CN103509082A - 一种糖基化蛋白和非糖基化蛋白的分离方法 - Google Patents
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Abstract
一种糖基化蛋白和非糖基化蛋白的分离方法，将含有糖基化蛋白的非糖基化蛋白样品或含有非糖基化蛋白的糖基化蛋白样品采用反相高效液相色谱(RP-HPLC)进行分离，该分离所用的缓冲液中含有Ba2+，Ba2+在缓冲液中的浓度至少为5mM。本发明可用于胰岛素及其类似物的纯化，可显著提高纯化效率。
Description
技术领域
本发明涉及糖基化蛋白或前体与非糖基化蛋白或前体的色谱分离方法。
背景技术
在蛋白质生产过程中，糖基化蛋白及前体和非糖基化蛋白及前体的分离是一个独特的研究领域。在去除糖基化杂质或者非糖基化杂质时往往会遇到比较大的困难。
蛋白或蛋白前体可以表达自酵母或者CHO、NSO或者昆虫细胞等真核细胞表达系统。特别是在酵母中，随着表达量的增高，糖基化的蛋白亦会较高的表达。这样就需要有较好的方法来进行非糖基化蛋白中糖基化蛋白的去除。
在酵母表达系统中，目的蛋白可以表达在胞内或者分泌到胞外，通过构建不同的载体，以得到不同的目的蛋白或前体；在哺乳细胞表达系统中，蛋白亦可以通过不同的表达载体进行胞内或者胞外表达。
在前期的纯化中，需要进行蛋白质的初纯，主要利用多种色谱层析介质进行，如酵母细胞表达蛋白利用离子交换层析进行捕获及利用盐离子梯度或者pH进行洗脱，或者利用亲和标签的亲和层析。通过反相高效液相色谱(RP-HPLC)进行糖基化和非糖基化蛋白的分离，层析缓冲液可以包括有机溶剂和其它常用的盐离子如NaCl、KCl、(NH4)2SO4等。但是现有技术中，各种盐的加入对蛋白的分离影响，除了US6180757专利中所提到的Ca2+的添加外，对其它二价阳离子在这方面的应用上没有提及。
例如，在现有的胰岛素及其类似物的纯化工艺中，糖基化的杂质去除主要靠RP-HPLC及缓冲液中Ca2+的添加，这虽然能有效去除糖基化蛋白，但是其上样量仍然不高，分离纯化效率仍有待于进一步提高。
发明内容
本发明的主要目的是提供一种糖基化蛋白和非糖基化蛋白的分离方法，通过添加特定的离子，实现样品中糖基化蛋白和非糖基化蛋白的高效分离的目标。
以下对本发明进行一般性的描述。
蛋白或蛋白前体及类似物主要来自于酵母表达系统、哺乳动物细胞表达系统及昆虫细胞表达系统。在蛋白质药物的生产过程中，色谱层析应用广泛。在表达或者后期的改造过程中，蛋白往往会发生一系列的修饰，一系列的色谱层析及其它纯化步骤也被广泛应用，比如疏水层析、反相高效液相层析、离子交换、亲和层析、(NH4)2SO4沉淀、PI沉淀、结晶等。本发明主要应用在糖基化蛋白和非糖基化蛋白的柱层析步骤。在糖基化和非糖基化蛋白的分离纯化中，缓冲液中至少含有5mM的Ba2+，从而达到糖基化和非糖基化蛋白的有效分离。
色谱层析进行蛋白质分离的基本原则是在一定的流动相缓冲液中不同结构的蛋白质和固定相的层析介质的相互作用不同，采用不同的流动相和固定相，蛋白质在层析柱上的保留时间不同，从而达到不同种类或者不同结构蛋白质的有效分离。
色谱层析可以选用多种不同性质的层析介质和层析方法，最好选用反相高效液相色谱(RP-HPLC)层析。
在样品的选择上，蛋白样品至少应该含有一定量的糖基化蛋白，其可以是单糖基化、二糖基化或者多糖基化或者它们的混合物。
