CN103497942A - 一种嗜热毁丝霉的发酵物及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种嗜热毁丝霉的发酵物及其制备方法和应用。本发明提供了一种制备发酵物的方法，包括如下步骤：将嗜热毁丝霉ACCC No.30572接种至发酵培养基，40-55℃、100-300r/min振荡培养5-9天；发酵培养基按照如下方法制备：将碳源、氮源、硫酸铵、磷酸二氢钾、碳酸钙、硫酸镁、甘油、吐温-80和水混合，得到发酵培养基；碳源的浓度为25-60g/L，氮源的浓度为10-40g/L，硫酸铵的浓度为1-10g/L，磷酸二氢钾的浓度为1-10g/L，碳酸钙的浓度为1-4g/L，硫酸镁的浓度为0.5-4g/L，甘油的浓度为1-4g/L，吐温-80的浓度为0.5-3g/L。本发明的提供的发酵物具有纤维素酶的活性，具有良好的温度稳定性和pH稳定性，在高温条件下具有较高的酶活，在较宽的pH范围内具有较高的酶活。

Description

一种嗜热毁丝霉的发酵物及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及一种嗜热毁丝霉的发酵物及其制备方法和应用。
背景技术
纤维素酶(cellulase)是一种能够将纤维素降解为葡萄糖的复合酶系，包括：（1）内切葡聚糖酶(endo-β-1,4-D-glucanase，EG,EC3.2.1.4)，也称CMC酶；（2）外切葡聚糖酶(exo-β-1,4-glucanase,EC3.2.1.91)或纤维二糖水解酶(cello-biohydrolases,CBH)；（3）葡萄糖苷酶(β-1,4-D-glucosidase,BG,EC3.2.1.21)，也叫水杨甙酶。以上三种酶中，每一类都有多个同工酶。内切酶将长链纤维素从内部切断，外切酶自纤维素链的还原端或非还原端切下二糖或寡糖，葡萄糖苷酶将纤维二糖或寡糖水解为葡萄糖。随着纤维素酶在工业上的广泛应用（如食品、饲料、酿造、造纸，特别是在纺织工业和生物能源上的应用），纤维素酶已经成为最近十几年酶工程研究的一个热点。
到目前为止，已发现了多种能够产生纤维素酶的微生物，涵盖了厌氧与好氧、原核与真核微生物。在产生纤维素酶的微生物中，不同菌株所产纤维素酶具有不同的作用方式与底物特异性。根据其酶学性质与应用环境，纤维素酶又被分为酸性纤维素酶、中性纤维素酶与碱性纤维素酶。酸性纤维素酶主要用于生物能源、纺织水洗等。中性纤维素酶主要用于纺织水洗工业。碱性纤维素酶则可用于洗涤剂中。
工业生产上常用的产纤维素酶微生物是常温、中温丝状真菌，它们能够产生完整的纤维素酶系，可以将结晶纤维素完全降解为葡萄糖，如木霉（Trichoderma sp.）、青霉（Penicillium sp.）、腐质霉（Humicola sp.）等。上述菌株产生的纤维素酶大多需要在50℃以下发挥较好的效能，而在较高的温度下容易失活。高温纤维素酶在生物能源领域具有较好的应用前景。
发明内容
本发明的目的是提供一种嗜热毁丝霉的发酵物及其制备方法和应用。
本发明提供了一种制备发酵物的方法，包括如下步骤：将嗜热毁丝霉（Myceliophthora thermophila）ACCC No.30572接种至发酵培养基，40-55℃、100-300r/min振荡培养5-9天；
所述发酵培养基按照如下方法制备：将碳源、氮源、硫酸铵、磷酸二氢钾、碳酸钙、硫酸镁、甘油、吐温-80和水混合，得到发酵培养基；所述碳源在所述发酵培养基中的浓度为25-60g/L（如25g-33g、33g-40g、40g-50g、50g、60g、25g、33g、40g、50g或60g），所述氮源在所述发酵培养基中的浓度为10-40g/L，所述硫酸铵在所述发酵培养基中的浓度为1-10g/L，所述磷酸二氢钾在所述发酵培养基中的浓度为1-10g/L，所述碳酸钙在所述发酵培养基中的浓度为1-4g/L，所述硫酸镁在所述发酵培养基中的浓度为0.5-4g/L，所述甘油在所述发酵培养基中的浓度为1-4g/L，所述吐温-80在所述发酵培养基中的浓度为0.5-3g/L。
所述发酵培养基的pH可为4-6，具体可为5。
