CN103540631B - 一种以棉籽糖蜜及棉籽油为底物发酵生产槐糖脂的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种以棉籽糖蜜及棉籽油为底物发酵生产槐糖脂的方法，是以廉价的棉籽糖蜜及棉籽油替代价格昂贵的葡萄糖和油酸实现发酵生产槐糖脂。本发明方法具有原料价格低廉，工艺简便，产槐糖脂能力高的特点，为提高棉籽利用率，减少能源消耗以及推广槐糖脂工业大规模生产提供了基础。
Description
技术领域
本发明涉及一种槐糖脂生产的方法，尤其涉及一种以棉籽糖蜜及棉籽油为底物由拟威克酵母变种(Wickerhamiella domercqiae var.sophorolipid)发酵生产槐糖脂的方法。
背景技术
槐糖脂是一种重要的表面活性剂，其和化学表面活性剂相比，具有生物可降解性，低毒性及良好的环境兼容性等优点，而被广泛应用于石油、食品、医药、环境保护、化妆品等工业领域。
槐糖脂目前主要是通过微生物发酵获得。制备成本较高是制约槐糖脂应用的一个重要因素。因此，设法降低槐糖脂的生产成本，提高槐糖脂的产量是其在各领域中广泛应用的先决条件。
中国是世界产棉大国，种植面积在500万公顷左右（约合7500万亩），棉花产量大约700万吨，棉籽占棉花比例的35-40%。棉籽糖蜜为利用棉籽生产棉籽糖的下脚料，价格低廉，但是其目前主要作为饲料，利用效率低；棉籽油由于其含有难以去除的棉酚，食品安全要求较高，作为食用油市场前景并不明朗，因此造成由棉籽压榨得到的棉籽油及生产棉籽糖而产生的副产物棉籽糖蜜具有产量大，价格低，行业使用率低的现状，成为行业负担。基于此，以棉籽糖蜜及棉籽油为进行槐糖脂发酵的原料发酵生产槐糖脂在实际应用方面具有重要的价值。经文献和专利检索，利用棉籽糖蜜及棉籽油作为廉价底物生产槐糖脂的研究国内外还未见报道。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明要解决的问题是提供一种以棉籽糖蜜及棉籽油为底物发酵生产槐糖脂的方法。
本发明所述以棉籽糖蜜及棉籽油为底物发酵生产槐糖脂的方法，步骤是：
(1)制备发酵培养基：
取含水量<20%的棉籽糖蜜，以w/v计配制成10～15%的水溶液，在35～55℃水浴10～30min至棉籽糖蜜完全溶解，然后向溶液中加入棉籽油并使其浓度以v/v计为5～9%，得适于发酵生产槐糖脂的发酵培养基，115℃灭菌30～40min后，冷却备用；
(2)发酵生产槐糖脂：
将活化好的拟威克酵母变种（Wickerhamierlla domercqiae var.sophorolipid）CGMCCNo.1576以体积百分比为1～4%的接种量接种于含上述发酵培养基的摇瓶中，于25±2℃、150～300rpm，摇床振荡发酵培养7～9天，得到含槐糖脂的发酵液；
或者，
将活化好的拟威克酵母变种（Wickerhamierlla domercqiae var.sophorolipid）CGMCCNo.1576以体积百分比为1～4%的接种量接种于含上述发酵培养基的发酵罐中，发酵罐的发酵参数设定为：温度25±2℃，通气量0.5～2.0L/min，初始转速200～500rpm、12～24h后升至600～900rpm，发酵时间7～9天，得到含槐糖脂的发酵液；
(3)槐糖脂的粗提：
取含槐糖脂的发酵液加入其2～6倍体积的乙酸乙酯萃取，6000～8000rpm离心5～15min，收集乙酸乙酯层，减压浓缩后烘干，得内酯型槐糖脂粗品；
或取含槐糖脂的发酵液加入其3～6倍体积的乙醇，涡旋混合，6000～10000rpm离心5～15min，收集上清，减压浓缩后烘干，得总槐糖脂粗品。
上述以棉籽糖蜜及棉籽油为底物发酵生产槐糖脂的方法中：步骤(1)所述棉籽糖蜜优选购自济南中棉生物科技有限公司，所述棉籽油优选购自山东省恒兴有限公司。
