CN103509079B - 一种熊果酸衍生物及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
一种熊果酸衍生物及其制备方法。该熊果酸衍生物是熊果烷-12-烯-28-酰（8’-氨基辛酸）。其制备方法包括先分两步将熊果酸转化成3-O-乙酰熊果烷-28-酰氯中间体的粗品，然后，以该粗品为反应物之一与8-氨基辛酸反应，最后再与氢氧化钠溶液水解反应而得到本发明的熊果酸衍生物。本发明的熊果酸衍生物在抑制人体白血病U937细胞增殖方面，其效果比现有技术更明显、更好；本发明所提供制备方法步骤少，纯化方法简单，能够节省成本，且产物纯度高。
Description
技术领域
本发明涉及熊果酸的衍生物及熊果酸衍生物的制备方法。
背景技术
熊果酸（ursolic acid，UA）又名乌苏酸，属五环三萜类化合物，它广泛存在于天然植物中。其结构式为：
熊果酸具有多种生物活性，有较高的药用价值，其抗肿瘤作用是其药用价值之一。与众多天然提取物一样，若想要熊果酸的抗肿瘤作用发挥得更好，针对不同肿瘤就需通过不同的化学修饰方法来将熊果酸的结构进行修饰。例如，为重点提高对人体白血病U937细胞增殖的抑制作用，申请公布号为CN102558282A、名称也为《一种熊果酸衍生物及其制备方法》的技术方案，就在熊果酸母体的3-位和28-位处进行了修饰。在3-位处的修饰主要是进行乙酰化修饰；对28-位处的修饰有两种，其中之一是28-酰（8’-氨基辛酸）。由此所得的熊果酸衍生物名称为3β-乙酰氧基-熊果烷-12-烯-28-酰（8’-氨基辛酸），其结构式为：
与未经修饰的熊果酸相比较，该3β-乙酰氧基-熊果烷-12-烯-28-酰（8’-氨基辛酸）取得了如下表所显示的比较不错的效果。
上表中，“μmol”表示该现有技术在验证时所用药品的浓度。
从上表中可以看出，随着浓度的增加，该现有技术的抑制率相对于熊果酸的增大幅度却明显减小；并且，在低浓度（例如5μmol）的情况下，几乎不能满足人们对药品效果的要求或愿望。简言之，在抑制人体白血病U937细胞增殖方面，该现有技术随其浓度增大的抑制率以及不同浓度情况下的抑制率，均仍然不够高。
发明内容
本发明的第一目的是，提供一种在抑制人体白血病U937细胞增殖方面，随其浓度增大而抑制率增大明显、且在不同浓度情况下的抑制率均更高的熊果酸衍生物。
本发明的第二目的是，提供一种制备实现所述第一目的之熊果酸衍生物的简便方法。
实现所述第一发明目的之技术方案，是这样一种熊果酸衍生物，与现有技术相同的方面是，它的结构中的母体为熊果酸，且在28-位为28-酰（8’-氨基辛酸），其改进之处是，在熊果酸母体的3-位为羟基；该熊果酸衍生物是熊果烷-12-烯-28-酰（8’-氨基辛酸），其结构式为：
实现所述第二发明目的之技术方案，是这样一种熊果酸衍生物的制备方法，该方法制备的是实现所述第一发明目的之熊果酸衍生物；该方法有如下制备步骤：
（1）将熊果酸和乙酸酐反应，以对熊果酸3-位上的羟基进行乙酰化保护而生成3-O-乙酰熊果酸；
（2）将3-O-乙酰熊果酸与草酰氯反应，以在28-位上修饰而生成3-O-乙酰熊果烷-28-酰氯中间体；
（3）将3-O-乙酰熊果烷-28-酰氯中间体作为反应物之一来生成所述熊果酸衍生物；