所述碳源可为微晶纤维素、玉米芯或稻草粉。
所述氮源可为玉米浆、玉米浆干粉、大豆胨、蛋白胨、酵母粉或胰蛋白胨。
所述碳源在所述发酵培养基中的浓度具体可为50g/L，所述氮源在所述发酵培养基中的浓度具体可为27g/L，所述硫酸铵在所述发酵培养基中的浓度具体可为5g/L，所述磷酸二氢钾在所述发酵培养基中的浓度具体可为6g/L，所述碳酸钙在所述发酵培养基中的浓度具体可为2.5g/L，所述硫酸镁在所述发酵培养基中的浓度具体可为1g/L，所述甘油在所述发酵培养基中的浓度具体可为2.5g/L，所述吐温-80在所述发酵培养基中的浓度具体可为2g/L。
所述振荡培养具体可三角瓶中进行，所述发酵培养基在单个三角瓶中的装液量可为40-70ml（如40ml、50ml、60ml或70ml）。
所述振荡培养的条件具体可为：45℃、180r/min振荡培养5天。
所述方法还可包括如下步骤：完成所述振荡培养后，5000g离心20min，收集上清液。
所述接种的实现方法具体如下：将嗜热毁丝霉接种到PDA斜面上，45℃培养5d后挖块（具体大小可为0.5×1厘米）并进行所述接种。
以上任一所述方法制备得到的发酵物也属于本发明的保护范围。
本发明还保护所述发酵物在制备纤维素酶中的应用。
本发明还保护所述发酵物作为纤维素酶的应用。应用所述发酵物时，反应的温度可为40-60℃，优选为60℃。应用所述发酵物时，反应的pH为3-6，优选为5。
本发明的提供了一种发酵物，该发酵物具有纤维素酶的活性，具有良好的温度稳定性和pH稳定性，在高温条件下具有较高的酶活，在较宽的pH范围内具有较高的酶活。
附图说明
图1为实施例2的步骤一的结果。
图2为实施例2的步骤二的结果。
图3为实施例2的步骤三的结果。
图4为实施例2的步骤四的结果。
图5为实施例3的步骤一的结果。
图6为实施例3的步骤二的结果。
图7为实施例3的步骤三的结果。
图8为实施例3的步骤四的结果。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
实施例中所用的嗜热毁丝霉（Myceliophthora thermophila）获自中国农业微生物菌种保藏管理中心(英文全称为“Agricultural Culture Collection of China”，英文缩写为“ACCC”，网址为“http://www.accc.org.cn/”)，ATCC编号为30572，所以又称嗜热毁丝霉（Myceliophthora thermophila）ACCC No.30572。
微晶纤维素：河北省鹿泉市焊条粉剂厂。玉米芯：阳谷金友农副产品深加工厂。稻草粉：毫州市保华药业有限公司。玉米浆：河北康欣制药有限公司。玉米浆干粉：山东郓城康源生物科技有限公司。大豆胨：北京双旋微生物培养基制品厂。蛋白胨：北京双旋微生物培养基制品厂。酵母粉：北京双旋微生物培养基制品厂。胰蛋白胨：北京双旋微生物培养基制品厂。新华1号滤纸：杭州沃华滤纸有限公司。
酶活力单位的定义：每小时水解滤纸产生1mg还原糖的酶量为一个酶活力单位(1U)。
实施例1、嗜热毁丝霉在生产纤维素酶中的应用
一、种子培养
将嗜热毁丝霉接种到PDA斜面上，45℃培养5d。
二、发酵
采用250ml三角瓶，每个三角瓶中装有50ml发酵培养基。
将种子斜面挖块（大小约为0.5×1厘米）接入发酵培养基，45℃、180r/min振荡（半径13mm）培养5天，然后5000g离心20min，收集上清液。
发酵培养基（pH=5）：取微晶纤维素50g、玉米浆27g、硫酸铵5g、磷酸二氢钾6g、碳酸钙2.5g、硫酸镁1g、甘油2.5g和吐温-802g，溶于水并用水定容至1L。
三、酶活力的测定
酶活力的测定（反应温度为50℃，反应pH为4.8）：以50mg滤纸（新华1号）为底物，加入1ml pH4.8、0.05M磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液，在50℃水浴中预热3min；然后加入步骤二得到的上清液的稀释液(用pH4.8、0.05M磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液进行稀释)0.5ml，50℃水浴60min；然后加入3ml DNS溶液以终止反应，混匀，沸水浴10min显色；冷却后，加入10ml水，摇匀，采用721分光光度计检测540nm处的吸光值，对照标准曲线方程（用葡萄糖作为标准品制作标曲线，标准曲线方程为y=(1.898x+0.139)×2×N，x为吸光值，N为稀释倍数，y为酶活力、单位为U/ml）得到上清液的酶活力。
