CN103497894A

CN103497894A - 一种微生物培养方法

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Publication number: CN103497894A
Application number: CN201310460326.8A
Authority: CN
Inventors: 钟琦
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2013-09-30
Filing date: 2013-09-30
Publication date: 2014-01-08

Abstract

本发明公开一种微生物培养方法，是将微生物引入加有培养液的培养器中，通入气体进行培养，所述培养器包括气泡导向组件，气泡导向组件中的曲折导向构件及导向板为气泡提供曲折向上的行进路径，通入的气体经气泡发生装置形成气泡，由气泡导向组件底部进入并沿导向板的下表面向上曲折爬升，在爬升的过程中与含有微生物的培养液发生物质交换。本发明的微生物培养方法通过采用包含特殊结构气泡导向组件的培养器，有效地增加了单位体积内气泡与培养液的接触面积及延长了接触时间，从而提高培养效率和降低培养成本，且气泡导向组件的设计和组装方式灵活，适应性强，使该微生物培养方法具有良好的工业应用前景。

Description

一种微生物培养方法

技术领域

本发明涉及微生物培养技术领域，特别是涉及一种微生物培养方法。

背景技术

在微生物培养过程中，通常需要将气态营养物以气泡的方式从大气中或人造气体储存容器中传递到微生物的培养液里，尤其是光合微生物如藻类，需要在存在太阳辐射和例如二氧化碳等富含碳的气体的情况下、在适当营养培养介质中生长并进行光合作用，因而增加气态营养物在微生物培养液里的供应有利于微生物的生长。目前，增加气态营养物供应的方法有三种：第一是增加气体的传输率，把更多的气体在一定时间内压入微生物培养环境中；第二是减小气泡的直径，使气泡可以溶解在培养液中；第三是增加培养器内气泡经历的微生物培养液的高度。这三种方法的缺点是：①都会增加微生物培养过程的能量消耗，从而增加生产成本；②不能把微生物培养器的模式放大到工业化生产的规模；③不能使用只装少量微生物培养液的微生物培养器进行培养，限制了微生物培养器的应用；④对于微藻培养，现有技术只能把二氧化碳气体与光能同时提供给一小部分微藻细胞进行光合作用，降低了培养效率。

发明内容

本发明的目的在于针对上述存在问题和不足，提供一种使用安全可靠、能耗低、效率高、应用范围广、工业化前景广阔的微生物培养方法。

本发明的技术方案是这样实现的：

一种微生物的培养方法，包括以下步骤：

将微生物引入加有培养液的培养器中，通入气体进行培养；

所述培养器包括容器和设置在所述容器中的气泡导向组件，所述气泡导向组件包括至少两个沿水平方向排列的曲折导向构件；所述曲折导向构件包括至少两个在竖直方向依次上下相连的导向板，所述导向板相对水平面倾斜设置，并且同一曲折导向构件中任意相邻的导向板相对水平面的倾斜方向相反，任意相邻的曲折导向构件之间形成曲折上升的通道；所述曲折导向构件的任一导向板与相邻曲折导向构件的最靠近的导向板在水平面的投影部分重叠；

所述培养器还包括设置在所述容器中的气泡发生装置，所述气泡发生装置设置在所述气泡导向组件的底部，通入的气体经所述气泡发生装置在培养液中形成气泡，气泡自气泡导向组件的底部进入所述通道并沿导向板的下表面爬升，为微生物提供营养气体。

本发明提供的微生物培养方法利用含有气泡导向组件的培养器进行微生物培养，大大提高培养器中单位体积内的气液接触面积及气液搅动频率，延长气液接触时间，进而提高营养气体的利用效率及微生物的培养效率，同时，气泡导向组件可实现模块化组装，利于实现规模培养。

作为本发明的进一步改进，所述气泡导向组件与所述容器的内壁之间留有供液体流动的间隙。随着气泡的上行，气泡中的营养气体与培养液之间发生物质交换，同时培养液也发生流动，促使物质在整个培养环境中分布均匀，提高培养效率。