其中，步骤（3）所述的3-O-乙酰熊果烷-28-酰氯中间体是没有经过纯化的粗品，该步骤（3）中的另一反应物是8-氨基辛酸，其具体步骤如下：
（3-1）用二氯甲烷将所述3-O-乙酰熊果烷-28-酰氯中间体粗品充分溶解；
（3-2）在所得溶液中加入催化剂三乙胺并充分混合，然后加入所需反应量的8-氨基辛酸；在20～30℃下搅拌反应；其中，所述催化剂三乙胺的摩尔量不少于3-O-乙酰熊果烷-28-酰氯的摩尔量；
反应结束后，再进行水洗，之后分液；
（3-3）将分液后所得有机相用足量的无水硫酸钠干燥，然后减压浓缩而得3β-乙酰氧基-熊果烷-12-烯-28-酰（8’-氨基辛酸）粗品；
（3-4）将所述粗品用300～400目硅胶过柱分离，得呈白色粉末状的3β-乙酰氧基-熊果烷-12-烯-28-酰（8’-氨基辛酸）纯品；其中，过柱分离3β-乙酰氧基-熊果烷-12-烯-28-酰（8’-氨基辛酸）粗品时所用洗脱剂为二氯甲烷和甲醇的混合液，其体积比为，二氯甲烷∶甲醇＝50∶1；
其改进之处是，在步骤（3-4）之后还有对3β-乙酰氧基-熊果烷-12-烯-28-酰（8’-氨基辛酸）纯品进一步水解的步骤，具体是：
（3-5）将步骤（3-4）所得纯品用甲醇与四氢呋喃体积比为1：1的混合溶剂溶解，然后加入浓度为4mol/L的氢氧化钠溶液来水解；水解完全后用盐酸调节pH值为1-2，再用三氯甲烷提取，提取液用无水硫酸钠干燥，再减压浓缩，得熊果烷-12-烯-28-酰（8’-氨基辛酸）纯品。
从实现第一发明目的之方案中可以看出，本发明的熊果酸衍生物——熊果烷-12-烯-28-酰（8’-氨基辛酸），在其在3-位处用羟基“替换”了现有技术中的3β-乙酰氧基，进而得到了在本质上与现有技术完全不同的结构。验证表明，与现有技术相比较，本发明在抑制人体白血病U937细胞增殖方面，不仅随其浓度的增大而使其抑制率也明显增大、且在不同浓度情况下的抑制率均得到了很大提高。
从实现第二发明目的之方案中可以看出，本发明方法的关键之处是，在现有技术基础上，作出了对3β-乙酰氧基-熊果烷-12-烯-28-酰（8’-氨基辛酸）纯品进行水解之改进，不仅克服现有技术在事实上认为不必水解的偏见，而且特别适合于本发明在3-位处用羟基“替换”现有技术中的3β-乙酰氧基的情形，因此才获得了在上述两个方面均优于现有技术的新的熊果酸衍生物——熊果烷-12-烯-28-酰（8’-氨基辛酸）。
下面结合具体实施方式对本发明作进一步的说明。
具体实施方式
一、一种熊果酸衍生物，它的结构中的母体为熊果酸，且在28-位为28-酰（8’-氨基辛酸），本发明中，在熊果酸母体的3-位为羟基；该熊果酸衍生物是熊果烷-12-烯-28-酰（8’-氨基辛酸），其结构式为：
二、一种熊果酸衍生物的制备方法，该方法制备的是本具体实施方式一所述的熊果酸衍生物；该方法有如下制备步骤：
（1）将熊果酸和乙酸酐反应，以对熊果酸3-位上的羟基进行乙酰化保护而生成3-O-乙酰熊果酸；
（2）将3-O-乙酰熊果酸与草酰氯反应，以在28-位上修饰而生成3-O-乙酰熊果烷-28-酰氯中间体；
（3）将3-O-乙酰熊果烷-28-酰氯中间体作为反应物之一来生成所述熊果酸衍生物；
