CN103509719B - 一种高效的反硝化厌氧甲烷氧化与厌氧氨氧化混合微生物体系的共培养方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种高效的反硝化厌氧甲烷氧化与厌氧氨氧化混合微生物体系的共培养方法，其包括（1）富集含有DAMO和ANAMMOX微生物菌群，得到预共培养体系；（2）将培养步骤（1）得到的预共培养体系微生物，接种到添加了液体石蜡的培养基的反应器中，并在培养过程中添加硝氮NO₃ ^‑‑N、甲烷CH₄和氨氮NH₄ ⁺‑N，最终得到高活性的DAMO和ANAMMOX的混合微生物。本发明提供的共培养方法，不需要额外曝气，也不需要外加有机碳源，既节约了成本又避免了二次污染。用本发明方法培养得到的体系能够将CH₄氧化成CO₂，同时将NO₃ ^‑和NH₄ ⁺转化成N₂排出，在含有氨氮、溶解甲烷的废水处理系统中有很好的应用前景。

Description

一种高效的反硝化厌氧甲烷氧化与厌氧氨氧化混合微生物体 系的共培养方法

技术领域

本发明涉及微生物共培养技术领域，特别是涉及一种高效的反硝化厌氧甲烷氧化与厌氧氨氧化混合微生物体系的共培养方法。

背景技术

甲烷（CH₄）作为一种能源物质的同时，还是一种很强的温室气体，单位质量的CH₄吸热量大约是CO₂的25倍。如果深海中的CH₄全部释放到大气中，地球的温度将远远高于现在的水平，导致全球气候变暖、冰山融化、海平面上升等严重后果。之所以没有发生这样的灾难，主要是因为90%以上的CH₄在从海底逃逸的过程中被微生物消耗了，其中厌氧甲烷氧化过程发挥了巨大的作用。

反硝化厌氧甲烷氧化（denitrifying anaerobic methane oxidation，DAMO）是一种新型的厌氧甲烷氧化过程，在厌氧条件下将甲烷氧化与反硝化结合起来，其中CH₄作为电子供体，NO_x作为电子受体。主要分为两类：5CH₄+8NO₃ ^-+8H⁺→5CO₂+4N₂+14H₂O(1)和3CH₄+8NO₂ ^-+8H⁺→3CO₂+4N₂+10H₂O(2)。由于DAMO微生物为自养型微生物，生长缓慢，倍增时间为数周，甚至数月，所以富集时间长、活性低等问题一直是限制DAMO微生物研究及相关技术发展和应用的主要因素。富集培养过程一般是通过顶空注入，或底部连续曝气的方式提供所需甲烷。由于甲烷在水相的溶解度低，传质系数小，甲烷从气相到液相、再到微生物的传质过程受到极大限制，从而导致微生物富集时间的延长，并且连续曝气造成CH₄的泄漏和浪费还存在安全隐患。所以现有DAMO微生物的培养方法不利于工业化应用。

厌氧氨氧化（anaerobic ammonium oxidation，ANAMMOX）也是一种比较新的脱氮工艺，反应方程式如下NO₂ ^-+1/1.32NH₄ ⁺→1.02/1.32N₂+0.26/1.32NO₃ ^-。ANAMMOX反应具有很多优点，不需外加有机碳源、避免了二次污染、节省供氧动力消耗、几乎不产生温室气体N₂O等，但需要前置短程硝化工艺，条件控制复杂，并且ANAMMOX微生物富集培养时间长、条件苛刻，并且NO₂ ^-浓度过高会对微生物活性产生不可逆的抑制。

由于NO₂ ^-是NO₃ ^-反硝化过程的中间产物，同时也是厌氧氨氧化反应的底物，而且DAMO和ANAMMOX两种微生物的培养条件类似，都要求厌氧、培养基中不需外加有机碳源，因此DAMO与ANAMMOX混合微生物共培养体系是可行的，是一种潜在的新型脱氮除碳途径，即通过DAMO反应生成NO₂ ^-，作为ANAMMOX的底物，避免NO₂ ^-浓度过高产生抑制作用，ANAMMOX反应生成的少量NO₃ ^-又被DAMO利用，同时实现CH₄、NO₃ ^-和NH₄ ⁺的高效去除。