作为进一步的改进，所述导向板为平板或弧形板，所述导向板为平板时，与水平面的夹角为10～30°，导向板为弧形板时气泡的行进路径可以进一步延长。

作为进一步的改进，相邻所述曲折导向构件的间隔为15-50mm。

作为进一步的改进，所述曲折导向构件中的导向板接触相连或者固定连接或者自成一整体。

作为进一步的改进，在所述曲折导向构件上设置有光源，在微生物培养的过程中施加光照。所述光源还可设置于容器的内壁上，为微生物生长提供所需光能。

本发明的有益效果是：

本发明提供一种微生物培养方法，该微生物的培养在包含特殊结构气泡导向组件的培养器中进行，气泡导向组件中的导向板为微生物培养过程所需的携带营养气体的气泡提供曲折向上的行进路径，使气泡在沿导向板下表面上行的过程中，垂直上升速度减慢而增加了水平方向的运动，从而有效地增加了单位体积内气泡与微生物培养液的接触面积及延长了气液接触时间，使微生物生长所需的营养气体能够充分地从气相传递到微生物培养液中供微生物生长使用，极大提高微生物培养过程中的物质及能量利用效率，从而提高了培养效率和降低了培养成本，同时气泡的曲折向上运动过程增加了气液搅动频率，带动了微生物培养液的运动，把微生物生长所需的营养物均匀地传送到整个微生物培养液中，利于提高微生物的培养效率，且气泡导向组件的设计和组装方式灵活，可实现模块化，适应性强，使采用所述方法培养微生物的生产能力可达到工业化生产的水平，成为一种可推广应用的工业生产方法。

附图说明

图1是曲折导向构件的导向板为多个时气泡导向组件的结构示意图；

图2是导向板为方形平板时气泡导向组件的装配件的分解示意图；

图3是导向板为方形平板时气泡导向组件的装配件的结构示意图；

图4是曲折导向构件的导向板为两个平板时气泡导向组件的分解示意图；

图5是曲折导向构件的导向板为两个平板时的气泡导向组件结构示意图；

图6是导向板为弧形板时气泡导向组件的装配件的结构示意图；

图7是曲折导向构件的导向板为两个弧形板时的气泡导向组件结构示意图；

图8是采用另一种装配方式的气泡导向组件结构示意图；

图9是图8的局部放大图A；

图10是图8的气泡导向组件中曲折导向构件的结构示意图；

图11是本发明实施例的微生物培养方法中使用的培养器剖面结构示意图；

图12是本发明实施例的微生物培养方法中使用的培养器结构分解示意图；

图13为本发明实施例的微生物培养方法中使用的培养器的立体图。

具体实施方式

下面结合附图说明及具体实施方式对本发明进一步说明。

本发明的微生物的培养方法，包括以下步骤：

将微生物引入加有培养液的培养器中，通入气体进行培养；

培养器包括容器和设置在所述容器中的气泡导向组件，气泡导向组件包括至少两个曲折导向构件；曲折导向构件包括至少两个在竖直方向依次上下相连的导向板，导向板相对水平面倾斜设置，并且同一曲折导向构件中任意相邻的导向板相对水平面的倾斜方向相反，任意相邻的曲折导向构件之间形成曲折上升的通道；曲折导向构件的任一导向板与相邻曲折导向构件的最靠近的导向板在水平面的投影部分重叠；

培养器还包括设置在所述容器中的气泡发生装置，气泡发生装置设置在气泡导向组件的底部，通入的气体经所述气泡发生装置在培养液中形成气泡，气泡自气泡导向组件的底部进入所述通道并沿导向板的下表面爬升，为微生物提供营养气体。

