CN103525697A - 快速热循环仪 - Google Patents

Abstract

公开了实现与聚合酶链式反应相关的快速热循环的方法与设备。将具有相对较小热质量的样品装置加热至所需的PCR工作温度，并使用分离的冷却装置根据需要快速降低温度。在一个实施方案中，具有集成加热元件的样品装置在需要升高或保持样品温度时与相对大热质量的冷却器分离，而在需要降低温度时与冷却器接触。

Description

快速热循环仪

本申请是申请号为200780036554.5的中国专利申请的分案申请，原申请是国际申请PCT/US2007/018946的中国国家阶段申请。

相关申请：本申请要求临时申请号60/824027的优先权，该申请名为“快速热循环仪(Rapid Thermal Cycler)”，于2006年8月30日提交，并以参考方式并入本文。

技术领域

发明领域：本发明属于用于实施聚合酶链式反应(PCR)的热循环仪领域。

背景技术

相关技术：多种工业、技术及研究应用利用热循环来实现应用，如化学或生化反应或者分析应用。

分子生物学领域中利用热循环的一个重要工具是称为“聚合酶链式反应”(PCR)的方法。PCR从遗传物质的少量样品产生出大量的遗传物质。这很重要，因为对遗传物质的少量样品进行测量或分析或为任何实际目的使用都可能是困难的或昂贵的，而通过PCR扩增方法产生大量所需遗传物质的能力使人们能进行重要的活动，例如鉴定样品中特定的遗传物质，或者测定存在多少遗传物质，或者产生足以用作其他应用中组分的遗传物质。

PCR过程是在含有用于DNA复制的以下组分的小反应管中进行的：待复制的DNA、装配起来以形成DNA的四种核苷酸、称为“引物”的两种不同的合成DNA(每种用于DNA互补链中的一条)和称为DNA聚合酶的酶。

DNA是双链的。PCR过程以将DNA的两条链分离成各个互补链开始，这一步骤称为“变性”。它通常是通过将PCR反应混合物加热至约94至96摄氏度的温度并持续几秒至超过一分钟的时间来实现的。

一旦DNA被分成单链，就将混合物降温至约45至约60摄氏度(通常选择成低于引物解链温度约5度)以允许引物结合到混合物中DNA的每条相应单链上。此步骤通常称为“退火”。退火步骤通常需要几秒钟到几分钟不等。

接下来，将反应管加热至约72至73摄氏度，在此温度下，反应混合物中的DNA聚合酶通过向引物添加核酸的方式在单链上建立DNA的第二条链，以形成与原始DNA链完全相同的双链DNA。此步骤通常称为“延伸”。延伸步骤通常需要几秒钟至几分钟来完成。

这一系列的三个步骤(有时也称为“阶段”)定义了一个“循环”。一个PCR循环的完成导致反应管中DNA的量倍增。重复一个循环导致反应管中DNA的量再次倍增。通常这一过程重复多次，如10-40次，产生大量相同的DNA片段。进行20个循环产生原始DNA样品的超过一百万个拷贝。进行30个循环产生超原始DNA样品的过十亿个拷贝。“热循环仪”用于使在需要的时间在需要的温度之间移动反应管的过程自动化。

当使用常规设备时，进行约30个循环可能需要约3个小时。由于完成每个PCR步骤之间温度变化所花费的时间以及在每个目标温度下停留的时间，所以需要这样的时间量。

发明内容

尽管能够在几小时内产生一百万以上的拷贝是分子生物学领域中极其重要的进展，但是能够缩短运行每个PCR循环所需的时间将非常有价值。

本发明提供通过缩短每个步骤所需时间量而允许聚合酶链式反应更快进行的方法和设备。这是通过使用具有相对较小热质量(thermalmass)的样品装置及能将该样品装置迅速加热至所需温度然后保持该温度下的相配套的加热元件来实现的。包含具有相对大热质量的冷却器(cold sink)的独立冷却装置来根据需要迅速降低样品装置的温度，这通过使冷却器与样品装置物理接触来实现。

