CN103555747A

CN103555747A - 胶质细胞bFGF表达提高系统及其构建方法和应用

Info

Publication number: CN103555747A
Application number: CN201310501115.4A
Authority: CN
Inventors: 杨帆; 屠洁; 刘运辉; 王立平
Original assignee: Shenzhen Institute of Advanced Technology of CAS
Current assignee: Shenzhen Institute of Advanced Technology of CAS
Priority date: 2013-10-22
Filing date: 2013-10-22
Publication date: 2014-02-05
Anticipated expiration: 2033-10-22
Also published as: CN103555747B

Abstract

本发明涉及一种胶质细胞bFGF表达提高系统，包括：用于感染胶质细胞的病毒载体，所述病毒载体中包括依次连接的ITR、启动子、光敏基因、绿色荧光标记基因和ITR；病毒载体导入装置，用于所述病毒载体导入到所述胶质细胞中；激光刺激装置，用于产生特定波长的光线并将所述特定波长的光线传送到所述胶质细胞。这种胶质细胞bFGF表达提高系统通过病毒载体刺激感染胶质细胞，接着通过激光刺激装置产生的特定波长的光线刺激感染了病毒载体的胶质细胞，从而特异性的刺激胶质细胞提高bFGF表达。本发明还提供了一种上述胶质细胞bFGF表达提高系统的构建方法，并公开其应用。

Description

胶质细胞bFGF表达提高系统及其构建方法和应用

技术领域

本发明涉及生长因子调控技术领域，特别是涉及一种胶质细胞bFGF表达提高系统及其构建方法和应用。

背景技术

胶质细胞是中枢神经系统中一类重要的细胞类型，胶质细胞的功能对于神经元正常代谢的运转，突触可塑性的维持和脑内微血管血流的控制都发挥重要作用。胶质细胞的重要功能同释放的神经递质和各类生长因子密切相关，胶质细胞可以分泌ATP,丝氨酸和谷氨酸等神经递质，同时还可以分泌bFGF,BDNF(脑相关生长因子)，NGF(神经生长因子)等生长因子。

碱性成纤维细胞生长因子（basic fibroblast growth factor,bFGF）,是一种重要的生长因子，在细胞的生长、增殖和代谢维持中发挥重要作用。在中枢神经系统中，bFGF主要由胶质细胞合成和释放，对于神经元的正常发育和维持正常生理功能都发挥重要作用。bFGF合成和释放同多种神经精神系统疾病相关，以严重影响人类健康的帕金森氏病为例，黑质纹状体的多巴胺能神经元的功能受bFGF的精细调节，bFGF不仅能维持多巴胺能神经元在胚胎发育阶段的正常发育，还可以对多巴胺能神经元进行保护作用，提高bFGF的在体水平对于治疗帕金森氏病具有重要的预防和治疗意义。

传统的提高胶质细胞bFGF表达的方法多通过药物刺激胶质细胞的方法进行，通过激活胶质细胞上的多巴胺能受体和内部的分子通路来促使胶质细胞释放bFGF，但该方法特异性低，在影响胶质细胞的同时也会干预神经元或其他细胞。

发明内容

基于此，有必要提供一种特异性提高bFGF表达的胶质细胞bFGF表达提高系统及其构建方法和应用。

一种胶质细胞bFGF表达提高系统，包括：

用于感染胶质细胞的病毒载体，所述病毒载体中包括依次连接的ITR、启动子、光敏基因、绿色荧光标记基因和ITR；

病毒载体导入装置，用于所述病毒载体导入到所述胶质细胞中；

激光刺激装置，用于产生特定波长的光线并将所述特定波长的光线传送到所述胶质细胞。

在一个实施例中，所述启动子为CMV，所述光敏基因为ChETA，绿色荧光标记基因为eYFP。

在一个实施例中，所述病毒载体导入装置为注射器。

在一个实施例中，所述激光刺激装置包括激光发生器和光纤，所述激光发生器用于产生波长为470nm的蓝光，所述光纤用于将所述激光发生器产生的波长为470nm的蓝光传送到所述胶质细胞。

一种胶质细胞bFGF表达提高系统的构建方法，包括如下步骤：

将包括依次连接的ITR、启动子、光敏基因、绿色荧光标记基因和ITR的融合质粒以及与慢病毒包装相关的混合质粒pCMVΔR8.74和pMD2.G.一起，用脂质体一起转染至293FT细胞中，然后将所述293FT细胞传代培养后，破碎细胞膜、过柱，取上清液，所述上清液中含有用于感染胶质细胞的病毒载体，所述病毒载体中包括依次连接的ITR、启动子、光敏基因、绿色荧光标记基因和ITR；