和不含Ba2+缓冲液进行糖基化与非糖基化蛋白的分离相比较，含有Ba2+，其至少可以增加60％的上样量，同时亦显著增加目的蛋白的纯度。与含有Ca2+的缓冲液比较，其也可以在相同的纯度及得率下提高10％-40％的上样量，或者在同样的上样量下大大提高目的蛋白的纯度。蛋白纯度也和层析介质基质材料及孔径及颗粒大小有关。不同大小的蛋白需要不同孔径的介质与其相匹配，胰岛素或者胰岛素类似物孔径应该为120-200A，层析蛋白上样量可以达到250-350mg/cm2(柱长250-300mm)。
层析柱温可以4-35℃，最好是20-35℃，温度低于最佳范围，其分离效率会大大降低。
利用本发明可以比不加Ba2+的工艺显著地提高产率，其产物中目的蛋白纯度亦显著提高，利用Ba2+则可以在使用较低的离子浓度的情况下比US6180757所述的Ca2+有更高的效率，同样上样量的情况下有更高的纯度，同样纯度要求下可以增加10％-40％的上样量，这样就可以大大提高胰岛素及其类似物的纯化效率，其可以在后续步骤添加SO4 2-来进行Ba2+的有效去除或者通过缓冲液置换予以去除。
应用本方法，既可以获得非糖基化的蛋白，亦可纯化获得糖基化蛋白，两种形式都可以显著提高效率。
在分离糖基化与非糖基化蛋白方面，本发明具有特别的优势，若是在非糖基化蛋白中去除糖基化的杂质，如进行胰岛素类蛋白的纯化，其糖基化的胰岛素类蛋白可以去除至0.15％以下，甚至0.1％以下。这可以使样品中糖基化蛋白的浓度降低20倍以上。如果在样品中也加入Ba2+，其分离效率会更进一步提高。
利用本发明分离的样品，可以是任何含有糖基化的非糖基化蛋白，或者是含有非糖基化的糖基化蛋白。这些蛋白可以来自于酵母表达系统，亦可以是哺乳动物细胞表达系统，如CHO、NSO表达系统，亦可以是昆虫细胞表达系统或者原核表达系统。这些样品可以直接亦可以经过几步初纯后应用本方法进行分离。
Ba2+的加入，其在分离糖基化和非糖基化蛋白方面所起的作用胜于任何常见一价阳离子的加入所起的作用，这些一价阳离子可以是Na+、NH4 +、K+、Li+等单独或者混合。这些结果说明Ba2+具有一价离子所没有的特性，其可以显著改变糖基化和非糖基化蛋白的疏水差异性。三价阳离子亦可能具有相似的性质，只是三价阳离子如Fe3+在一般的溶液中比较容易沉淀，应用起来不方便。Ba2+的提供可以应用其盐酸盐、硝酸盐、醋酸盐等，只要能稳定可溶于缓冲液中即可。
Ba2+的应用亦可以联合应用一价阳离子盐，其一价阳离子的加入的浓度和Ba2+加入的浓度具有交互影响作用，Ba2+的浓度达到5-10mM已经足以达到分离效果，亦可以多加直至达到溶解度，一价阳离子的浓度可以是100-400mM，最好是200-300mM，其加入量一般是Ba2+的10-50倍以上。在各种一价阳离子联合应用的选择上，Na+、NH4 +、K+、Li+等浓度具有相似性。可以单独使用亦可以联合应用。
进行分离时，一般pH越高越好，可以选择6-8.5，在不影响层析介质寿命和蛋白活性的情况下选择偏高的pH，比如应用到7-8。
进行糖基化蛋白的分离，其可以利用等梯度洗脱亦可以进行梯度洗脱，一般情况进行5-15CV的柱保留可以进行较好的分离。
利用RP-HPLC进行层析分离，可以包含任何有机溶剂，其可以是乙腈、乙醇、甲醇、异丙醇等。在本发明中所述实例中有机溶剂的浓度占30％-40％体积。
利用本发明可以进行胰岛素类蛋白的纯化，其可以有效去除糖基化的胰岛素或其类似物，得到纯度较高的非糖基化胰岛素或其类似物。利用本发明，可以使胰岛素类蛋白中的糖基化蛋白浓度降低到0.15％以下，一般可以降低到0.1％以下。
在纯化非糖基化蛋白方面，特别是胰岛素及其类似物的纯化方面，可以具有广泛的应用，例如在医药方面胰岛素对糖尿病的治疗，在生物制药方面培养基中胰岛素及其相关促生长因子的添加等，应用十分广泛。