本发明的这些和其他目的和特征通过下文的描述和所附权利要求将变得更为明显，或者可以通过如下文所述实施本发明来理解。

附图说明

为了进一步阐明本发明的以上及其他优点和特征，将通过参考附图中所示其特定实施方案更为具体地描述本发明。应当明白，这些附图仅展示了本发明的一些典型实施方案，因而不能认为是对其范围的限制。将使用下列附图通过更多的特性和细节来描述和解释本发明，其中：

图1A是一种构造的热循环仪中多个组件的示意图，其中样品是热分离的；

图1B是与图1B相似的示意图，但它显示了导致样品冷却的不同构造；

图2是快速热循环仪的一个说明性实施方案的透视图；

图3是图2中实施方案的各个组件的分解图；

图4A是图2中实施方案的横截面，其以样品模块与冷却器热分离的位置显示；

图4B是与图4A相似的横截面，其中样品模块与冷却器热连通；

图5A图2-4中样品模块的透视图；且

图5B是图5A中样品模块的侧视图。

具体实施方式

聚合酶链式反应是用作多种活动的预备步骤的重要工具，所述活动例如鉴定样品中少量的特定遗传物质，测定样品中存在多少遗传物质，或产生足以用于多种应用的遗传物质。本发明提供了对用于聚合酶链式反应的热循环仪的改进。

常规的热循环仪有多种样式。可能最常见的结构包含一个大的固体导热块，其中形成适于放置小反应管孔。就用于进行PCR的热循环仪而言，常规块包含多个放置相应大小和形状的反应管的锥形孔，通常是96孔。使用大的金属块来提供大的热质量，这旨在迅速将所有反应管同时带到正确的反应温度，并在预期的反应持续时间中将它们保持在相同的温度。这是很重要的，使得技术人员可以确保在热循环仪的循环中，每个反应管会在反应路径上前进到相似的程度。例如，不能将所有反应管保持在合适的温度将会导致在一个或多个管中无法对受影响的管内的内含物正确地进行变性、退火或延伸。

使用具有大热质量的样品块需要大量时间将该块的温度升高或降低至每个PCR循环中后续步骤的目标温度。与使用大热质量块的热循环仪相反，本发明提供不同的方法，其允许热循环仪的循环在不同阶段之间迅速进行温度变化。本发明减少了每个PCR循环所需的时间量，并减少了反应管接近但未到每个目标温度的时间量。

图1A和1B图示了根据本发明一个方面的快速热循环仪的一些组件。具体地，图1A描述了样品装置20，其设置成容纳含有待扩增DNA或cDNA的一个或多个样品，并包括加热元件或与其相关联，此加热元件能够使样品温度升高至所需温度并能够使样品保持在该温度。

样品装置20任选地与PCR检测系统22相关联，后者实时监测样品装置中聚合酶链式反应的进行状态，或观察其是否未能进行。

样品装置20还与控制器24相关联，后者在PCR循环的不同步骤中控制样品装置的温度。控制器24还与冷却装置26相关联。

在图1A中，样品装置20显示为由于样品装置与冷却装置物理分离而与冷却装置26热分离。图1B显示与图1A相同的组件，但显示的是样品装置20与冷却装置26物理接触，导致热量如箭头28所示从样品装置传导至冷却装置。

将包含待扩增DNA和必要的PCR化学成分的样品放入样品装置20。如已经指出的，样品装置20包括能够将温度提升至PCR循环中不同目标温度并在达到后能够保持这一温度的加热元件。控制器24监测和控制该样品装置的温度，且优选地还控制PCR进程中每一步骤的持续时间。控制器24还控制PCR步骤中冷却装置与样品装置的分离，并在期望降低样品装置的温度时使样品装置与冷却装置物理接触。这可以通过使样品装置或者冷却装置保持静止并将另一个从与其分离或接触的位置上移开来实现，或者两者都可移动。但是优选将样品装置固定，从而使可能包含要求精确对准的光学设备的PCR检测系统不会受到可能由于移动而引起的不良影响。

样品装置20可以设计成容纳单个样品，但更普遍的是容纳多个样品。对于小的便携式热循环仪而言，样品装置很可能为实现小外形因素(form factor)和低能耗而容纳少量一次性样品管，但是，本发明的热循环仪可以扩大规模以容纳许多样品，这通过扩大样品装置及冷却装置各自的大小或通过提供多个样品装置和多个冷却装置来实现。