需要指出的是，由于NO₂ ^-同时作为n-damo与ANAMMOX两种菌的底物，所以这两种菌之间主要为竞争关系，而另一种以NO₃ ^-为底物的DAMO古菌与ANAMMOX菌之间不是竞争关系而是协同关系，即只要DAMO古菌与ANAMMOX菌中有一种菌活性提高，就可通过协同作用促进另外一种菌活性的提高，这也是该体系与n-damo与ANAMMOX共培养体系相比的优势。

有研究者对以NO₂ ^-为底物的反硝化厌氧甲烷氧化过程(n-damo，以CandidatusMethylomirabilis oxyfera细菌为主)与ANAMMOX的共培养进行了尝试，如FranciscaA.Luesken曾经对n-damo与ANAMMOX两种菌群之间的竞争关系进行了研究；北京工业大学的郭建华等人，通过先分别单独培养再协同培养或者先单独培养n-DAMO再驯化其中的ANAMMOX的方法，实现了以NO₂ ^-为底物的n-damo细菌与ANAMMOX的耦合，同Luesken的工作类似，均以M.oxyfera细菌为研究对象，并且该发明存在一些不足，如反应装置复杂，操作繁琐，需要用甲烷连续曝气等。

但是针对另一种类型的反硝化厌氧甲烷氧化(NO₃ ^-为底物的反硝化厌氧甲烷氧化，以古菌为主)与ANAMMOX混合微生物的共培养方法，尤其是通过添加液体石蜡间接促进ANAMMOX反应的共培养体系还没有报道。

如果能够快速富集得到高活性DAMO微生物，解决ANAMMOX应用中的问题，并且将两种脱氮新方法中的优势相结合，这种方法将在含有氨氮、甲烷的污水处理系统及相关产业中发挥巨大的作用。因此有必要发明一种解决CH₄传质、获得高活性的反硝化厌氧甲烷氧化微生物的方法，也需要一种DAMO与ANAMMOX共培养的体系，实现高效的厌氧氨氧化、反硝化以及甲烷氧化。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供了一种高效的反硝化厌氧甲烷氧化与厌氧氨氧化混合微生物体系的共培养方法，得到高活性的DAMO和ANAMMOX的混合微生物。

本发明首先提供了一种高效的反硝化厌氧甲烷氧化与厌氧氨氧化混合微生物体系的共培养方法，其包括如下步骤：

（1）富集含有DAMO和ANAMMOX微生物菌群，得到预共培养体系；

（2）将培养步骤（1）得到的预共培养体系微生物，接种到添加了液体石蜡的培养基的反应器中，并在培养过程中添加硝氮NO₃ ^--N、甲烷CH₄和氨氮NH₄ ⁺-N，最终得到高活性的DAMO和ANAMMOX的混合微生物。

优选的，所述硝氮NO₃ ^--N在整个液相中的浓度为50～100mg/L，所述氨氮NH₄ ⁺-N在整个液相中的浓度为40～80mg/L，所述甲烷CH₄是通过曝气的方式加入。

优选的，所述液体石蜡在整个液相中的体积含量为1～10%。

优选的，所用培养基为液体矿物盐培养基，不添加任何其他有机碳源。

优选的，所述矿物盐培养基配方为：每升培养基中含KHCO₃0.5g，KH₂PO₄0.05g，MgSO₄·7H₂O0.2g，CaCl₂0.2265g，酸性微量元素0.5mL，碱性微量元素0.2mL。

