CN103509847A - 一种高通量筛选产生群体感应信号分子菌株的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种高通量筛选产生群体感应信号分子菌株的方法；其包括以下步骤：步骤一：报告平板的准备，其中所述的报告平板为分散有报告菌株的固体微生物培养基；步骤二：待测菌株的分离，获得待测菌株的单菌落；步骤三：待测菌株的转移，以覆膜法将待测菌株的单菌落影印至步骤一所述的报告平板；步骤四：表达信号分子的菌株的获得，培养步骤三所述的报告平板至可检测到表达信号，步骤二中待测菌落的单菌落中与报告平板中显示表达信号的位置相对应的菌株即为表达信号分子的菌株。本发明的方法可以一次实现对40~60个单菌落的筛选，当筛选平台扩大时，可以进一步增加筛选的效率，并且筛选得到的结果可靠，假阳性和假阴性的发生率低。
Description
技术领域
本发明涉及一种菌株筛选方法，涉及生物技术领域，具体的涉及一种高通量筛选产生群体感应信号分子菌株的方法。
背景技术
群体感应(quorum sensing, QS)现象是指细菌细胞根据密度变化进行基因表达调控的一种生理行为, 调控与食品腐败、动植物致病性等有关的许多特性的表达, 如蛋白酶活性、嗜铁素的产生等。N-酰基-高丝氨酸内酯(N-acyl-homoserine lactones, AHLs)类化合物是革兰氏阴性菌群体感应系统中最典型的一类信号分子。 信号分子作为细菌QS系统中的关键因子，是细菌之间的交谈语言。因此如何快速、准确地测定细菌是否产生信号分子，成为研究细菌QS系统的重要手段。目前用于检测细菌产信号分子的方法主要包括物理学的检测手段和微生物传感菌检测。
物理学的检测手段：由于细菌产信号分子的浓度较低，一般使用高效液相色谱-技术来检测、纯化来自液体培养基的样品，该方法不仅能够定量还能鉴定信号分子的性质。同时还可以通过连接质谱、核磁共振来或红外光谱来鉴定信号分子的结构以及信号分子的性质，但似乎其操作复杂，费用昂贵等原因难以成为检测信号分子的常规方法。
微生物传感菌检测法：微生物传感菌的工作原理是人为地删除某些细菌产生信号分子的功能性基因或使其不能产生信号分子，并且这些细菌本身含有LuxR类似的功能基因和其相应的启动子序列以及与其融合在一起的报告基因(如luxAB，lacZ，gfp等)，这时构建的突变株便成为信号分子的生物感应器。当遇到外源信号分子时，报告基因的转录表达被启动, 通过检报告基因的活性便可以检测信号分子的存在。该方法是作为菌种筛选的常规方法，但是由于受筛选菌群的群体数量大，而往往需要进行大量的重复性工作，才能筛选到目的菌株，因此需要开发一种可以节约工作量的高通量的筛选方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种操作简便，可以节约工作量的，实现高效、快速筛选，且筛选结果可靠的高通量筛选产生群体感应信号分子菌株的方法。
为了实现上述发明目的，本发明所采用的技术方案如下：
本发明包括以下步骤：
步骤一：报告平板的准备，其中所述的报告平板为分散有报告菌株的固体微生物培养基；
步骤二：待测菌株的分离，获得待测菌株的单菌落；
步骤三：待测菌株的转移，以覆膜法将待测菌株的单菌落影印至步骤一所述的报告平板；
步骤四：表达信号分子的菌株的获得，培养步骤三所述的报告平板至可检测到表达信号，步骤二中待测菌落的单菌落中与报告平板中显示表达信号的位置相对应的菌株即为表达信号分子的菌株。
进一步的，本发明所述的报告菌株为紫色杆菌CV026或脓杆菌NTL4。
进一步的，本发明步骤一中报告平板为LB平板，由含报告菌株的菌悬液与LB培养基混合制得。
进一步的，本发明所述含报告菌株的菌悬液的光密度为0.8-1.2。
进一步的，本发明所述报告平板的pH为6.8-7.0。
进一步的，本发明调整步骤二中所述的待测菌株的单菌落至40~60个单菌落/平板。
进一步的，本发明所述的平板选自以下形式：9cm培养皿、15cm培养皿、托盘或载玻片。
进一步的，本发明步骤三中所述的覆膜法使用亲水膜。
进一步的，本发明所述的亲水膜为混合纤维素酯微孔滤膜。
本发明在对筛选方法的摸索中发现，通过调整报告平板中报告菌株的含量对筛选结果的显示有较大影响，如果报告菌株的含量偏小，容易出现假阴性的结果，而当报告菌株的含量偏大时，则容易出现待分离菌株被抑制生长的现象。经摸索，当报告菌株的光密度为0.85时分离菌株的效果最好。
本发明在对筛选方法的摸索中发现，选用混合纤维素酯微孔滤膜与其他的滤膜相比具有转移率高、转移过来的菌株菌落形态完整的优势，并且该滤膜比有机系滤膜便宜，且更利于操作。
本发明采用上述技术方案所获得的有益效果为：
通过本发明的方法可以一次实现对40~60个单菌落的筛选，当筛选平台扩大时，可以进一步增加筛选的效率。并且通过本发明的方法筛选得到的结果可靠，假阳性和假阴性的发生率低。
附图说明
图1为本发明实施例1的载有单菌落的LB平板的示意图；