在糖蛋白的分离上，本发明中所涉及的蛋白为所有的糖基化蛋白及其前体，尤其是胰岛素及其类似物或者前体蛋白。
另一点需要明确指出的是在胰岛素及其类似物类蛋白上，所收集的是不含糖基化的目的蛋白。
与现有技术相比，本发明提供了一种较好的分离糖基化与非糖基化蛋白的方法。通过本发明使用含有Ba2+的溶液在RP-HPLC上可以将糖基化与非糖基化蛋白进行很好地分离，进行组分收集可以得到较纯的糖基化蛋白及非糖基化蛋白。
附图说明
以下是本发明附图的简要描述。色谱峰进行了标记。
图1为胰岛素类蛋白纯化前的RP-UPLC(反相超高效液相色谱)的检测图谱，箭头所指示的各组分的含量为：127I：89.84％，mg127I：2.11％，dg127I：0.10％，
desamido：2.64％，127I ester：4.61％。
图2为胰岛素类蛋白纯化后的RP-UPLC(反相超高效液相色谱)检测图谱，箭头所指示的各组分的含量为：127I：98.76％，mg127I：0.04％，dg127I：0.00％，desamido：0.69％，127I polymer：0.39％。
图3为缓冲液中含有2mM BaCl2进行的胰岛素类蛋白RP-HPLC纯化图谱。
图4为缓冲液中含有5mM BaCl2进行的胰岛素类蛋白RP-HPLC纯化图谱，其中糖基化的蛋白和非糖基化的蛋白基本上进行了基线分离。
图5为缓冲液中含有20mM BaCl2的胰岛素类蛋的RP-HPLC纯化图谱。
图6为缓冲液中含有20mM BaCl2并提高40％上样量的胰岛素类蛋白RP-HPLC纯化图谱。
图7为缓冲液中含有20mM CaCl2的胰岛素类蛋白RP-HPLC纯化图谱。
图8为缓冲液中含有10mM BaCl2的胰岛素RP-HPLC纯化图谱。
图9为缓冲液中未添加任何二价阳离子时胰岛素类蛋白纯化的RP-HPLC图谱。
具体实施方式
以下实施例、实验例仅仅对本发明进行进一步说明，不应构成对本发明的限制。
下述实施例、实验例中的原材料如果没有特别说明，均为市售。
通用方法：
所用样品为胰岛素类似物127I或者胰岛素，127I为B28ASP胰岛素，除了B链28位氨基酸和胰岛素不同外，其余皆为相同。
所有纯度单位为质量百分比。
检测方法：
不同组分均采用药典相关蛋白检测方法转换成UPLC方法，使用RP-UPLC C18柱进行检测，用面积归一法进行标记目的蛋白和糖基化蛋白的含量。纯化仪：
所有的纯化操作使用AKTApurifier层析系统，280nm紫外吸收作为检测波长。层析介质，采用150A孔径C1810um反相硅胶颗粒作为层析介质，温度采用28℃，柱参数为10×250mm半制备柱，再生液为1M甲酸+75％乙醇。
缓冲液配制：
所用水为WFI(注射用水)，所有的试剂均为分析纯试剂，缓冲液pH用盐酸或者醋酸调至7.6±0.3，洗脱液采用50mMTris+250mM KCl添加不用种类及浓度的二价阳离子配制而成，有机溶剂乙醇含量为35％(V/V)左右，保留时间为8-12CV实施例一：分离糖基化与非糖基化蛋白纯化缓冲液中添加BaCl2，在对照组中加入CaCl2
具体分组如下：
分离前样品及分离后目的蛋白峰样品检测结果见图1、图2。在分离127I时缓冲液中添加BaCl2或CaCl2，Ba2+在缓冲液中的浓度分别为2mM(见图3)、5mM(见图4)、20mM(见图5)，以及提高上样量的20mMBaCl2(见图6)，Ca2+在缓冲液中的浓度为20mM(见图7)。分离胰岛素时缓冲液中添加BaCl2，Ba2+在缓冲液中的浓度为10mM(图8)。