上述以棉籽糖蜜及棉籽油为底物发酵生产槐糖脂的方法中：步骤(1)所述棉籽糖蜜优选以w/v计配制成11.5～12%的水溶液；所述棉籽油浓度优选以v/v计为6～7%。
最优的适于发酵生产槐糖脂的发酵培养基为棉籽糖蜜120.0g/L，棉籽油7.0%（v/v）。
上述以棉籽糖蜜及棉籽油为底物发酵生产槐糖脂的方法中：步骤(2)所述摇瓶发酵的温度优选是25℃、摇床振荡转数优选为200rpm。
上述以棉籽糖蜜及棉籽油为底物发酵生产槐糖脂的方法中：步骤(2)所述发酵罐的发酵参数优选为：温度25℃，通气量1.0L/min，初始转速400rpm、12后升至700rpm。
对利用棉籽糖蜜及棉籽油发酵得到的槐糖脂进行HPLC-MS鉴定：
1.HPLC成分分析：
制样：将制得的槐糖脂提取样品分别溶解于色谱纯甲醇，0.22μm有机膜过滤后用于分析。
条件：分析柱为Venusil MP C18分析柱（4.6μm×250mm×4.6mm，Agela Technologies Inc.,USA）；流动相为乙腈/水，采用梯度洗脱（v/v），总流速1～3ml/min，程序如下：0～15min，乙腈含量从40±5%升高至60±5%；15～30min，乙腈含量从60±5%升高至70±5%；30～40min乙腈含量从70±5%升高至90±5%，并在90±5%保持5min；检测波长：200～210nm。
2.使用API4000质谱仪（Applied Biosystems,USA）对HPLC各峰进行MS分析：
离子源：ESI；喷雾电压：-4500V；离子源温度：100℃；雾化气：25psi；辅助气：20psi；正离子或者负离子模式，扫描范围在50～800amu。
本发明方法利用棉籽糖蜜及棉籽油为碳源培养基发酵生产槐糖脂，通过HPLC-MS检测鉴定，发现7种主要的槐糖脂组分，和利用葡萄糖、油酸为底物发酵所得槐糖脂成分基本一致，证明棉籽糖蜜和棉籽糖完全可以起到很好的替代作用。实验还证实本发明方法比利用葡萄糖油酸培养基的进行发酵槐糖脂产量基本一致，且无需添加无机盐及较为昂贵的酵母粉，明显降低了生产成本，同时本发明方法工艺简便，提高了棉籽的利用率，减少了能源消耗，非常利于进行工业大规模生产。
附图说明
图1棉籽糖蜜与棉籽油的二因子响应面实验的结果曲面图（A），等值线图(B)。
图2利用葡萄糖与油酸作为底物(A)和棉籽糖蜜与棉籽油作为底物(B)进行发酵生产槐糖脂，7天后发酵液槐糖脂HPLC成分比较。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明内容作进一步的说明。
实施例1：
（1）第一碳源与第二碳源替换：配制四组发酵培养基（g/l）：a葡萄糖80.0，油酸6%（v/v）；b葡萄糖80.0，棉籽油6%（v/v）；c棉籽糖蜜133.33（含糖80.0），油酸6%（v/v），d棉籽糖蜜133.33（含糖80.0）棉籽油6%（v/v），每组均加KH2PO41.0，Na2HPO41.0，MgSO4·7H2O0.50，酵母粉3.0，pH自然。
（2）发酵生产槐糖脂：将（1）中四组发酵培养基115℃，30min灭菌后，冷却。将活化好的拟威克酵母变种（Wickerhamierlla domercqiae var.sophorolipid）CGMCC No.1576以体积百分比为2%的接种量接种于上述四种发酵培养基中于25℃、200rpm，摇床振荡发酵培养7天，得到槐糖脂的发酵液。
（3）槐糖脂的粗提：取含槐糖脂的发酵液加入其2倍体积的乙酸乙酯萃取，6000rpm离心15min，收集乙酸乙酯层，减压浓缩后烘干，得内酯型槐糖脂粗品；或取含槐糖脂的发酵液加入其3倍体积的乙醇，涡旋混合，6000rpm离心15min，收集上清，减压浓缩后烘干，得总槐糖脂粗品。
