CN103525734B - 一种脱氮复合菌剂及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种脱氮复合菌剂，包括：CPZ24(Rhodococuus pyridinivorans)1×108-10×108cfu/mL；CPZ56(Shinella zoogloeoides)1×108-10×108cfu/mL；WL12(Pseudomonasspp.)1×108-5×108cfu/mL。本发明所述脱氮复合菌剂是经过配比优化后组成的微生物复合菌剂，可同时进行硝化-反硝化。本发明还提供所述脱氮复合菌剂的制备方法和应用。利用本发明脱氮复合菌剂处理畜禽养殖废水，产生气体中约95%-99%的气体为N2，1-5%的气体为N2O、NO、NO2，总氮去除率达到79%-85%，具有高效脱氮作用，利于环境保护。
Description
技术领域
本发明涉及一种脱氮复合菌剂及其制备方法和应用，属于环境污染物生物技术处理领域。
背景技术
目前，畜禽养殖业集约化、规模化的快速发展，随之而带来的环境污染问题也越发严重。其中畜禽养殖废水中氮污染问题最为突出，多数养殖场废水中的氨氮都超标，超标率为80%以上，氮超标所引起水体的富营养化以及严重的生态环境污染已经成为世界性的问题。因此，对畜禽养殖废水中氮降解的研究，就显得尤为迫切。氨氮在水体中常转化为硝酸氮和亚硝酸氮，它们仍能导致水体富营养化，并且亚硝酸态氮可以通过亚硝酸氨化作用再次转化为氨氮，同时亚硝酸氮也是一种致癌物，对动物和人类健康都存在很大的威胁；而饮水中硝酸态氮超过10mg/L时不宜饮用，它可氧化亚铁离子成三价铁离子，引起婴儿高铁血红蛋白症，因此只有彻底去除水溶解态的氮才能免除危害"因此，废水的氨氮脱除己成为环境工作者研究的热点之一，其中生物脱氮法是广泛应用的一种经济高效的方法。
异养硝化-好氧反硝化的实质为一种同步硝化反硝化的实现手段。将同时具有硝化和反硝化功能的脱氮微生物投入后，可以加强污水处理效果的应用，进行污水处理的生物强化；但是硝化-反硝化的实现受制于能同时异养硝化-好氧反硝化菌株的分离，因此近年来国内研究学者大部分集中在异养硝化-好氧反硝化菌株的分离和筛选研究中，而将筛选出的异养硝化-好氧反硝化菌株进行规模化生产与应用，目前未见报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种脱氮复合菌剂及其制备方法和应用。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种脱氮复合菌剂，包括：
CPZ24(Rhodococuus pyridinivorans) 1×108-10×108cfu/mL；
CPZ56(Shinella zoogloeoides) 1×108-10×108cfu/mL；
WL12(Pseudomonasspp.) 1×108-5×108cfu/mL；
总菌数为3×108-25×108cfu/mL。
所述CPZ24(Rhodococuus pyridinivorans)、CPZ56(Shinellazoogloeoides)、WL12(Pseudomonasspp.)均为北京沃土天地生物科技有限公司已出售的，本领域技术人员可购买的产品。
作为本发明优选的实施方式，所述脱氮复合菌剂，由如下组成：
CPZ24(Rhodococuus pyridinivorans) 1×108-8×108cfu/mL；
CPZ56(Shinella zoogloeoides) 1×108-8×108cfu/mL；
WL12(Pseudomonasspp.) 1×108-4×108cfu/mL；
总菌数为3×108-20×108cfu/mL。
本发明还提供了上述脱氮复合菌剂的制备方法，包括如下步骤：
1).固体斜面培养：将CPZ24、CPZ56、WL12分别接种于固体培养基上，于30℃无菌环境下培养1-3天，使菌株活化；