优选的，所述共培养方法是在CSTR（continuous stirred tank reactor，连续搅拌釜式反应器）或类似反应器中进行。

优选的，步骤（2）中的反应体系的运行条件控制如下：温度30～38℃，搅拌速度200～400r/min，pH7～8，顶空气相压强为90～130kPa。

优选的，步骤（2）中的反应体系按照序批次模式运行，所述体系运行时间为3～5个月。

进一步地，本发明提供了一种污水处理剂，其含有上述方法制备得到的高活性的DAMO和ANAMMOX的混合微生物体系。

更进一步地，本发明提供了一种污水处理方法，其利用了上述污水处理剂进行处理。

本发明的有益效果如下：

本方法具有如下优点：(1)由于亚硝氮是反硝化的中间产物，提供适量氨氮使体系中同时存在DAMO和ANAMMOX两种微生物。(2)液体石蜡对甲烷的溶解度远高于矿物盐培养基，在连续搅拌下，分散成的小液滴作为载体，连续不断地将气相中的CH₄运输到液相被微生物利用，促进甲烷从气相到液相再到微生物的传质过程，提高甲烷的利用率。(3)通过外加液体石蜡提高DAMO活性，从而提高ANAMMOX的活性。(4)不需要外加有机碳源，也不需要额外曝气，避免了二次污染的同时降低了成本。基于上述优点，本发明的方法能够在厌氧条件下，同时实现高效的氨氧化、反硝化以及甲烷氧化，在含有氨氮、甲烷的污水处理系统及相关产业中具有潜在的应用价值。

附图说明

图1为DAMO与ANAMMOX混合微生物共培养装置示意图。

图2为液体石蜡影响液相中溶解甲烷的含量。

图3为液体石蜡对CH₄、NH₄ ⁺、NO₃ ^-的消耗以及N₂的产生速率的影响。

具体实施方式

为了进一步理解本发明，下面结合具体实施例对本发明优选实施方案进行描述，这些描述只是为了进一步说明本发明的特征和优点，而不是对本发明权利要求的限制。

下述实例中如无特别说明均为常规试剂和方法，所有培养基中的溶剂均为蒸馏水。

本发明首先提供了一种高效的反硝化厌氧甲烷氧化与厌氧氨氧化混合微生物体系的共培养方法，其包括如下步骤：

（1）富集含有DAMO和ANAMMOX微生物菌群，得到预共培养体系；

（2）将培养步骤（1）得到的预共培养体系微生物，接种到添加了液体石蜡的培养基的反应器中，并在培养过程中添加硝氮NO₃ ^--N、甲烷CH₄和氨氮NH₄ ⁺-N，最终得到高活性的DAMO和ANAMMOX的混合微生物。

该方法的原理为：针对以NO₃ ^-为电子受体的DAMO微生物，通过液体石蜡的添加，增加甲烷在液相的溶解度，促进气液传质，首先提高DAMO活性，利用DAMO与ANAMMOX之间的相互作用，促进ANAMMOX活性的提高，从而实现高效的反硝化厌氧甲烷氧化和厌氧氨氧化过程。

由于液体石蜡难溶于水、不挥发、对微生物无毒、对甲烷溶解度高，所以矿物盐培养基中添加液体石蜡后，在连续搅拌下，分散成的小液滴作为载体，连续不断地将气相中的CH₄运输到液相被微生物利用，促进甲烷从气相到液相再到微生物的传质过程，提高甲烷的利用率，从而促进了反硝化厌氧甲烷氧化过程。

NO₂ ^-作为NO₃ ^-反硝化过程的中间产物的同时，也可以与NH₄ ⁺一起被ANAMMOX微生物利用。由于DAMO活性提高，产生的中间产物NO₂ ^-也就越多，一部分继续与CH₄反应进行反硝化厌氧甲烷氧化，另一部分与NH₄ ⁺进行厌氧氨氧化反应。优选的，所述硝氮NO₃ ^--N在整个液相中的浓度为50～100mg/L，所述氨氮NH₄ ⁺-N在整个液相中的浓度为40～80mg/L，所述甲烷CH₄是通过曝气的方式加入。

所以液体石蜡的添加增加液相甲烷的溶解度，促进CH₄从气相到液相，再到微生物的传质，提高反硝化厌氧甲烷氧化过程，从而促进了厌氧氨氧化反应。

所用培养基优选为液体矿物盐培养基，不添加任何有机碳源。按一定比例加入液体石蜡，液体石蜡不需要进行处理，可直接添加，加入量与液相体积有关，含量优选为1～10%，勿使添加的液体石蜡过多。