样品装置20将优选地具有相对小的热质量，以能够在PCR循环的过程中相对迅速地提高或降低温度，但应当明白的是，实际的热质量可以视特定的PCR需要、样品装置以及所使用的其他装置(例如所用的加热元件和冷却装置)的材料而不同。就快速热循环而言，本发明优选样品装置、加热元件和冷却装置的组合使得样品承载器能够以至少5℃/秒提高或降低温度，但应当明白，在不需要快速PCR时，相对于使用具有大热质量的常规样品块，利用样品装置(与加热元件相关联或包含加热元件)和可移动冷却器的设计仍然是一个工程上的改进。

样品装置20可含有电阻加热元件、陶瓷类加热元件、固态设备例如金属氧化物场效应晶体管(MOSFET)或者具有可控热输出的其他组件。加热元件可以是脉冲宽度调节的或电压调节的或以其他方式控制，以将样品装置提高并保持在期望的温度。已经提到，优选将加热元件选择成允许样品装置以每秒至少5℃的速度快速加热。还优选加热元件能够在PCR循环中不显著过度加热样品装置地运行。如果可以快速地调节热输出，这一目的将很好地达到。

PCR检测系统22用于监测每个PCR步骤的状态。PCR检测系统22可包括任何允许监测PCR步骤的方法，但是本发明优选使用光学系统，更优选使用荧光光学系统。以参考方式并入本文的US公开No.US2006/0152727A1描述了可用于检测PCR样品中少量荧光的光学系统。PCR检测系统的使用是可选的，虽然其使用对于高效PCR而言是非常优选的。

控制器24可采取多种形式，从使每个PCR步骤在设定温度下进行设定时间的简单机械控制器，到更加复杂的控制器，它允许定制，或者与PCR监测系统协同操作，以通过实时监测每一步骤何时完成来优化每个PCR步骤。作为非限制性的实例，控制器24可以监测和控制温度、控制循环的时间、控制样品装置和/或冷却装置在彼此接触及彼此物理分离的位置之间各个位置的时间控制和移动、控制样品装置中加热元件的运行、将来自光学系统的电子读数记录至存储器和周边仪器(如图表记录仪和打印机)中、与使用者交流以及向外部连接或存储器提供数字信息。优选地，控制器24为计算机形式，其中本文使用的术语“计算机”以广义使用，包括使用可编程逻辑控制器或其他能够执行此功能的结构。

将冷却装置26保持在样品装置会运行的最低温度或之下。优选地，冷却装置处在显著地低于这种最低温度的温度，且冷却装置26具有显著高于样品装置20热质量的热质量，以在冷却装置与样品装置相接触时更迅速地冷却样品装置。应当明白，尽管监测样品装置可以允许冷却装置在使用时有温度变化，但优选冷却装置能主动地降温以将其保持在相对恒定的温度，从而其冷却能力在PCR过程中相对恒定。

图2是热循环仪30的说明性实施方案的透视图。图2展示了使用发挥图1样品装置功能的样品模块32的一个实施方案。图1显示为与样品模块32机械分离的冷却器34作为冷却装置的一个组件。虽然图2中没有显示，但提供了控制如下所讨论功能的控制器。虽然图2还省略了PCR检测装置，但由于已经说明的原因，优选提供一个。

通过参考与图2一起提供的图3更容易理解图2中的一些组件。图3是图2的分解图，并显示冷却器34为冷却装置的核心。优选地，冷却器34是由具有与样品模块热质量相比相对更大热质量的固体材料块。冷却器34可以用具有高热传导率并优选地也具有高热存储能力的任何材料制成。冷却器的一种合适材料是铜。可以使用一个以上的冷却器。

有利地，在冷却器34上相反的侧面提供常规的热电冷却器36(TEC)。图2和3显示，热电冷却器36嵌入冷却器相反侧面上形成的凹槽38中，此凹槽帮助安置TEC，并确保TEC与冷却器紧密接触。TEC的“冷”侧附在冷却器34上，而TEC的“热”侧向外。

通过从TEC的“热”面迅速带走热量来提高TEC的效率。这可以通过将主动吸热器(heat sink)40与热电冷却器的“热”侧紧密接触以从TEC带走热量来实现。运行吸热器40外侧的风扇以将热量从吸热器带走并带离热循环仪30。优选地，TEC的附着面包裹多种导热油脂、流体或胶带中的任何一种，以有利于热量更迅速地从冷却器34传递到TEC，然后从TEC传递到主动吸热器40。