2).一级种子培养：将步骤1）活化的菌株，在无菌条件下分别接种于液体培养基中，均于30℃，150-180rpm下培养2-3天时，单菌种液体培养OD600值达到2.0-4.0之间时停止培养，制得一级种子；
3).二级种子培养：按液体培养基的体积比为10-20%的接种量，将步骤2）所得一级种子分别接种于发酵罐中，30℃条件下，培养2-3天，制得二级种子；
4).混合发酵培养：按液体培养基的体积比为10-20%的接种量，将步骤3）得到的二级种子接种于发酵罐中，进行高密度发酵培养，获得菌剂。
其中，步骤1)中所用的固体培养基为牛肉膏蛋白胨培养基：具体培养基配方为：牛肉膏5g，蛋白胨10g，NaCl5g，蒸馏水1000ml，琼脂15-20g，pH7.0-7.2。
在步骤2）中，所述OD600值优选为2.5-3.5。
步骤2）、步骤3）中所用的液体培养基为牛肉膏蛋白琼脂胨培养基：具体培养基配方为：牛肉膏5g，蛋白胨10g，NaCl5g，蒸馏水1000ml，琼脂15-20g，pH7.0-7.2。
在步骤3）中，发酵培养条件：搅拌速度为100-200r/min，通气量为1：0.8-2，优选为1：1-1.5；
在步骤4），所述液体培养基的配方按质量百分比为：柠檬酸钠5-10%、葡萄糖2-10%、硫酸铵1.0-5%，余量为水。
在步骤4），所述高密度发酵培养可以采用补料分批培养（FBC）方式，其中补料碳源为：葡萄糖、柠檬酸钠、甘油中任一种或两种以上；氮源为：硫酸铵和/或蛋白胨。
在步骤4），所述混合发酵培养的过程中需要分阶段调控发酵pH、溶解氧、搅拌转速和温度等条件。具体地说，混合发酵培养为有氧培养：起始0-24小时内，间隔通气，保持在有氧条件发酵，通气量1：0.8-1.5，调控发酵溶解氧10-15%，搅拌转速100-200r/min，搅拌间隔时间2-3小时，搅拌1-3分钟，温度25-35℃。
本发明所述脱氮复合菌剂在畜禽废水中的应用。具体方法为：按接种量4-6%比例将脱氮复合菌剂接种于畜禽废水中，同时加入50mg·L-1葡萄糖补充各菌株生长所需碳源，30℃摇床培养，150-180rpm，120h。
本发明所述脱氮复合菌剂是经过配比优化后组成的微生物复合菌剂，可同时进行硝化-反硝化，产生95%-99%的气体为N2，1-5%的气体为N2O、NO、NO2，总氮去除率达到79%-85%，具有高效脱氮作用，利于环境保护。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
实施例1
一种脱氮复合菌剂，由如下组分组成：
上述脱氮复合菌剂的制备方法，包括如下步骤：
1).斜面培养：将CPZ24、CPZ56、WL12接种于固体培养基上，30℃条件下CPZ24、CPZ56培养2天，WL12培养3天，使菌株活化；
2).一级种子培养：将步骤1)活化的菌种在无菌条件下分别接种于液体培养基，30℃，160rpm条件下培养2天，待各菌悬液光密度OD600值均达到2.5停止培养，制得一级种子；
3).二级种子培养：按液体培养基的体积比为10%的接种量，将步骤2）所得一级种子分别接种到100L的发酵罐中，发酵罐内培养液的总体积为60L，30℃条件下，搅拌速度为160r/min，通气量为1：1，培养3天制得二级种子；
4).混合发酵培养：按液体培养基的体积比为10%的接种量，将步骤3）得到的二级种子接种到1吨的发酵罐中，发酵罐内的培养基总体积为600L，进行高密度发酵培养，获得菌剂。
其中，步骤1)中所用的固体培养基为牛肉膏蛋白胨培养基：具体培养基配方为：牛肉膏5g，蛋白胨10g，NaCl5g，蒸馏水1000ml，琼脂15-20g，pH7.0-7.2。
步骤2）、步骤3）中所用的液体培养基为牛肉膏蛋白琼脂胨培养基：具体培养基配方为：牛肉膏5g，蛋白胨10g，NaCl5g，蒸馏水1000ml，琼脂15-20g，pH7.0-7.2。
