆，借助在RNA2的细胞间运动蛋白(movement protein：MP)和Vp25之间附加有外源基因导入位点的ALSV载体而在草本植物、苹果中成功地使外源基因进行表达(例如非专利文献2)。另外，可知如果将整合有GFP(green fluorescent protein)的ALSV载体接种在表达GFP的烟草中，则可诱导烟草中进行表达的GFP的沉默，接种叶中GFP荧光圆状地消失，很快GFP荧光在所有上位叶中都消失(例如非专利文献3)。进而，可知通过整合有作为植物的内源基因的八氢番茄红素去饱和酶(phytoene desaturase，PDS)基因或sulfer(SU)基因的一部分的ALSV感染，可在烟草、拟南芥、大豆、黄瓜等植物中诱导病毒诱导的基因沉默(virus induced gene silencing：VIGS)，且ALSV在感染植物中诱导全身的VIGS(例如非专利文献4)。

2.RNA沉默

RNA沉默是于1990年首先在植物中报告的普遍保存于真核生物中的序列特异的基因钝化机构(非专利文献5)，主要是由双链RNA(dsRNA)所诱导的。一旦RNA病毒进行感染，则通过依赖于RNA的RNA聚合酶(RdRp)的作用而合成dsRNA，然后dsRNA被双链RNA分解酶Dicer(在植物的情况下为Dicer-like：DCL)分解为21～25个碱基(nucleotide：nt)的小的干扰RNA(siRNA)(非专利文献6、7)。siRNA进入RNA-诱导的沉默复合物(RISC)，与siRNA互补的碱基序列的RNA被RISC分解。另外，siRNA向邻接的细胞移动，通过RdRp的作用，与siRNA互补的RNA转换为dsRNA，沉默扩大到全身。在不具备免疫机构的植物中，RNA沉默作为对病毒的防御机构而具有重要的作用(非专利文献8)。1995年报告了通过整合有植物内源性基因的TMV感染而可诱导该基因的RNA沉默(非专利文献9)，此后VIGS作为反向遗传学的手法被广泛利用。

3.植物的病原病毒与其对策

近年来，由于小西葫芦黄花叶病毒(Zucchini yellow mosaic virus：ZYMV)的感染所导致的西葫芦科作物的受害已成为世界性问题，在日本国内黄瓜的受害程度也正在加重。ZYMV属于马铃薯Y病毒(potyvirus)属，是具有大小约9,600nt的单链RNA基因组且长约750nm的带状病毒。已知通过因油虫(アブラムシ)所导致的非持久性传播而进行蔓延，特别是在西葫芦科植物(黄瓜、南瓜、甜瓜、西瓜等)中引起严重的花叶病、叶和果实畸形、植物体萎缩等症状(非专利文献10、11)。

黄瓜花叶病是将ZYMV、Potyvirus属南瓜花叶病毒(Watermelonmosaic virus 2：WMV2)和Cucumovirus属黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaicvirus：CMV)这3种病毒作为病原病毒，通过这些病毒的单独感染和重复感染而发生的(非专利文献11)。CMV是Cucumovirus属的基准株，是具有3段单链RNA基因组(RNA1、RNA2、RNA3)和次基因组RNA(RNA4)的直径为29nm的球状病毒。存在着许多宿主和病原性不同的系统，其中也存在着具有卫星RNA的系统。CMV通过油虫被非持久性传播，其宿主范围非常广，可感染1,000种以上的植物(非专利文献10)。

对于因ZYMV和CMV所致的农作物的受害，除了利用抗性品种和防除油虫等措施外，也实施了利用使用了病原性弱的ZYMV、CMV(弱毒ZYMV、弱毒CMV)的干扰效果而进行的防除(非专利文献12、13)。干扰效果是感染了某种病毒的植物在此后不再感染同种病毒的现象，它的发现早在1929年最初在烟草花叶病毒中进行了报告。对于干扰效果的机制，可认为主要为借助于病毒的衣壳蛋白(coat protein：CP)的干扰效果和借助于RNA的干扰效果这两种干扰效果(非专利文献14、15)。

作为涉及作为对ZYMV和CMV的防除方法的弱毒病毒的发明，专利文献1、2已有报道，在专利文献3中公开了将同一病毒组内的2种以上的弱毒病毒混合而得的混合弱毒型病毒。另外，作为将病毒的卫星RNA整合到该病毒中而形成弱毒病毒的技术，在专利文献4、5中已有报道。进而，作为市售品，在日本销售有作为生物农薬已制剂化的弱毒ZYMV，并已用于黄瓜(非专利文献7、12)。另外，就番茄来说，感染了具有卫星RNA的弱毒CMV的苗已有销售(非专利文献16)。

但是，将将病原病毒基因整合到与病原病毒不同的载体病毒而得的重组病毒用作防除病原病毒感染的方法的技术尚未可知。

专利文献1：日本特开平5-68540号公报

专利文献2：日本特开平10-203901号公报

专利文献3：日本特开2000-264806号公报

专利文献4：日本特开平5-3789号公报

专利文献5：日本特开平11-279013号公报

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发明内容

发明所要解决的课题

如上所述，对于植物的病原病毒的感染，已知有利用弱毒病毒的干扰效果的防除法，但使用弱毒病毒的防除法仅限于能够利用弱毒病毒的一部分病毒，而在难以从自然界中分离弱毒病毒或难以通过变异诱导来制作弱毒病毒的病毒中，是难以应用的技术。另外，对于不同的病毒，不能发挥由弱毒病毒所引起的干扰效果，因此，每种病毒都需要弱毒病毒，但弱毒病毒的制作需要很长时间和很多劳力。

另外，在基于卫星RNA的插入所制作的弱毒病毒情况，亲株病毒为病原性，在植物体内的增殖过程中恢复到强毒病毒的危险性完全不存在。

本发明是鉴于以上所述的状况而完成的发明，其课题在于提供一种新方法，即，理论上将所有的病原性病毒作为对象，能够制作分别对上述各种病原性病毒发挥干扰效果的病毒，而且在增殖过程中没有强毒化的危险性的新方法。

用于解决课题的手段

作为用于解决上述课题的本发明，提供一种重组苹果潜隐球形病毒(ALSV)，其保有1种或2种以上的植物病原病毒的基因组RNA或其cDNA的部分片段。

在该重组ALSV实施方式中，植物病原病毒优选为小西葫芦黄花叶病毒(ZYMV)、黄瓜花叶病毒(CMV)、或大豆花叶病毒(SMV)。

另外，本申请提供一种防除植物病原病毒的方法，其特征在于，使上述重组ALSV感染于植物幼苗，另外，还提供一种病原病毒抗性植物，其是在幼苗期接种了上述的重组ALSV的病原病毒抗性植物。

发明的效果

本发明中，通过整合有植物病原病毒的基因组RNA或其cDNA的部分片段而得的重组ALSV来防除该病原病毒的感染。作为对象的病原病毒没有限制，制作能够防除所有的病原病毒的感染的重组ALSV在理论上是可能的。重组ALSV的制作只要是具备该技术领域的常规知识的技术人员，就可根据本说明书的记载很容易地进行，与以往的弱毒病毒相比，以极少时间和劳力就可作成。

另外，ALSV为无病征感染病毒，由于插入到该ALSV中的病原病毒的基因组RNA或其cDNA的部分片段其自身不带有病原性，因此，重组ALSV在植物体内不存在获得毒性的危险性，可以安全使用。

附图说明

图1表示ALSV的感染性cDNA克隆与ALSV载体的构成。pEALSR1：ALSV RNA1的感染性cDNA克隆、pEALSR2L5R5：ALSV RNA2的感染性cDNA克隆、P35S：35S promoter、Tnos：nopaline synthase terminator、Q/G：蛋白质的切断部位、PRO-co：protease cofactor、HEL：NTP-bindinghelicase、C-PRO：cystein protease、POL：RNA polymerase、MP：movementprotein、VP25，VP20，VP24：capsid protein。

图2表示实施例1中导入有ZYMV基因片段的ALSV载体的构建工程。

图3表示实施例1中采集盘形叶的位置。

图4表示实施例1的结果。是第1本叶二次接种区的黄瓜(品种：青大黄瓜)的由ZYMV引起的病征(21dpi)。照片左上：(A)第5本叶、照片左下：(B)第6本叶、照片右：(C)植物全体。(A)(B)按照从左上至右下顺序，(C)按照从左开始的顺序，依次分别为：1：非接种区、2：单一ALSV区、3：单一ZYMV区、4：wtALSV+ZYMV区、5：ALSV-Z：CP200+ZYMV区。

图5表示实施例1的结果。是单一ZYMV区的第1本叶至第6本叶的GFP荧光的分布(14dpi)。

图6表示实施例1的结果。是wtALSV+ZYMV区的第1本叶至第6本叶的GFP荧光的分布(14dpi)。

图7表示实施例1的结果。是ALSV-Z:CP200+ZYMV区的第1本叶至第6本叶的GFP荧光的分布(14dpi)。

图8表示实施例1的结果。是利用直接ELISA法对第1本叶二次接种区的黄瓜(品种：青大黄瓜)中的ZYMV和ALSV蓄积量进行解析而得的结果。

图9表示实施例1的结果。是利用直接ELISA法对第2本叶二次接种区的黄瓜(品种：青大黄瓜)中的ZYMV和ALSV蓄积量进行解析而得的结果。

图10表示实施例1的结果。利用直接ELISA法对第3本叶二次接种区的黄瓜(品种：青大黄瓜)中的ZYMV和ALSV蓄积量进行解析而得的结果。

图11表示实施例1的结果。是一次接种了导入有不同的ZYMV基因片段的ALSV载体后的黄瓜(品种：青大黄瓜)的各试验区中的病征(21dpi)。照片左上：(A)第5本叶、照片左下：(B)第6本叶、照片右：(C)植物全体。(A)(B)按照从左上至右下的顺序、(C)按照从左开始的顺序，依次分别为：1：非接种区、2：单一ALSV区、3：单一ZYMV区、4：wtALSV+ZYMV区、5：ALSV-Z:P1+ZYMV区、6：ALSV-Z:P3+ZYMV区、7：ALSV-Z:CP200+ZYMV区。

图12表示实施例1的结果。是ALSV-Z:P3+ZYMV区的第1本叶至第6本叶的GFP荧光分布(14dpi)。

图13表示实施例1的结果。是ALSV-Z:P1+ZYMV区的第1本叶至第6本叶的GFP的荧光分布(14dpi)。

图14表示实施例1的结果。是利用直接ELISA法对一次接种了导入有不同的ZYMV基因片段的ALSV载体后的黄瓜(品种：青大黄瓜)的第1本叶二次接种区的ZYMV和ALSV蓄积量进行解析而得的结果。

图15表示例1的结果。是利用直接ELISA法对黄瓜(品种：铃成四叶)的第1本叶二次接种区的ZYMV和ALSV蓄积量进行解析而得的结果。

图16表示实施例1的结果。是利用直接ELISA法对黄瓜(品种：TSUBASA(つばさ))的第1本叶二次接种区的ZYMV和ALSV蓄积量进行解析而得的结果。

图17表示实施例1的结果。是一次接种了导入有长度不同的ZYMV基因片段的ALSV载体后的黄瓜(品种：青大黄瓜)的各试验区的病征(21dpi)。照片左上：(A)第5本叶、照片左下：(B)第6本叶、照片右：(C)植物全体。(A)(B)按照从左上至右下的顺序，(C)按照从左开始的顺序，依次分别为：1：非接种区、2：单一ALSV、3：单一ZYMV区、4：wtALSV+ZYMV区、5：ALSV-Z:CP100+ZYMV区、6：ALSV-Z:CP200+ZYMV区。

