CN103525817A - 一种猪肺特异性启动子及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种动物肺特异性启动子及其应用。本发明所提供的启动子，是下述a）或b）或c)的DNA片段：a）3′端至少含有序列表中序列1的第1001-3000位核苷酸序列，并且从序列1的第1001位开始、按照序列1的核苷酸序列向序列1的5′端延长，得到长度为2000bp至3000bp的任意一个DNA片段；所述DNA分子具有启动子功能；b）与a）限定的核苷酸序列具有75%或75%以上同源性，且具有启动子功能的DNA片段；c）在严格条件下与a）或b）限定的核苷酸序列杂交，且具有启动子功能的DNA片段。本发明所提供的启动子在肺来源的细胞中特异表达目的基因，这对于培育抗呼吸系统传染病的转基因动物具有重要意义。

Description

一种猪肺特异性启动子及其应用

技术领域

本发明涉及一种猪肺特异性启动子及其应用，特别涉及一种来源于猪的肺泡表面活性蛋白B特异性启动子及其应用。

背景技术

长期以来我国的猪群存栏与产量一直处于世界领先地位。随着养殖业规模的扩大化、集约化，动物饲养密度不断增加，动物疫病感染状况日益复杂，动物疫病的发生和流行严重制约着我国养殖业的进一步发展和壮大。当前猪场传染病发生日益严重，且发病面广、传染快、流行蔓延迅速、死亡率极高。据资料统计，自20世纪70年代以来新增加猪传染病有21种，其中90年代以来新增加7种。猪的多种传染病的发生和流行，严重打击了农民养猪的积极性，阻碍了养猪业的发展。通过呼吸系统传播的疾病占绝大多数，包括猪气喘病、猪副嗜血杆菌病、猪链球菌病，猪肺疫、猪传染性胸膜肺炎、猪传染性萎缩性鼻炎、猪沙门氏菌病、猪流感、猪繁殖与呼吸综合症、猪圆环病毒病、猪附红细胞体病、弓形虫病等。如果能够通过抗病育种的方法，培育抗呼吸系统传染病的转基因猪，减少呼吸系统传染病的发生，将对我国的养猪业带来巨大的经济效益。

转基因技术的关键在于使外源目的基因在转基因动物体内稳定高效的表达，而转基因表达所用的启动子起着非常重要的作用。启动子是一段能使基因进行转录的DNA序列，转录的RNA通过进一步的翻译和修饰形成功能蛋白质。根据启动子作用的方式及功能不同，可以大致分为4类：组成型启动子、诱导型启动子、组织或发育阶段特异型启动子和合成型启动子。外源基因在组织或发育阶段特异型启动子的调控下，能够在某些特定的组织器官中表达。如果采用呼吸道特异表达的启动子，利用转基因技术将抗病基因在猪呼吸道特异表达，培育出能够抗呼吸系统传播疾病的转基因猪，将在猪的遗传改良中具有重大意义。目前已有一些组织特异性启动子被应用于植物的遗传改良中，获得了显著的成效。然而猪组织特异性启动子的研究却相对滞后，目前报道的猪组织特异性启动子寥寥无几。

肺表面活性物质（pulmonary surfactant，PS）是由肺泡II型细胞合成并分泌的一种脂蛋白复合物，具有降低肺泡表面张力、提高肺的顺应性、促进肺气体交换、参与肺的防御的生理功能。其主要成分是90%磷脂和8%～10%的肺表面活性蛋白（surfactant protein，SP）。SP按其发现的先后顺序，有SP-A，SP-B，SP-C和SP-D共4种，其中SP-A和SP-D是亲水性蛋白，主要调节肺免疫功能，参与主动防御过程;SP-B和SP-C是疏水性蛋白，在维持正常肺呼吸功能上起重要作用。SP-B是一种极其重要的疏水蛋白，其表达明显受肺泡II型上皮细胞和Clara细胞调控。它能增强吸附作用，促进磷脂分布，维持磷脂单层的稳定。除了作为肺泡表面活性物质的重要组成成分，SP-B还在天然免疫反应中起重要作用，可能使其出现过度炎症反应。肺表面活性物质蛋白B在胎肺发育16周时开始表达，定位于上皮细胞胞浆，早期表达于高柱状未分化上皮细胞，随着支气管发育，逐渐由呼吸道近端向远端迁移，到原始肺泡期稳定表达于肺泡2型上皮细胞极其前体细胞，然后表达趋于稳定，生后肺内表达有明显增加。