微生物包括霉菌、酵母、细菌或藻类等，该类微生物在培养过程中，需要通入含有氧气、二氧化碳、二氧化硫、二氧化氮等营养气体的气体并形成气泡，将营养气体提供给微生物培养过程使用。其中，气泡在培养液中运动的过程中，营养气体在培养液中溶解后供微生物利用，同时微生物代谢过程产生的气体可由气泡带出培养液。

本发明的微生物培养方法在特殊的培养器中进行，培养器的容器的形状、体积不限，可以为便于携带、搬移的培养箱，或容积较大、可实现规模培养的培养池、培养罐等，培养器中的气泡导向组件也可根据需要设置多个。

培养器为一个与外界连通的装置，可以包括常规设置的用于隔挡外界污染的盖，用于输送气体进入培养液中的气体导入装置，以及气体导出装置等，气体导出装置可以为设置在培养器的盖或壁上的出气孔或出气管道。

气泡导向组件中，曲折导向构件的导向板相对水平面倾斜设置，倾斜设置的导向板为气泡提供爬升斜面，与之相连的导向板相对水平面倾斜方向相反，则相邻导向板在竖直方向上形成转折，使曲折导向构件整体曲折向上，从而显著增加气泡行进路径长度及单位体积内的气液接触面积。

图1～图5给出方便导向板的批量制作及气泡导向组件的装配的一种优选实施方式。如图1所示，为气泡导向组件的结构示意图，气泡导向组件1包括多个沿水平方向等间距排列的曲折导向构件10，曲折导向构件10包括多块在竖直方向依次上下接触相连的导向板101，导向板101相对水平面倾斜设置，同一曲折导向构件10中任意相邻的导向板101相对水平面的倾斜方向相反，任意相邻的曲折导向构件10之间形成曲折上升的通道，且曲折导向构件10的任一导向板101与相邻曲折导向构件10的最靠近的导向板101在水平面的投影部分重叠，气泡自气泡导向组件的底部进入通道并沿导向板101的下表面爬升。

图1中，气泡导向组件1的装配方法是将多个水平方向上平行等间距设置的导向板101固定后得到装配件，然后在竖直方向叠加得到气泡导向组件1，具体将装配件翻转180°，得到另一个装配件，将翻转前后的装配件叠加，使导向板101相接触且相对水平面倾斜方向相反，得到气泡导向组件1，叠加后可进一步固定，防止导向板移动。

如图2所示，为导向板为方形平板时，气泡导向组件的装配件的分解示意图。装配件包括导向板101和固定件，固定件包括具有与水平方向成锐角的斜向插槽1110的横条111和楔形承台112，可进一步包括紧固件113，楔形承台112上具有与横条111尺寸对应的凹槽1120，楔形承台112的厚度与导向板101的竖直高度相同，其与导向板101靠近的面与导向板101平行。

图3是导向板为方形平板时，气泡导向组件的装配件的结构示意图，在多个水平方向上等间距设置的导向板101的前方和后方分别用横条111固定导向板101，在最末两端的导向板101的相邻位置设置楔形承台112，使楔形承台112的斜面与末端的导向板101间形成通道，将横条111两端分别插入楔形承台112上的1120中，经过紧固件113如螺丝固定，得到装配件。

图4是曲折导向构件的导向板为两个平板时，气泡导向组件的分解示意图，图5为相应气泡导向组件的结构示意图。该气泡导向组件由两个装配件叠加得到，装配件的分解示意图及结构示意图参见图2、图3，将一个装配件翻转180°叠加在另一个装配件上得到图5中的气泡导向组件1。图1中的气泡导向组件可由多个图5中的气泡导向组件叠加组装得到。

如图5所示的气泡导向组件1中，曲折导向构件10由两个导向板101组成，相邻曲折导向构件10中，任意相邻的曲折导向构件10之间形成曲折上升的通道2，曲折导向构件10的任一导向板101a与相邻曲折导向构件10的最靠近的导向板101b及导向板101c在水平面的投影均部分重叠。曲折导向构件10的导向板101d与相邻曲折导向构件10的最靠近的导向板101e及导向板101f在水平面的投影也部分重叠。气泡3在通道2中，沿导向板101d下表面爬升至末端后竖直上行，到达相邻曲折导向构件10中位置稍在上方的导向板101b下表面，并沿该下表面继续向上爬升，从而交替沿相邻两个曲折导向构件10的导向板101下表面曲折向上爬升。