（4）槐糖脂粗品HPLC比较：将不同的槐糖脂处提取样品分别溶解于色谱纯甲醇，0.22μm有机膜过滤后用于分析型HPLC分析。上柱前，超纯水与有机溶剂菌要经过0.22μm滤膜过分别过滤。分析柱为Venusil MP C18分析柱（4.6μm×250mm×4.6mm，Agela Technologies Inc.,USA）；流动相为乙腈/水，采用梯度洗脱（v/v），总流速1ml/min，程序如下：0～15min，乙腈含量从40%升高至60%；15～30min，乙腈含量从60%升高至70%；30～40min乙腈含量从70%升高至90%，并在90%保持5min；检测波长：207nm。
结果表明，利用葡萄糖与油酸作为碳源的培养基进行槐糖脂发酵实验，得到槐糖脂45.75g/l，内酯型槐糖脂为21.10g/l，对第一碳源和第二碳源用棉籽糖蜜及棉籽油替换时，产量均略为下降。
实施例2：
（1）氮源梯度设计：配制五组发酵培养基（g/l）：其中以酵母粉添加量分别为0，1.0g/l，2.0g/l，3.0g/l，4.0g/l五个梯度，并均加入棉籽糖蜜133.33（含糖80.0），KH2PO41.0，Na2HPO41.0，MgSO4·7H2O0.50，棉籽油6%（v/v），pH自然。
（2）发酵生产槐糖脂：将（1）中五组发酵培养基115℃，30min灭菌后，冷却。将活化好的拟威克酵母变种（Wickerhamierlla domercqiae var.sophorolipid）CGMCC No.1576以体积百分比为2%的接种量接种于上述发酵培养基中于25℃、200rpm，摇床振荡发酵培养7天，得到槐糖脂的发酵液。
（3）槐糖脂的粗提：取含槐糖脂的发酵液加入其2倍体积的乙酸乙酯萃取，6000rpm离心15min，收集乙酸乙酯层，减压浓缩后烘干，得内酯型槐糖脂粗品；或取含槐糖脂的发酵液加入其3倍体积的乙醇，涡旋混合，6000rpm离心15min，收集上清，减压浓缩后烘干，得总槐糖脂粗品。
（4）槐糖脂粗品HPLC比较：将不同的槐糖脂处提取样品分别溶解于色谱纯甲醇，0.22μm有机膜过滤后用于分析型HPLC分析。上柱前，超纯水与有机溶剂菌要经过0.22μm滤膜过分别过滤。分析柱为Venusil MP C18分析柱（4.6μm×250mm×4.6mm，Agela Technologies Inc.,USA）；流动相为乙腈/水，采用梯度洗脱（v/v），总流速1ml/min，程序如下：0～15min，乙腈含量从40%升高至60%；15～30min，乙腈含量从60%升高至70%；30～40min乙腈含量从70%升高至90%，并在90%保持5min；检测波长：207nm。
实验结果表明，随着发酵液的酵母粉含量降低，其槐糖脂产量升高，当不添加酵母粉时，槐糖脂的产量达到最大值，此时产量为利用葡萄糖基本发酵培养基产量的95%。因此，单独不添加氮源既简化了配方，降低了成本，又提高了产量。
实施例3：
（1）无机盐影响：配制两组发酵培养基（g/l）：一组添加KH2PO41.0，Na2HPO41.0，MgSO4·7H2O0.50，另一组不添加无机盐离子，两组均加棉籽糖蜜133.33（含糖80.0），棉籽油6%（v/v），pH自然。
（2）发酵生产槐糖脂：将（1）中两组发酵培养基115℃，30min灭菌后，冷却。将活化好的拟威克酵母变种（Wickerhamierlla domercqiae var.sophorolipid）CGMCC No.1576以体积百分比为2%的接种量接种于上述发酵培养基中于25℃、200rpm，摇床振荡发酵培养7天，得到槐糖脂的发酵液。
（3）槐糖脂的粗提：取含槐糖脂的发酵液加入其2倍体积的乙酸乙酯萃取，6000rpm离心15min，收集乙酸乙酯层，减压浓缩后烘干，得内酯型槐糖脂粗品；或取含槐糖脂的发酵液加入其3倍体积的乙醇，涡旋混合，6000rpm离心15min，收集上清，减压浓缩后烘干，得总槐糖脂粗品。