发明内容

本发明的目的是提供一种动物肺特异性启动子及其应用。

本发明所提供的动物特异性启动子来源于猪（Sus scrofa domastica L.），是下述a）或b）或c）的DNA片段：

a）3′端至少含有序列表中序列1的第1001-3000位核苷酸序列，并且从序列1的第1001位开始、按照序列1的核苷酸序列向序列1的5′端延长，得到长度为2000bp至3000bp的任意一个DNA片段；所述DNA分子具有启动子功能；

b）与a）限定的核苷酸序列具有75%或75%以上同源性，且具有启动子功能的DNA片段；

c）在严格条件下与a）或b）限定的核苷酸序列杂交，且具有启动子功能的DNA片段。

所述严格条件是在2×SSC，0.1%SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次。每次5min.0.5X SSC，0.1%SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次。每次15min。

所述启动子的最后一位核苷酸是序列1的第3000位。

在本发明的一个实施例中，所述启动子具体为下述a1）-a3）中任一种：

a1）核苷酸序列为序列表中序列1的第1001-3000位核苷酸所示的DNA分子（SP-B2000）；

a2）核苷酸序列为序列表中序列1的第501-3000位核苷酸所示DNA分子（SP-B2500）；

a3）核苷酸序列为序列表中序列1所示DNA分子（SP-B3000）

序列表中序列1由3000个核苷酸组成，即为SP-B3000全长启动子。而上述a1）和a2）所述的启动子为所述SP-B3000全长启动子的5′端截短启动子。

含有所述启动子的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌也属于本发明的保护范围。

所述重组载体中，由所述启动子启动目的基因的表达。在本发明的一个实施例中，所述重组载体具体为在pGL3-Basic载体的多克隆位点插入所述启动子得到的重组质粒。所述多克隆位点具体为限制性内切酶识别位点Kpn I和Hind III。所述目的基因具体为荧光素酶基因（luc）。

所述表达盒由所述启动子，由所述启动子启动表达的目的基因，以及转录终止序列组成；所述启动子以功能性方式与所述目的基因连接，且所述目的基因与所述转录终止序列连接。在本发明的一个实施例中，所述目的基因具体为荧光素酶基因（luc）。

所述启动子在启动目的基因在动物细胞表达中的应用也属于本发明的保护范围。

在所述应用中，所述动物细胞可为呼吸道细胞.

进一步，所述呼吸道细胞可为肺来源的细胞。

在本发明的一个实施例中，所述动物细胞具体为A549细胞（人肺腺癌细胞）、LTEP-a-2细胞（人肺腺癌细胞）。

在所述应用中，所述表达具体为肺特异性表达。

所述肺特异性表达为在肺中的表达量显著高于肺以外的其他部位。

所述启动子在制备用于培育抗呼吸系统传染病的转基因动物的产品中的应用也属于本发明的保护范围。所述动物可为猪等。

本发明利用相关生物信息学技术、分子生物学技术及转基因技术，在猪的全基因组中找到了SP-B的基因序列，从杜×长×大猪的基因组中克隆了猪SP-B的启动子序列，将该启动子序列连入pGL3-Basic载体中，将构建的质粒转染真核细胞系，通过检测启动子所驱动的荧光素酶报告基因的活性确定了猪SP-B启动子是肺特异性启动子。

本发明所提供的猪肺特异性表达启动子具有如下特点：

1、本发明启动子序列来源于猪基因组，在多个真核细胞中验证了其组织表达特异性，确定了其只在肺来源细胞中特异性表达外源基因。

2、启动子SP-B2000已去掉了非功能区，只保留了核心启动子区，可直接应用到猪转基因工程和分子育种。

本发明对培育抗呼吸系统传染病的转基因动物具有重要意义。

附图说明

图1为猪SP-B3000启动子的PCR扩增产物的琼脂糖电泳图。其中，泳道M为DNA分子量标准（NP5000）；泳道1为PCR产物。

图2为重组表达载体pGL3-SP-B3000和pGL3-SP-B2000的酶切鉴定电泳图。其中，泳道M为DNA size DNA分子量标准（NP5000）；泳道1为Kpn I/Hind III双酶切pGL3-SP-B3000产物；泳道2为Kpn I/Hind III双酶切pGL3-SP-B2000产物。

图3为验证猪SP-B3000启动子区不同截短体的启动子活性（不同载体的荧光素酶相对活性的测定结果）。直方图表示荧光素酶相对活性，误差线用标准差标示，重复数为4。其中，basic表示pGL3-Basic载体；control表示pGL3-control载体；-500至-3000依次表示pGL3-SP-B500至pGL3-SP-B3000一系列pGL3-SP-B载体。