图6是导向板为弧形板时，气泡导向组件的装配件的结构示意图，装配件中包含导向板101和固定件，固定件的结构及装配件的装配方式参照图2及图3，导向板101采用弧形板可以进一步延长气泡的上行路径长度。

图7是导向板为弧形板时，气泡导向组件的结构示意图，将图6中的装配件翻转180°后与未翻转的装配件叠加，使导向板101相接触，得到气泡导向组件1，包括曲折导向构件10及曲折上升的通道2，气泡交替沿相邻两个曲折导向构件10的导向板101下表面曲折向上爬升。

图1、图5及图7的气泡导向组件1中，曲折导向构件10上的导向板101采用接触的连接方式，即导向板101独立可拆分，从而可采用将导向板101沿水平方向排列设置并固定后叠加的装配方式，实现模块化组装，组装方式灵活、方便。同时，导向板101在水平方向上等间距排列，相互平行，在提高单位体积内导向板101的密集程度及气液接触面积的同时，相邻曲折导向构件上靠近的导向板间距越小，在水平面上的投影重叠部分面积越大，气泡在导向板下表面上的上行路径越长，气液接触面积也越大。

图8是采用另一种装配方式的气泡导向组件结构示意图，图9是图8的局部放大图A。该气泡导向组件1中，导向板101相对水平面倾斜设置，多个导向板101在竖直方向上采用依次固定连接为一体的方式形成曲折导向构件10，同一曲折导向构件10中任意相邻的导向板101相对水平面的倾斜方向相反，在水平方向上等间距设置多个曲折导向构件10，经固定件固定即可。

固定件包括设置在曲折导向构件10两端的卡条114及具有与卡条114的厚度对应的卡槽1150的横条115，多个曲折导向构件10由横条115固定，得到气泡导向组件1。

图10是图8的气泡导向组件1中曲折导向构件10的结构示意图，图中示出了相邻曲折导向构件10的位置关系，即任意相邻的曲折导向构件10之间形成曲折上升的通道，曲折导向构件10的任一导向板101与相邻曲折导向构件10的最靠近的导向板101在水平面的投影部分重叠，使气泡交替沿相邻两个曲折导向构件10的导向板101下表面曲折向上爬升，同时气泡导向构件10上下端固定连接有卡条114，方便固定。

图8中的气泡导向组件1采用先将导向板101依次固定连接为一体或将多个导向板101整体一次成型的加工方式即导向板101自成一整体，得到曲折导向构件10后，再将多个曲折导向构件10组合固定的装配方式，方便曲折导向构件10的制作，且组装方式灵活。同时，导向板101在水平方向上间距相等，相互平行，可提高单位体积内导向板101的密集程度及气液接触面积，且相邻曲折导向构件间距越小，导向板在水平面上的投影重叠部分面积越大，气泡在导向板下表面上的上行路径越长，气液接触面积也越大。

图5及图8的气泡导向组件中通过固定件将导向板及曲折导向构件固定，固定件及固定方式多种多样，将导向板及曲折导向构件固定，不影响气泡曲折上行的行进路径以及培养液的流动即可。

气泡导向组件中的导向板为气泡不能穿透的薄板，材质为塑料、金属或玻璃或其它不溶于培养液的物质，当微生物培养过程中需要光照时，宜为透光板。同时，气泡在培养液中受到竖直向上的力或气泡行进速度较快，冲量较大时，均可推动气泡沿导向板运动。因而导向板的具体形状及相对水平面的倾斜角度均不受严格限制，气泡能够上行而不因受阻碍导致完全停留即可，具体如波浪形、弧形或平面等及几种形状的混合均是可行的，采用表面为曲面的导向板如弧形板或波浪形板，可以进一步增加气泡行进路径长度，导向板为平面板时，其与水平面的夹角优选为10～30°，更优选为20°。