虽然多种方法可用以实现冷却器与样品模块的分离或接触，但图示的实施方案显示，冷却器34通过杆46可移动地安装在基板44上，杆46可滑动地穿过基板上的孔48，并固定在冷却器的下方。杆46有利地具有置于杠杆臂52上的T形底端，杠杆臂52继而通过支点与基板44相连。冷却装置的重量使杠杆臂下移，导致冷却器采取与样品模块在空间上分离的关系。

冷却器34还在每个侧面安装承载装置54，承载装置54可滑动地容纳相应的导杆56。承载装置54紧固在相应的支撑托架58上，支撑托架58固定在基板44上。支撑托架58、导杆56和承载装置54的组合允许冷却器在与样品模块接触的较高位置和与样品模块分离的较低位置之间移动。

当期望将冷却器与样品模块接触时，启动螺线管60(见图4A和4B)，以转动杠杆臂52从而抬高冷却器，以使冷却器的上表面62与样品模块32的下表面紧密接触，由此实现样品模块的冷却。当冷却完成后，关闭螺线管，允许重力使冷却器回落至与样品模块物理分离的位置。样品模块32紧固在顶板64上，其在图2和3中显示为具有一个露出样品模块顶部的开口66，以放入或取出2个样品管(未显示)。

图5A-5B更详细地展示了样品模块32。图5A是样品模块的透视图，而图5B是侧视图。样品模块32是由样品块68形成的，样品块68优选地在保持实用性的基础上尽可能小，但应注意，它必须大至足以放置所需数量的样品管。优选地，样品模块32由具有高热导率和高热储存能力的任何材料制成。像冷却器一样，一种合适的材料是铜。优选地，提供热电偶(未显示)以监测样品模块的温度，且热电偶为控制器提供实时信息。

图5的样品模块具有两个孔70，其中每个适于容纳一个样品管(未显示)。虽然所示的实施方案提供了适用于容纳一次性管的孔，但应当明白，使用一次性管并不是必须的。也可以使用其他几何构造替代孔70的构造。

为了使用监测PCR状态的传感器，任选地在样品模块32中提供孔洞72。所示实施例中穿过样品模块的洞与加热单元74匹配。优选地，将样品块68的相对热质量与加热元件74的相对热质量选择成确保在激活加热元件后样品块的温度可迅速上升。此结构是在PCR循环中能够将插入孔70的样品管中所包含样品的温度迅速到达预期目标温度的样品块的一个实例。当然，鉴于本文的教导，其他结构也是很明显的，并且加热元件可以仅仅是在需要提高或保持温度时才与样品模块接触，而不是将其固定在样品模块中的洞内。

在使用时，PCR循环过程开始于在样品孔70中放置含有合适的PCR化学物质的样品管。然后在已编程计算机的操控下开启热循环仪。在PCR热循环的变性步骤中，冷却器保持与样品模块物理分离。为了将样品装置加热至PCR的变性步骤中预期的目标温度，计算机启动加热元件74。计算机监测热电偶或其他温度传感设备并控制样品模块的温度，以将温度提高然后保持在预期的目标温度。计算机程序优选使用预定的常数来调节样品模块32的温度，以使样品管内的温度对于PCR过程的每一步都是合适的。

当PCR方案需要PCR化学物质的温度降低以进行PCR循环的退火阶段时，加热元件被关闭而螺线管60被开启以使冷却器34与样品模块32物理接触。由于温度不同并且冷却器34的质量比样品模块32大得多，热能迅速从样品模块中移去。计算机再次监测样品模块的温度，并在样品模块充分冷却时关闭螺线管60，从而使冷却器与样品模块分离。

接下来，计算机开启样品模块加热元件以将样品块维持在PCR循环的退火步骤相应的温度。这一过程在延伸步骤时重复进行，然后可以继续至所期望的PCR循环数。虽然描述为三个步骤的PCR过程，但是也可使用更多或更少的步骤。例如，有可能以两步过程来进行PCR：用于变性的较高温度(例如，95℃)和用于退火和延伸的较低温度(例如，60℃)。两步法对于快速PCR是优选的。