图4为验证猪SP-B2000启动子在不同来源的细胞上的启动子活性（不同细胞的荧光素酶相对活性的测定结果）。直方图表示荧光素酶相对活性，误差线用标准差标示，重复数为4。其中，SP-B2000即表示pGL3-SP-B2000。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

引物由北京博迈德生物科技有限公司合成，2×Pfu PCR MasterMix（10212-01），NP5000核酸Marker（20211-01），pTP-BS1克隆载体（30222-01），定点突变试剂盒（80111-01）购自北京诺派生物科技有限公司，血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒购自天根生化科技（北京）有限公司（DP304-02），质粒小提试剂盒购自天根生化科技（北京）有限公司，pGL3-Control载体（E1741），pGL3-Basic载体（E1751），PRL-TK质粒（E2241），荧光素酶活性检测试剂盒（E1910）购自美国Promega公司，lipofectamine2000购自美国invitrogen公司（11668-019），DMEM培养基购自美国GIBICO公司（12100-046），1640培养基购自美国GIBICO公司（31800-022），A549细胞（人肺腺癌细胞）、LTEP-a-2细胞（人肺腺癌细胞）、Hela细胞（人宫颈癌细胞）、Caco-2细胞（人结肠癌细胞）、293T细胞（人胚肾细胞）、HepG2细胞（人肝癌细胞）和CNE2细胞（人鼻咽癌细胞）均购自上海细胞库。杜×长×大猪购自北京市大兴区种猪场。

实施例1、猪SP-B3000启动子的克隆及序列测定

一、引物设计

从GENBANK上检索到猪的SP-B基因序列（GENBANK：AM779476.1），通过BLAST软件对猪全基因组进行同源性分析，寻找到猪基因组中的SP-B基因序列位置，选取猪SP-B基因上游5’侧翼3000bp设计引物。设计的引物序列如下，引物引入KpnI和Hind III限制性酶切位点，人工合成：

F1（引物1）：5’-CGGGGTACCATCTGATGTTGCTATGGCTGT-3’（下划线处为Kpn I的识别序列，其后的序列为序列1的第1-21位）

R1（引物2）：5’-CCCAAGCTTCCGCAGCCTGGACACCCT-3’（下划线处为HindIII的识别序列，该序列的第9-27为序列1的第2982-3000位的反向互补序列）

二、猪全基因组的提取

取新鲜健康的杜×长×大猪的肝脏组织约200mg，迅速剪碎后转移到玻璃研磨器中，采用血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒提取组织全基因组DNA，具体操作参照试剂盒说明书。

三、PCR扩增猪SP-B3000启动子区

以步骤二提取的猪基因组DNA为模板，在引物F1和引物R1的引导下，利用2×Pfu PCR MasterMix并参照试剂盒说明书进行扩增，反应条件为：首先94℃5min；其次94℃30sec，60℃30sec，72℃3min，共35个循环；最后72℃5min。将PCR产物进行琼脂糖电泳检测。

四、测序及序列分析

将PCR扩增的大小约3000bp左右的目的DNA亚克隆入平端载体pTP-BS1中，经筛选后挑取单克隆测序，将经测序后表明含有序列表中序列1所示DNA片段（SP-B3000）的重组质粒命名为pTP-SP-B3000。序列1由3000个核苷酸组成。

实施例2、猪SP-B3000启动子功能鉴定

一、重组表达载体的构建

将实施例1中获得的重组质粒pTP-SP-B3000用限制性内切酶Kpn I和Hind III双酶切后，与经同样双酶切的pGL3-Basic载体的骨架片段相连，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，获得阳性重组菌，将经PCR检测（图1）和酶切鉴定（图2中泳道1）含有大小约为3000bp目的条带的的重组载体送样测序，将测序表明含有SP-B3000启动子（序列1）的重组载体命名为pGL3-SP-B3000，将含有该重组载体的重组菌命名为DH5α-pGL3-SP-B3000。