提供用于所述病毒载体导入到所述胶质细胞中的病毒载体导入装置；

提供用于产生特定波长的光线并将所述特定波长的光线传送到所述胶质细胞的激光刺激装置。

在一个实施例中，所述病毒载体导入装置为注射器。

一种上述的胶质细胞bFGF表达提高系统在治疗帕金森症、癫痫、运动神经障碍、中风或抑郁症中的应用。

这种胶质细胞bFGF表达提高系统通过病毒载体刺激感染胶质细胞，接着通过激光刺激装置产生的特定波长的光线刺激感染了病毒载体的胶质细胞，从而特异性的刺激胶质细胞提高bFGF表达。这种胶质细胞bFGF表达提高系统用于提高胶质细胞的bFGF表达，相对于传统的提高胶质细胞bFGF表达的方法，特异性较高。

附图说明

图1为病毒载体感染离体小鼠胶质细胞48hr后的明场照片（BF）和荧光（FL）照片对比图；

图2为采用激光刺激装置对实施例1得到的胶质细胞进行蓝光刺激，得到的刺激电流和内向光电流的对比图；

图3为通过免疫荧光共定位的方法确定胶质细胞在体特异性表达光感基因得到的eYFP和ChETA的表达对比图；

图4为通过蓝光刺激在体胶质细胞三周后，取出纹状体的组织进行匀浆，ELISA后得到的bFGF表达对比图；

图5为通过免疫荧光的方法对TH进行染色，评估多巴胺能神经元在bFGF作用下的数量变化，得到的对比图；

图6为将神经干细胞移植入受损的纹状体部位，然后进行蓝光刺激，3周之后检测其表达多巴胺能分子标记物的情况得到的对比图。

具体实施方式

为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合附图对本发明的具体实施方式做详细的说明。在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明。但是本发明能够以很多不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似改进，因此本发明不受下面公开的具体实施的限制。

一实施方式的胶质细胞bFGF表达提高系统，包括用于病毒载体、病毒载体导入装置和激光刺激装置。

病毒载体用于感染胶质细胞，病毒载体中包括依次连接的ITR（invertedterminal repeat，反向终端重复序列）、启动子、光敏基因、绿色荧光标记基因和ITR。

本实施方式中，启动子为CMV，光敏基因为ChETA，绿色荧光标记基因为eYFP。

本实施方式中，病毒载体为慢病毒载体。

光感基因调控技术是近几年快速发展的一种新兴技术，其原理是基于基因治疗的方法给哺乳动物细胞转入不同的对光敏感的基因，通过不同波长的光对特定细胞类型活性进行调控。Channelrhodopsin-2(ChR2)编码阳离子通道蛋白，493nm波长的蓝光光照后使阳离子进入细胞，而兴奋细胞活性。

ChETA把ChR2的E123突变为苏氨酸或丙氨酸，提高了对频率较高的光照的敏感性和稳定性。利用光感基因ChETA的电传导性和快速动力学特性，不仅可以实现通过光来诱导神经元产生动作电位，还可以调控神经系统的兴奋性和突触的传递性。

病毒载体导入装置用于病毒载体导入到胶质细胞中。在一个实施例中，病毒载体导入装置为注射器。

激光刺激装置用于产生特定波长的光线并将特定波长的光线传送到胶质细胞。

激光刺激装置包括激光发生器和光纤，激光发生器用于产生波长为470nm的蓝光，光纤用于将激光发生器产生的波长为470nm的蓝光传送到胶质细胞。

上述胶质细胞bFGF表达提高系统的构建方法，包括如下步骤：

S10、将包括依次连接的ITR、启动子、光敏基因、绿色荧光标记基因和ITR的融合质粒以及与慢病毒包装相关的混合质粒pCMVΔR8.74和pMD2.G.一起，用脂质体一起转染至293FT细胞中，然后将293FT细胞传代培养后，破碎细胞膜、过柱，取上清液，上清液中含有用于感染胶质细胞的病毒载体，病毒载体中包括依次连接的反向终端重复序列ITR、启动子、光敏基因、绿色荧光标记基因和反向终端重复序列ITR。

具体而言，将该转染后的293FT细胞传代至25代后即需要更换新的一批细胞株。转染24小时后，将培养293FT细胞的培养液换成无血清含有5mM丙酮酸钠的DMEM培养液后继续孵育16小时。