需要指出，气泡向上爬升时，导向板相对水平面倾斜程度小，气泡的运动速率慢，气液搅动程度低，但气液接触时间长，气泡运行的路径长度或气液接触面积较大，而倾斜程度较大时，气泡的运动速率较快，气液搅动程度大，而气液接触时间短，气泡运行的总路径或气液接触面积较小。

本发明的微生物培养方法的具体操作还可包括培养基制备及对培养液进行的常规灭菌等预处理，以及培养完成后的分离提纯等操作。

下面提供一个本发明微生物培养方法的具体实施例，该微生物培养方法包括以下步骤：

待培养微生物为微藻Synechococcussp.MA19，培养基BG11的配制方法为：将硝酸钠1.5g，磷酸氢二钾0.04g，硫酸镁（MgSO₄·7H₂O）0.075g，氯化钙（CaCl₂·2H₂O）0.036g，柠檬酸0.006g，柠檬酸铁铵0.006g，EDTA0.001g，碳酸钠0.02g，微量金属溶液1.0ml，混合溶解于1L蒸馏水中，调节pH为7.1，灭菌后放入冰箱待用。其中微量金属溶液的配置方法为：将硼酸2.86g，氯化锰（MnCl₂·4H₂O）1.81g，硫酸锌（ZnSO₄·7H₂O）0.222g，钼酸钠（NaMoO₄·2H₂O）0.39g，硫酸铜（CuSO₄·5H₂O）0.079g，硝酸钴（Co(NO₃)₂·6H₂O）49.4mg，加入1.0L蒸馏水中溶解即得。

将微藻引入培养器的培养液的过程首先进行预培养，预培养包括以下步骤：

S01、在锥形瓶中将10ml微藻液与30ml培养基BG11混合，在25℃、LED灯光照射及连续通入气体的条件下培养24h，得到微藻培养液1，为略有浑浊的绿色液体；

S02、三天后，将35ml微藻培养液1与165ml培养基BG11混合，继续进行培养，培养条件同S01，得到微藻培养液2；

S03、三天后，将S02得到的200ml微藻培养液3分为三等份分装在锥形瓶中，分别加入培养基BG11至200ml，继续培养，条件与S01相同，至微藻培养液变混浊，得到微藻培养液3；

S04、一天后，将三个锥形瓶中的微藻培养液3合并到一个锥形瓶中，加入培养基BG11至2L，继续培养，培养条件同S01，得到绿色浑浊的微藻预培养液。

将预培养得到的微藻预培养液加入培养器的容器中，再加入18L培养基BG11，开启培养器中的LED灯，同时连续通入气体，进行培养。

微藻的预培养及培养过程中的气体为含有二氧化碳15%（体积分数），100ppm二氧化氮，250ppm二氧化硫的空气，培养过程中进气量为每分钟1立方米。

本发明的微生物培养方法还可用于培养细菌，待培养细菌为E.coli时，培养基LB的配制方法为：将胰蛋白胨(tryptone)10g，酵母提取物(yeastextract)5g，氯化钠(NaCl)10g，琼脂粉15-20g，加入1000mL双蒸水中溶解，用5mol/LNaOH溶液约0.2ml调pH至7.2即得，121℃灭菌30min后待用。将待培养细菌E.coli引入培养容器中的培养基LB中，通入气体后进行培养。

图11为培养器的剖面结构示意图，图12为培养器的结构分解示意图，图13为培养器的立体图，培养器包括容器和设置在培养箱中的气泡导向组件1、气泡发生装置6，还包括气体导入装置。

容器具体为培养箱，包括箱体41，箱盖42和出气孔43，箱体41底面约为1×1m²，高约1m，培养箱中的培养液液面高度高于气泡导向组件1，箱体41和箱盖42分别由塑料或金属或玻璃或其它材料制成，无特殊限制。