其中，步骤（3）所述的3-O-乙酰熊果烷-28-酰氯中间体是没有经过纯化的粗品，该步骤（3）中的另一反应物是8-氨基辛酸（H2NCH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2COOH），其具体步骤如下：
（3-1）用二氯甲烷（CH2Cl2）将所述3-O-乙酰熊果烷-28-酰氯中间体粗品充分溶解；
（3-2）在所得溶液中加入催化剂三乙胺［N(CH2CH3)3］并充分混合，然后加入所需反应量的8-氨基辛酸；在20～30℃下搅拌反应；其中，所述催化剂三乙胺的摩尔量不少于3-O-乙酰熊果烷-28-酰氯的摩尔量；
注：催化剂的用量可适度过量，以提高反应速率；但以不超过3-O-乙酰熊果烷-28-酰氯摩尔量的两倍为度，过多的用量将造成不必要浪费。在该催化剂用量范围内，其反应时间通常为12～24小时。
反应结束后，再进行水洗，之后分液；
（3-3）将分液后所得有机相用足量的无水硫酸钠（元明粉，Na2SO4）干燥，然后减压浓缩而得3β-乙酰氧基-熊果烷-12-烯-28-酰（8’-氨基辛酸）粗品（显然，无水硫酸钠的实际用量，以能确保所述“干燥”能够比较好而快地进行为度）；
（3-4）将所述粗品用300～400目硅胶过柱分离，得呈白色粉末状的3β-乙酰氧基-熊果烷-12-烯-28-酰（8’-氨基辛酸）纯品；其中，过柱分离3β-乙酰氧基-熊果烷-12-烯-28-酰（8’-氨基辛酸）粗品时所用洗脱剂为二氯甲烷和甲醇的混合液，其体积比为，二氯甲烷∶甲醇＝50∶1；
本发明中，在步骤（3-4）之后还有对3β-乙酰氧基-熊果烷-12-烯-28-酰（8’-氨基辛酸）纯品进一步水解的步骤，具体是：
（3-5）将步骤（3-4）所得纯品用甲醇与四氢呋喃体积比为1：1的混合溶剂溶解，然后加入浓度为4mol/L的氢氧化钠溶液来水解；水解完全后用盐酸调节pH值为1-2，再用三氯甲烷提取，提取液用无水硫酸钠干燥，再减压浓缩，得熊果烷-12-烯-28-酰（8’-氨基辛酸）纯品。
注：氢氧化钠的用量显然应当以能够完成全部水解为度，通常，该用量为3β-乙酰氧基-熊果烷-12-烯-28-酰（8’-氨基辛酸）摩尔量的两倍为宜，过多的用量将造成不必要浪费，其反应时间通常为4～6小时。调节pH值的盐酸浓度为6mol/L为宜，用量为调节pH=1-2即可，过多用量造成试剂浪费。另外，三氯甲烷和无水硫酸钠的用量，显然也应当能够完成相应的提取和干燥任务为准。
进一步讲，为取得更好效果，在本具体实施方式中，步骤（1）所述的3-O-乙酰熊果酸，由如下方法制得：
将熊果酸与足量的吡啶（Pyridine，C5H5N）混合，搅拌并升温到100℃以让熊果酸完全溶解在吡啶中；再滴加过量的乙酸酐，并保持在100℃状态下让所述熊果酸与乙酸酐反应；
本领域技术人员清楚，将熊果酸溶解于吡啶中的目的，是为确保熊果酸与乙酸酐之间的反应能够正常进行；用过量乙酸酐的目的，是为了让全部熊果酸都能参与反应而得到尽量多的产物。因此，吡啶的用量、乙酸酐的过量程度，均应当以能够达到上述目的为度——在这种情况下，其反应时间通常为4～5小时。
反应结束后，将反应液倾入冰水混合液中（冰水混合液的用量以能使反应液充分冷却为度，其量可适当增加），过滤，并用水反复洗至无吡啶味，烘干得白色粉末状的3-O-乙酰熊果酸。