然后，用超速离心机对上述293FT细胞进行破膜得到细胞悬液，将该细胞悬液通过20%的蔗糖滤柱，收集上清，得到含有携带光敏基因的病毒的细胞液。该病毒滴度能达3×10⁸TU/mL以上，用灭菌的磷酸盐缓冲液重悬含有携带光敏基因的病毒的细胞液得到重悬液，其中含有携带光敏基因的病毒的细胞液与磷酸盐缓冲液的体积比为1:1000。

本实施方式中，包括依次连接的ITR、启动子、光敏基因、绿色荧光标记基因和ITR的融合质粒通过如下步骤制备得到：将人源化CMV-ChETA密码子(由stanford大学Karl Deisseroth教授的实验室2007年馈赠，GENE ID:3077445)通过HindIII/BamHI酶切位点融入到开放型框架质粒pCS2-eYFP-ITR(于2008年从Clotech公司购得)的N末端。

构建成功后的融合质粒通过Qiagen公司的maxiprep试剂盒纯化扩增，PCR扩增的正向引物序列为SEQ ID No.1所示的序列，反向引物序列为SEQ ID No.2所示的序列，目标产物的大小为3.6kb。

S20、提供用于病毒载体导入到胶质细胞中的病毒载体导入装置。

S30、提供用于产生特定波长的光线并将特定波长的光线传送到胶质细胞的激光刺激装置。

这种胶质细胞bFGF表达提高系统可以用于治疗帕金森症、癫痫、运动神经障碍、中风或抑郁症。

下通过具体实施例，对这种胶质细胞bFGF表达提高系统的作用进行进一步的解释和实验证明。

实施例1

病毒载体的构建以及侵染体外胶质细胞

将包括依次连接的ITR、启动子、光敏基因、绿色荧光标记基因和ITR的融合质粒，和慢病毒包装的质粒pCMVΔR8.74、pMD2.G.（1.5　g）一起，利用脂质体（Invitrogen公司产品）一起转染至293FT细胞（ATCC公司产品，该细胞传代至25代后即需要更换新的一批细胞株）中（每200，000个细胞用6mg/L脂质体），24hr后用含有5mM丙酮酸钠的DMEM替代原293FT细胞的培养液继续培养，16小时后，利用超速离心机在50，000g速度下破膜，将悬液通过20%的蔗糖滤柱，收集上清。该病毒滴度能达3×10⁸TU/mL以上，产出的病毒颗粒以灭菌的磷酸盐缓冲液以1：1000的体积比进行重悬。将获取的病毒按1：400的体积比混入无血清DMEM中，用于感染目标细胞：星型胶质细胞；6小时后，将含病毒的培养液换成新鲜含有10%胎牛血清的DMEM，继续培养48小时-72小时；放到显微镜下观察，如果80%左右的细胞表达绿色荧光的标记蛋白，可初步证实转染成功。

试验用的胶质细胞来自新生小鼠纹状体的胶质细胞，利用上述的携带光感基因的病毒载体感染胶质细胞（感染浓度为1:500），感染24hr后用含10%血清的培养基替代感染时的无血清培养基后继续观察，在48hr后的明场照片（BF）和荧光（FL）照片如图1所示。

图1中可以观察到胶质细胞有绿色荧光表达，提示光感基因标记胶质细胞成功。

实施例2

以膜片钳技术对纹状体来源的胶质细胞表达的光敏通道蛋白的进行功能验证。

采用激光刺激装置对上述细胞进行蓝光刺激，这种系统在此刺激模式下，光强到1.1mW左右，光刺激的相关参数为：10Hz，50ms。

以电压钳的形式记录相关由光所诱发的内向光电流，以确认光敏型胶质细胞被光特异性地改变了兴奋性。

得到的刺激电流和内向光电流的对比图为图2，由图2可以看出，蓝光刺激胶质细胞，单个脉冲刺激和连续光脉冲刺激可以诱发对应的光电流。

实施例3

在体试验。

利用光基因载体对在体的胶质细胞进行感染，通过绿色荧光验证光基因对胶质细胞标记。

通过携带光感基因的病毒载体对小鼠的纹状体部位进行注射，病毒注射剂量为3微升，注射后首先通过免疫荧光共定位的方法确定胶质细胞在体特异性表达光感基因，得到图3。

由图3可以看出，免疫荧光共定位表明在体胶质细胞可以表达胶质细胞标记物eYFP和光基因ChETA，表明光基因可以特异的标记胶质细胞。

光感基因小鼠纹状体胶质细胞表达1周后，在对应位置植入直径200μm的光纤，光照的平均强度为10mW/mm²，然后通过蓝光刺激在体胶质细胞，每周照射3次，共持续三周，3周之后取出纹状体的组织进行匀浆，在此时通过酶联免疫吸附（ELISA）的方法对组织内的碱性成纤维生长因子进行定量测量，得到图4。