本发明的热循环仪在以下方面均可按比例放大或缩小：大小、特征和复杂程度，以及根据任何期望的样品数、便携性要求、控制器的控制复杂度要求、可能使用的PCR检测装置的类型和鉴于本文的教导而对普通技术人员显而易见的其他特征来进行优化的多种外形因素。图2-5所示的实施方案可以容易地在具有能够使用电池满足的低能耗的便携式包中提供。

应当明白，用以描述本发明示例性实施方案的多个方面的图是这些示例性实施例的示意图和概要展示，而并不限制本发明，它们也不一定按比例绘制。而且，前面的描述中所述具体细节是为了以提供对本发明的透彻理解而给出，但是对本领域技术人员显而易见的是，本发明实施时可能没有这些特定的细节或者有不同的细节。在许多方面，热循环仪和PCR的许多公知方面并没有具体地描述，以避免不必要地模糊本发明。

本发明可以以其他特定的形式实施，而不背离其构思或基本特征。在所有方面中，所述实施例均应认为仅仅是说明性的而非限制性的。因而，本发明的范围是由所附的权利要求书指明，而不是前面的描述。落入权利要求的意义和等同范围内的所有改变都包含在其范围之内。

Claims (15)

1.用于DNA扩增的热循环仪，其包括：

样品承载装置；

控制器，其控制样品承载装置的温度在目标温度之间循环；

加热元件，用于在控制器的控制之下将样品承载装置加热至期望的温度；

冷却装置，所述冷却装置的热质量比样品承载装置的热质量更大，足以导致在该冷却装置与样品承载装置接触时使该样品承载装置的温度迅速下降；和

机械装置，用于在期望保持或提高样品承载装置的温度时使冷却装置与样品承载装置分离，以及在期望降低样品承载装置的温度时使冷却装置与样品承载装置物理接触，所述机械装置处于所述控制器的控制之下。

2.权利要求1的热循环仪，其中所述样品承载装置的热质量相对于加热元件和冷却装置而言足够小，以致于使其能够迅速改变温度。

3.权利要求1的热循环仪，其中所述样品承载装置能够以每秒至少5℃迅速提高或降低温度。

4.权利要求1的热循环仪，其中所述样品承载装置具有多个样品孔。

5.权利要求1的热循环仪，其中所述样品承载装置具有穿入其中的洞，并且所述加热元件位于所述洞中。

6.权利要求1的热循环仪，其中所述控制器还控制每个PCR步骤的持续时间。

7.权利要求1的热循环仪，其中所述样品承载装置保持不动，而其中所述冷却装置在与该样品承载装置物理分离的位置和与样品承载装置物理接触的位置之间移动。

8.权利要求1的热循环仪，其中所述冷却装置包括：

冷却器；

至少一个热电冷却设备，其与所述冷却器的至少一个表面相接触；

吸热器，用于从每个热电冷却设备中带走热量；和

风扇，用于从每个吸热器中带走热量。

9.权利要求1的热循环仪，还包括在运行中监测PCR状态的PCR检测装置。

10.权利要求9的热循环仪，其中所述控制器根据对运行中PCR状态的监测来控制样品承载装置的温度循环。

11.权利要求1的热循环仪，还包括电池作为电源。

12.实现用于聚合酶链式反应的热循环的方法，其包括以下步骤：

提供能够承载含有待扩增DNA之样品的样品装置；

将所述样品装置加热至PCR步骤的目标温度；

在所述PCR步骤完成时停止加热所述样品装置；

提供冷却器，其热质量与样品装置的热质量相比足够大，以致于使其能迅速降低所述样品装置的温度；

通过将所述冷却器与所述样品装置接触而将所述样品装置冷却至PCR步骤的目标温度，然后移动所述冷却器以使其不与所述样品装置接触；和

根据PCR的需要，重复进行前述的加热、停止加热及冷却的步骤，并进行至所期望的PCR循环数。

13.权利要求12的方法，其中加热和冷却至目标温度的步骤是以每秒至少5℃的速率实现的。

14.权利要求13的方法，还包括以实时方式监测每个PCR步骤的状态的步骤。

15.权利要求14的方法，其中根据对每个PCR步骤的实时监测来进行加热和冷却至目的温度的步骤。

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