特别说明，通过上述反复过滤、洗涤之后，多余的乙酸酐也早已被除去了，即在本步骤产物3-O-乙酰熊果酸中，不另含没有参与反应的乙酸酐。
在本具体实施方式中，步骤（2）所述3-O-乙酰熊果烷-28-酰氯中间体，由如下方法制得：
将3-O-乙酰熊果酸完全溶解于足量的二氯甲烷中，再加入过量的草酰氯［乙二酰氯，(COCl)2］，于室温下搅拌，以使所述3-O-乙酰熊果酸与草酰氯反应；
本领域技术人员清楚，将3-O-乙酰熊果酸溶解于二氯甲烷中的目的，同样也是为了确保3-O-乙酰熊果酸和草酰氯之间的反应能够正常进行；用过量草酰氯的目的，当然也是为了全部3-O-乙酰熊果酸均参与反应而得到尽量多的产物。因此，二氯甲烷的用量、草酰氯的过量程度，均应当以能够达到上述目的为度——在这种情况下，其反应时间通常为12～24小时；
反应结束后，除去二氯甲烷和多余草酰氯，得3-O-乙酰熊果烷-28-酰氯中间体粗品；
最后，或将3-O-乙酰熊果烷-28-酰氯中间体粗品提纯以备用，或直接用所述粗品为原料去制备所述熊果酸衍生物。
为本领域技术人员能够更加清楚地理解本发明，再按照步骤（1）、（2）、（3）顺序，将各步骤的反应式披露如下。
步骤（1）：
步骤（2）：
步骤（3）：
本发明在实验室经过了与现有技术相比较的试验验证。制备两种熊果酸衍生物的方法与各自披露的方法及步骤相同。验证时，还用核磁共振仪测试了本发明熊果酸衍生物的1HNMR和13CNMR谱图（注：因现有技术的结构不是需在本发明中来证明的，故省略）。
本发明的熊果烷-12烯-28-酰（8’-氨基辛酸）的1HNMR和13CNMR如下：
1HNMR(400MHz,CDCl3)：δ0.77(3H,s);0.87(9H,s);0.95(6H,s);1.06(3H,s);(7×CH3);2.33(2H,t,J=7.2Hz H-7’);2.99(1H,m,Ha-1’);3.33(1H,m,Hb-1’);4.50(1H,t,H-3);5.30(1H,H-12);5.92(1H,t-like,NH)。
13CNMR(100MHz,CDCl3)：
δ178.2(C-28),171.0(-COOH),140.0(C-13),125.4(C-12),80.8(C-3)。
从上述1HNMR和13CNMR中可以看出，该化合物的结构确为本发明的目标化合物结构。
然后，采用MTT［3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐，商品名：［噻唑蓝］染色法，针对人体白血病U937细胞增殖的抑制结果，用制得的两种熊果酸衍生物进行了对比验证。验证结果见下表的：
从验证表中的抑制率可以看出，本发明的熊果酸衍生物在抑制人体白血病U937细胞增殖方面，几种浓度的效果明显优于现有技术，尤其是在低浓度情况下，本发明所取得的进步还更加明显。这就是说，在人体白血病U937细胞增殖较严重的情况下，用本发明的熊果酸衍生物能够取得比现有技术更快、更好的抑制效果；在人体白血病U937细胞增殖不很严重，或其他可用、需用低浓度药品的情况下，本发明的熊果酸衍生物的实际用量就可以比现有技术用得更少些，不仅能够可节省治疗成本，因用药而可能造成的毒副作用也将极大减小。
Claims (4)