图2为本发明实施例1的报告平板的示意图；
在附图中，1显色菌株、1’信号分子阳性菌株、2未显色菌株、2’信号分子阴性菌株、3载有单菌落的LB平板、4报告平板。
具体实施方式
实施例1
对粉纹夜蛾消化道菌群的表达QS信号分子的菌株的筛选。
步骤一：报告平板的准备，其中所述的报告平板为分散有报告菌株的固体微生物培养基。
报告菌株采用Chromobacterium violaceum CV026，该菌为C. violaceum ATCC 31532 的mini-Tn5 突变体, 本身不产生AHLs, 也不产生紫色, 当有外源AHLs时，紫色杆菌素可恢复产生。
将过夜培养的报告菌CV026调整其OD值到0.85然后与50 mL 含有0.8%琼脂的LB 培养基混合，调整其PH到7, 倒平板即制备好报告平板。
步骤二：待测菌株的分离，获得待测菌株的单菌落。
选取粉纹夜蛾幼虫3条，杀死后分别放入75 %的酒精中浸泡10 s ，在无菌操作下取出虫体并放在0. 1 %升汞液中消毒2min ，在灭菌水中清洗，然后在蜡盘中进行无菌解剖。分别取出其消化道，在灭菌研钵中研磨，将研磨后得到的液体用灭菌水稀释至1×10-1—1×10-8。取1×10-6、1×10-7、1×10-8三个稀释度涂LB平板，30℃培养6-8小时。培养好的单菌落用牙签有序的接种在新的LB固体培养基上，30℃培养至出现单菌落。
步骤三：待测菌株的转移，以覆膜法将待测菌株的单菌落影印至报告平板。
用混合纤维素酯微孔滤膜轻轻覆盖步骤二中载有单菌落的LB平板；缓缓揭下滤膜，将滤膜上的分离菌株影印到步骤一制得的报告平板，弃滤膜，滤膜覆盖在平板上整个过中切忌移动。
步骤四：表达信号分子的菌株的获得，培养报告平板至可检测到表达信号，步骤二中待测菌落的单菌落中与报告平板中显示表达信号的位置相对应的菌株即为表达信号分子的菌株。
将报告平板培养至显色。如附图1和2所示，报告平板4中含有的CV026，当待测菌株中表达信号分子AHL时，CV026在外源AHLs刺激时，紫色杆菌素恢复表达，成为显色菌株1，其所在区域显示紫色，载有单菌落的LB平板3中与报告平板4中的显色菌株1中位置相对应的即为信号分子阳性菌株1’。 当待测菌株中未表达信号分子AHL时，CV026本是不表达AHLs，因此不会表达紫色杆菌素，成为未显色菌株2，其所在区域不变色，载有单菌落的LB平板3中与报告平板4中的未显色菌株2中位置相对应的为信号分子阴性菌株2’。
对比例1
考察报告菌株、待测菌株数量对筛选结果的影响
对实施例1中过夜培养的报告菌CV026菌悬液的光密度、待测菌株的数量进行替换，其他步骤不变，具体条件和结果见表1。
由表1的数据显示，报告菌的含量偏低，当菌体密度低于0.85时，出现了假阴性结果，即使经后期筛选表达信号分子的菌株，在此条件下易没有使报告菌体显示紫色；而当增大报告菌的含量时，甚至会抑制待筛选菌株的生长，部分单菌落不能正常的生长。在本发明所主张的报告菌的菌体浓度下，带筛选菌株可以正常生长，并且筛选所得的菌株准确，经后期验证，不会出现假阳性和假阴性的结果。
Claims (9)
1.一种高通量筛选产生群体感应信号分子菌株的方法，其特征在于其包括以下步骤：
步骤一：报告平板的准备，其中所述的报告平板为分散有报告菌株的固体微生物培养基；
步骤二：待测菌株的分离，获得待测菌株的单菌落；
步骤三：待测菌株的转移，以覆膜法将待测菌株的单菌落影印至步骤一所述的报告平板；
步骤四：表达信号分子的菌株的获得，培养步骤三所述的报告平板至可检测到表达信号，步骤二中待测菌落的单菌落中与报告平板中显示表达信号的位置相对应的菌株即为表达信号分子的菌株。
2.根据权利要求1所述的一种高通量筛选产生群体感应信号分子菌株的方法，其特征在于所述的报告菌株为紫色杆菌CV026或脓杆菌NTL4。
3.根据权利要求1所述的一种高通量筛选产生群体感应信号分子菌株的方法，其特征在于步骤一中报告平板为LB平板，由含报告菌株的菌悬液与LB培养基混合制得。
4.根据权利要求3所述的一种高通量筛选产生群体感应信号分子菌株的方法，其特征在于所述含报告菌株的菌悬液的光密度为0.8-1.2。
5.根据权利要求3所述的一种高通量筛选产生群体感应信号分子菌株的方法，其特征在于所述报告平板的pH为6.8-7.0。
6.根据权利要求1所述的一种高通量筛选产生群体感应信号分子菌株的方法，其特征在于调整步骤二中所述的待测菌株的单菌落至40~60个单菌落/平板。
7.根据权利要求5所述的一种高通量筛选产生群体感应信号分子菌株的方法，其特征在于所述的平板选自以下形式：9cm培养皿、15cm培养皿、托盘或载玻片。
8.根据权利要求1所述的一种高通量筛选产生群体感应信号分子菌株的方法，其特征在于步骤三中所述的覆膜法使用亲水膜。
9.根据权利要求7所述的一种高通量筛选产生群体感应信号分子菌株的方法，其特征在于所述的亲水膜为混合纤维素酯微孔滤膜。
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