利用定点突变试剂盒，对已构建的pGL3-SP-B3000质粒进行截短突变，具体操作参照说明书。依次从SP-B3000的5’端进行截短，突变成pGL3-SP-B2500（在pGL3-Basic载体的Kpn I和Hind III之间插入序列1的第501-3000位）、pGL3-SP-B2000（在pGL3-Basic载体的Kpn I和Hind III之间插入序列1的第1001-3000位）、pGL3-SP-B1500（在pGL3-Basic载体的Kpn I和Hind III之间插入序列1的第1501-3000位）、pGL3-SP-B1000（在pGL3-Basic载体的Kpn I和Hind III之间插入序列1的第2001-3000位）、pGL3-SP-B500（在pGL3-Basic载体的Kpn I和Hind III之间插入序列1的第2501-3000位），共5个截短质粒。对5个截短质粒均进行Kpn I和Hind III双酶切鉴定及测序鉴定，证实其准确性。其中pGL3-SP-B2000经Kpn I和Hind III双酶切的鉴定结果如图2（泳道2）所示。将含有这5个截短质粒的重组菌，依次命名为DH5α-pGL3-SP-B2500、DH5α-pGL3-SP-B2000、DH5α-pGL3-SP-B1500、DH5α-pGL3-SP-B1000、DH5α-pGL3-SP-B500。将上述所构建的5个截短质粒中携带的外源DNA片段按照外源DNA片段由小到大的顺序依次命名为：SP-B500、SP-B1000、SP-B1500、SP-B2000、SP-B2500。

二、质粒提取与鉴定

将上述重组菌DH5α-pGL3-SP-B3000、DH5α-pGL3-SP-B2500、DH5α-pGL3-SP-B2000、DH5α-pGL3-SP-B1500、DH5α-pGL3-SP-B1000、DH5α-pGL3-SP-B500分别接种于含氨苄青霉素的LB培养基中，在37℃条件下，200转/分（旋转半径为13mm）摇床上振荡培养至OD₆₀₀值为1，采用质粒小提试剂盒抽提重组菌的质粒，即步骤一构建的6个重组表达载体，具体操作参照试剂盒说明书。

三、细胞培养

将A549细胞、Hela细胞、Caco-2细胞，HepG2细胞、293T细胞、LTEP-a-2细胞和CNE2细胞在10%（v/v）新生牛血清的含双抗DMEM（Dulbecco’s ModifiedEagle’sMedium）培养基中，其培养条件为37℃，浓度为5%的CO₂。当细胞完全铺板时，进行传代培养，操作如下：用洗涤液快速洗涤细胞一次，加入2mL胰酶，37℃消化约为2分钟，在显微镜下观察到细胞已成球状后立即弃去胰酶，向培养基中加入细胞生长培养基，并用吸管吹打细胞使尽量以单个细胞的形式存在。将获得的细胞悬液一部分留在细胞培养瓶中传代培养，另一部分等体积分装到24孔板中，置于培养箱中培养用于转染。

四、转染

当24孔板中细胞达到60%-70%的汇合率时准备转染。首先吸去培养液，加入无血清无双抗的optiMEM换液培养。其次将步骤一构建的6个重组表达载体、作为阴性对照的pGL3-Basic载体（没有启动子启动荧光素酶基因的表达）、作为阳性对照的pGL3-Control载体（SV40启动子启动荧光素酶基因的表达）分别用optiMEM稀释成100ng/μl，将作为内参照的载体PRL-TK（T7启动子启动荧光素酶基因的表达）稀释成50ng/μl，按1μg质粒需0.75μl的lipofectamine2000计算所需的转染试剂的量。按说明书要求用optiMEM稀释lipofectamine2000，轻轻混匀，室温下静置5分钟后将转染试剂和质粒混合均匀，再室温静置20分钟。取转染液100μl滴加到24孔板的其中一个孔中，这样每个重组表达载体可保证4次重复。转染过程需在换液后2h内完成。转染完成后放入培养箱中温育，6小时后弃净24孔板里液体，PBS清洗一次后加入10%（v/v）新生牛血的无双抗DMEM培养基继续培养，24-48小时后收集细胞。

五、荧光素酶相对活性测定与分析

使用荧光素酶活性检测试剂盒对步骤四转染后的细胞进行活性测定，测定前，准备以下试剂：（1）1×磷酸裂解缓冲液（PLB），用购自美国Promega公司试剂盒提供的5×PLB与灭菌水按体积比1:4比例混合，每次使用前配置；（2）LARII（LuciferaseAssay ReangentII荧光分析剂），将美国Promega公司试剂合提供的冻干荧光分析底物重悬于10ml的LARII中，混匀，分装后做上标记置于-70℃保存备用；（3）Stop GloReagent，每次使用前配置，将50×Stop﹠Glo Substrate（终止剂）与Stop Glo Buffer（终止缓冲剂）按体积比1:50混合，试剂配置完毕后进行荧光素酶活性测定，操作步骤如下：