1.一种熊果酸衍生物，它的结构中的母体为熊果酸，且在28-位为28-酰(8’-氨基辛酸)，其特征在于，在熊果酸母体的3-位为羟基；该熊果酸衍生物是熊果烷-12-烯-28-酰(8’-氨基辛酸)，其结构式为：
2.一种熊果酸衍生物的制备方法，该方法制备的是权利要求1所述的熊果酸衍生物；该方法有如下制备步骤：
(1)将熊果酸和乙酸酐反应，以对熊果酸3-位上的羟基进行乙酰化保护而生成3-O-乙酰熊果酸；
(2)将3-O-乙酰熊果酸与草酰氯反应，以在28-位上修饰而生成3-O-乙酰熊果烷-28-酰氯中间体；
(3)将3-O-乙酰熊果烷-28-酰氯中间体作为反应物之一来生成所述熊果酸衍生物；
其中，步骤(3)所述的3-O-乙酰熊果烷-28-酰氯中间体是没有经过纯化的粗品，该步骤(3)中的另一反应物是8-氨基辛酸，其具体步骤如下：
(3-1)用二氯甲烷将所述3-O-乙酰熊果烷-28-酰氯中间体粗品充分溶解；
(3-2)在所得溶液中加入催化剂三乙胺并充分混合，然后加入所需反应量的8-氨基辛酸；在20～30℃下搅拌反应；其中，所述催化剂三乙胺的摩尔量不少于3-O-乙酰熊果烷-28-酰氯的摩尔量；
反应结束后，再进行水洗，之后分液；
(3-3)将分液后所得有机相用足量的无水硫酸钠干燥，然后减压浓缩而得3β-乙酰氧基-熊果烷-12-烯-28-酰(8’-氨基辛酸)粗品；
(3-4)将所述粗品用300～400目硅胶过柱分离，得呈白色粉末状的3β-乙酰氧基-熊果烷-12-烯-28-酰(8’-氨基辛酸)纯品；其中，过柱分离3β-乙酰氧基-熊果烷-12-烯-28-酰(8’-氨基辛酸)粗品时所用洗脱剂为二氯甲烷和甲醇的混合液，其体积比为，二氯甲烷∶甲醇＝50∶1；
其改进之处是，在步骤(3-4)之后还有对3β-乙酰氧基-熊果烷-12-烯-28-酰(8’-氨基辛酸)纯品进一步水解的步骤，具体是：
(3-5)将步骤(3-4)所得纯品用甲醇与四氢呋喃体积比为1：1的混合溶剂溶解，然后加入浓度为4mol/L的氢氧化钠溶液来水解；水解完全后用盐酸调节pH值为1-2，再用三氯甲烷提取，提取液用无水硫酸钠干燥，再减压浓缩，得熊果烷-12-烯-28-酰(8’-氨基辛酸)纯品。
3.根据权利要求2所述熊果酸衍生物的制备方法，其特征是，步骤(1)所述的3-O-乙酰熊果酸，由如下方法制得：
将熊果酸与足量的吡啶混合，搅拌并升温到100℃以让熊果酸完全溶解在吡啶中；再滴加过量的乙酸酐，并保持在100℃状态下让所述熊果酸与乙酸酐反应；
反应结束后，将反应液倾入冰水混合液中，过滤，并用水反复洗至无吡啶味，烘干得白色粉末状的3-O-乙酰熊果酸。
4.根据权利要求2或3所述熊果酸衍生物的制备方法，其特征是，步骤(2)所述3-O-乙酰熊果烷-28-酰氯中间体，由如下方法制得：
将3-O-乙酰熊果酸完全溶解于足量的二氯甲烷中，再加入过量的草酰氯，于室温下搅拌，以使所述3-O-乙酰熊果酸与草酰氯反应；
反应结束后，除去二氯甲烷和多余草酰氯，得3-O-乙酰熊果烷-28-酰氯中间体粗品；
最后，或将3-O-乙酰熊果烷-28-酰氯中间体粗品提纯以备用，或直接用所述粗品为原料去制备所述熊果酸衍生物。
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