（4）槐糖脂粗品HPLC比较：将不同的槐糖脂处提取样品分别溶解于色谱纯甲醇，0.22μm有机膜过滤后用于分析型HPLC分析。上柱前，超纯水与有机溶剂菌要经过0.22μm滤膜过分别过滤。分析柱为Venusil MP C18分析柱（4.6μm×250mm×4.6mm，Agela Technologies Inc.,USA）；流动相为乙腈/水，采用梯度洗脱（v/v），总流速1ml/min，程序如下：0～15min，乙腈含量从40%升高至60%；15～30min，乙腈含量从60%升高至70%；30～40min乙腈含量从70%升高至90%，并在90%保持5min；检测波长：207nm。
实验表明，不添加无机盐离子与添加无机盐离子的培养基对槐糖脂最终产量基本没有变化，在2%以内。因此考虑成本与培养基简化可以不添加无机盐。
实施例4：
（1）单因子梯度设计：配制两组发酵培养基：一组设置棉籽糖蜜梯度（w/v）为8.33%，10.0%，11.67%，13.33%，15.0%，棉籽油浓度为6%（v/v）；另一组设置糖蜜为11.67%（w/v），棉籽油梯度（v/v）为5.0%，6.0%，7.0%，8.0%，9.0%，pH自然。
（2）发酵生产槐糖脂：将（1）中两组发酵培养基115℃，30min灭菌后，冷却。将活化好的拟威克酵母变种（Wickerhamierlla domercqiae var.sophorolipid）CGMCC No.1576以体积百分比为2%的接种量接种于上述四种发酵培养基中于25℃、200rpm，摇床振荡发酵培养7天，得到槐糖脂的发酵液。
（3）槐糖脂的粗提：取含槐糖脂的发酵液加入其2倍体积的乙酸乙酯萃取，6000rpm离心15min，收集乙酸乙酯层，减压浓缩后烘干，得内酯型槐糖脂粗品；或取含槐糖脂的发酵液加入其3倍体积的乙醇，涡旋混合，6000rpm离心15min，收集上清，减压浓缩后烘干，得总槐糖脂粗品。
（4）槐糖脂粗品HPLC比较：将不同的槐糖脂处提取样品分别溶解于色谱纯甲醇，0.22μm有机膜过滤后用于分析型HPLC分析。上柱前，超纯水与有机溶剂菌要经过0.22μm滤膜过分别过滤。分析柱为Venusil MP C18分析柱（4.6μm×250mm×4.6mm，Agela Technologies Inc.,USA）；流动相为乙腈/水，采用梯度洗脱（v/v），总流速1ml/min，程序如下：0～15min，乙腈含量从40%升高至60%；15～30min，乙腈含量从60%升高至70%；30～40min乙腈含量从70%升高至90%，并在90%保持5min；检测波长：207nm。
实验结果表明，通过对棉籽糖蜜进行梯度实验，发现棉籽糖蜜在11.67%（w/v，含糖7%）槐糖脂产量最高，棉籽油浓度在7%时，在5个棉籽油梯度中，槐糖脂产量达到最大值。
实施例5：
（1）二因子响应面优化：以棉籽糖蜜及棉籽油浓度为二因子，以10%（w/v）的棉籽糖蜜，及6%(v/v)棉籽油为基点，设计13组实验，2%为一个单位，分组情况见表1。
（2）发酵生产槐糖脂：将（1）中13组发酵培养基115℃，30min灭菌后，冷却。将活化好的拟威克酵母变种（Wickerhamierlla domercqiae var.sophorolipid）CGMCC No.1576以体积百分比为2%的接种量接种于上述发酵培养基中于25℃、200rpm，摇床振荡发酵培养7天，得到槐糖脂的发酵液。
（3）槐糖脂的粗提：取含槐糖脂的发酵液加入其2倍体积的乙酸乙酯萃取，6000rpm离心15min，收集乙酸乙酯层，减压浓缩后烘干，得内酯型槐糖脂粗品；或取含槐糖脂的发酵液加入其3倍体积的乙醇，涡旋混合，6000rpm离心15min，收集上清，减压浓缩后烘干，得总槐糖脂粗品。