检测结果：
经UPLC检测各纯化主峰糖基化蛋白含量，结果如下：
结果讨论：
缓冲液中加入少量的Ba2+，可以显著提高糖基化蛋白的去除效率。Ba2+浓度为5mM即可以使糖基化和非糖基化的胰岛素及类似物进行基线分离，而且峰形都比较陡峭。相同上样量的情况下，Ba2+浓度为5mM就可以达到Ca2+浓度为20mM的分离效果。主峰纯度相似的情况下，含有20mM Ba2+的缓冲液其上样量可以达到20mMCa2+的1.4倍，即提高40％的上样量。在加入Ba2+后，蛋白保留时间均有一定的延长，非糖基化的蛋白时间延长更明显。因此，缓冲液中加入Ba2+分离糖基化与非糖基化蛋白，其分离纯化效率要显著优于含有Ca2+的缓冲液。
我们选用Ba2+离子的醋酸盐或硝酸盐形式重复上述实验，仍能得到相同的结论。
实施例二：分离糖基化与非糖基化蛋白纯化缓冲液中不添加二价阳离子
分离样品为127I，在洗脱缓冲液中不添加任何二价阳离子，而一价阳离子用250mMKCl(见图9)。
检测结果：
经UPLC检测不加任何二价离子时纯化主峰糖基化蛋白含量为0.43％。
结果讨论：
在不含有二价阳离子的情况下，分离糖基化蛋白的能力均比较差，其糖基化与非糖基化蛋白不能进行基线分离，通过分段收集，合并组分，使得率达到80％左右时，其目的蛋白组分中糖基化蛋白的含量仍大于0.2％。
上述仅为本发明的具体实施方式，但本发明的设计构思并不局限于此，凡利用此构思对本发明进行非实质性的改动，均应属于侵犯本发明保护范围的行为。
Claims (10)
1.一种糖基化蛋白和非糖基化蛋白的分离方法，其特征在于：将含有糖基化蛋白的非糖基化蛋白样品或含有非糖基化蛋白的糖基化蛋白样品采用反相高效液相色谱进行分离，该分离所用的缓冲液中含有Ba2+，Ba2+在缓冲液中的浓度至少为5mM。
2.如权利要求1所述的一种糖基化蛋白和非糖基化蛋白的分离方法，其特征在于：所述缓冲液的pH值为6-8.5，优选pH值为7-8。
3.如权利要求1所述的一种糖基化蛋白和非糖基化蛋白的分离方法，其特征在于：该分离的层析温度为20-35℃。
4.如权利要求1所述的一种糖基化蛋白和非糖基化蛋白的分离方法，其特征在于：所述糖基化蛋白为单糖基化、二糖基化、多糖基化蛋白或者它们的任意混合物。
5.如权利要求1所述的一种糖基化蛋白和非糖基化蛋白的分离方法，其特征在于：所述缓冲液中还含有一价阳离子，其在缓冲液中的浓度为Ba2+的10-50倍。
6.如权利要求1所述的一种糖基化蛋白和非糖基化蛋白的分离方法，其特征在于：该分离的柱保留时间为5-15CV。
7.如权利要求1所述的一种糖基化蛋白和非糖基化蛋白的分离方法，其特征在于：所述样品为含有糖基化蛋白的胰岛素或其类似物。
8.如权利要求1所述的一种糖基化蛋白和非糖基化蛋白的分离方法，其特征在于：在所述样品中也含有Ba2+。
9.如权利要求1所述的一种糖基化蛋白和非糖基化蛋白的分离方法，其特征在于：所述Ba2+为盐酸盐、醋酸盐或硝酸盐形式。
10.一种含有糖基化蛋白的胰岛素或其类似物的分离方法，其特征在于：将含有糖基化蛋白的胰岛素或其类似物样品采用反相高效液相色谱进行分离，该分离所用的缓冲液中含有Ba2+，Ba2+在缓冲液中的浓度至少为5mM，缓冲液的pH值为6-8.5，优选pH值为7-8，分离的层析温度为20-35℃，缓冲液中还含有一价阳离子，其在缓冲液中的浓度为Ba2+的10-50倍，分离的柱保留时间为5-15CV，Ba2+为盐酸盐、醋酸盐或硝酸盐形式。
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