CN103492413A - 抗tace抗体分子及其应用 - Google Patents

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Abstract

在本领域中第一次公开了抗TACE(ADAM17)抗体，其能够结合TACE，并能够拮抗一种或多种其生物活性，特别是以一种跨结构域结合方式结合TACE，其中催化结构域和富含半胱氨酸/解联蛋白结构域(Dis-Cys)的残基均参与抗体结合TACE，有助于提高抗体结合的特异性和/或有助于提高对TACE生物活性的抑制。公开了抗体的治疗应用，特别是治疗癌症。

Description

抗TACE抗体分子及其应用
发明领域
本发明涉及抗TNF-α转化酶(TACE)抗体分子及其应用，更具体地，涉及能够通过结合其催化结构域和Dis-Cys结构域抑制TACE生物活性的抗TACE抗体分子。
发明背景
TNF-α转化酶(TACE)(也称作解联蛋白样金属蛋白酶17(ADAM17))，是一种膜结合的金属蛋白酶，负责切割多种病理学上有意义的底物。TACE最初被鉴定为负责溶解膜关联的前体TNF-α(该过程后来被称为“胞外域脱落”)的酶，现已经被证明能够切割多种类型的底物，例如表皮生长因子受体(EGFR)配体、细胞外Notch、细胞表面受体和粘附分子。因为蛋白水解切割是许多这些底物不可或缺的激活事件，所以TACE已经被视为用于治疗癌症和风湿性关节炎的引人注意的治疗靶标。TACE的作用在Murphy(NatureReviews:Cancer,8(12):929-941,2008)中有综述。
人们已经认识到TACE调节TNF-α的作用以及因此抑制TACE作为炎症疾病治疗策略的潜在应用性有一段时间了，并且许多公司已经试图开发TACE的小分子抑制剂。然而，金属蛋白酶家族高度保守，开发选择性的小分子抑制剂已经被证明具有非常大的挑战。先前使用更广谱的金属蛋白酶抑制剂的试验已经被证明具有组织毒性，因此人们期待能够生产该家族的选择性抑制剂，见Moss等(Nature Clinical Practice,4(6):300-309,2008)。
开发选择性TACE抑制剂的一个替代性策略是利用一般可以通过抗体实现的选择性。然而，尽管可以结合TACE的抗体已经有报道并且在商业上可得，但是迄今为止，这些中几乎没有一个具有拮抗活性。例如，尽管WO96/041624公开了TACE酶的鉴定，并提出产生了抗TACE抗体，但是在该专利申请中并没有公开抗体，更没有公开具有特定的功能性质的抗体，例如拮抗抗体。这进一步意味着，开发基于抗体的能够阻断TACE活性的治疗剂本技术领域仍然是一个未解决的问题。
发明概要
从广义上说，本发明是基于如下的认识，即用于产生抗体的整体多结构域途径可以用于特异性抑制复合体蛋白酶，例如TACE。这种认识随后被用于产生能够抑制TACE的抗体分子，而且该抗体分子是本领域中第一个能够发挥TACE的一种或多种生物活性的拮抗剂的功能的抗体。
不希望受限于任何特定的理论，本发明人相信，本发明的抗体分子具有独特的抗体结合模式，即它以跨结构域结合(cross domain binding)方式与TACE结合。如实施例中支持的，这意味着催化结构域和富含半胱氨酸/解联蛋白结构域(Dis-Cys)的残基均参与了抗体与TACE的结合，有助于提高抗体结合的特异性和/或有助于提高对TACE生物活性的抑制。
本发明的抗体分子是根据发明人的如下认识设计的：在完整的ADAM胞外域中，催化结构域和Dis-Cys结构域在空间上相互关联，并且特别地，TACE的“C-形”意味着TACE的非催化性羧基端Dis-Cys结构域部分地阻碍大分子接近氨基端催化结构域。这进一步导致本发明人得出结论，即选择性TACE抑制剂可以利用这种空间上相连的多结构域拓扑学来以广泛地拮抗催化结构域，同时从局部的Dis-Cys残基获得额外的特异性。
