CN103509870A - 一组诊断马尔尼菲青霉病的引物和探针及其应用 - Google Patents

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Abstract

一组诊断马尔尼菲青霉病的引物和探针，上游引物的序列为：SEQNO.1：5′-CGAATCTTTGAACGCACATTG-3’；下游引物的序列为：SEQ NO.2：5′-TCCCCGGAGGGACCACA-3’；探针的序列为：SEQ NO.3：FAM-5′-TGCTGTGTGCCCCGGTCATCTAGC-3′-TAMRA。本发明能够特异地检测马尔尼菲青霉基因组DNA，应用于检测人或动物的血清、全血、骨髓或尿液中马尔尼菲青霉菌的DNA载量，为马尔尼菲青霉病的诊断与病情评估的试剂的研究和开发创造了必要的条件，具有重要的理论和实践意义。

Description

一组诊断马尔尼菲青霉病的引物和探针及其应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一组用于诊断马尔尼菲青霉病的引物和探针。
技术背景
马尔尼菲青霉病好发于东南亚地区，是我国南方艾滋病患者最常合并的机会性感染之一，是导致当地艾滋病患者死亡的重要因素，死亡率达80%。马尔尼菲青霉病起病隐匿，临床表现复杂且无明显特征，但若能早期诊断并及时应用抗真菌药物治疗，通常可获得较好的疗效。目前马尔尼菲青霉病的诊断仍依靠传统的真菌培养和形态学鉴定，培养需1-4周不等，耗时长，阳性率相对较低，远远不能满足临床需要。目前尚没有快速诊断马尔尼菲青霉病的相关制剂。随着艾滋病患者增多及免疫抑制剂的使用，马尔尼菲青霉病患者呈增多趋势。当前亟待于开发特异、快速的早期诊断马尔尼菲青霉病的制剂。
发明内容
本发明的目的是提供一组用于诊断马尔尼菲青霉病的引物和探针，以克服现有技术存在的不足。
本发明实现上述目的所采用的技术方案是：诊断马尔尼菲青霉病的引物，包括下游引物和上游引物，所述的上游引物的序列为：SEQNO.1：5′-CGAATCTTTGAACGCACATTG-3’；所述的下游引物的序列为：SEQNO.2：5′-TCCCCGGAGGGACCACA-3’。
与所述的诊断马尔尼菲青霉病的引物进行组合使用的探针，其序列为：SEQNO.3：FAM-5′-TGCTGTGTGCCCCGGTCATCTAGC-3′-TAMRA。
本发明还要求保护所述的诊断马尔尼菲青霉病的引物和探针制成医药制品，在检测人或动物的血清、全血、骨髓或尿液中马尔尼菲青霉菌的DNA载量上的应用。
本发明利用实时荧光定量PCR的方法检测从人或动物的血清、全血、骨髓、活检组织或尿液中提取的DNA的ITS区含111个碱基的基因片段的Ct值和拷贝数，以Ct值≤40个循环数为阳性诊断标准，最低检测限为2个拷贝数。所述的基因片段由以下序列组成：
CGAATCTTTG AACGCACATT GCGCCCCCTG GCATTCCGGG GGGCATGCCT GTCCGAGCGT
CATTTCTGCC CTCAAGCACG GCTTGTGTGT TGGGTGTGGT CCCTCCGGGG A
利用本发明所述的诊断马尔尼菲青霉病的引物和探针，能够敏感地检测马尔尼菲青霉病患者的菌载量，经试验证明，该引物和探针不能扩增烟曲霉、黄曲霉、土曲霉、黑曲霉、构巢曲霉、米曲霉、白色念珠菌、热带念珠菌、光滑念珠菌、近平滑念珠菌、克柔念珠菌、新型隐球菌、米根霉、毛霉、根毛霉和尖端赛多孢菌基因组DNA，证明该引物和探针能够特异地检测马尔尼菲青霉基因组DNA，为马尔尼菲青霉病的诊断与病情评估的试剂的研究和开发创造了必要的条件，具有重要的理论和实践意义。