在优选实施例中，所述矿物盐培养基配方为：每升培养基中含KHCO₃0.5g，KH₂PO₄0.05g，MgSO₄·7H₂O0.2g，CaCl₂0.2265g，酸性微量元素0.5mL，碱性微量元素0.2mL。其中，酸性微量元素每升含FeSO₄·7H₂O2.085g，ZnSO₄·7H₂O0.068g，CoCl₂·6H₂O0.12g，MnCl₂·4H₂O0.5g，CuSO₄0.32g，NiCl₂·6H₂O0.095g，H₃BO₃0.014g，HCl100mmol。碱性微量元素每升含SeO₂0.067g，Na₂WO₄·2H₂O0.05g，Na₂MoO₄0.242g，NaOH0.4g。培养基通氮气曝气除氧，pH调节到7～8之间。

首先构建混合微生物共培养装置，如图1所示，然后按照进水、供气、沉淀、排水和待机的序批次模式运行：供水装置通过进水口向反应器中加入含有反硝化厌氧甲烷氧化微生物的接种物和液体培养基，加入一定浓度的NO₃ ^-和NH₄ ⁺，甲烷供气装置通过进气口向反应器中加入甲烷气体。

优选的，所述共培养方法是在CSTR（continuous stirred tank reactor，连续搅拌釜式反应器）或类似反应器中进行。

优选的，步骤（2）中的反应体系的运行条件控制如下：温度30～38℃，搅拌速度200～400r/min，pH7～8，顶空气相压强为90～130kPa。

优选的，步骤（2）中的反应体系按照序批次模式运行，所述体系运行时间为3～5个月。

另外，本发明还提供了一种污水处理剂，其含有上述方法制备得到的高活性的DAMO和ANAMMOX的混合微生物体系。本发明还提供了一种污水处理方法，该方法利用了该污水处理剂处理污水。

实施例1、液体石蜡对液相甲烷溶解度的影响

如图1所示，两个混合微生物共培养装置通氮气除氧，再加入总体积2/3的已除氧的液体矿物盐培养基，其中一个添加液体石蜡，加入量为液相体积的5%，另一个不加。所述矿物盐培养基配方为：每升培养基中含KHCO₃0.5g，KH₂PO₄0.05g，MgSO₄·7H₂O0.2g，CaCl₂0.2265g，酸性微量元素0.5mL，碱性微量元素0.2mL。其中，酸性微量元素每升含FeSO₄·7H₂O2.085g，ZnSO₄·7H₂O0.068g，CoCl₂·6H₂O0.12g，MnCl₂·4H₂O0.5g，CuSO₄0.32g，NiCl₂·6H₂O0.095g，H₃BO₃0.014g，HCl100mmol。碱性微量元素每升含SeO₂0.067g，Na₂WO₄·2H₂O0.05g，Na₂MoO₄0.242g，NaOH0.4g。底部用CH₄曝气10～25min，最终顶空N₂的含量<5%，顶空气相压为90～130kPa，控制温度30～38℃左右，搅拌速度200～400r/min，pH7～8，24h以后分别取1mL样品测其液相中溶解的甲烷，具体方法如下。

将10mL的小瓶抽成真空，加入l mL液相样品，补充空气至平衡，剧烈振荡30s，用高压针取样，气相色谱分析气相甲烷含量。因为空气中甲烷基本为0，所以根据下面简化的公式计算液相中甲烷含量。χ_L液相甲烷含量，χ_a顶空甲烷含量,V_a顶空体积，V_L液相体积，0.03为25℃下甲烷的分配系数。液体石蜡对甲烷在培养基中的溶解度有影响，提高了液相中甲烷的含量，结果如图2所示。不添加液体石蜡的液相中甲烷浓度为1.29mmol/L，加入液体石蜡的液相中甲烷浓度为1.61mmol/L，与不添加石蜡的相比，液相溶解甲烷浓度明显增加，增加了24.8%。

实施例2、反硝化厌氧甲烷氧化与厌氧氨氧化混合微生物体系的富集培养

构建混合微生物共培养装置，结构如图1所示，包括温度、pH、搅拌、曝气等装置。

取含有DAMO和ANAMMOX微生物菌群的污泥，河道底泥微生物与污水处理厂的活性污泥作为母反应器的接种物，进行预富集。

从母反应器取出一部分微生物接种到共培养装置中，装置在加入微生物之前要通氮气除氧，加微生物的过程中也要保证厌氧。

补充液体培养基至装置总体积的2/3，加NO₃ ^--N50～100mg/L、NH₄ ⁺-N40～80mg/L。反应器运行条件优选为：温度30～38℃，搅拌速度200～400r/min，pH7～8。

