CN103497231B - 一种量子点标记蛋白聚合物的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种量子点标记蛋白聚合物的方法，属于纳米生物技术领域。其特征在于选用包含组氨酸标签序列（Histag）的荧光蛋白二聚物（TIP1-mCherry二聚体）。将蛋白与量子点按照一定比例混匀，偶联成蛋白-量子点复合物，并通过咪唑取代证实复合物的结构非常稳定。该方法对三维结构的蛋白与量子点组装特性的影响做了系统研究，提高了蛋白与量子点结合的稳定性，可以作为纳米荧光探针广泛应用于生物标记。

Description

一种量子点标记蛋白聚合物的方法
技术领域
本发明涉及纳米生物技术领域，具体涉及一种量子点标记蛋白聚合物的方法。
背景技术
量子点（QDs）是一种零维半导体纳米晶体，近似球形，直径1～12nm，可分散于水或者有机溶剂中形成胶。与传统的有机染料相比，QDs具有更优异的光谱性质，如激发光谱宽且连续分布，而发射光谱呈对称分布且宽度窄，颜色可调，并且光化学稳定性高，不易光解（Marcel BJ，Mario M，Peter G，et al.Science1998，281，2013-2016）。这些优越的性能使QDs在体内细胞成像和生物特定标记等方面都得到了广泛应用，它正在并将日益成为分子细胞成像研究中非常重要的一种探针工具。
目前，在生物标记中应用最广泛的是金属有机溶剂法合成的脂溶性CdSe/ZnS量子点。因此，必须将脂溶性的QDs转化成水溶性的QDs才能进行生物标记。而将脂溶性的QDs转化成水溶性的QDs最常用的方法是先用巯基小分子（如巯基乙酸、巯基丙酸、谷胱甘肽、巯基丁二酸等）取代脂溶性QDs表面的配体，然后通过偶联剂与生物分子偶联；另一种常用的QDs标记生物分子的方法是与含有组氨酸标签（Histag）的多肽或蛋白结合。QDs表面的Zn原子和多组氨酸残基的金属亲和协调作用，含有组氨酸残基的蛋白质和多肽能够直接接到QDs表面的Zn原子，这种方法具有很好的稳定性，已逐渐成为生物标记中一种常用的方法。Sapsford等（Sapsford K.E.，Pons T.，Medintz I.L.，et al.J.Phys.Chem.C2007，111，11528-11538）系统地研究了含组氨酸多肽与QDs之间的相互作用及结合常数等，6个组氨酸序列与QDs的结合速率是约100秒，Kd -1约为1nM。虽然近几年在这方面研究有很大的进步，但对于三维结构的蛋白对组装特性的影响仍缺乏系统研究。因而，我们设计了包含Histag的荧光蛋白二聚物，使更多的组氨酸与QDs结合，以此提高结合的稳定性，从而大大提高QDs在生物标记领域中的应用。
发明内容
本发明要解决的技术问题是：为了研究三维结构的蛋白对量子点与蛋白组装特性的影响，以及QDs标记蛋白稳定性差的问题，为解决上述技术问题，本发明提供一种量子点标记蛋白聚合物的方法，选用了包含Histag的荧光蛋白二聚物，从而提高量子点与蛋白结合的稳定性。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：一种量子点标记蛋白聚合物的方法，是蛋白上表达一个含有组氨酸标签的多肽序列，然后加入连接多肽(CGGWRESAI)2，使蛋白形成二聚体;将带组氨酸标签的蛋白二聚体与量子点混合，得到量子点标记的复合物。
所述的蛋白为TIP1-mCherry。
所述的蛋白与量子点之间的摩尔比为1:1-64:1。
由于选用的蛋白结合多个Histag，可同时与量子点结合，从而提高结合的稳定性。
本发明所述的量子点为含有Zn的量子点，如CdSe/ZnS、CdTe/ZnS、CdSe/ZnSe或者CdTe/ZnSe。