附图说明
图1是本发明实施例中所述的DNA扩增图；
图2是本发明实施例中所述的DNA扩增后的标准曲线图；
图3是本发明实施例中所述的20例马尔尼菲青霉病患者的血清检测到马尔尼菲青霉菌DNA拷贝数。
图4是本发明实施例中所述的患者在抗真菌治疗后不同时期抽血检测菌载量。
具体实施方式
下面对本发明作进一步说明。
1、含特异性基因片段的质粒标准品的制备
1.1、提取马尔尼菲青霉菌基因组DNA作为模板，根据ITS区序列合成基因片段特异引物和探针：
上游引物：5′-CGAATCTTTGAACGCACATTG-3’；
下游引物：5′-TCCCCGGAGGGACCACA-3’；
探针：FAM-5′-TGCTGTGTGCCCCGGTCATCTAGC-3′-TAMRA；
用普通PCR方法从马尔尼菲青霉菌基因组DNA中扩增基因片段。
1.2、将上述基因片段导入T载体，并转化至大肠杆菌中进行复制。
1.3、提取含特异性基因片段的质粒，稀释成不同浓度梯度的标准品。
2、从人或动物的血清、全血、骨髓、活检组织或尿液中提取DNA。
3、从烟曲霉、黄曲霉、土曲霉、黑曲霉、构巢曲霉、米曲霉、白色念珠菌、热带念珠菌、光滑念珠菌、近平滑念珠菌、克柔念珠菌、新型隐球菌、米根霉、毛霉、根毛霉和尖端赛多孢菌中提取基因组DNA。
4、将2ul的不同梯度的标准品和待测样本DNA加入反应体系中，在实时荧光定量PCR仪中进行扩增，每个样本均做3个复孔。反应体系包括10ulMIX、1ul上游引物、1ul下游引物、1ul探针、5ul双蒸水。反应条件为95℃预变性10min；95℃变性15s，60℃退火1min，40个循环。
5、扩增后，若复孔间重复性好，如图1所示，各复孔间曲线重叠在一起，说明实验可信及具有可重复性；
如图2所示，标准曲线斜率为-3.3，相关系数＞0.99，不加模板的对照组未检测到荧光信号，认为实验数据可信。以Ct值≤40个循环数为阳性诊断标准。
6、上述烟曲霉等16种常见致病真菌均未检测到荧光信号；如图3所示，20例通过血培养确诊的马尔尼菲青霉病患者的血清均可检测到不同拷贝数的马尔尼菲青霉菌DNA，其中3例患者在抗真菌治疗后不同时期抽血检测菌载量，总体呈下降趋势，图4即为其中一名患者在抗真菌治疗后不同时期抽血检测菌载量变化趋势图，与临床症状及体征的缓解相一致。50例健康体检者的血清均未检测马尔尼菲青霉菌DNA。
7、结果分析：本发明可特异的检测到马尔尼菲青霉菌DNA，与临床诊断方法一致率为100%。
Figure IDA0000390505680000011

Claims (3)

1.诊断马尔尼菲青霉病的引物，包括下游引物和上游引物，其特征在于，所述的上游引物的序列为：SEQ NO.1：5′-CGAATCTTTGAACGCACATTG-3’；所述的下游引物的序列为：SEQ NO.2：5′-TCCCCGGAGGGACCACA-3’。
2.与权利要求1所述的诊断马尔尼菲青霉病的引物进行组合使用的探针，其特征在于，所述的探针的序列为：SEQ NO.3：FAM-5′-TGCTGTGTGCCCCGGTCATCTAGC-3′-TAMRA。
3.权利要求1所述的诊断马尔尼菲青霉病的引物和权利要求2所述的探针制成医药制品，在检测人或动物的血清、全血、骨髓或尿液中马尔尼菲青霉菌的DNA载量上的应用。
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