1）将上述24孔板中转染有目的DNA的贴壁细胞用1×PBS洗涤一次，弃去残液，加入100μl新鲜配制的1×PLB，室温下，置于冰上15分钟，然后-80℃冻融一次；

2）用移液器吹吸两次后将裂解液收集到1.5ml离心管做好标记，待用；

3）取若干个1.5ml离心管，均加入50μl的LLARII溶液（-70℃取出，室温下融化），备用；

打开Luminometer20/20照度计（购自美国Promega公司）电源开关，进入“HOME”主菜单，按下“Protocol”设定工作模式中各种参数，包括：Display显示，3S；integrate time（整合时间）10S；repeat（重复）；灵敏度选用默认值；设定好后返回“HOME”；

4）在“HOME”状态下，在含50μl LARII溶液的1.5mL离心管中加入上述步骤2）制备好的样品10μl，用吸头混合后，放入样品检测池中，按“Measure”，仪器自动处理，计算出萤火虫荧光酶素（6个重组表达载体、阴性对照pGL3-Basic载体以及阳性对照pGL3-Control载体中的荧光素酶基因所表达）活力，显示加入Stop﹠GloSubstrate页面，此时取出1.5mL离心管，再加入50μl新鲜配置的Stop Glo Reagent，混匀后，放回样品检测池中，按“OK”仪器便会现计算出海肾荧光素酶活力（内参照载体PRL-TK中的荧光素酶基因所表达），并计算出两种荧光素酶活力比值，即荧光素酶相对活力，记录结果，然后，绘制直方图。

对不同载体荧光素酶活性的检测结果如图3（A549细胞）所示，所构建的pGL3-SP-B系列质粒（步骤一构建的6个重组表达载体）的荧光素酶活性与阴性对照（pGL3-Basic载体）相比均达到显著差异（P﹤0.05），表明重组表达载体中各自在多克隆位点Kpn I和Hind III之间的外源DNA片段均具有启动子活性；与阳性对照（pGL3-Control载体）相比，pGL3-SP-B系列质粒中的pGL3-SP-B3000、pGL3-SP-B2500、pGL3-SP-B2000这3个重组表达载体的荧光素酶活性高很多或者至少齐平，表明这3个重组表达载体中所插入的外源DNA片段的启动子活性很高。其中，以重组表达载体pGL3-SP-B2000的荧光素酶活性最高，pGL3-SP-B2500次之。综上所述，SP-B启动子的核心区在SP-B2000（序列1的第1001-3000位）区域。

对不同组织来源的7种细胞检测pGL3-SP-B2000的启动子活性，证明了其只在肺（A549细胞和LTEP-a-2细胞）具有较强的启动子活性，证明了该启动子是肺特异性启动子，结果如图4所示。

Claims (10)

1.DNA分子，是下述a）或b）或c)的DNA片段： 

a）3′端至少含有序列表中序列1的第1001-3000位核苷酸序列，并且从序列1的第1001位开始、按照序列1的核苷酸序列向序列1的5′端延长，得到长度为2000bp至3000bp的任意一个DNA片段；所述DNA分子具有启动子功能； 

b）与a）限定的核苷酸序列具有75%或75%以上同源性，且具有启动子功能的DNA片段； 

c）在严格条件下与a）或b）限定的核苷酸序列杂交，且具有启动子功能的DNA片段。 

2.根据权利要求1所述的DNA分子，其特征在于：所述DNA分子的最后一位核苷酸是序列1的第3000位。 

3.根据权利要求1或2所述的DNA分子，其特征在于：所述DNA分子为下述a1）-a3）中任一种： 

a1）核苷酸序列为序列表中序列1的第1001-3000位核苷酸所示的DNA分子； 

a2）核苷酸序列为序列表中序列1的第501-3000位核苷酸所示DNA分子； 

a3）核苷酸序列为序列表中序列1所示DNA分子。 

4.含有权利要求1-3中任一所述DNA分子的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。 

5.根据权利要求4所述的重组载体，其特征在于：所述重组载体中，由权利要求1-3中任一所述DNA分子启动目的基因的表达。 

6.权利要求1-3中任一所述DNA分子在制备启动目的基因在动物细胞表达的产品中的应用。 

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：所述动物细胞为呼吸道细胞。 

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：所述呼吸道细胞为肺来源的细胞。 

9.根据权利要求6-8中任一所述的应用，其特征在于：所述表达为肺特异性表达。 

10.权利要求1-3中任一所述的DNA分子在制备用于培育抗呼吸系统传染病的转基因动物的产品中的应用。 

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