图18表示实施例1的结果。是ALSV-Z:CP100+ZYMV区第1本叶至第6本叶的GFP荧光的分布(14dpi)。

图19表示实施例1的结果。是利用直接ELISA法对一次接种了导入有长度不同的ZYMV基因片段的ALSV载体后的黄瓜(品种：青大黄瓜)的第1本叶二次接种区的ZYMV和ALSV蓄积量进行解析而得的结果。

图20表示实施例1的结果。是一次接种了导入有弱毒ZYMV和不同的ZYMV基因片段的各种ALSV后的黄瓜(品种：青大黄瓜)的各试验区的病征(21dpi)。(A)第5本叶、(B)植物全体。(A)(B)按照从左开始的顺序依次分别为：1：非接种区、2：单一ALSV、3：单一ZYMV、4：wtALSV+ZYMV区、5：ALSV-Z:P1+ZYMV区、6：ALSV-Z:P3+ZYMV区、7：ALSV-Z:CP200+ZYMV区、8：ZYMV 2002+ZYMV区。

图21表示实施例1的结果。是ZYMV 2002+ZYMV区的第1本叶至第6本叶的GFP荧光的分布(14dpi)。

图22表示实施例1的结果。是利用直接ELISA法对一次接种了导入有弱毒ZYMV和不同的ZYMV基因片段的各种ALSV后的黄瓜(品种：青大黄瓜)的第1本叶二次接种区的ZYMV和ALSV蓄积量进行解析而得的结果。

图23表示实施例2中的CMV-Y基因的克隆与CMV-Y基因片段的构建工序。

图24表示实施例2中的导入有CMV-Y基因片段的ALSV载体的构建工序。

图25表示实施例2的结果。是一次接种了导入有各CMV-Y基因片段的ALSV载体后的烟草的CMV-Y病征(9dpi)。按照从左上至右下的顺序依次为：非接种区、单一CMV-Y区、单一ALSV区、wtALSV+CMV-Y区、ALSV-C:1a+CMV-Y区、ALSV-C:2a+CMV-Y区、ALSV-C:CP+CMV-Y区。

图26表示实施例2的结果。是利用直接ELISA法对一次接种了导入有不同的CMV-Y基因片段的各种ALSV后的烟草的CMV-Y和ALSV蓄积量进行解析而得的结果。

图27表示实施例2的结果。是一次接种了导入有各CMV-Y基因片段的ALSV载体后的黄瓜(品种：青大黄瓜)的CMV-Y病征(18dpi)。(A)植物全体、(B)第6本叶、(A)按照从左开始的顺序、(B)按照从左上至右下的顺序依次为：1：非接种区、2：单一ALSV区、3：单一CMV-42CM区、4：wtALSV+CMV-42CM区、5：ALSV-C:1a+CMV-42CM区、6：ALSV-C:2a+CMV-42CM区、7：ALSV-C:CP+CMV-42CM区。

图28表示实施例2的结果。是利用直接ELISA法对一次接种了导入有各CMV-Y基因片段的ALSV载体后的黄瓜(品种：青大黄瓜)的第1本叶二次接种区的CMV-42CM和ALSV蓄积量进行解析而得的结果。

具体实施方式

本发明的重组ALSV的特征在于，插入有植物病原病毒的基因组RNA或其cDNA的部分片段。根据RNA沉默的原理，如果复制该重组ALSV，则可合成含有插入片段的序列的siRNA，并破坏与之互补的病原病毒基因组的区域。

ALSV虽然也可以使用从苹果分离出的ALSV，但可优选使用专利文献2所述的ALSV的RNA1感染性cDNA克隆(pEALSR1)、RNA2感染性cDNA克隆(pEALSR2L5R5)等ALSV载体(参照图1)。

作为植物病原病毒，除了实施例所示的黄瓜花叶病毒(CMV)、小西葫芦黄花叶病毒(ZYMV)、大豆花叶病毒(SMV)之外，原则上所有的病毒都可作为对象。例如，与CMV和ZYMV同样地以油虫类为媒介的南瓜花叶病毒(WMV-2)、蚕豆晶须鸣人病毒(BBWV)、芜菁花叶病毒(TuMV)等；以缨翅目昆虫类为媒介的蕃茄斑萎病毒(TSWV)、凤仙花属枯斑点病毒(Impatiens necrotic spot virus，INSV)、鸢尾黄斑病毒(IYSV)等；以枯黄粉虱类为媒介的黄瓜黄化病毒(CuYV)等；通过土壤传染的番茄花叶病毒(ToMV)等。

本发明的重组ALSV可以是将这些病原病毒的1种或2种以上(例如3种)的各个基因组RNA或cDNA的部分片段组合(例如做成融合多核苷酸)而插入到ALSV载体而得的重组ALSV。这样的对于2种以上的病原病毒的重组ALSV具有所谓的混合疫苗样的功能，可以防御2种以上的病原病毒对同一植物个体的感染。例如，如实施例所述的对于小西葫芦黄花叶病毒(ZYMV)和黄瓜花叶病毒(CMV)对黄瓜的感染的防御。

插入ALSV的插入片段可以由这些病原病毒的基因组RNA或其cDNA来制备。插入片段可以从病原病毒基因组的任意区域中选择，但优选从与病原病毒的生存、增殖、或其病原性相关的基因区域等中选择。例如，如实施例所述，对于小西葫芦黄花叶病毒(ZYMV)的情况，可以选择P1、HC-Pro、P3、Cl、Nla、Nlb、CP(优选P3、Cl、Nla、Nlb、CP)，对于黄瓜花叶病毒(CMV)的情况，可以选择1a、2a、CP(优选2a)，对于大豆花叶病毒(SMV)的情况，可以选择与分别将CP编码的基因组RNA的部分区域或与该区域对应的cDNA。

对于插入片段的大小，例如，在插入到ALSV载体中的情况下，可以在对该植物个体的感染能力、或植物个体内的增殖能力没有影响的大小范围内任意选择。另外，插入片段的大小选择含有插入片段的序列的siRNA可有效地破坏病原病毒基因组且能够稳定维持该插入片段的范围。即，具体来说，可将插入片段的大小例如设为100～300bp、优选设为150～200bp左右。

另外，该插入片段进行编码而成的肽为了作为与ALSV肽的融合肽来进行表达(即，通过部分片段的插入而使终止密码不出现)，必须使读框一致。使用ALSV载体的情况下，用与其克隆部位一致的限制性内切酶来制备上述的部分片段，使用市售的连接试剂盒等将该部分片段插入到ALSV载体中。然后，使该重组ALSV载体感染昆诺阿藜，从感染叶中分离出病毒，从而作成重组ALSV。

该重组ALSV可以直接接种于植物，从而在病原病毒的感染防除中使用。或者也可以在含有稳定剂等的缓冲液中使其冷冻干燥，从而产品化为感染防除剂(例如专利文献2等)。

重组ALSV、或溶解的感染防除剂可以利用碳化硅法等众所周知的方法接种于植物的幼苗的叶(例如黄瓜的子叶展开期的子叶、烟草的5叶期的第3至第5本叶等)。

以下，示出实施例来对本发明进行更详细而具体的说明，但本发明并不限定于以下例子。

实施例1

导入有ZYMV的基因片段的ALSV载体所引起的干扰效果

1：材料和方法

1-1：实验材料

1-1-1：供试植物

将Chenopodium quinoa(以下称为昆诺阿藜)用作ALSV增殖用植物。另外，在干扰效果的检验中，将Cucumis sativus(以下称为黄瓜)的不具有ZYMV抗性的3个品种(青大黄瓜、铃成四叶、TSUBASA)供试验用。

1-1-2.供试感染性克隆

对于供试感染性克隆而言，将非专利文献2等中记载的ALSV的RNA1感染性cDNA克隆(pEALSR1)和RNA2感染性cDNA克隆(pEALSR2L5R5)(图1)、以及由宇都宫大学农学部教授夏秋知英博士分享的强毒株ZYMV isolate Z5-1(accession number：AB188115)的感染性cDNA克隆(p35S-Z5vector+GFP-FL)供试验用。另外，将由(株)微生物化学研究所梁宝成博士分享的弱毒株的ZYMV isolate 2002(以下为ZYMV 2002、accession number：AB188116)供试验用。

1-2：ZYMV基因片段向ALSV载体的导入

1-2-1：ZYMV基因片段的克隆

以p35S-Z5vector+GFP-FL为模板，使用将已知的ZYMV isolate Z5-1的P1基因、P3基因和CP基因序列作为基础而设计出的引物，扩增P1基因(210nt)时使用Z:P1-Xho(+)与Z:P1-Bam(-)的组合，扩增P3基因(189nt)时使用Z:P3-Xho(+)与Z:P3-Bam(-)的组合，扩增CP基因(225nt)时使用Z:CP-Xho(+)与Z:CP-Bam(-)的组合，扩增CP基因(117nt)时使用Z:CP-Xho(+)与Z:CP100-Bam(-)的组合(表1：序列号1-7)。

[表1]

取2μl的模板DNA溶液(1ng/μl)加到容量为0.2ml的PCR管中，然后加入35μl灭菌水、5μl的10×Ex TaqBuffer(TaKaRa)、5μl的2.5mMdNTP Mixture(TaKaRa)、10μM各基因片段扩增引物各1μl、1μl的TaKaRaEx Taq^TM(TaKaRa)后混合，使用TaKaRa PCR Thermal Cycler DiceVersionIII Model TP600(TaKaRa)在94℃下处理5分钟后，再进行〔94℃、30秒→57℃、30秒→72℃、60秒〕这样的反应30次，然后在72℃下处理5分钟，最后在4℃下处理5分钟，终止PCR。所得到的PCR产物按以下方法进行电泳。将使用0.15g的Agarose S(日本人)、15ml的TAE[40mM Tris、40mM乙酸、1mMEDTA(pH8.0)]、0.6μl的溴化乙锭所作成的1％琼脂糖凝胶设置在用TAE将泳动槽内灌满的Mupid-2plus(ADVANCE)中，将1μl的10×Loading Buffer(TaKaRa)混合在2μl的PCR产物中，加到琼脂糖凝胶的孔中后进行电泳，确认出所设计的大小的片段。

进行了大小确认后的PCR产物使用MonoFas DNA纯化试剂盒I(GLSciences)如下所述地进行纯化。用小刀将使用1％琼脂糖进行电泳后的每孔20μl的PCR产物带切下，放入到容量为1.5ml的微量管中，对凝胶的重量进行称量。然后加入与凝胶的重量等量的Buffer A，在60℃下保温10分钟，使凝胶完全溶解。将溶解的凝胶样品溶液加入到安装有收集管的旋转柱中，以10,000rpm(4℃)离心30秒钟。离心后，向旋转柱中加入500μl的Buffer B，以10,000rpm(4℃)离心30秒钟。离心后，将旋转柱更换为容量为1.5ml的微量管，加入20μl的Buffer C，以10,000rpm(4℃)离心60秒钟，将得到的溶液作为ZYMV的各基因片段。