如将下面更详细介绍的，本发明人利用ADAM多结构域拓扑学，第一次分离出了一种抑制性人抗体(D1)，该抗体排他性地通过其可变重链(VH)结构域与TACE非催化区的结合。然后使用D1-VH偏倚的scFv噬菌体展示文库选择性分离了一种新的能够同时结合TACE催化结构域的可变轻链(VL)。最终的“跨结构域”(cross-domain)人抗体(D1(A12))是第一个整体性ADAM胞外域抑制剂，是迄今为止描述的最有选择性的强细胞表面TACE抑制剂。
因此，在第一个方面中，本发明提供了一种分离的抗体分子，其特异结合TNF-α转化酶(TACE)并抑制TACE的生物学功能。如上面解释的，本发明人相信，本发明的抗体分子能够通过结合TACE的催化结构域和Dis-Cys结构域二者来抑制TACE的生物活性。例如，本发明的抗体优选能够抑制TACE对底物的切割。抗体的其它特征和性质在下面描述。
在第一个方面中，本发明提供了一种药物组合物，其包括如本文中公开的抗体分子和药学可接受的赋形剂。
在进一步的方面中，本发明提供了一种如本文中公开的抗体分子，供在治疗人或动物的方法中使用。
在进一步的方面中，本发明提供了一种如本文中公开的抗体分子，供在治疗TACE介导的疾病的方法中使用。
在进一步的方面中，本发明提供了本文中所公开的抗体分子制造用于治疗TACE介导的病症的药物的用途。
在进一步的方面中，本发明提供了一种治疗具有TACE介导的病症的个体的方法，包括向有该需要的个体施用如本文中公开的抗体分子。
在本发明的医学使用和治疗方法中，优选的TACE介导的病症是癌症、免疫相关疾病或银屑病，更具体地是癌症如脑癌、乳腺癌、结肠癌、胃癌、肾癌、肝癌、肺癌、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌或结直肠癌，免疫相关疾病如类风湿关节炎，或基于炎症或变应性的疾病如哮喘。
在进一步的方面中，本发明提供了产生特异性结合ADAM家族金属蛋白酶的抗体分子的方法，其中抗体能够通过结合金属蛋白酶的催化结构域和Dis-Cys结构域二者来抑制ADAM家族金属蛋白酶的蛋白酶活性，该方法包括：
(a)鉴定包含能够结合包含催化结构域和Dis-Cys结构域的ADAM家族金属蛋白酶多肽的可变重链结构域的抗体，其中所述催化结构域结合于ADAM家族金属蛋白酶的抑制剂；
(b)鉴定包含能够结合分离的ADAM家族金属蛋白酶催化结构域的可变轻链结构域的抗体；和
(c)产生抗体分子，其包含在步骤(a)中鉴定的可变重链结构域和在步骤(b)中鉴定的可变轻链结构域。ADAM家族金属蛋白酶的描述及其序列和结构的参考见Murphy等Nature Reviews:Cancer,8:929-941,2008。其描述了ADAM家族金属蛋白酶如何共享一个共同的结构域结构，该结构包括Dis-Cys和催化结构域。ADAM家族金属蛋白酶及它们的替代名称的实例包括，但不仅限于，ADAM8(Ms2,CD156a),ADAM9(Meltrin-γ,MDC9),ADAM10(Kuzbanian,MADM,sU17),ADAM12(Meltrin-α),ADAM15(Metargidin,MDC15),ADAM17(TACE),ADAM19(Meltrin-β,MADDAM),ADAM28(MDCL,eMDCII,TECADAM)和ADAM33。
现在参考附图对本发明的实施方案进行描述，这些描述是示例性的，不构成限定。然而，基于本公开，本领域的技术人员可以显见本发明的各个其他方面和实施方案。
在本文中所使用的，“和/或”是指在具体公开两个特定特征或组分的每一个时，可以有或者没有另一个。例如，“A和/或B”应被看作如下的特定公开的每一个：(i)A,(ii)B和(iii)A和B，如同本文中单独提出每一个那样。
除非上下文中明确指出，否则上面提出的特征的描述和定义并不限制本发明的任何特殊方面或实施方案，并可以同等地应用于所描述的所有方面和实施方案。
附图简述