底部用CH₄曝气10～25min，最终顶空N₂的含量<5%，顶空气相压强优选为90～130kPa。

构建好上述共培养体系后，在优选条件下按照序批次模式运行。每天检测气相CH₄和N₂的含量，取液相样品检测NO₃ ^-、NO₂ ^-和NH₄ ⁺的浓度。当NO₃ ^--N或NH₄ ⁺-N的浓度低于10mg/L时，加入浓缩液进行补充，使其浓度恢复到80mg/L左右；当CH₄的含量<60%或N₂>40%时，用CH₄曝气，置换顶空气体；当pH升高超过8，加入1mol/L的HCl进行调节。所述培养系统按照上述方法运行100天以后，CH₄的消耗速率可达到0.121mmol/d，N₂的产生速率可达到0.088mmol/d，NO₃ ^--N的消耗速率可达到4.612mg/L/d，NH₄ ⁺-N消耗速率可达到0.325mg/L/d，结果如图3所示。菌群分析表明，其中ANAMMOX菌与DAMO菌分别占总菌的20.5%和35%。

实施例3、利用液体石蜡培养DAMO与ANAMMOX混合体系并与不含液体石蜡培养的进行比较

首先用120mL血清瓶进行试验，对液体石蜡加入比例进行优化。向血清瓶中通氮气除氧后，将液体培养基和部分母反应器微生物加入血清瓶，总量为血清瓶体积的2/3，加NO₃ ^--N50～100mg/L、NH₄ ⁺-N40～80mg/L，添加液体石蜡，加入量分别为液相总体积的0%，1%，2.5%，5%，7.5%，10%，15%，再用CH₄曝气10～25min。

10天后NO₃ ^--N的消耗速率依次为1.649，2.429，2.928，3.539，3.320，3.122，1.683mg/L/d。当液体石蜡加入量从0%增加到5%，NO₃ ^--N的消耗速率逐渐增加，说明在此范围内随着液体石蜡含量的提高，其对DAMO活性的促进作用也随之增加；当液体石蜡由5%继续增加至10%，NO₃ ^--N的消耗速率不再增加；当超过10%后，NO₃ ^--N的消耗速率与不添加液体石蜡基本没有区别，说明液体石蜡的加入量不是越多越好，当浓度过高时，虽然液相中CH₄含量较高，但过多的液体石蜡会阻碍微生物与水相中的NO₃ ^-接触，从而失去促进DAMO活性的作用。根据以上结果可知，液体石蜡含量在1～10%的范围内，对DAMO微生物都有明显的促进作用，其中液体石蜡含量为5%最合适。

构建混合微生物共培养装置，结构如图1所示，包括温度、pH、搅拌、曝气等装置。

取含有DAMO和ANAMMOX的微生物菌群的污泥，如河道底泥微生物与污水处理厂的活性污泥作为母反应器的接种物，进行预富集。

从母反应器取出一部分微生物接种到共培养装置中，装置在加入微生物之前通氮气除氧，加微生物的过程中保证厌氧操作。

加入液体培养基至反应器总体积的2/3，添加液体石蜡，加入量为液相总体积的5%，加NO₃ ^--N50～100mg/L、NH₄ ⁺-N40～80mg/L。底部用CH₄曝气10～25min，最终顶空N₂的含量<5%，顶空气相压强优选为90～130kPa。

构建好上述共培养体系后，在温度30～38℃，搅拌速度200～400r/min，pH7～8的优选条件下按照序批次模式运行。每天检测气相CH₄和N₂的含量，取液相样品检测NO₃ ^-、NO₂ ^-和NH₄ ⁺的浓度。当NO₃ ^--N或NH₄ ⁺-N的浓度低于10mg/L时，加入浓缩液进行补充，使其浓度恢复到80mg/L左右；当CH₄的含量<60%或N₂>40%时，用CH₄曝气，置换顶空气体；当pH升高超过8，加入1mol/L的HCl进行调节。所述培养系统按照上述方法运行100天以后，CH₄的消耗速率可达到0.124mmol/d，N₂的产生速率可达到0.159mmol/d，NO₃ ^--N的消耗速率可达到9.185mg/L/d，NH₄ ⁺-N消耗速率可达到6.493mg/L/d，结果如图3所示。与未加液体石蜡相比CH₄消耗速率提高了2.5%，N₂的产生速率提高了80.7%，NO₃ ^--N和NH₄ ⁺-N的消耗速率分别是原来的2倍和20倍。菌群分析表明，ANAMMOX与DAMO分别占总菌的25.9%和51.7%，与未加液体石蜡相比，两种菌总量从55.5%提高到77.6%，其中ANAMMOX菌含量提高了26.3%，DAMO菌提高了35.1%。