各基因片段使用pGEM-T Easy Vector System(Promega)如下所述地进行TA克隆。将4μl的P1基因片段加到容量为1.5ml的微量管中，然后加入5μl的2×Rapid Ligation Buffer、1μl的pGEM-T Easy Vector、1μl的T4DNA Ligase并混合后，在室温下静置60分钟，进行连接反应。将进行了连接反应的样品溶液10μl加入到预先在冰上解冻了的100μl的大肠杆菌DH5α的感受态细胞中，平稳地混合后在冰上静置20分钟。静置后在42℃水浴中进行45秒钟热激处理，立刻在冰上静置2分钟。静置后向样品中加入1ml的SOC培养基(pH7.5)[每1L中bacto tryptone 20g、bactoyeast extract 5g、NaCl 0.5g、1M MgCl₂ 10ml、1M MgSO₄ 10ml]，在37℃的摇床中进行60分钟震荡培养。培养后，在含有0.15％的琼脂的LB培养基(pH7.5)[每1L中bacto tryptone 10g、bacto yeast extract 5g、NaCl 10g、氨苄西林(25mg/ml)2ml]的板上涂布50μl样品，将样品涂开。涂布了样品的板在37℃的保温箱中静置14～16小时。

对在板上形成的菌落进行小规模培养，通过采用煮沸法的以下方法来提取质粒。使用经高压釜灭菌后的牙签，在分注到试管内的2ml的LB培养基上接菌，在设定于37℃的摇床中震荡培养8小时。将培养液移至容量为1.5ml的微量管中，以14,000rpm(室温)离心1分钟。离心后，使用抽吸器除去上清液，加入350μl的STET[0.1M NaCl、10mM Tris-HCl(pH8.0)、1mM EDTA(pH8.0)、5％TritonX-100]，用涡旋混合器使沉淀悬浮。加入25μl溶菌酶溶液[10mM Tris-HCl(pH8.0)、10mg/ml溶菌酶]，用涡旋混合器混合3秒钟。混合后将微量管煮沸40秒钟，立刻移到冰中冷却5分钟。冷却后以14,000rpm(室温)离心10分钟，用经高压釜灭菌过的牙签将沉淀除去。向上清液中加入40μl的3M乙酸钠(pH5.2)和420μl的异丙醇后进行混合，在-20℃冷库内静置5分钟。静置后以14,000rpm(4℃)离心，除去上清液。向微量管内的沉淀中加入1ml的70％乙醇，以14,000rpm(4℃)离心2分钟，除去上清液后，用减压干燥机将微量管内的沉淀干燥2分钟。使干燥后的沉淀悬浮于50μl的RNase溶液[10mM Tris-HCl(pH8.0)、1mM EDTA(pH8.0)、20μg/ml DNase freeRNase]中。悬浮后在37℃的保温箱中静置20分钟，制成质粒溶液。

使用2μl的提取出的质粒溶液，在1％琼脂糖凝胶中进行电泳，挑取认为保持有插入片段的质粒。所挑取的质粒按照以下方法进行利用了EcoR I的限制性内切酶处理，确认到保持有插入片段。取2μl质粒到微量管中，然后加入6.8μl灭菌水、1μl的10×H Buffer(TaKaRa)、0.2μl的EcoRI(TaKaRa)后进行混合，在37℃保温箱中静置3小时。静置后用1％琼脂糖凝胶进行电泳，确认到保持有插入片段，完成了TA克隆。

1-2-2：ZYMV基因片段的序列

通过TA克隆而得的质粒用以下方法进行纯化。向46μl质粒中加入154μl的TE[10mM Tris-HCl(pH8.0)、1mM EDTA(pH8.0)]、100μl的TE饱和苯酚、100μl氯仿，用涡旋混合器混合5分钟，以14,000rpm(4℃)离心5分钟。离心后将200μl水层移到新的微量管中，加入200μl氯仿，用涡旋混合器混合，以14,000rpm(4℃)离心5分钟。将150μl的水层移到新的微量管中，加入15μl的3M乙酸钠(pH5.2)、375μl的99％乙醇，用涡旋混合器混合2分钟，在-20℃冷库中静置20分钟。以14,000rpm(4℃)离心20分钟，除去上清液后，向沉淀中加入1ml的70％乙醇。以14,000rpm(4℃)离心5分钟。离心后，除去上清液，用减压干燥机干燥2分钟后，悬浮于50μl的TE中。加50μl的PEG溶液(13％polyethylene glycol 8000、1.6M NaCl)后混匀，在冰上静置1小时。静置后，以14,000rpm(4℃)离心20分钟，向沉淀中加入500μl的70％乙醇，以14,000rpm(4℃)离心2分钟。除去上清液，将沉淀用减压干燥机干燥2分钟。用20μl灭菌水使沉淀悬浮，使用NanoDrop ND-1000 Spectrophotometer(旭テクノグラス)来测量吸光度(波长260nm)，将浓度调整为300ng/μl，制成纯化质粒。

纯化质粒用以下方法进行序列分析。供试于序列分析的电泳试样是使用BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit(Applied Biosystems)如下所述地加以制作的。取1μl纯化质粒加入到容量为0.2ml的PCR管中，然后加4μl的灭菌水、1μl的5×BigDye Sequencing Buffer、2μl的引物ACUNI6745(+)、2μl的Ready reaction mix并混匀，使用TaKaRa PCRThermal Cycler Dice VersionIII Model TP600(TaKaRa)在94℃处理1分钟后，进行〔94℃、30秒→50℃、15秒→60℃、4分钟〕这样的反应30次，之后在60℃下处理3分钟，最后在4℃处理5分钟，完成PCR。PCR后，将全部试样都加入到容量为1.5ml的微量管中，然后加入7.25μl的灭菌水、1.5μl的3M乙酸钠、31.25μl的99％乙醇，用涡旋混合器混合1分钟，用铝箔包好避光，在室温下静置10分钟。静置后，以14,000rpm(4℃)离心20分钟，向沉淀中加入1ml的70％乙醇，以14,000rpm(4℃)离心5分钟。离心后用减压干燥机将沉淀干燥，使其悬浮于20μl的Hi-DiFormamido中。然后将悬浊液煮沸2分钟，立刻在冰上静置了5分钟，将由此所得材料作为电泳试样。

试样的电泳按照ABI PRISM 3100-Avant Genetic Analyzer的指南进行。将20μl的电泳试样加到MicroAmp 96-well Reaction Plate的孔中，组装板组(plate assembly)，设置在自动取样器中。毛细管长为80cm，聚合物为POP-4，电泳缓冲液为用灭菌水稀释10倍后的10×Genetic AnalyzerBuffer with EDTA。然后，制定板编号，设定样品名、电泳条件和解析条件等。分别设定Dye Set为Z、Mobility File为DT3100POP4{BDv3}v1.mob、BioLIMS Project为3100_Project1、Run Module为Longseq80_POP4DefaultModule、Analysis Module为BC-3100APOP4_80cm_SeqOffFtOff.saz，进行电泳。电泳结束后，按照ABI PRISM 3100-Avant Genetic Analyzer的指南，将解析数据变换为碱基序列。所得的碱基序列数据使用序列信息解析软件DNASIS Pro ver2.09.000.001(HitachiSoft)来进行解析，确认到所制作的ZYMV基因片段与模板相同。

1-2-3：ZYMV基因片段向ALSV载体的导入

为了使经序列的确认后的各ZYMV基因片段导入到ALSR2L5R5中，如下所述地进行了基因片段的纯化、使用了BamH I与Xho I的限制性内切酶处理。

向28μl的各ZYMV基因片段中加入72μl的TE、50μl的TE饱和苯酚、50μl的氯仿，用涡旋混合器混合3分钟，以14,000rpm(4℃)离心10分钟。将100μl的水层移到新的微量管中，加入10μl的3M乙酸钠(pH5.2)、250μl的99％乙醇，用涡旋混合器混合2分钟，在-80℃冷库中静置15分钟。以14,000rpm(4℃)离心15分钟，除去上清液，向沉淀中加入1ml的70％乙醇，以14,000rpm(4℃)离心5分钟。除去上清液，用减压干燥机对沉淀进行干燥。使干燥的沉淀悬浮于17μl的灭菌水中，加入2μl的10×K Buffer(TaKaRa)、0.5μl的BamH I(TaKaRa)、0.5μl的Xho I(TaKaRa)，平稳地混合，在37℃的保温箱中静置12小时。ALSR2L5R5也用同样方法进行了限制性内切酶处理。

对于进行了限制性内切酶处理后的各种ZYMV基因片段和ALSR2L5R5，使用MonoFas DNA纯化试剂盒I，利用上述1-2-1的方法进行纯化，将所得的溶液分别作为纯化Z:P1基因、纯化Z:P3基因、纯化Z:CP200基因、纯化Z:CP100基因(插入有ZYMV的DNA)和纯化ALSR2L5R5(载体DNA)。

使用DNA Ligation Kit Ver.2.1(TaKaRa)，按照以下方法对各种插入有ZYMV的DNA与载体DNA进行连接反应。取4μl各种插入有ZYMV的DNA加到微量管中，分别加入1μl的载体DNA和5μl的I液，平稳地混合，在16℃的水浴中进行4小时的连接反应。使用各连接产物，按照与上述1-2-1同样的方法进行大肠杆菌DH5α的性状转换和小规模培养以及利用煮沸法而进行的质粒的提取。提取出的质粒在1％琼脂糖凝胶中进行电泳，挑取认为保持有插入片段的质粒。挑取出的质粒利用以下的方法进行使用了BamH I和Xho I的限制性内切酶处理，确认出保持有插入片段。取2μl质粒加到微量管中，然后加入6.6μl灭菌水、1μl的10×K Buffer、0.2μl的BamH I、0.2μl的Xho I后混匀，在37℃保温箱中静置3小时。静置后，在1％琼脂糖凝胶中进行电泳，确认出保持有各质粒的插入片段。

对保持有插入片段的克隆进行大规模培养，使用QIAGEN PlasmidMidi Kit(QIAGEN)，使用在离心机中设置有RPR16转子(HITACHI)的高速冷却离心机himac CR20G(HITACHI)，用以下的方法进行纯化。向500ml容量的坂口烧瓶中分注100ml的LB培养基，用经高压釜灭菌后的牙签接入菌落，使用37℃的摇床以180rpm震荡培养14～16小时。将培养液移至容量为50ml的离心管中，以7,500rpm(4℃)离心15分钟。除去上清液，将余下的培养液移走，以7,500rpm(4℃)离心15分钟。除去上清液，使沉淀悬浮于4ml的Buffer P1中。向悬浊液加入4ml的BufferP2，颠倒混和，在室温下静置4分钟。立刻加入4ml的Buffer P3，然后颠倒混匀，于冰上静置20分钟。以13,000rpm(4℃)离心30分钟，将上清液移到新的容量为50ml的离心管中，再以13,000rpm(4℃)离心15分钟。将离心上清液加到用4ml的Buffer QBT使柱子平衡好的QIAGEN-tip 100中，通过自然落下使质粒DNA吸附于柱上。用10ml的Buffer QC将QIAGEN-tip 100清洗2次，将QIAGEN-tip 100设置在新的容量为50ml的SUMIRON管中，用5ml的Buffer QF将DNA洗脱下来。向洗脱出的DNA溶液中加入3.5ml异丙醇后混匀，立即移到容量为15ml的COREX管中，以11,000rpm(4℃)离心30分钟。除去上清液，向沉淀中加入2ml的70％乙醇，以11,000rpm(4℃)离心10分钟。除去上清液，用减压干燥机将沉淀干燥。然后使沉淀悬浮于200μl的TE中，使用NanoDrop ND-1000 Spectrophotometer测定吸光度(波长260nm)，将浓度调整为1μg/μl。将各质粒分别设为ALSVR2L5R5-Z:P1、ALSVR2L5R5-Z:P3、ALSVR2L5R5-Z:CP:200、ALSVR2L5R5-Z:CP:100(图2)。