图1.实验概况。(A)人TACE胞外域由氨基端金属蛋白酶催化结构域(亮红色)和羧基端非催化Dis-Cys结构域（亮蓝色）构成(I-TASSER模型)。我们利用这一多结构域拓扑结构，使用两步抗体噬菌体展示开发了第一个真实的特异性ADAM抑制剂。(B)(i)首先，在第一抗体噬菌体展示选择中使用小分子抑制剂CT1746封闭TACE胞外域的催化位点。这防止选择结合催化性裂口(cleft)表位的抗体，因为这样的抗体会与非靶标金属蛋白酶交叉反应。(ii)第一次筛选揭示了抑制性scFv抗体克隆D1。该scFv通过其可变重链(VH)结构域特异性结合TACE Dis-Cys结构域。(iii)产生一个D1-VH偏倚性抗体噬菌体展示文库，以便引入新的可变轻链(新VL)同时保持由D1-VH提供的TACE特异性。第二次筛选在没有CT1746存在下进行，以便让新VL链能不受干扰地接近TACE催化位点。(iv)第二次筛选鉴定了数个能够结合分离的TACE催化结构域的新VL scFv。由于通过D1-VH结合Dis-Cys结构域，这些“跨结构域”抗体保持其对TACE的严格特异性。D1-VH-新-VL scFv克隆A12(下文称作D1(A12))对TACE胞外域显示最高的亲和性，因此是迄今为止描述的最强的选择性细胞表面ADAM抑制剂。
图2.ScFv D1是一个VH依赖的TACE胞外域抑制性人抗体。(A)将重组人TACE胞外域(Arg 215-Arg 651)与滴定浓度的人D1scFv或天然TACE抑制剂N-TIMP-3的N端片段预温育。随后在淬灭荧光肽切割测定中测量TACE蛋白水解活性。D1抑制TACE胞外域蛋白水解，其强度与N-TIMP-3相当(IC50 D1=5.4(±0.4)nM;(IC50 N-TIMP-3=3.2(±0.2)nM))。(B)固定化的TACE胞外域和催化结构域(Arg215-Ser474)用滴定浓度的scFv D1和抗催化结构域兔多克隆抗体pAb33进行探测。尽管具有抑制TACE介导的肽水解能力，但是D1scFv不能结合分离的TACE催化结构域。(C)我们先前描述了蛋白二硫键异构酶(PDI)如何能够重排TACE Dis-Cys结构域的二硫键。TACE催化结构域抗体pAb33和scFv A9的结合不受PDI处理TACE胞外域的影响。对比地，Dis-CysscFv D3和scFv D1在PDI处理后丧失了全部的免疫活性(*)。(D)scFv D1CDR的互补位扫描诱变(Paratope scanning mutagenesis)显示，VH结构域主要负责TACE胞外域结合。对比地，D1VL结构域对于TACE胞外域的结合而言似乎几乎完全不必要。
图3.通过VL交换诱导TACE催化结构域结合。(A)将scFv D1的VH结构域克隆到幼稚人VL噬菌体展示文库中，并在不存在CT1746的条件下（溶液和固相遴选），针对滴定浓度的生物素化TACE胞外域进行再次遴选。将选出的scFv克隆到FLAG标记的表达载体中，并筛选TACE胞外域结合。对最好的30个克隆进行测序，以除去重复（剩余21个），单独表达，亲和纯化，并定量地[10nM]再次就TACE胞外域和催化结构域的结合进行筛选。对于许多克隆，新VL结构域使得对TACE催化结构域的独立结合变得容易了。D1-VH-新-VL克隆“A12”(*)(下文称作D1(A12))对两个抗原均显示最高的亲和性。(B)与scFv D1不同，scFv D1(A12)对TACE Dis-Cys结构域的PDI调变大体耐受(=)。这种行为与针对TACE催化结构域表位的抗体相似。(C)对与分离的TACE催化结构域和完整胞外域相互作用的N-TIMP-3(催化裂口结合抑制剂)和D1(A12)FAb(跨结构域结合抑制剂)进行的表面等离子体共振(SPR)动力学分析。尽管N-TIMP-3的深度催化裂口焦点(catalytic cleft focus)支持其与分离的TACE催化结构域具有优良的结合(KD Cat=211(±32)pM)，