步骤二得到的上清液作为纤维素酶的酶活力为9.7U/mL。
实施例2、嗜热毁丝霉的发酵条件的优化
一、不同碳源对产纤维素酶的影响
1、种子培养
将嗜热毁丝霉接种到PDA斜面上，45℃培养5d。
2、发酵
采用250ml三角瓶，每个三角瓶中装有50ml发酵培养基。
将种子斜面挖块（大小约为0.5×1厘米）接入发酵培养基，45℃、180r/min振荡（半径13mm）培养5天，然后5000g离心20min，收集上清液。
发酵培养基（pH=5）：取碳源（微晶纤维素、玉米芯或稻草粉）50g、玉米浆27g、硫酸铵5g、磷酸二氢钾6g、碳酸钙2.5g、硫酸镁1g、甘油2.5g和吐温-802g，溶于水并用水定容至1L。
3、酶活力的测定
将步骤2得到的上清液按照实施例1的步骤三中的方法检测酶活力。
步骤2得到的上清液的结果见图1（纵坐标的单位为U/mL）。以微晶纤维素作为碳源时具有最高酶活。
二、不同氮源对产纤维素酶的影响
1、种子培养
将嗜热毁丝霉接种到PDA斜面上，45℃培养5d。
2、发酵
采用250ml三角瓶，每个三角瓶中装有50ml发酵培养基。
将种子斜面挖块（大小约为0.5×1厘米）接入发酵培养基，45℃、180r/min振荡（半径13mm）培养5天，然后5000g离心20min，收集上清液。
发酵培养基（pH=5）：取微晶纤维素50g、氮源（玉米浆、玉米浆干粉、大豆胨、蛋白胨、酵母粉或胰蛋白胨）27g、硫酸铵5g、磷酸二氢钾6g、碳酸钙2.5g、硫酸镁1g、甘油2.5g和吐温-802g，溶于水并用水定容至1L。
3、酶活力的测定
将步骤2得到的上清液按照实施例1的步骤三中的方法检测酶活力。
步骤2得到的上清液的结果见图2（纵坐标的单位为U/mL）。以玉米浆干粉作为氮源时具有最高酶活。
三、微晶纤维素浓度对产酶的影响
1、种子培养
将嗜热毁丝霉接种到PDA斜面上，45℃培养5d。
2、发酵
采用250ml三角瓶，每个三角瓶中装有50ml发酵培养基。
将种子斜面挖块（大小约为0.5×1厘米）接入发酵培养基，45℃、180r/min振荡（半径13mm）培养5天，然后5000g离心20min，收集上清液。
发酵培养基（pH=5）：取微晶纤维素（25g、33g、40g、50g或60g）、玉米浆27g、硫酸铵5g、磷酸二氢钾6g、碳酸钙2.5g、硫酸镁1g、甘油2.5g和吐温-802g，溶于水并用水定容至1L。
3、酶活力的测定
将步骤2得到的上清液按照实施例1的步骤三中的方法检测酶活力。
步骤2得到的上清液的结果见图3（纵坐标的单位为U/mL）。微晶纤维素浓度为50g/L时具有最高酶活。
四、通气量对产酶的影响
1、种子培养
将嗜热毁丝霉接种到PDA斜面上，45℃培养5d。
2、发酵
采用250ml三角瓶，每个三角瓶中装有40ml、50ml、60ml或70ml发酵培养基。
将种子斜面挖块（大小约为0.5×1厘米）接入发酵培养基，45℃、180r/min振荡（半径13mm）培养5天，然后5000g离心20min，收集上清液。
3、酶活力的测定
将步骤2得到的上清液用pH4.8、0.05M磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液稀释至1.5倍体积，得到稀释液，然后按照实施例1的步骤三中的方法检测酶活力。
稀释液的结果见图4（纵坐标的单位为U/mL）。发酵培养基的装液量为40ml时具有最高酶活。
实施例3、纤维素酶的酶学性质
一、最适反应温度
取实施例1的步骤二得到上清液，参照实施例1的步骤三的酶活力测定方法检测酶活力，差异仅在于分别采用如下反应温度：30℃、40℃、50℃、60℃和70℃。
上清液的结果见图5（纵坐标的单位为U/mL）。在60℃时具有最高酶活。
二、最适反应pH