气体导入装置包括配气器51和进气管道52，气体经进气管道52导入容器底部的气室后，经过气泡发生装置6在培养液中产生直径较小的气泡，由气泡导向组件1的底部进入，与含微藻的培养液发生物质交换后的气泡3溢出培养液后由出气孔43排出。气泡发生装置6为微孔板，在气室与气泡发生装置之间设置垫圈7。

气泡导向组件1的结构及装配方式参见图1～图5，包括曲折导向构件和固定件，将相同尺寸的导向板沿水平方向等间距排列设置并固定，得到装配件，将翻转180°后的装配件与未旋转的装配件叠加，使曲折导向构件上的导向板接触相连，得到多个曲折导向构件组成的气泡导向组件。具体的，导向板为长1米，宽10.6cm，厚1mm的方形透明玻璃平板，与水平面的夹角为20度，28个在竖直方向依次上下相接触连接的导向板构成曲折导向构件，图中示出了10个导向板构成的曲折导向构件；在水平方向上等间距（20mm）排列45个曲折导向构件，固定后得到气泡导向组件，气泡交替沿相邻两个曲折导向构件的导向板下表面曲折向上爬升，直至逸出含待培养微生物的培养液。

气泡导向组件1设置于箱体41中后，在气泡导向组件1与箱体41的内壁之间留有空隙8，供受到气泡搅动的含待培养微生物的培养液流动，促进培养体系中的物质平衡分布，提高培养效率，具体在培养过程中，气泡在气泡导向组件1的通道中沿曲折向上的路径行进的同时，含待培养微生物的培养液也随之向上运动，然后在随气泡行出气泡导向组件1后沿箱体41与气泡导向组件1之间的空隙8回流至箱体41底部。

该培养箱中，在气泡导向组件1的导向板或箱体41的内壁上安装led灯，将光投射到气泡周围，使待培养微生物可同时获得进行光合作用必需的二氧化碳和光能，使待培养微生物能够有效地进行光合作用及快速地生长。

在本实施例的气泡导向组件1中，气泡在含待培养微生物的培养液中的行进路径长度为2.99m，相对竖直行进距离（1m）提高近200%，气泡3与含待培养微生物的培养液的接触面积为134m²，比其直接在竖直方向行进时的面积1m²增加134倍，显著提高了单位体积内的气液接触面积，促进气液物质交换及微生物的培养过程。同时，气泡在曲折向上行进的过程中带动含待培养微生物的培养液流动，提高气液搅动频率，促进物质平衡，提高微生物培养效率。

在微藻培养过程中，通过观察绿色变化并检测培养液光密度变化来衡量微藻的生长情况，试验结果表明，采用该装置进行上述微藻的培养，每分钟可处理297克二氧化碳，0.26克二氧化氮，0.66克二氧化硫，并生产162克微藻生物质，培养效率显著提高。

以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。

Claims

1.一种微生物的培养方法，其特征在于，包括以下步骤：

将微生物引入加有培养液的培养器中，通入气体进行培养；

2.根据权利要求1所述微生物培养方法，其特征在于，所述导向板为平面板或弧形板。

3.根据权利要求2所述微生物培养方法，其特征在于，所述导向板为平面板，其与水平面的夹角为10～30°。

4.根据权利要求1～3任一项所述微生物培养方法，其特征在于，相邻所述曲折导向构件的间隔为15-50mm。

5.根据权利要求1～4任一项所述微生物培养方法，其特征在于，所述曲折导向构件中的导向板接触相连或者固定连接或者自成一整体。

6.根据权利要求1～5任一项所述微生物培养方法，其特征在于，所述气泡导向组件与所述容器的内壁之间留有供液体流动的间隙。

7.根据权利要求1～6任一项所述微生物培养方法，其特征在于，在所述曲折导向构件上设置有光源，在微生物培养的过程中施加光照。