其与完整胞外域的结合被额外存在的非催化TACE Dis-Cys结构域严重破坏(KD Ecto=7,221(±84)pM)(ΔKD=KD Cat/KD Ecto=0.03)。对比地，跨结构域D1(A12)FAb对完整胞外域的亲和性(KD Ecto=461(±65)pM)比分离的催化结构域(KD Cat=5,210(±102)pM)(ΔKD=11.3)高>10倍。(D)反转D1(A12)ELISA研究产生了相当于>10倍的亲和力差异(EC50 D1(A12):Ecto=920(±19)pM;EC50 D1(A12):Cat=11,120(±94)pM)(ΔEC50 D1(A12)=EC50 D1(A12):Cat/EC50 D1(A12):Ecto=12.1)。全部±代表SD。
图4.D1(A12)互补位扫描诱变。(A)将延伸到β-碳之外的所有D1(A12)scFv互补位残基均个别地突变成丙氨酸(n=30)，在大肠杆菌中表达，并亲和纯化。通过淬灭荧光肽测定在溶液中确定每个突变体针对完整TACE胞外域(IC50 Ecto)和分离的催化结构域(IC50 Cat)的IC50值。此外，使用相同的程序同时计算“野生型”D1(A12)scFv IC50(IC50 WT)对TACE胞外域(IC50 Ecto:WT)和催化结构域(IC50 Cat:WT)的IC50值。为每个突变体和抗原计算吉布斯自由能(ΔΔG)的随后变化(ΔΔG=+RTln(IC50 Ala/IC50 WT))。尽管许多突变体均被证明对两种抗原的D1(A12)IC50 WT不利，但是有数个突变体似乎特异性改变了与TACE胞外域(*)或催化结构域(=)的结合。与scFv D1(图1(C))的互补位突变相关联的是，D1(A12)可变重链(VH)内数个残基对IC50 Ecto:WT有贡献。有趣的是，残基SH31,YH32和SH52(*)(Kabat编号)仅支持IC50 Ecto:WT，并且对于实现IC50 Cat:WT似乎是相对不必要的。对比地，数个可变轻链(VL)残基显著地支持IC50 Cat:WT(QL27,SL28,IL29,SL91和FL92(=))，但对于实现IC50 Ecto:WT似乎是相对不必要的。当定位到D1(A12)Fv模型上时(26)(采用Y轴右侧详细描述的颜色)，显示IC50抗原偏好的残基聚集在互补位的极性端（白色虚线）。(B)通过固相ELISA计算对每个互补位突变体的EC50值，并用于计算ΔΔG(ΔΔG=+RTln(EC50 Ala/EC50 WT)。与(A)描述的图谱呼应，残基SH31,YH32和SH52(*)支持EC50 Ecto:WT，残基QL27,SL28,IL29,SL91和FL92(=)支持EC50 Cat:WT。除了显示特异性抗原EC50偏倚的残基之外，CDR-H3内所有的丙氨酸突变均破坏了与两种抗原的结合。
图5.D1(A12)是TACE胞外域蛋白水解的强抑制剂。(A)将100nM TACE完整胞外域或分离的催化结构域与5μM GST-TNF-α和滴定浓度的D1(A12)FAb混合。37°C温育后，将每个反应用SDS-PAGE解析，考马斯蓝染色，并通过光密度分析定量各个条带。来自三次独立实验的定量结果显示为50μM CT1746(CT)金属蛋白酶抑制剂对照的百分比。D1(A12)FAb抑制了TACE胞外域对重组TNF-α的剪切(IC50 Ecto=73.9(±3.2)nM)，也抑制了对分离的催化结构域对重组TNF-α的剪切，但强度稍弱(IC50 Cat=124.7(±6.2)nM)。(B)将重组人TACE胞外域和催化结构域分别与滴定浓度的D1(A12)FAb和催化裂口聚焦的TACE抑制剂N-TIMP-3预温育。随后用淬灭荧光肽剪切测定法测量蛋白水解活性。D1(A12)FAb抑制TACE催化结构域蛋白水解的强度与N-TIMP-3相当。然而，当将全长重组人TACE胞外域与两种抑制剂预温育时，D1(A12)FAb证明比N-TIMP-3(=)强>5倍。(C)使用已知表达TACE底物的癌细胞(TOV21G:TNF-α,IGROV1:TGF-α,PC3:AREG)和稳定过表达HB-EGF-碱性磷酸酶的HeLa细胞测定细胞表面TACE活性。每个细胞系用PMA刺激，随后用各种浓度的D1(A12)人IgG1,N-TIMP-3或对照人血浆IgG预处理1小时。来自条件化培养基的可溶TACE产物通过夹心式ELISA或碱性磷酸酶活性进行定量。D1(A12)IgG1一贯地抑制细胞表面TACE活性，比N-TIMP-3(*)强大约5倍或者更强。细胞表面TACE抑制与(B)中的酶学数据正相关(即*≈=)。全部IC50数据见附表1。