取实施例1的步骤二得到上清液，参照实施例1的步骤三的酶活力测定方法检测酶活力，差异仅在于分别采用如下缓冲液替换“pH4.8、0.05M磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液缓冲液”：pH为3.0、4.0、5.0或6.0的0.05M磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液。
上清液的结果见图6（纵坐标的单位为U/ml）。在pH5.0时具有最高酶活。
三、热稳定性
将实施例1的步骤二得到上清液分别于40℃、50℃、60℃或70℃放置一定时间（1h或2h），然后按照实施例1的步骤三的酶活力测定方法检测，以未放置的上清液（0h）的酶活作为100%，计算在不同温度孵育不同时间后的上清液的相对酶活。
结果见图7(纵坐标的单位为%)。在50-60℃热稳定性较强。
四、pH稳定性
将实施例1的步骤二得到上清液分别用3.0、4.0、5.0、6.0、7.0或8.0的0.05M磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液稀释至2倍体积，室温放置10小时，得到各个稀释液。将用水稀释相同倍数的稀释液作为对照。
取各个稀释液，按照实施例1的步骤三的酶活力测定方法检测，以对照的酶活力作为100%，计算在不同pH条件下孵育后的相对酶活。
结果见图8(纵坐标的单位为%)。除采用pH4.0的缓冲液孵育后酶活力稍有下降，其余pH条件时的酶活力均有所上升，表明由嗜热毁丝霉产生的纤维素酶有极强的pH稳定性。

Claims (10)

1.一种制备发酵物的方法，包括如下步骤：将嗜热毁丝霉（Myceliophthorathermophila）ACCC No.30572接种至发酵培养基，40-55℃、100-300r/min振荡培养5-9天；
所述发酵培养基按照如下方法制备：将碳源、氮源、硫酸铵、磷酸二氢钾、碳酸钙、硫酸镁、甘油、吐温-80和水混合，得到发酵培养基；所述碳源在所述发酵培养基中的浓度为25-60g/L，所述氮源在所述发酵培养基中的浓度为10-40g/L，所述硫酸铵在所述发酵培养基中的浓度为1-10g/L，所述磷酸二氢钾在所述发酵培养基中的浓度为1-10g/L，所述碳酸钙在所述发酵培养基中的浓度为1-4g/L，所述硫酸镁在所述发酵培养基中的浓度为0.5-4g/L，所述甘油在所述发酵培养基中的浓度为1-4g/L，所述吐温-80在所述发酵培养基中的浓度为0.5-3g/L。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述碳源在所述发酵培养基中的浓度为50g/L，所述氮源在所述发酵培养基中的浓度为27g/L，所述硫酸铵在所述发酵培养基中的浓度为5g/L，所述磷酸二氢钾在所述发酵培养基中的浓度为6g/L，所述碳酸钙在所述发酵培养基中的浓度为2.5g/L，所述硫酸镁在所述发酵培养基中的浓度为1g/L，所述甘油在所述发酵培养基中的浓度为2.5g/L，所述吐温-80在所述发酵培养基中的浓度为2g/L。
3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述振荡培养是在三角瓶中进行的，所述发酵培养基在单个三角瓶中的装液量为40-70ml。
4.如权利要求1至3中任一所述的方法，其特征在于：所述振荡培养的条件为：45℃、180r/min振荡培养5天。
5.如权利要求1至4中任一所述的方法，其特征在于：所述方法还包括如下步骤：完成所述振荡培养后，5000g离心20min，收集上清液。
6.权利要求1至5中任一所述方法制备得到的发酵物。
7.权利要求6所述发酵物在制备纤维素酶中的应用。
8.权利要求6所述发酵物作为纤维素酶的应用。
9.如权利要求8所述的应用，其特征在于：应用所述发酵物时，反应的温度为40-60℃，优选为60℃。
10.如权利要求8所述的应用，其特征在于：应用所述发酵物时，反应的pH为3-6，优选为5。
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