采用上述的技术方案后，本发明取得的有益效果是，本发明提供的一种量子点标记蛋白聚合物的新方法，操作方法简单，可重复性高，与量子点结合速度快，当配体分子量越大，蛋白结合量子点的化学计量比越小，同时四聚体的空间结构越小，结合稳定性越高，解决了现有量子点蛋白结合的稳定性不足而导致其在生物体内的不稳定，进一步拓展了量子点—蛋白作为纳米荧光探针在生物中的应用。
附图说明
下面结合附图和实施例对本发明进一步说明。
图1TIP1-mCherry单体、TIP1-mCherry二聚体与量子点的组装(A)量子点标记TIP1-mCherry二聚体
图2不同摩尔比TIP1-mCherry与QD组装a，QD；b，1:1；c，2:1；d，4:1；e，8:1；f，16:1；g，32:1；g，64:1。
图3200mM(c)和400mM(b)咪唑置换QD-TIP1-mCherry蛋白-量子点复合物。
图4200mM(b)和400mM(c)咪唑置换QD-(TIP1-mCherry二聚物)，a为未加
咪唑的QD-蛋白复合物。
具体实施方式
实施例
本发明将就以下实施例作进一步说明，但应了解的是，这些实施例仅为例示说明之用，而不应被解释为本发明实施的限制。
实施例1
选用发射波长为565nm的CdSe/ZnS量子点，选取TIP1蛋白，C端连接mCherry，N端连接一个Histag，组成一个TIP1-mCherry单体。将两个TIP1-mCherry单体通过二聚多肽配体(CGGWRESAI)2连接成为一个稳定的H形，TIP1-mCherry二聚体具有2个Histag(图1)。将TIP1-mCherry单体及其二聚体通过Histag分别与量子点按不同比例偶联混匀，得到TIP1-mCherry-QD复合物和TIP1-mCherry二聚体-QD复合物，用于FRET测定(图2)。
为了检测TIP1-mCherry单体及其二聚体与QDs结合的稳定性，将QDs与TIP1-mCherry单体及其二聚体混合后，加入咪唑取代配体（咪唑终浓度为200mM或400mM）。咪唑能与Zn离子螯合，因此可与Histag产生竞争，有可能把结合到QDs上的TIP1-mCherry单体及其二聚体取代下来，因此通过加入高浓度的咪唑来判断TIP1-mCherry单体及其二聚体与QDs结合的稳定性。实验结果表明，加入大量取代分子后，TIP1-mCherry单体荧光削弱了50%（图3），TIP1-mCherry二聚体削弱了30%，说明QDs与TIP1-mCherry二聚体的结合比较稳定（图4）。
实施例2
选用发射波长为612nm的CdTe/ZnS量子点，其他步骤同实施例1。
实施例3
所用的融合蛋白为TIP1-GFP荧光蛋白，其他步骤同实施例1。
通过上述三个实施例可以看出，本发明可以实现量子点与二聚体蛋白的快速结合，并且稳定性高，操作方便。
以上述依据本发明的理想实施例为启示，通过上述的说明内容，相关工作人员完全可以在不偏离本项发明技术思想的范围内，进行多样的变更以及修改。本项发明的技术性范围并不局限于说明书上的内容，必须要根据权利要求范围来确定其技术性范围。

Claims (3)

1.一种量子点标记蛋白聚合物的方法，其特征在于，是在蛋白TIP1-mCherry上表达一个含有组氨酸标签序列的多肽，然后加入连接多肽(CGGWRESAI)2，使蛋白形成二聚体；将带组氨酸标签的蛋白二聚体与量子点混合，得到量子点标记的复合物；所述的量子点为含有Zn的量子点。
2.根据权利要求1所述的一种量子点标记蛋白聚合物的方法，其特征在于所述的蛋白与量子点之间的摩尔比为1:1-64:1。
3.根据权利要求1所述的一种量子点标记蛋白聚合物的方法，其特征在于：所述含有Zn的量子点是CdSe/ZnS、CdTe/ZnS、CdSe/ZnSe或者CdTe/ZnSe。
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