（4）槐糖脂粗品HPLC比较：将不同的槐糖脂处提取样品分别溶解于色谱纯甲醇，0.22μm有机膜过滤后用于分析型HPLC分析。上柱前，超纯水与有机溶剂菌要经过0.22μm滤膜过分别过滤。分析柱为Venusil MP C18分析柱（4.6μm×250mm×4.6mm，Agela Technologies Inc.,USA）；流动相为乙腈/水，采用梯度洗脱（v/v），总流速1ml/min，程序如下：0～15min，乙腈含量从40%升高至60%；15～30min，乙腈含量从60%升高至70%；30～40min乙腈含量从70%升高至90%，并在90%保持5min；检测波长：207nm。
通过预实验，以10%（w/v）的棉籽糖蜜，及6%(v/v)棉籽油为基点，设计的13组变量组合，发酵结果如表1所示。
表1棉籽糖蜜与棉籽油的二因子响应面实验分组及产量情况
通过结果分析（如图1），最适棉籽糖蜜浓度为12%（w/v），棉籽油浓度为7%(v/v)。槐糖脂产量高于48.07g/l，内酯型槐糖脂产量高于25.0g/l。对照组，葡萄糖油酸基本培养基槐糖脂产量为46.15g/l，内酯型为24.0g/l，产量至少提高4.16%。因此，通过条件优化，利用棉籽糖蜜及棉籽油发酵培养基的槐糖脂产量比最初提高约10%，且不添加无机盐及氮源，使得成分更加简单，廉价。
实施例6：
（1）优化结果验证：配制两组发酵培养基（g/l）：a葡萄糖80.0，KH2PO41.0，Na2HPO41.0，MgSO4·7H2O0.50，酵母粉3.0，油酸6%（v/v），b棉籽糖蜜120.0，棉籽油7%（v/v）；pH均自然。
（2）发酵生产槐糖脂：将步骤（1）中2组发酵培养基115℃，30min灭菌后，冷却。将活化好的拟威克酵母变种（Wickerhamierlla domercqiae var.sophorolipid）CGMCC No.1576以体积百分比为2%的接种量接种于上述发酵培养基中于25℃、200rpm，摇床振荡发酵培养7天，得到槐糖脂的发酵液。
（3）槐糖脂的粗提：取含槐糖脂的发酵液加入其2倍体积的乙酸乙酯萃取，6000rpm离心15min，收集乙酸乙酯层，减压浓缩后烘干，得内酯型槐糖脂粗品；或取含槐糖脂的发酵液加入其3倍体积的乙醇，涡旋混合，6000rpm离心15min，收集上清，减压浓缩后烘干，得总槐糖脂粗品。
（4）HPLC分析：将不同的槐糖脂处提取样品分别溶解于色谱纯甲醇，0.22μm有机膜过滤后用于分析型HPLC分析。上柱前，超纯水与有机溶剂菌要经过0.22μm滤膜过分别过滤。分析柱为Venusil MP C18分析柱（4.6μm×250mm×4.6mm，Agela Technologies Inc.,USA）；流动相为乙腈/水，采用梯度洗脱（v/v），总流速1ml/min，程序如下：0～15min，乙腈含量从40%升高至60%；15～30min，乙腈含量从60%升高至70%；30～40min乙腈含量从70%升高至90%，并在90%保持5min；检测波长：207nm。
（5）MS分析：使用API4000质谱仪（Applied Biosystems,USA）对HPLC各峰进行MS分析：离子源：ESI；喷雾电压：-4500V；离子源温度：100℃；雾化气：25psi；辅助气：20psi；正离子或者负离子模式，扫描范围在50～800amu。
结果显示：HPLC分析发酵液槐糖脂成分如图2所示，葡萄糖油酸基本培养基如图2（A），有6个主要峰型，而棉籽糖蜜棉籽油培养基发酵液槐糖脂成分如图2（B），有7个主要峰型，并且两种培养基发酵槐糖脂的总体峰型基本一致。利用MS进一步对7种主要峰型进行分析（表2），完全符合槐糖脂组分参数，证明拟威克酵母变种利用棉籽糖蜜棉籽油培养基可以产生槐糖脂且其成分与葡萄糖油酸基本培养基发酵所得槐糖脂基本一致。
表2利用葡萄糖与油酸作为底物和棉籽糖蜜与棉籽油作为底物进行发酵生产槐糖脂，7天后发酵液7种主要槐糖脂成分
实施例7：