其中，步骤4）所用的液体培养基的配方按质量百分比为：葡萄糖5%、柠檬酸钠5%、硫酸铵2%，余量为水；
步骤4）中，高密度发酵培养采用补料分批培养方式，其中补料碳源为：葡萄糖、柠檬酸钠；氮源为：硫酸铵。
步骤4）中，混合发酵培养阶段：起始0-24小时内，间隔通气，保持在有氧条件发酵，通气量1：1，调控发酵溶解氧10%，搅拌转速160r/min，搅拌间隔时间2小时，搅拌2分钟，温度30℃。
实施例2
一种脱氮复合菌剂，由如下组分组成：
上述脱氮复合菌剂的制备方法，包括如下步骤：
1).斜面培养：将CPZ24、CPZ56、WL12接种于固体培养基上，30℃条件下CPZ24、CPZ56培养1天，WL12培养2天，使菌株活化；
2).一级种子培养：将步骤1)活化的菌种在无菌条件下分别接种于液体培养基，30℃，180rpm条件下培养3天，待各菌悬液光密度OD600值均达到3.0停止培养，制得一级种子；
3).二级种子培养：按液体培养基的体积比为20%的接种量，将步骤2）所得一级种子分别接种到100L的发酵罐中，发酵罐内培养液的总体积为60L，30℃条件下，搅拌速度为150r/min，通气量为1：1.5，培养2天制得二级种子；
4).混合发酵培养：按液体培养基的体积比为20%的接种量，将步骤3）得到的二级种子接种到1吨的发酵罐中，发酵罐内的培养基总体积为600L，进行高密度发酵培养，获得菌剂。
其中，步骤1)、2)、3)中所用的培养基均与实施例1中相应的培养基配方相同。
步骤4）所用的液体培养基的配方按质量百分比为：葡萄糖10%、柠檬酸钠10%、硫酸铵5%，余量为水；
步骤4）中，高密度发酵培养采用补料分批培养方式，其中补料碳源为：葡萄糖、柠檬酸钠、甘油；氮源为：硫酸铵。
步骤4）中，混合发酵培养阶段：起始0-24小时内，间隔通气，保持在有氧条件发酵，通气量1：1.2，调控发酵溶解氧10%，搅拌转速150r/min，搅拌间隔时间2小时，搅拌2分钟，温度30℃。
实施例3
一种脱氮复合菌剂，由如下组分组成：
上述脱氮复合菌剂的制备方法，包括如下步骤：
1).斜面培养：将CPZ24、CPZ56、WL12接种于固体培养基上，30℃条件下CPZ24、CPZ56培养1天，WL12培养2天，使菌株活化；
2).一级种子培养：将步骤1)活化的菌种在无菌条件下分别接种于液体培养基，30℃，180rpm条件下培养3天，待各菌悬液光密度OD600值均达到3.0停止培养，制得一级种子；
3).二级种子培养：按液体培养基的体积比为20%的接种量，将步骤2）所得一级种子分别接种到100L的发酵罐中，发酵罐内培养液的总体积为60L，30℃条件下，搅拌速度为150r/min，通气量为1：1.5，培养2天制得二级种子；
4).混合发酵培养：按液体培养基的体积比为20%的接种量，将步骤3）得到的二级种子接种到1吨的发酵罐中，发酵罐内的培养基总体积为600L，进行高密度发酵培养，获得菌剂。
其中，步骤1)、2)、3)中所用的培养基均与实施例1中相应的培养基配方相同。
步骤4）所用的液体培养基的配方按质量百分比为：葡萄糖10%、柠檬酸钠10%、硫酸铵5%，余量为水；
步骤4）中，高密度发酵培养采用补料分批培养方式，其中补料碳源为：葡萄糖、柠檬酸钠、甘油；氮源为：硫酸铵。
步骤4）中，混合发酵培养阶段：起始0-24小时内，间隔通气，保持在有氧条件发酵，通气量1：1.5，调控发酵溶解氧15%，搅拌转速150r/min，搅拌间隔时间2小时，搅拌2分钟，温度30℃。
实验例1
对实施例3所得脱氮复合菌剂的异养硝化效果进行测定。
按1%的接种量接种于100mL新鲜液体异养培养基中（50mg/LNH4 +-N，C/N=50），保证充足的氧气，30℃、120r/min摇床培养，每隔2h检测氨氮浓度、亚硝酸盐氮浓度、硝酸盐氮浓度以及总氮浓度。
氨氮起始浓度为50mg/L，反应进行到15h，该菌剂可将培养基中的氨氮基本上全部去除，对总氮的去除率可达到99%。