1-2-4：ALSV载体的接种与病毒化

纯化后的各质粒(ALSVR2L5R5-Z:P1、ALSVR2L5R5-Z:P3、ALSVR2L5R5-Z:CP200、ALSVR2L5R5-Z:CP100)每种都与用上述1-2-3的方法纯化了的pEALSR1等量混合，制成DNA溶液。将制作的DNA溶液用碳化硅法按照每一片本叶8μl的量接种在7叶期的昆诺阿藜的第3本叶至第6本叶。接种后，取出现了退绿症状的上叶作为样品，在2倍容量的ALSV磨碎缓冲液[0.1M Tris-HCl(pH7.8)、0.1M NaCl、5mM MgCl₂]中磨碎，用碳化硅法接种于8叶期的昆诺阿藜的第3本叶至第8本叶。接种后，取出现了退绿症状的上叶作为样品，将各病毒分别设为ALSV-Z:P1、ALSV-Z:P3、ALSV-Z:CP200、ALSV-Z:CP100，作为以后的接种试验的接种源。另外，ALSVR2L5R5也用同样方法进行病毒化，将得到的病毒设为wtALSV，作为以后接种试验的接种源。

1-3：对黄瓜的接种法与一次接种和二次接种

1-3-1：对黄瓜的一次接种

对黄瓜的一次接种使用各ALSV(ALSV-Z:P1、ALSV-Z:P3、ALSV-Z:CP200、ALSV-Z:CP100、wtALSV)和ZYMV 2002，通过以下方法来进行。将各ALSV感染昆诺阿藜叶分别在2倍容量的ALSV磨碎缓冲液中磨碎。将各ALSV磨碎液、和在2倍容量的0.1M磷酸缓冲液(pH7.0)中将ZYMV 2002感染南瓜叶磨碎后所制备的ZYMV磨碎液，用碳化硅法接种于2枚子叶展开期的黄瓜的子叶。黄瓜在25℃的长日条件下进行培育。

1-3-2：对黄瓜的二次接种

用以下方法将p35S-Z5vector+GFP-FL涂敷到金粒子上，使用HeliosGene Gun系统(BIO-RAD)对一次接种的黄瓜进行二次接种。称取10mg的直径为1.6μm的金粒子(BIO-RAD)加到容量为1.5ml的微量管中，加50μl的50％甘油后，用涡旋混合器混匀。用超声波清洗机进行2分钟的声波降解，边用涡旋混合器进行混合，边加入25μl的p35S-Z5vector+GFP-FL，然后加150μl的1M CaCl2，再加入150μl的0.05M亚精胺后混匀。于室温静置15分钟，用移液器除去上清液。在使沉淀不崩解的情况下加入1ml的99％乙醇，进行洗涤，用移液器除去上清液。进行3次同样的洗涤，洗涤后，向沉淀中加入500μl的99％乙醇，用指弹方式使其悬浮，确认到金粒子的分散。将悬浮的金粒子全部移至容量为15ml的管中，加入2.5ml的99％乙醇并混匀。制备的金粒子悬浊液按照Helios Gene Gun简易操作指南，用以下的方法涂敷于涂金用管，进行接种。在tubing-prep-station中，将带注射器的悬浊液加样用管安装在使用0.35-0.40LPM(liters per minute)的N₂气将管内干燥20分钟后的涂金用管上，使用该注射器将金粒子悬浊液装填到涂金用管中，静置5分钟。静置后，将带注射器的悬浊液加样用管去掉，安装除乙醇用带注射器的管，将涂金用管内的乙醇彻底除去。除去后立刻将涂金用管旋转180°，启动tubing-prep-station的旋转开关。向涂金用管内通入0.35-0.40LPM的N₂气，对管内进行干燥。将干燥后的涂金用管从tubing-prep-station中取出，使用切管器切断，作成样品子弹(sample cartridge)。将样品子弹安装到Helios Gene Gun的子弹架上，对1叶期黄瓜的第1本叶以180PSI(poundsper square inch)进行1次发射接种，形成第1本叶二次接种区。将用上述方法只对2叶期的第2本叶进行二次接种的区域作为第2本叶二次接种区，将只对3叶期的第3本叶进行二次接种的区域作为第3本叶二次接种区。二次接种后，黄瓜与一次接种后一样在25℃的长日条件下培育。

需说明的是，对于作为二次接种的接种源的p35S-Z5vector+GFP-FL，通过将所使用的培养基由LB培养基换成2×YT培养基(pH7.5)[每1L中含有bacto tryptone 16g、bacto yeast extract 10g、NaCl 5g、氨苄西林(25mg/ml)2ml]的大规模培养，利用与上述1-2-3同样的方法进行纯化，用NanoDrop ND-1000 Spectrophotometer测定浓度后，调整为400ng/μl，在-80℃下保存，备用。

1-4：病征观察与病毒检验

1-4-1：病征观察

二次接种后每天进行病征观察，二次接种后第21天用数码照相机FinePix S1Pro(FUJIFILM)对病征照相。

1-4-2：GFP荧光的观察

GFP荧光的观察在二次接种后第7天、第14天、第21天使用荧光显微镜系统VB系列(KEYENCE)和显微镜数码照相机DP70(OLYMPUS)进行，同时进行照相。

1-4-3：免疫印迹法

在一次接种后第7天取2枚黄瓜的子叶，用以下方法对各自的一次接种病毒的感染进行确认。对所采取的2枚子叶的重量进行测量，与3倍容量的ALSV磨碎缓冲液一起用乳钵和乳棒磨碎，将100μl的磨碎液移至容量为1.5ml的微量管中。加入100μl的2×样品缓冲液[01M Tris-HCl(pH8.0)、4％SDS、30％蔗糖、0.05％BPB、2％巯基乙醇]，用涡旋混合器混合1分钟，然后煮沸5分钟，立刻于冰上静置5分钟。静置后，以14,000rpm(4℃)离心5分钟，将上清液作为电泳试样。使用10μl的电泳试样，使用浓缩胶(5％丙烯酰胺凝胶)和分离胶(12.5％丙烯酰胺凝胶)以及电泳缓冲液[0.6％Tris、28％甘氨酸、0.1％SDS]进行电泳(160V、20mA、90分钟、室温)。电泳后，使用转印缓冲液[0.1M Tris、0.192M甘氨酸、20％甲醇]进行半干式电印迹，向PVDF膜(MILIPOLE)转印蛋白质。转印后，将PVDF膜浸入封闭液[0.02M Tris-HCl(pH7.5)、0.5M NaCl、2％Tween-20、2％脱脂奶、2％PVP]中，于37℃的保温箱中静置60分钟。静置后，使用用TTBS[0.02M Tris-HCl(pH7.5)、0.5MNaCl、2％Tween-20]稀释25倍后的抗ALSV和ZYMV的吸收抗体，于37℃保温箱中进行60分钟的一次抗体处理。一次抗体处理后，将PVDF膜浸入加满了TTBS的容器中，利用杠杆反复洗涤5分钟。将TTBS换成新鲜的，用同样方法再洗涤2次。对于洗涤后的PVDF膜，使用被TTBS稀释2000倍后的碱性磷酸酶标记抗兔免疫球蛋白山羊血清(Cell Signaling TECHNOLOGY)在37℃保温箱中进行60分钟的二次抗体处理。二次抗体处理后，用TTBS将PVDF膜洗涤3次，然后使用发色底物液[0.2M Tris-HCl(pH8.2)、3mg/mlFast Red TR salt、1mg/ml Naphthol AS-MX phosphate]进行发色处理。充分发色后，用蒸馏水洗涤PVDF膜，停止反应。需说明的是，吸收抗体预先用以下方法制备。首先，将在5倍容量的TTBS中磨碎了的供试植物的磨碎液以3,000rpm(4℃)离心5分钟，将上清液作为粗汁液。取10μl一次抗体(各种病毒抗血清)加入到容量为1.5ml的微量管中，然后加入90μl粗汁液并混匀，在37℃下静置60分钟。静置后，以14,000rpm(4℃)离心5分钟，将100μl上清液移至新的容量为1.5ml的微量管中。向上清液中加入100μl磨碎液后混匀，于37℃静置60分钟。静置后，以14,000rpm(4℃)离心5分钟，将上清液200μl移至新的容量为1.5ml的微量管中。向上清液中加入200μl磨碎液，混合，于37℃静置60分钟。以14,000rpm(4℃)离心5分钟，将400μl上清液移至新的容量为1.5ml的微量管中。向上清液中加入400μl的100％甘油，用涡旋混合器充分混合，制成吸收抗体。吸收抗体于-20℃冷库保存，便于使用。

1-4-4：ELISA法

ALSV和ZYMV的蓄积量使用直接ELISA法，GFP的蓄积量使用间接ELISA法，用以下方法进行定量。

在二次接种后第21天使用软木钻孔机(コルクボ一ラ一)如下所述地采集检验试样。分别在第1本叶接种区采集第3至第6本叶的各个本叶，在第2本叶接种区采集第4至第7本叶的各个本叶，在第3本叶接种区采集第5至第8本叶的各个本叶，避开粗的叶脉从所采集的本叶的基部、中心部、周边部凿榫出直径1cm的盘形叶片各2枚，从1枚本叶中共计采集出6枚盘形叶片(图3)。将所采集的6枚盘形叶片与一个不锈钢珠SUB-50(TOMY)一起放到容量为2ml的冷冻保存管(ASSIST)中，用液氮冷冻，使用Micro Smash MS100-R(TOMY)以2,500rpm破碎30秒钟。破碎后，加1.8ml的PBST[137mMNaCl、8.1mM Na₂HPO₄、2.68mMKCl、1.47mM KH₂PO₄、0.05％Tween20]，使用Micro Smash MS100-R以2,500rpm混合30秒钟。然后以14,000rpm(4℃)离心5分钟，将得到的上清液作为检验试样。