（1）发酵罐扩大培养：配制两组发酵培养基，每组5L（g/l）：a葡萄糖80.0，KH2PO41.0，Na2HPO41.0，MgSO4·7H2O0.50，酵母粉3.0，油酸6%（v/v），b棉籽糖蜜120.0，棉籽油7%（v/v）；pH均自然。
（2）发酵生产槐糖脂：将步骤（1）中两组发酵培养基115℃，30min灭菌后，冷却。将活化好的拟威克酵母变种（Wickerhamierlla domercqiae var.sophorolipid）CGMCC No.1576以体积百分比为2%的接种量接种于上述发酵培养基中，发酵罐温度设定25℃，通气量1.0L/min，初始转速400rpm，12h后升至700rpm，培养7天，得到槐糖脂的发酵液。
（3）槐糖脂的粗提：取含槐糖脂的发酵液加入其2倍体积的乙酸乙酯萃取，6000rpm离心15min，收集乙酸乙酯层，减压浓缩后烘干，得内酯型槐糖脂粗品；或取含槐糖脂的发酵液加入其3倍体积的乙醇，涡旋混合，6000rpm离心15min，收集上清，减压浓缩后烘干，得总槐糖脂粗品。
结果显示：利用发酵罐扩大培养，使得拟威克酵母变种利用葡萄糖油酸发酵培养基发酵7天其内酯型槐糖脂产量为33.10g/l，总槐糖脂产量为68.59g/l；而利用棉籽糖蜜棉籽油发酵培养基7天其内酯型槐糖脂产量为33.48g/l，其总槐糖脂产量大于69.38g/l，两种培养基的槐糖脂产量均比摇瓶发酵时有较大幅度增长，且HPLC分析，其组分与摇瓶发酵时槐糖脂组分基本一致。说明，用棉籽糖蜜及棉籽油可以进行大规模的槐糖脂生产，且本专利提出的培养基组分配比为最适配比，可以在尽可能降低成本前提下最大限度提高槐糖脂产量。
Claims (3)
1.一种以棉籽糖蜜及棉籽油为底物发酵生产槐糖脂的方法，步骤是：
(1)制备发酵培养基；
(2)发酵生产槐糖脂：
将活化好的拟威克酵母变种(Wickerhamierlla domercqiae var.sophorolipid)CGMCC No.1576以体积百分比为1～4％的接种量接种于含上述发酵培养基的摇瓶中，于25±2℃、150～300rpm，摇床振荡发酵培养7～9天，得到含槐糖脂的发酵液；
或者，
将活化好的拟威克酵母变种(Wickerhamierlla domercqiae var.sophorolipid)CGMCC No.1576以体积百分比为1～4％的接种量接种于含上述发酵培养基的发酵罐中，发酵罐的发酵参数设定为：温度25±2℃，通气量0.5～2.0L/min，初始转速200～500rpm，12～24h后升至600～900rpm，发酵时间7～9天，得到含槐糖脂的发酵液；
(3)槐糖脂的粗提：
取含槐糖脂的发酵液加入其2～6倍体积的乙酸乙酯萃取，6000～8000rpm离心5～15min，收集乙酸乙酯层，减压浓缩后烘干，得内酯型槐糖脂粗品；
或取含槐糖脂的发酵液加入其3～6倍体积的乙醇，涡旋混合，6000～10000rpm离心5～15min，收集上清，减压浓缩后烘干，得总槐糖脂粗品；
其特征在于：
步骤(1)所述制备发酵培养基的方法是：取含水量<20％的棉籽糖蜜，以w/v计配制成10～15％的水溶液，在35～55℃水浴10～30min至棉籽糖蜜完全溶解，然后向溶液中加入棉籽油并使其浓度以v/v计为5～9％，得适于发酵生产槐糖脂的发酵培养基，115℃灭菌30～40min后，冷却备用。
2.如权利要求1所述以棉籽糖蜜及棉籽油为底物发酵生产槐糖脂的方法，其特征在于：步骤(1)所述棉籽糖蜜购自济南中棉生物科技有限公司，所述棉籽油购自山东省恒兴有限公司。
3.如权利要求1所述以棉籽糖蜜及棉籽油为底物发酵生产槐糖脂的方法，其特征在于：步骤(1)所述棉籽糖蜜以w/v计配制成11.5～12％的水溶液；所述棉籽油浓度以v/v计为6～7％。
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