按照上述方法对实施例1、2进行异养硝化测试，反应进行到14-16h，对总氮的去除率可达到98-99%，结果基本与实施例3的效果相同。
实验例2
对实施例1所得脱氮复合菌剂的好氧反硝化效果测定。
按1%的接种量接种于100mL以硝酸钾为唯一氮源，琥珀酸钠为唯一碳源的反硝化培养基中，保证充足的氧气，30℃、120r/min摇床培养，每隔2h检测硝酸盐氮浓度、亚硝酸盐氮浓度以及总氮浓度。
硝酸盐氮的浓度由开始的100.0mg/L降低到25.16mg/L，去除率达到74.84%，总氮的去除率达到70%。
按照上述方法对实施例2、3进行好氧反硝化测试，对硝酸盐氮的去除率可达到73-75%，总氮的去除率达到68-71%。结果基本与实施例1的效果相同。
实验例3
对实施例2所得脱氮复合菌剂的同步硝化反硝化效果测定。
实验所用的反应器为300L全自动不锈钢密封生物反应器，所有实验均在室温25～30℃完成。生物反应器内反应温度为30±0.2℃，反应器内溶解氧DO（METTLER InPro6800，Switzerland）的范围为4-6mg/L，通过气体流量计和搅拌器控制。Do、pH、温度等，一切反应参数均为在线控制。
具体方法：蒸汽灭菌后，将已灭过菌的120L培养基（配方同异养硝化培养基）注入反应器内，并接入10L(OD=1.164)种子培养液及实施例2所得脱氮复合菌剂，密封反应器。打开进气口和出气口，两端均有气体过滤器。以10L/min的高纯氧气（99.99%）量通入反应器数分钟，直到反应器和管道中的氮气全部被排出。用GC-TCD的方法测定氮气是否存在。关闭出气口，通入高纯氩气（99.9995%），(反应器内的压力恒定为0.5MPa.)每间隔5小时，从反应器的顶部取样口取气体样品检测N2、N2O、NO、NO2;从反应器的底部取样口取液体样品检测NH4 +-N，NO3 --N，NO2 --N，和细胞内的氮。
最终测定顶部可知反应产物为N2、N2O、NO、NO2，底部反应硝化产物为NO3 --N，NO2 --N。实验经过20h，氨氮去除率达到91%，其中有15%的氨氮转化硝化产物即为NO3 --N，NO2 --N，28%的氨氮转化为细胞内的氮。47%的氨氮转化为反硝化产物即为N2、N2O、NO、NO2，其中N2占99%。
按照上述方法对实施例1、3进行测定，结果与实施例2基本相同。
实验例4
脱氮复合菌剂的畜禽废水降解能力检测。
将实施例1-3所得脱氮复合菌剂分别按接种量5%接种于100mL高压蒸汽灭菌的畜禽废水中（在养殖废水中加入50mg·L-1葡萄糖补充各菌株生长所需碳源），30℃摇床培养，160rpm，并分别在0h、24h、48h、72h、96h、120h取样，将样品进行离心（8000rpm，10min）取上清液测定氨氮的浓度；同时以芽孢杆菌制剂（北京沃土天地生物科技有限公司产品）为对照例，结果见表1。
表1脱氮复合菌剂对畜禽废水的降解 单位：mg/L
| 0h | 24h | 48h | 72h | 96h | 120h | |
| 实施例1 | 75.21 | 68.36 | 53.17 | 43.22 | 26.86 | 12.29 |
| 实施例2 | 75.21 | 66.24 | 51.89 | 42.67 | 24.91 | 11.35 |
| 实施例3 | 75.21 | 67.69 | 52.78 | 41.75 | 25.82 | 10.68 |
| 对照例 | 75.21 | 70.24 | 64.15 | 52.39 | 40.31 | 35.65 |
由表1可知，经过实施例1-3所得的脱氮复合菌剂降解后，氨氮浓度从起始的75.21mg/L降低至10.68-12.29mg/L，总氮的去除率达到79-85%。由此可见，实施例1-3所得的脱氮复合菌剂对氨氮去除效果明显好于传统芽孢杆菌制同时测定产生气体，气体中约95%-99%的气体为N2，1-5%的气体为N2O、NO、NO2。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