ALSV的定量使用直接ELISA法按照以下方法进行。向ELISA板的孔中加入150μl用包被液[0.05M碳酸缓冲液(pH9.6)]稀释1000倍后的ALSV抗体溶液，盖上板盖，于37℃保温箱中静置2小时。弃掉溶液，用PBST将孔洗涤3次，然后向孔中加入150μl封闭液[137mM NaCl、8.1mM Na₂HPO₄、2.68mM KCl、1.47mM KH₂PO₄、2％脱脂奶]，盖上板盖，于37℃保温箱中静置1小时。弃掉溶液，用PBST将孔洗涤3次，对于一个检验试样，向两个孔中每个孔各加入150μl的检验试样，盖上板盖，于4℃冷库中静置一晚。弃掉溶液，用PBST将孔洗涤10次，向孔中加入用PBST稀释1000倍后的进行了酶标记的ALSV抗体溶液150μl，盖上板盖，于37℃保温箱中静置3小时。弃掉溶液，用PBST将孔洗涤10次，加入150μl底物液[10％二乙醇胺(pH9.8)、0.67mg/ml对硝基苯基磷酸]，于室温下静置，反应至呈色。反应后，用型号550酶标分析仪(BIO-RAD)测定孔的吸光度，计算出ALSV的蓄积量。

ZYMV的定量用直接ELISA法按照以下方法进行。向ELISA板的孔中加入150μl的用包被液稀释500倍后的ZYMV抗体(日本植物防疫协会研究所)溶液，盖上板盖，于37℃保温箱中静置3小时。弃掉溶液，用PBST将孔洗涤3次，然后向孔中加入150μl封闭液，盖上板盖，于37℃保温箱中静置1小时。弃掉溶液，用PBST将孔洗涤3次，对于一种检验试样，向两个孔中各加入150μl的检验试样，盖上板盖，于4℃冷库中静置过夜。弃掉溶液，用PBST将孔洗涤10次，向孔中加入用PBST稀释1000倍后的进行了酶标记的ZYMV抗体(日本植物防疫协会研究所)溶液150μl，盖上板盖，于37℃保温箱中静置4小时。弃掉溶液，用PBST将孔洗涤10次，加入150μl底物液[10％二乙醇胺(pH9.8)、1mg/ml对硝基苯基磷酸]，于室温下静置，反应至呈色为止。反应后，用型号550酶标分析仪测定孔的吸光度，算出ZYMV的蓄积量。

GFP的定量按照以下方法进行。在ELISA板的孔中，对于每1种检验试样，向2个孔中各加入150μl检验试样，盖上板盖，于37℃保温箱中静置2小时。弃掉溶液，用PBST将孔洗涤5次，然后向孔中加入150μl封闭液，盖上板盖，于37℃保温箱中静置1小时。弃掉溶液，用PBST将孔洗涤5次，加入用PBST稀释1000倍后的GFP抗体(Clontech)150μl，盖上板盖，于37℃冷库中静置过夜。弃掉溶液，用PBST将孔洗涤10次，向孔中加入用PBST稀释2000倍后的碱性磷酸酶标记抗兔免疫球蛋白山羊血清150μl，盖上板盖，于37℃保温箱中静置3小时。弃掉溶液，用PBST将孔洗涤10次，加入150μl底物液[10％二乙醇胺(pH9.8)、1mg/ml对硝基苯基磷酸]，于室温下静置，反应至呈色为止。反应后，用型号550酶标分析仪测定孔的吸光度，作为GFP的蓄积量。

1-4-5：RNA提取法和RT-PCR法

在二次接种后第21天，采集黄瓜的最上位展开叶，于-80℃冷库中冷冻，作为检验试样。用乳钵和乳棒将0.1g检验试样磨碎，加1ml的TriPureIsolation Reagent(Roche)后再进行磨碎。将1ml磨碎液移至容量为1.5ml的微量管中，于室温下静置5分钟。静置后，加200μl氯仿，用涡旋混合器混合20秒钟，于室温下静置10分钟。静置后，以14,000rpm(4℃)离心15分钟，将500μl的水层移至新的容量为1.5ml的微量管。加250μl的水饱和苯酚、250μl氯仿，用涡旋混合器混合5分钟，以14,000rpm(4℃)离心5分钟。离心后，将500μl的水层移至新的微量管，加420μl异丙醇，用涡旋混合器混合，于室温静置10分钟。静置后，以14,000rpm(4℃)离心10分钟，除去上清液，加1.4ml的70％乙醇，用涡旋混合器混合5分钟。以14,000rpm(4℃)离心5分钟，除去上清液后，使沉淀悬浮于20μl的灭菌水，用NanoDrop ND-1000 Spectrophotometer测定RNA浓度，将浓度调整为500ng/μl，制成RNA溶液。

逆转录反应按照以下方法进行。向容量为0.2ml的PCR管中加入2μlRNA溶液、6μl灭菌水、4μl的5×RT Buffer(TOYOBO)、8μl的2.5mM dNTPmixture(TaKaRa)、1μl的10μM Oligo(dT)₁₂引物、0.5μl的RNase Inhibitor(Wako)、0.5μl的ReverTraAce(TOYOBO)后混匀，使用TaKaRa PCRThermal Cycler Dice VersionIII Model TP600(TaKaRa)于42℃处理50分钟，然后于95℃处理5分钟，最后于4℃处理5分钟，将获得的产物作为RT产物。

PCR分别使用能够扩增ALSV-RNA2载体的包含外源基因导入位点的序列的10μM R2ALS 1363(+)[5’-GCGAGGCACTCCTTA-3’：序列编号8]与10μM R2ALS 1511(-)[5’-GCAAGGTGGTCGTGA-3’：序列编号9]作为正链引物和负链引物。将1μl的RT产物加入到容量为0.2ml的PCR管，然后加入4.9μl灭菌水、1μl的10×Ex Taq Buffer(TaKaRa)、1μl的2.5mM dNTP Mixture(TaKaRa)、10μM R2ALS 1363(+)与10μM R2ALS1511(-)各1μl、0.1μl的TaKaRa Ex TaqTM(TaKaRa)后混匀，使用TaKaRaPCR Thermal Cycler Dice VersionIII Model TP600(TaKaRa)，于94℃下处理5分钟后，进行〔94℃、30秒→58℃、30秒→72℃、60秒〕这样的反应30次，然后于72℃处理5分钟，最后于4℃处理5分钟，结束PCR。在得到的2μl的PCR产物中混合1μl的10×Loading Buffer(TaKaRa)，进行使用了1％琼脂糖凝胶的电泳，确认出各种ALSV保持有插入片段序列。

2：结果

2-1：导入有ZYMV基因的ALSV载体对ZYMV的干扰效果

为了研究导入有ZYMV基因的ALSV载体对ZYMV的干扰效果，考察了一次接种了导入有wtALSV和ZYMV的CP基因片段的ALSV(ALSV-Z:CP200)的黄瓜(青大黄瓜)中的ZYMV的病征、GFP荧光和病毒量。

只接种了p35S-Z5vector+GFP-FL的试验区(单一ZYMV区)在接种后12天前后观察到在第3本叶的基部周边出现退绿斑点、脉间退绿等病征。之后在展开了的第4本叶中也看到叶的花叶病症状，在第5本叶以上的叶中整个叶面都观察到严重的花叶病症状(图4A)。另外，还在第6本叶以上的叶中同时观察到严重的花叶病症状和叶的畸形、萎缩(图4B)，植物体整体也显现出矮化(图4C)。至于一次接种wtALSV后，二次接种了p35S-Z5vector+GFP-FL的试验区(wtALSV+ZYMV区)中，第3至第5本叶中的病征的表现几乎与单一ZYMV区相同，但症状比单一ZYMV区轻，没有观察到植物体整体矮化现象(图4)。与此相对，一次接种ALSV-Z:CP200后又二次接种p35S-Z5vector+GFP-FL的试验区(ALSV-Z:CP200+ZYMV区)中，与非接种区和只接种ALSV的试验区(单一ALSV区)一样，在所有的上叶中完全观察不到病征(图4)。

当用荧光显微镜观察GFP荧光时，在单一ZYMV区中，在第1本叶的接种部位周边观察到点状的荧光，在叶脉上观察到荧光。至于第2本叶，在叶脉处所观察到的荧光伴随着叶的展开一起扩大。关于第3本叶至第5本叶，所有的叶遍布荧光。至于第6本叶，虽然在所有的叶中都能观察到荧光，但在叶的各处也能观察到没有荧光的区域(图5)。在从第7叶开始的上位的叶中观察到荧光的区域和没有观察到的区域以镶嵌状混合在一起。而在wtALSV+ZYMV区中，在各个叶位都观察到与单一ZYMV区几乎相同的荧光(图6)。与此相对，在ALSV-Z:CP200+ZYMV区的第1叶中，与单一ZYMV区和wtALSV+ZYMV区同样，在接种部位周边观察到点状荧光以及在叶脉上观察到荧光，至于第2本叶，在叶脉处观察到的荧光扩展的范围与ZYMV区和wtALSV+ZYMV区相比，被限定在更狭窄的区域。进而，在第3本叶中只在几处观察到荧光，而在从第4叶开始的上位的叶中没有观察到荧光(图7)。

接着，对ZYMV进行定量，结果从第3本叶至第6本叶所有的本叶在wtALSV+ZYMV区中蓄积了与单一ZYMV区同等程度的ZYMV，与此相对，ALSV-Z:CP200+ZYMV区中没有看到ZYMV的蓄积(图8)。另外，对ALSV进行定量，结果wtALSV+ZYMV区与单一ALSV相比，表现出约2倍的ELISA值，ALSV-Z:CP200+ZYMV区与单一ALSV区相比稍有减少(图8)。当进行一次接种中所使用的ALSV-Z:CP200的插入片段检测时，确认到所有黄瓜个体中都保持有ALSV的插入片段。

第2本叶二次接种区的各试验区的病征大致与第1本叶二次接种区一样，病征出现的叶位每1枚都偏移至上位。

在GFP荧光的观察中，在ALSV-Z:CP200+ZYMV区中，仅在接种叶的第2本叶的接种部位周边观察到点状荧光以及在叶脉的一部分观察到荧光，在第3本叶以后展开的本叶中没有观察到荧光。与此相对，在单一ZYMV区和wtALSV+ZYMV区中，与第1本叶二次接种区的各试验区一样在所有叶中都观察到GFP荧光。

当用直接ELISA法研究ZYMV的蓄积时，在各试验区中几乎与第1本叶二次接种区相同地都蓄积着ZYMV(图9)。就一次接种中使用的ALSV-Z:CP200的插入片段检测而言，确认到所有黄瓜个体中都保持有ALSV的插入片段。

至于第3本叶二次接种区的各试验区的病征的样子和GFP荧光的分布，意外的是在ALSV-Z:CP200+ZYMV区中包括接种叶在内的所有本叶中都没有观察到荧光，大致与第1本叶二次接种区相同。但观察到病征和GFP荧光偏移至2枚上位。

在利用直接ELISA法对ZYMV和ALSV的定量中，可知在ALSV-Z:CP200+ZYMV区中，比单一ALSV区蓄积着更多的ALSV，至于其他的试验区，得到大致与第1本叶二次接种区和第2本叶二次接种区同样的结果(图10)。确认到也保持有ALSV-Z:CP200的插入片段。

在3个品种的黄瓜(青大黄瓜、铃成四叶、TSUBASA)中，对通过预备试验中进行的p35S-Z5vector+GFP-FL接种所引起的ZYMV的病征观察进行比较，青大黄瓜表现出最严重的症状，铃成四叶表现出轻度症状，而TSUBASA几乎没有出现病征。因此，决定在以后所有试验中都使用青大黄瓜。