由图4可以看出，在体携带光基因的胶质细胞在光照后释放bFGF显著高于对照组和携带空壳病毒组。

通过MPTP的方法建立小鼠的帕金森氏病模型,在模型发病2周后，通过光调控的方法增加组织内的bFGF因子的含量，然后通过免疫荧光的方法对酪氨酸羟化酶（TH）进行染色，从而评估多巴胺能神经元在bFGF作用下的数量变化，得到图5。

从图5中可以明显看出携带光基因的光照组的多巴胺神经元的数量显著高于对照组和空壳病毒组。在升高bFGF因子的作用下，多巴胺能神经元的数量明显增多，提示bFGF对PD动物模型的受损伤部位有一定的修复作用。

进一步评估bFGF在体水平升高后对干细胞修复PD模型的影响，建立MPTP的小鼠的帕金森病模型，在体感染胶质细胞2周后，将神经干细胞移植入受损的纹状体部位，然后进行蓝光刺激，每周刺激3次，刺激3周之后通过免疫荧光共定位的方法对移植入纹状体的神经干细胞进行定位，同时检测其表达多巴胺能分子标记物（TH/DAT/Nurr）的情况，得到图6。

从图6中可以看出在干细胞移植模型中，携带光基因的光照组的干细胞向多巴胺神经元分化的数量显著高于对照组和空壳病毒组。

在bFGF升高的作用下，干细胞向多巴胺能神经元的分化明显增多，提示在体bFGF的升高可以提高干细胞对帕金森氏病的修复效果。

结合上述试验，可以得出如下结论。

i.纹状体来源的胶质细胞，且对光刺激的不同频率做出一一对应的光电流；

ii.光特异性刺激在体胶质细胞有效提高bFGF的释放；

iii.光特异性刺激胶质细胞后，有效提高在体bFGF的水平和浓度，促进局部多巴胺能神经元的数量增加。

iv.光在动物体内特异性刺激胶质细胞后，有效促进移植干细胞向多巴胺能神经元方向分化，并修复帕金森氏病中受损的神经回路。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims

1.一种胶质细胞bFGF表达提高系统，其特征在于，包括：

2.根据权利要求1所述的胶质细胞bFGF表达提高系统，其特征在于，所述启动子为CMV，所述光敏基因为ChETA，绿色荧光标记基因为eYFP。

3.根据权利要求1所述的胶质细胞bFGF表达提高系统，其特征在于，所述病毒载体导入装置为注射器。

4.根据权利要求1所述的胶质细胞bFGF表达提高系统，其特征在于，所述激光刺激装置包括激光发生器和光纤，所述激光发生器用于产生波长为470nm的蓝光，所述光纤用于将所述激光发生器产生的波长为470nm的蓝光传送到所述胶质细胞。

5.一种胶质细胞bFGF表达提高系统的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：

将包括依次连接的ITR、启动子、光敏基因、绿色荧光标记基因和ITR的融合质粒以及与慢病毒病毒包装相关的混合质粒pCMVΔR8.74和pMD2.G.一起，用脂质体一起转染至293FT细胞中，然后将所述293FT细胞传代培养后，破碎细胞膜、过柱，取上清液，所述上清液中含有用于感染胶质细胞的病毒载体，所述病毒载体中包括依次连接的ITR、启动子、光敏基因、绿色荧光标记基因和ITR；

6.根据权利要求5所述的胶质细胞bFGF表达提高系统的构建方法，其特征在于，所述启动子为CMV，所述光敏基因为ChETA，绿色荧光标记基因为eYFP。

7.根据权利要求5所述的胶质细胞bFGF表达提高系统的构建方法，其特征在于，所述病毒载体导入装置为注射器。

8.根据权利要求5所述的胶质细胞bFGF表达提高系统的构建方法，其特征在于，所述激光刺激装置包括激光发生器和光纤，所述激光发生器用于产生波长为470nm的蓝光，所述光纤用于将所述激光发生器产生的波长为470nm的蓝光传送到所述胶质细胞。

9.一种如权利要求1～4任一项所述的胶质细胞bFGF表达提高系统在治疗帕金森症、癫痫、运动神经障碍、中风或抑郁症中的应用。