Claims (10)
1.一种脱氮复合菌剂，其特征在于，包括：
CPZ24(Rhodococuus pyridinivorans) 1×108-10×108cfu/mL；
CPZ56(Shinella zoogloeoides) 1×108-10×108cfu/mL；
WL12(Pseudomonas sp.) 1×108-5×108cfu/mL。
2.根据权利要求1所述的脱氮复合菌剂，其特征在于，由如下组成：
CPZ24(Rhodococuus pyridinivorans) 1×108-8×108cfu/mL；
CPZ56(Shinella zoogloeoides) 1×108-8×108cfu/mL；
WL12(Pseudomonas sp.) 1×108-4×108cfu/mL。
3.权利要求1或2所述脱氮复合菌剂的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)固体斜面培养：将CPZ24、CPZ56、WL12分别接种于固体培养基上，于30℃无菌环境下培养1-3天，使菌株活化；
2)一级种子培养：将步骤1)活化的菌株，在无菌条件下分别接种于液体培养基中，均于30℃，150-180rpm下培养2-3天时，单菌种液体培养OD600值达到2.0-4.0之间时停止培养，制得一级种子；
3)二级种子培养：按液体培养基的体积比为10-20％的接种量，将步骤2)所得一级种子分别接种于发酵罐中，30℃条件下，培养2-3天，制得二级种子；
4)混合发酵培养：按液体培养基的体积比为10-20％的接种量，将步骤3)得到的二级种子接种于发酵罐中，进行高密度发酵培养，获得菌剂。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，在步骤1)中，所述固体培养基为牛肉膏蛋白胨琼脂培养基；在步骤2)、步骤3)中，所述液体培养基为牛肉膏蛋白胨培养基。
5.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，在步骤3)中，发酵培养条件：搅拌速度为100-200r/min，通气量为1：0.8-2。
6.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，在步骤4)中，所述液体培养基的配方按质量百分比为：柠檬酸钠5-10％、葡萄糖2-10％、硫酸铵1.0-5％，余量为水。
7.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，在步骤4)中，所述高密度发酵培养采用补料分批培养方式，其中补料碳源为：葡萄糖、柠檬酸钠、甘油中任一种或两种以上；氮源为：硫酸铵和/或蛋白胨。
8.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，在步骤4)中，所述混合发酵培养为有氧培养：起始0-24小时内，间隔通气，保持在有氧条件发酵，通气量1：0.8-1.5，调控发酵溶解氧10-15％，搅拌转速100-200r/min，搅拌间隔时间2-3小时，搅拌1-3分钟，温度25-35℃。
9.权利要求1或2所述脱氮复合菌剂在畜禽处理废水中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，具体应用方法为：按接种量4-6％比例将脱氮复合菌剂接种于畜禽废水中，同时加入50mg·L-1葡萄糖补充各菌株生长所需碳源，30℃摇床培养，150-180rpm，120h。
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