2-2：导入有不同的ZYMV基因片段的ALSV载体的干扰效果

为了对通过整合有ZYMV基因的不同区域的ALSV载体所诱导的干扰效果进行比较，对黄瓜的子叶一次接种ALSV-Z:P1、ALSV-Z:P3和ALSV-Z:CP200，对第1本叶二次接种p35S-Z5vector+GFP-FL。

在ALSV-Z:CP200+ZYMV区中，如上述2-1所示。一次接种ALSV-Z:P3后二次接种p35S-Z5vector+GFP-FL的试验区(ALSV-Z:P3+ZYMV区)与ALSV-Z:CP200+ZYMV区一样没有观察到病征(图11)，至于荧光，在第1本叶接种部位周边观察到点状荧光和叶脉上的荧光。第2本叶在叶脉上观察到的荧光在很窄范围内扩大了。至于第3本叶和第4本叶，仅在几个地方观察到荧光，而在从第5本叶开始的上位叶中没有观察到荧光(图12)。另一方面，在一次接种ALSV-Z:P1后二次接种p35S-Z5vector+GFP-FL的试验区(ALSV-Z:P1+ZYMV区)中，第3本叶在叶周边部位观察到弱的退绿症状，该症状在之后展开的所有叶中都观察到。虽然观察到了退绿症状，但没有观察到在单一ZYMV区所观察到的严重的花叶病症状和叶的矮化、植物体整体的矮化(图11)。对于GFP荧光，在第1本叶的接种部位周边观察到点状荧光和叶脉上的荧光，而在第2本叶中叶脉上的荧光在很窄范围中扩大。另外，在从第3本叶开始的上叶中，观察到叶脉的荧光、叶脉周边部的点状荧光、叶周边部和前端部中的荧光(图13)。

在利用直接ELISA法对ZYMV量进行测定时，对于ALSV-Z:CP200+ZYMV区和ALSV-Z:P3+ZYMV区，在第3本叶至第6本叶的所有本叶中没有看到ZYMV的蓄积。另外，在ALSV-Z:P1+ZYMV区中蓄积了约单一ZYMV区、wtALSV+ZYMV区的一半的程度(图14)。ALSV在wtALSV+ZYMV区中蓄积了约单一ALSV区的2倍，但在ALSV-Z:P1+ZYMV区、ALSV-Z:P3+ZYMV区和ALSV-Z:CP200+ZYMV区蓄积了比单一ALSV区稍多的程度(图14)。进行一次接种中使用的导入有ZYMV的各基因片段的ALSV(ALSV-Z:P1、ALSV-Z:P3、ALSV-Z:CP200)的插入片段检测，结果确认到所有黄瓜个体中都保持有ALSV的插入片段。

需要说明的是，对于ZYMV的其它的基因区域(HC-Pro、Cl、Nla、Nlb)的片段(180-201nt)也同样进行了干扰效果的试验。结果表明，Cl、Nla和Nlb各片段显示出与上述CP200片段和P3片段同样的效果。另一方面，HC-Pro片段的效果大致与上述P1片段的效果相同。

2-3：不同的黄瓜品种中的干扰效果

在与青大黄瓜不同的两个品种(铃成四叶、TSUBASA)中就ALSV-Z:CP200能否诱导对ZYMV的干扰效果进行了研究。

对于铃成四叶，在单一ZYMV区和wtALSV+ZYMV区中仅出现了退绿症状，没有观察到严重的花叶病和叶的萎缩、植物体的矮化。另外，在ALSV-Z:CP200+ZYMV区完全没有观察到病征。至于TSUBASA，在所有的试验区都没有观察到ZYMV的症状。

在铃成四叶的单一ZYMV区和wtALSV+ZYMV区中，在第1本叶至第5本叶中观察到与青大黄瓜的第1本叶二次接种区情况同样的GFP荧光的分布。在第6本叶中，虽然在基部观察到一部分没有荧光的区域，但其他部分都可观察到荧光。在第7叶以后展开的叶中从叶周边部至中心部可观察到大量点状的荧光，但在基部没有观察到荧光。在ALSV-Z:CP200+ZYMV区中，在第1本叶的接种部位周边部仅观察到少许点状的荧光，而在第2本叶中也只是观察到数个荧光点。在从第3本叶开始的上位叶中没有观察到荧光。

至于TSUBASA的单一ZYMV区和wtALSV+ZYMV区，在第1本叶至第5本叶中观察到与青大黄瓜和铃成四叶情况同样的GFP荧光的分布。在第6本叶基部虽然观察到一部分没有荧光的区域，但其他地方都观察到了荧光。在从第7本叶开始的上位叶中观察到点状荧光将叶的周边部镶边，而其他部分没有观察到荧光。在ALSV-Z:CP200+ZYMV区中，仅在第1本叶的接种部位周边观察到少许点状荧光，即使在第2本叶中也只是观察到数个荧光点。在第3本叶开始的上叶中没有观察到荧光。

当用直接ELISA法对ZYMV进行定量时，可知铃成四叶和TSUBASA的ALSV-Z:CP200+ZYMV区中，第3本叶至第6本叶中没有蓄积ZYMV(图15、图16)。而在铃成四叶和TSUBASA这两个品种中，与单一ALSV区相比，在wtALSV+ZYMV区中ALSV的蓄积量增加了，而ALSV-Z:CP200+ZYMV区中降低了若干(图15、图16)。当进行ALSV-Z:CP200的插入片段的检测时，确认出在两品种的黄瓜个体中保持有ALSV的插入片段。

2-4：导入有不同的长度的ZYMV基因片段的ALSV载体的干扰效果

为了对导入到ALSV载体中的ZYMV基因片段的长度对干扰效果是否有影响进行研究，对插入了约100nt和约200nt的ZYMV-CP基因片段的ALSV(ALSV-Z:CP100、ALSV-Z:CP200)的干扰效果进行了研究。

ALSV-Z:CP200+ZYMV区中的病征与上述的2-1的第1本叶二次接种区一样，在所有的上叶中都没有观察到病征，与此相对，在一次接种ALSV-Z:CP100后二次接种p35S-Z5vector+GFP-FL的试验区(ALSV-Z:CP100+ZYMV区)中，叶的一部分观察到弱的退绿症状(图17)。

至于ALSV-Z:CP200+ZYMV区，在第1本叶的接种部位周边观察到点状的GFP荧光和叶脉上的荧光，而在第2本叶中叶脉上的荧光在很窄范围中扩展。至于第3本叶，仅在几个地方观察到荧光，而从第4本叶开始的上位叶中没有观察到荧光，与上述的2-1的第1本叶二次接种区一样。与此相对，在ALSV-Z:CP100+ZYMV区中，在第1本叶的二次接种部位周边观察到点状的荧光和叶脉上的荧光。在第2本叶中，在叶脉上观察到荧光，随着叶的展开荧光也扩大。在第3本叶中，观察到全部叶中遍布荧光。在第4本叶中，整个叶都观察到点状荧光，特别是在叶周边部分观察到很多。在第5本叶中，在叶的周边部的叶脉上观察到荧光。在从第6本叶开始的上位叶中仅在叶的前端部中观察到荧光(图18)。

当利用直接ELISA法对ZYMV进行定量时，可知在ALSV-Z:CP200+ZYMV区的第3本叶至第6本叶中没有ZYMV蓄积，与此相对，在ALSV-Z:CP100+ZYMV区中，与单一ZYMV区和wtALSV+ZYMY区相比虽略少，但蓄积了ZYMV(图19)。对ALSV进行定量时，与单一ALSV区相比，wtALSV+ZYMV区中蓄积量增加了，而ALSV-Z:CP200+ZYMV区蓄积了同等程度。与此相对，ALSV-Z:CP100+ZYMV区如果与单一ALSV区比较，则第3本叶至第5本叶中ALSV的蓄积量增加，而第6本叶处于同等程度(图19)。当对一次接种中所使用的导入有不同的长度的ZYMV的CP基因片段的ALSV(ALSV-Z:CP100、ALSV-Z:CP200)的插入片段进行检测时，确认出在所有的黄瓜个体中保持有ALSV的插入片段。

需要说明的是，同样地对分别插入有ZYMV-CP基因的66nt片段和33nt片段的ALSV的干扰效果进行了研究。结果确认出随着插入基因片段的大小变小，干扰效果也减弱。

2-5：导入有ZYMV基因片段的ALSV与弱毒系统ZYMV的干扰效果的比较

为了对作为病毒制剂而市售的ZYMV 2002所引起的干扰效果与导入有ZYMV基因片段的3种ALSV所引起的干扰效果进行比较，研究了各试验区的病征、GFP荧光的分布以及病毒蓄积。

在一次接种ZYMV 2002后二次接种了p35S-Z5vector+GFP-FL的试验区(ZYMV 2002+ZYMV区)，在接种叶和上叶中没有观察到病征(图20)。

另外，在ALSV-Z:P1+ZYMV区、ALSV-Z:P3+ZYMV区和ALSV-Z:CP200+ZYMV区中，如2-2所述，在各个接种叶和上叶中观察到了GFP荧光，与此相对，在ZYMV 2002+ZYMV区中，接种叶和上叶中没有观察到GFP荧光(图21)。

当通过使用了GFP抗体的间接ELISA法来研究强毒ZYMV的蓄积时，在单一ZYMV区和wtALSV+ZYMV区中蓄积了GFP，与此相对，在ALSV-Z:P3+ZYMV区、ALSV-Z:CP200+ZYMV区和ZYMV 2002+ZYMV区中则完全没有蓄积GFP，而在ALSV-Z:P1+ZYMV区中少许蓄积了GFP(图22)。当进行一次接种中所使用的导入有ZYMV的各基因片段的ALSV(ALSV-Z:P、ALSV-Z:P3、ALSV-Z:CP200)的插入片段的检测时，确认出所有的黄瓜个体中保持有ALSV的插入片段。

3：考察

如果对黄瓜接种导入有ZYMV基因片段的ALSV，则预想到VIGS被诱导，获得对ZYMV的防御体制。首先，为了研究ALSV载体接种后的时间如何影响干扰效果的诱导，而在接种导入有ZYMV的CP基因的ALSV(ALSV-Z:CP200)后第6天、第9天和第12天，分别对第1本叶、第2本叶和第3本叶接种强毒ZYMV株的感染性克隆，研究了干扰效果的诱导。结果，在全部3个条件(第1本叶二次接种区、第2本叶二次接种区、第3本叶二次接种区)下，在上位叶中没有看到ZYMV的蓄积。另外，在对GFP荧光进行观察时，虽然在第1本叶二次接种区的第1本叶至第3本叶中观察到GFP荧光，但仅在第2本叶二次接种区的接种叶中观察到GFP荧光，至于第3本叶二次接种区，即使在接种叶中也没有观察到GFP荧光。以上结果表明，接种ALSV-Z:CP200后经历的天数越多，则越发抑制ZYMV的蔓延。对于该结果，若与由ALSV载体所引起的沉默诱导仅在ALSV存在的区域中发生诱导且常常在ALSV增殖后诱导VIGS这样的观察结果一并考虑，则可认为在对第1本叶和第2本叶进行二次接种的试验区中，由于ALSV尚未分布，所以在接种叶和上叶中引起ZYMV的增殖和转移。与此相对，在对第3本叶进行二次接种的试验区中由于ALSV已经分布且VIGS被诱导，所以ZYMV的增殖被抑制，观察不到GFP荧光。在对第1本叶接种的试验区中，虽然在第3本叶的很小的一部分观察到荧光，但是在使用了直接ELISA法的ZYMV量的测定中，其量为无法检出病毒的水平，另外，所有的试验区中都没有观察到病征。以上结果表明，在导入有ZYMV基因片段的ALSV所感染的黄瓜中，如果从接种起始经过6天以上，则可诱导对ZYMV的干扰效果，可以抑制ZYMV的增殖。