图6.预测的TACE胞外域拓扑结构(A)TACE胞外域(构建体Arg651)的一维表征，显示了信号肽(S;白色)、前结构域(pro domain)(绿色)、弗林蛋白酶剪切位点(空心箭头)、催化结构域(红色)、锌络合组蛋白和解联蛋白-富半胱氨酸(Dis-Cys)结构域(蓝色)的相对定位。(B)TACE同源物的三维展示，采用(A)中列举的颜色系统。ADAM同源物拉塞尔氏蝰蛇毒金属蛋白酶(Russell’s Viper Venom metalloprotease)(RVV-X)的晶体结构报告了催化结构域和Dis-Cys结构域之间的紧密空间关联。结合较早前的血管细胞凋亡诱导蛋白(VAP)晶体图，该结构证据支持如下的观点，即ADAM为“C形”。更近些时候的非催化人ADAM22胞外域结构(与羧基端EGF氧结构域(黄色)竞争)继续支持了这种观点。(C)TACE的结构同源物建模(Edwards et al,2008)显示，完整胞外域很可能以类似的“C形”存在。这些模型提示，Dis-Cys结构域阻碍大分子接近TACE催化位点，其方式与RVV-X和ADAM22相似。Dis-Cys结构域和催化性裂口之间的紧密关联可以解释为什么完整TACE胞外域的蛋白水解比分离的催化结构域低～10倍。而且，该拓扑结构还解释为什么TACE(和许多其它金属蛋白酶)的天然蛋白抑制剂，金属蛋白酶3的组织抑制子(TIMP-3)，对暴露的TACE催化结构域的抑制比对“受保护的”(guarded)完整胞外域显著更好。
图7.抗TACE胞外域人scFv抗体的分离。(A)经过两轮针对生物素化TACE胞外域(用CT1746)的溶液相噬菌体展示选择之后，将洗脱的噬菌粒群体转移到pSANG10-3F载体中，并在大肠杆菌中表达各个scFvs。对每个抗体进行针对TACE胞外域(无CT1746)和BSA的ELISA筛选。结果表示为两种抗原之间的倍数差异(ΔA450=A450TACE/A450BSA)。分离所有ΔA450≥10的克隆（虚线），测序以排除重复，分别表达，并通过亲和色谱进行纯化。此外，还开发了一个阴性对照克隆(B9)。(B)针对TACE胞外域的滴定ELISA显示EC50值范围是11-420nM。(C)与500nM的纯化前导抗体预温育的1nM的重组TACE胞外域的淬灭荧光(QF)肽活性揭示，数种scFv具有一些抑制能力(*)。(D)为了研究QF肽抑制到细胞表面TACE抑制的因果关系(translation)，将过表达带碱性磷酸酶(AP)标签的HB-EGF的HeLa细胞与500nM的每种scFv预温育，并用PMA刺激。使用PBS和内源TACE抑制剂TIMP-3的氨基端结构域，N-TIMP-3(NT3)，分别作为阳性和阴性对照。TACE介导的HB-EGF脱落通过测定条件化培养基中的AP活性(显示为A405)加以测量。尽管在(C)中鉴定了数种重组TACE胞外域抑制剂，但是仅有scFvD1(**)似乎在细胞表面上保持其抑制能力。全部±代表SD。
图8.D1scFv对TACE有选择性。(A)将50nM固定化的人TACE胞外域、人TACE催化结构域、小鼠TACE胞外域、人ADAM10胞外域、人ADAM12胞外域和BSA分别与100nM D1scFv、抗TACE催化结构域多克隆(pAb28233)和抗-ADAM10多克隆(pAb10956)进行ELISA检测。尽管各ADAM抗原之间具有紧密的序列同源性，但是D1scFv似乎对人TACE胞外域具有完全的选择性。(B)重组人ADAM10胞外域与滴定浓度的人D1scFv或小分子金属蛋白酶抑制剂CT1746预温育。随后在淬灭荧光肽切割测定中测量ADAM10蛋白水解活性。结果表示为未处理对照的百分比。尽管CT1746快速抑制ADAM10蛋白水解，但是scFv D1没有效果。全部±代表SD。