由以上实施例可知，采用本发明的培养方法可以成功获得高效的反硝化厌氧甲烷氧化与厌氧氨氧化混合微生物体系，主要是在DAMO微生物的富集过程中，提供一定浓度的NH₄ ⁺-N，并且在矿物盐培养基中加入一定比例的液体石蜡。

本发明主要是通过添加液体石蜡提高CH₄在液相中的溶解度，促进气液传质过程，从而提高DAMO活性，以NO₃ ^-反硝化过程的中间产物NO₂ ^-为纽带，利用DAMO微生物与ANAMMOX之间的协同作用，从而间接提高ANAMMOX活性，实现了高效的反硝化厌氧甲烷氧化与厌氧氨氧化混合微生物体系的共培养。

尽管本发明是针对以NO₃ ^-为底物的DAMO微生物进行尝试的，在理论上添加石蜡油对于以NO₂ ^-为底物的n-damo微生物同样具有促进作用,所以将本发明应用于n-damo与ANAMMOX的共培养体系中也是具有积极作用的。由于ANAMMOX生长速率比n-damo快很多，通常需要限制NH₄ ⁺的浓度适当降低ANAMMOX活性，否则生长速率很慢的n-damo竞争不过ANAMMOX最终将被淘汰。本发明同样可以利用添加液体石蜡提高n-damo对NO₂ ^-的竞争力，不必将ANAMMOX活性限制在较低水平，从而提高n-damo与ANAMMOX共培养体系整体的效率。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，需要指出的是，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围，而且，在阅读了本发明的内容之后，本领域相关技术人员可以对本发明做出各种改动或修改，这些等价形式同样落入本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (3)

1.一种高效的反硝化厌氧甲烷氧化与厌氧氨氧化混合微生物体系的共培养方法，其包括如下步骤：

(1)富集含有DAMO和ANAMMOX微生物菌群，得到预共培养体系；

(2)将培养步骤(1)得到的预共培养体系微生物，接种到添加了液体石蜡的液体培养基的反应器中，所述液体石蜡的添加量为液相总体积的5％，并在培养过程中添加50～100mg/L的硝氮NO₃ ^--N和40～80mg/L的氨氮NH₄ ⁺-N，底部用甲烷曝气10～25min，最终顶空N₂的含量＜5％，顶空气相压强为90～130kPa，得到共培养体系；

(3)所述步骤(2)的共培养体系的运行条件控制如下：温度30～38℃，搅拌速度200～400r/min，pH值7～8；

每天检测气相CH₄和N₂的含量，取液相样品检测NO₃ ^-、NO₂ ^-和NH₄ ⁺的浓度，当硝氮NO₃ ^--N或氨氮NH₄ ⁺-N的浓度低于10mg/L，加入浓缩液进行补充，使硝氮NO₃ ^--N或氨氮NH₄ ⁺-N的浓度恢复到80mg/L；

当甲烷的含量＜60％或N₂＞40％，用甲烷曝气，置换顶空气体；

当pH值升高超过8，加入1mol/L的HCl进行调节；

所用培养基为液体矿物盐培养基，不添加任何其他有机碳源，所述矿物盐培养基配方为：每升培养基中含KHCO₃ 0.5g，KH₂PO₄ 0.05g，MgSO₄·7H₂O 0.2g，CaCl₂ 0.2265g，酸性微量元素0.5mL，碱性微量元素0.2mL。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述共培养方法是在连续搅拌釜式反应器中进行。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中的反应体系按照序批次模式运行，所述体系运行时间为3～5个月。