接下来，为了考察导入到ALSV载体中的ZYMV基因区域的不同对干扰效果的诱导带来的影响，而对导入有3种ZYMV基因的ALSV(ALSV-Z:P1、ALSV-Z:P3、ALSV-Z:CP200)之间的干扰效果进行了比较。在ALSV-Z:P1接种区中，观察到弱的病征和GFP荧光，蓄积了ZYMV，与此相对，在ALSV-Z:P3和ALSV-Z:CP200接种区中，没有观察到病征，另外，虽然观察到一部分GFP荧光，然而没有看到ZYMV的蓄积。另外，Cl、Nla和Nlb各片段也表现出与上述CP200片段和P3片段同样的效果。

为了研究不同黄瓜品种对干扰效果的影响，而使用ALSV-Z:CP200进行了比较试验，结果对被诱导的疫苗效果来说没有发现品种间差异。因此，可以认为品种的差异对干扰效果没有影响，对于这3个品种以外的品种，可认为均能够诱导ALSV载体所引起的干扰效果。

为了考察导入到ALSV载体中的基因片段的长度对干扰效果的诱导带来的影响，而对ALSV-Z:CP200和ALSV-Z:CP100所引起的干扰效果进行了比较。在一次接种了ALSV-Z:CP100的试验区中蓄积了ZYMV，观察到轻微的病征和GFP荧光，由此可认为被诱导的干扰效果不比ALSV-Z:CP200弱。由此结果可认为，在烟草中诱导PDS基因的沉默时，如果将不同大小的PDS基因片段、和同一大小而不同部分的PDS基因片段导入到ALSV载体中，则与发现沉默的程度上有差别的报告(例如非专利文献4)是一致的。需要说明的是，在将插入基因的大小进一步缩小的ALSV-Z:CP66、ALSV-Z:CP33的试验中，也确认到随着基因大小变小，干扰效果降低。根据这些结果，使用ALSV载体来对病毒诱导干扰效果时，有可能因导入到ALSV载体中的基因的大小和部位不同，则使所诱导的干扰效果不同。因此，优选制作多个导入有病毒基因片段的ALSV，对它们的干扰效果进行比较研究。

在市售的弱毒ZYMV与导入有ZYMV基因的ALSV(ALSV-Z:P1、ALSV-Z:P3、ALSV-Z:CP200)的干扰效果的比较试验中，发现GFP荧光的分布存在差异。即，在弱毒ZYMV接种区中完全没有观察到ZYMV的GFP荧光。可以认为这是由于弱毒病毒和ALSV所引起干扰效果的机构的差异所致。总之，对于ALSV载体，是通过导入基因片段的沉默来诱导干扰效果的RNA介在性机构，因此，在没有ALSV分布的区域不能进行沉默的诱导，因此认为强毒株的ZYMV增殖了。与此相对，对于弱毒ZYMV，是由同种的病毒所引起的干扰效果，因此可以认为蛋白质介在性干扰效果抑制强毒ZYMV的增殖，完全观察不到荧光。进而，至于ALSV载体和ZYMV，感染叶中的病毒的蔓延方向不同，ALSV从叶的基部向前端部蔓延，以扩展其范围的方式蔓延，与此相对，ZYMV首先蔓延到所有叶脉，然后以从叶脉渗出的方式蔓延，这样的移动的差别也许会影响干扰效果。一次接种了ALSV后二次接种ZYMV的区中，ALSV的蓄积量增加，可认为是由于引起了与ZYMV的重复感染所导致的增效作用(synergism)的缘故(例如非专利文献7)。另外，在wtALSV接种区也未发现弱的干扰效果即植物体的矮化也许是该增效作用产生影响的缘故。

归纳以上结果表明，通过在ALSV载体中整合ZYMV的基因片段，从而诱导了对ZYMV的干扰效果。然而，因所导入的基因片段的种类、大小、位置不同，干扰效果所表现出的强弱也不同，在实际上作为对病毒的干扰效果的诱导载体而加以利用时，优选制作多个导入有病毒基因片段的ALSV，比较它们的效果。

[实施例2]

导入了黄瓜花叶病毒(CMV)的基因片段的ALSV载体所引起的干扰效果

1：材料与方法

1-1：实验材料

1-1-1：供试植物

提供昆诺阿藜(quinoa)、Nicotiana tabacum cv Xanthi nc(烟草)、和黄瓜(青大黄瓜)为试验用植物。

1-1-2：供试病毒

供试病毒是由东北大学农学部准教授高桥英树博士分享的Cucumbermosaic virus strain Y(以下CMV-Y)和从独立行政法人农业生物资源研究所得到的CMV isolate 42CM(以下CMV-42CM、MAFF编号104087)。

1-2：CMV基因片段向ALSV载体的导入

1-2-1：CMV基因片段的克隆

用与实施例1的1-4-5同样的方法从CMV-Y感染烟叶中提取RNA，将提取出的RNA为模板，使用以已知的CMV-Y基因序列为基础所设计的负链引物CMVY 1a(-)、CMVY 2a(-)、CMVY CP(-)(表2：序列编号10-15)，通过以下的方法进行对于CMV-Y的RNA1(accession number：D12537)、RNA2(accession number：D12538)、RNA3(accession number：D12499)的逆转录反应。

[表2]

在容量为0.2ml的PCR管中，将2μl的RNA溶液、6μl的灭菌水、4μl的5×RT Buffer、8μl的2.5mM dNTP Mixture(TaKaRa)、1μl的10μM的负链引物、0.5μl的RNase Inhibitor、0.5μl的ReverTra Ace进行混合，使用TaKaRa PCR Thermal Cycler Dice VersionIII Model TP600，于42℃处理50分钟，然后于95℃处理5分钟，最后于4℃处理5分钟，获得的产物作为RT产物。

以得到的RT产物为模板，用与实施例1的1-2-1相同的方法，进行了基于在扩增1a基因(750nt)时使用CMVY 1a(+)与CMVY 1a(-)的组合的引物、在扩增2a基因(663nt)时使用CMVY 2a(+)与CMVY 2a(-)的组合的引物、在扩增CP基因(558nt)时使用CMVY CP(+)与CMVY CP(-)的组合(第2表)的引物这样的PCR所引起的各基因片段的扩增与PCR产物大小的确认，进行了PCR产物的使用了MonoFas DNA纯化试剂盒I的纯化，将纯化后的基因片段分别作为C:1a基因片段、C:2a基因片段、C:CP基因片段。

用与实施例1的1-2-1中相同的方法进行如下操作：利用纯化后的3种基因片段的借助pGEM-T Easy Vector System而进行的TA克隆、使用了其连接产物的大肠杆菌DH5α的性状转化，小规模的培养、利用煮沸法的质粒的提取，提取质粒的通过使用了1％琼脂糖凝胶的电泳而进行的挑选，以及通过使用了EcoR I的限制性内切酶处理而进行的插入片段的确认。

1-2-2：CMV基因片段的序列

对于通过TA克隆所制作的质粒，用与实施例1的1-2-2相同的方法进行质粒的纯化和序列解析。将确认出序列的质粒分别设为pGEM-C:1a、pGEM-C:2a、pGEM-C:CP(图23)。

1-2-3：CMV基因片段向ALSV载体的导入

以pGEM-C:1a为模板而利用CMV-Y 1a Xho(+)与CMV-Y 1a Bam(-)的组合，以pGEM-C:2a为模板而利用CMV-Y 2a Xho(+)与CMV-Y 2a Bam(-)的组合，以pGEM-C:CP为模板而使用CMV-Y CP Xho(+)与CMV-Y CPBam(-)的组合(表3：序列编号16-21)，用与实施例1的1-2-1相同的方法进行PCR。利用与II-1-(2)-3)相同的方法进行了PCR产物的使用了BamHI和Xho I而进行的限制性内切酶处理、使用了MonoFas DNA纯化试剂盒I进行的纯化。使用DNA Ligation Kit Ver.2.1进行各种插入有CMV的DNA与载体DNA的连接，将大肠杆菌DH5α性状转换后，进行小规模的培养，用煮沸法来提取质粒。

[表3]

对于保持有各插入有CMV的DNA的克隆，分别将浓度调整为1μg/μl，将得到的质粒设为ALSVR2L5R5-C:1a:、ALSVR2L5R5-C:2a、ALSVR2L5R5-C:CP(图24)。

1-2-4：ALSV载体的接种和病毒化

对于纯化后的各质粒(ALSVR2L5R5-C:1a、ALSVR2L5R5-C:2a、ALSVR2L5R5-C:CP)，用与实施例1的1-2-4相同的方法进行病毒化，将通过各质粒的接种而得的病毒分别设为ALSV-C:1a、ALSV-C:2a、ALSV-C:CP，作为以后试验的接种源。

1-3：对供试植物的接种法以及一次接种和二次接种

1-3-1：一次接种

对烟草的一次接种如下所述地进行。将分别感染了wtALSV、ALSV-C:1a、ALSV-C:2a、ALSV-C:CP的昆诺阿藜叶在2倍容量的ALSV磨碎缓冲液中磨碎。使用碳化硅法将制作的各ALSV磨碎液接种于5叶期烟草的第3至第5本叶的3枚本叶上。烟草在25℃的长日条件下培育。

对黄瓜的一次接种利用与II-(3)-1)相同的方法进行，在25℃的长日条件培育。

1-3-2：二次接种

对于烟草中的二次接种，使用CMV-Y如下所述地进行。将CMV-Y感染烟叶在2倍容量的0.1M磷酸缓冲液(pH7.0)中磨碎，使用碳化硅法对第7至第9本叶的3枚本叶进行二次接种。二次接种后，与一次接种后一样，烟草在25℃的长日条件下培育。

对于对黄瓜的二次接种，使用CMV-42CM按照以下方法接种。将CMV-42CM感染烟叶在2倍容量的0.1M磷酸缓冲液(pH7.0)中磨碎，用碳化硅法对1枚第1本叶进行二次接种。二次接种后，与一次接种后一样，黄瓜在25℃的长日条件下培育。

需说明的是，预先使用0.1M磷酸缓冲液(pH7.0)将二次接种中所用的CMV-Y和CMV-42CM接种在烟草上，采集出现病征的烟草的上叶，在-80℃下冷冻保存，备用。

1-4：病征观察与病毒检验

1-4-1：病征的观察

病征的观察在二次接种后每天都进行。烟草在二次接种后第9天，黄瓜在二次接种后第18天用数码照相机FinePix S1Pro对病征进行拍照。

1-4-2：免疫印迹法

在一次接种后第7天，对烟草采集第3本叶至第5本叶，对黄瓜采集子叶2枚，用与II-1-(4)-3)相同的方法进行免疫印迹，对一次接种后的ALSV的感染进行确认。

1-4-3：ELISA法

对于烟草中的CMV-Y和ALSV的蓄积量，如下所述地制作检验试样，用直接ELISA法进行定量。在二次接种后第9天采集第12至第15本叶，使用乳钵和乳棒在20倍容量的PBST中磨碎，将1ml磨碎液移至容量为1.5ml的微量管中。以14,000rpm(4℃)离心5分钟，将得到的上清液作为检验试样。使用用上述方法制作的检验试样，按照实施例1的1-4-4中直接ELISA法进行病毒的定量。

对于黄瓜中的CMV-42CM和ALSV的蓄积量，如下所述地制作检验试样，用实施例1中1-4-4的直接ELISA法进行定量。在二次接种后第18天分别从第3本叶至第6本叶中如II-1-(4)-4)所述地采集6枚盘形叶片，制作检验试样。

利用直接ELISA法对CMV-Y和CMV-42CM的定量使用了CMV抗体(日本植物防疫协会研究所)和酶标记的CMV抗体(日本植物防疫协会研究所)。

1-4-4：RNA提取法与RT-PCR法

对于烟草，在二次接种后第9天采集烟草的最上位叶，对于黄瓜，在二次接种后第18天采集黄瓜的最上位叶，将它们分别于-80℃进行冷冻，制成检验试样。RNA提取与逆转录反应以及PCR均利用与实施例1-4-5相同的方法进行，确认出保持有ALSV的插入片段序列。

2：结果

2-1：烟草中的导入有CMV-Y基因片段的ALSV载体的干扰效果

为了考察通过接种导入有CMV-Y基因片段的ALSV载体是否能在烟草中诱导对CMV-Y的干扰效果，而对一次接种了导入有wtALSV和CMV-Y的各基因片段的ALSV(ALSV-C:1a、ALSV-C:2a、ALSV-C:CP)的烟草二次接种了CMV-Y，考察了对CMV-Y的干扰效果的诱导。

至于未进行ALSV的一次接种而只将CMV-Y二次接种后的试验区(单一CMV-Y区)和在一次接种wtALSV后又进行CMV-Y的二次接种的试验区(wtALSV+CMV-Y区)，大约在二次接种后3天在全部个体的接种叶中观察到黄斑，大约7天在上叶中观察到严重的花叶病症状。与此相对，在一次接种了ALSV-C:2a后又二次接种了CMV-Y的试验区(ALSV-C:2a+CMV-Y区)中，在全部个体中均未观察到病征。就一次接种了ALSV-C:1a后又二次接种了CMV-Y后的试验区(ALSV-C:1a+CMV-Y区)中，在6个个体中3个个体的上叶中观察到轻微的花叶病症状，其余的3个个体观察不到病征。另一方面，至于一次接种ALSV-C:CP后又二次接种了CMV-Y的试验区(ALSV-C:CP+CMV-Y区)，6个个体所有的上叶中都观察到轻微的花叶病症状(图25、表4)。

[表4]

在对CMV-Y的蓄积进行研究时，在ALSV-C:2a+CMV-Y区中没有发现CMV-Y的蓄积。与此相对，ALSV-C:CP+CMV-Y区与单一CMV-Y区和wtALSV+CMV-Y区同等程度地进行了蓄积。ALSV-C:1a+CMV-Y区蓄积了单一CMV-Y区和wtALSV+CMV-Y区的3分之1左右(图26)。在ALSV的定量中，确认出在ALSV-C:1a+CMV-Y区和ALSV-C:2a+CMV-Y区中与单一ALSV区同等程度地发生了蓄积，wtALSV+CMV-Y区与单一ALSV区相比，蓄积量增加若干。另一方面，至于ALSV-C:CP+CMV-Y区，确认出蓄积了单一ALSV区的一半到4分之1程度这样少的量(图26)。当进行一次接种中所使用的导入有CMV-Y的各基因片段的ALSV(ALSV-C:1a、ALSV-C:2a、ALSV-C:CP)的插入片段的检测时，发现全部黄瓜个体都保持有ALSV的插入片段。

2-2：黄瓜中的导入有CMV-Y基因片段的ALSV载体的干扰效果

考察了一次接种了导入有wtALSV和CMV-Y的各基因片段的ALSV(ALSV-C:1a、ALSV-C:2a、ALSV-C:CP)后的黄瓜中的对CMV-42CM的干扰效果。

对于二次接种了单一CMV-42CM的试验区(单一CMV-42CM区)和一次接种wtALSV后二次接种了CMV-42CM的试验区(wtALSV+CMV-42CM区)，在二次接种后约3天，所有个体的第2本叶中都观察到退绿斑，又在之后展开的上叶中观察到退绿斑。特别是在第6本叶至第8本叶中观察到了花叶病症状。与此相对，就一次接种ALSV-C:2a后二次接种了CMV-42CM的试验区(ALSV-C:2a+CMV-42CM区)来说，在全部个体中都观察不到病征。至于一次接种ALSV-C:1a后二次接种了CMV-42CM的试验区(ALSV-C:2a+CMV-42CM区)，6个个体中2个个体的接种叶中观察到退绿斑，在第2本叶至第4本叶中也观察到退绿斑。而从第5本叶开始的叶中观察不到病征。另外，其余的4个个体也观察不到病征。对于一次接种ALSV-C:CP后二次接种了CMV-42CM的试验区(ALSV-C:CP+CMV-42CM区)，全部6个个体中都观察到与单一CMV-42CM区和wtALSV+CMV-42CM区同样的病征(图27)。

对CMV-42CM进行定量，结果在ALSV-C:2a+CMV-42CM区没有发现CMV-42CM的蓄积。与此相对，在ALSV-C:CP+CMV-42CM区中蓄积了与单一CMV-42CM区、wtALSV+CMV-42CM区同等程度的CMV-42CM，而在ALSV-C:1a+CMV-42CM区中，蓄积了约一半的ZYMV(图28)。另外，在ALSV-C:1a+CMV-42CM区、ALSV-C:2a+CMV-42CM区中蓄积着与单一ALSV区同等程度的ALSV，而在wtALSV+CMV-42CM区中与单一ALSV区相比，蓄积量增加了。另一方面，ALSV-C:CP+CMV-42CM区与单一ALSV区相比蓄积少(图28)。对一次接种中所使用的导入有CMV-Y的各基因片段的ALSV(ALSV-C:1a、ALSV-C:2a、ALSV-C:CP)的插入片段进行检测，结果表明所有的ALSV保持有插入片段。

3：考察

就烟草和黄瓜两种植物的接种了ALSV-C:2a的试验区来说，可诱导对CMV-Y和CMV-42CM的干扰效果，没有确认出病征和病毒的蓄积。与此相对，接种了ALSV-C:1a和ALSV-C:CP的试验区中观察到轻度病征，确认出CMV-Y和CMV-42CM的蓄积。可为这种干扰效果的差别在于导入到ALSV载体中的各个基因片段的差别。

至于整合有2a基因片段的ALSV-C:2a，由于完全不能确认出CMV-Y与CMV-42CM的病征和病毒蓄积，因此表明在烟草和黄瓜两种植物中均可诱导由ALSV载体所引起的干扰效果，可期待ALSV载体作为干扰效果诱导载体而应用在宿主植物中。

当对导入到ALSV中的各CMV-Y基因片段区域和与它相对应的CMV-42CM基因区域的碱基序列同源性进行比较时，结果发现对于1a基因而言90.3％相同、对于2a基因而言98.1％相同、对于CP基因而言97.9％相同。

在本实施例2中，通过导入有以已知的CMV-Y基因为基础所构建的2a基因片段后的ALSV，而可以对于两种CMV(CMV-Y和CMV-42CM)诱导出干扰效果。这一结果表明，通过向宿主接种导入有保存了碱基序列同源性的基因区域的片段的ALSV载体，从而能够诱导对于不同系统或分离株的干扰效果。

如果与实施例1的结果一并考察，则由于ALSV载体在不同属的病毒中成功地进行了干扰效果的诱导，因此表明通过改变导入到ALSV载体中的基因片段，从而可在短期内制出防除剂(植物疫苗)，该防除剂可诱导出对于多数病毒的干扰效果。

[实施例3]

由导入有SMV的基因片段的ALSV载体所引起的干扰效果

制作插入了对SMV的衣壳蛋白(CP)进行编码的基因组序列的一部分(201nt)后的ALSV(SMVCP-ALSV)，试验了对SMV的干扰效果。将SMVCP-ALSV一次接种于大豆品种(Jack和丹波黑)的子叶后，对展开的初生叶和第一本叶利用碳化硅法来二次接种SMV(挑战接种)。

其结果，在SMV单独接种区中，上叶表现出花叶病和缩叶症状，与此相对，一次接种了SMVCP-ALSV的区中几乎观察不到病征。另外，若与SMV单独接种区比较，则确认出SMV的增殖量明显降低，出现了SMVCP-ALSV所引起的干扰效果。另外，通过组织印迹分析对上叶中的SMV的分布进行了解析，结果表明在SMV单独接种的个体中在整个叶面中SMV呈镶嵌状分布，与此相对，在一次接种SMVCP-ALSV后的个体中病毒仅局部存在于叶脉及其附近。

[实施例4]

由导入有ZYMV和CMV的基因片段的ALSV载体所引起的干扰效果

制作以发生融合的方式插入了与实施例1相同的ZYMV基因片段(150nt)和实施例2的CMV基因片段(150nt)的ALSV(ZC-ALSV)，试验了对ZYMV和CMV的干扰效果。将ZC-ALSV一次接种于黄瓜子叶后，在5～6天后将ZYMV和CMV分别单独地或混合地二次接种于第1本叶(挑战接种)。

其结果，表明在对象区中上叶出现了伴随有ZYMV的畸形的严重的花叶病(ZYMV二次接种区)、严重的花叶病(CMV二次接种区)、严重的花叶病和矮化症状(混合二次接种区)，与此相对，对于ZC-ALSV一次接种区，对于ZYMV单独、CMV单独、ZYMV和CMV混合中的任一种的二次接种区，均表现出干扰效果，且没有发现明显的病征，另外，各病毒的蓄积也均受到抑制。

由以上结果确认到能够作出同时抑制2种病毒的ALSV混合疫苗株。

Claims (6)

1.一种重组苹果潜隐球形病毒ALSV，其保有1种或2种以上的植物病原病毒的基因组RNA或其cDNA的部分片段。

2.根据权利要求1所述的重组ALSV，其中，植物病原病毒为小西葫芦黄花叶病毒ZYMV。

3.根据权利要求1所述的重组ALSV，其中，植物病原病毒为黄瓜花叶病毒CMV。

4.根据权利要求1所述的重组ALSV，其中，植物病原病毒为大豆花叶病毒SMV。

5.一种防除植物病原病毒的感染的方法，其特征在于，将权利要求1所述的重组ALSV接种于植物的幼苗。

6.一种病原病毒抗性植物，其是在幼苗期接种了权利要求1所述的重组ALSV的病原病毒抗性植物。

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