图9.D1(A12)与N-TIMP-3共享一个共同表位。(A)将100nM TACE胞外域固定在ELISA平板上并用各种浓度的D1(A12)单价FAb预温育。随后通过测定N-TIMP-3结合监测TACE活性位点的可接近性。D1(A12)以1:1摩尔比阻断接近TACE胞外域活性位点。(B)翻转探针方向(即用各种浓度的N-TIMP-3预温育TACE，并用D1(A12)FAb进行检测)产生了相似的结果。全部±代表SD。
图10.D1(A12)IgG1和FAb对细胞表面TACE的抑制。为了研究D1(A12)IgG1的二价性质是否影响其TACE抑制强度，在PMA刺激的HeLa碱性磷酸酶(AP)标记HB-EGF测定中比较IgG1和单价FAb的滴度(titration)。D1(A12)FAb显示与IgG1具有相当的抑制谱。这提示，每个IgG1只有一个可变结构域负责抑制细胞表面TACE。全部±代表SD。
图11.D1(A12)是一种选择性TACE抑制剂。(A)50nM固定的人TACE胞外域、人TACE催化结构域、小鼠TACE胞外域、人ADAM10胞外域、人ADAM12胞外域和BSA分别用100nM D1(A12)FAb、抗TACE催化结构域多克隆(pAb28233)和抗-ADAM10多克隆(pAb10956)进行ELISA检测。尽管ADAM抗原之间具有紧密的序列同源性，但是D1(A12)FAb似乎完全选择性地针对人TACE胞外域。(B)将重组人ADAM10胞外域与滴定浓度的人D1(A12)FAb或小分子金属蛋白酶抑制剂CT1746预温育。随后在淬灭荧光肽切割测定中测量ADAM10蛋白水解活性。尽管D1(A12)FAb部分结合TACE催化结构域，但它对ADAM10活性没有影响。(C)稳定转染带碱性磷酸酶标签的HB-EGF的MCF7细胞为区分ADAM10和TACE细胞表面脱落活性提供了一种有用的模型。用非靶向性、ADAM10或TACE siRNA处理后的MCF7乳腺癌细胞裂解物的Western印迹分析。(D)PMA刺激的MCF7细胞导致TACE依赖的HB-EGF-AP脱落。(E)伊屋诺霉素刺激MCF7细胞导致HB-EGF-AP发生ADAM10依赖的脱落。(F)在MCF7乳腺癌细胞中，D1(A12)IgG1仅抑制TACE介导的PMA刺激的HB-EGF-AP脱落。对于细胞测定，使用单因素方差分析(one-way ANOVA)检验来比较对照细胞(例如非靶向性siRNA)与可变量(例如PMA刺激的)。P-值:*=<0.05,**=<0.01,***=<0.001。全部±代表SD。
图12.PC3细胞以～10%汇合率接种并在无血清培养基中生长24小时。每8小时向培养基中添加200nM D1(A12)IgG1或等体积的PBS。汇合率用IncuCyte来测量。D1(A12)IgG1的TACE抑制严重阻碍了PC3细胞的无血清增殖。误差线代表S.D.。
图13.将包含内皮细胞、成纤维细胞和MDA-MB-231乳腺癌细胞系的多细胞三维球状体(spheroid)在I型胶原中与330nM D1(A12)IgG1或等体积PBS温育。温育36小时后，对用绿色CMFDA CellTracker染料预染色的内皮细胞成像，并定量内皮细胞芽体形成(endothelial cell sprout formation)以确定总长出(total outgrowth)和芽体数目(number of sprouts)。这两个参数均显示：当TACE被D1(A12)抑制时，内皮细胞芽体形成降低。白色误差线对应于100μm。
图14.重组TACE胞外域单独或者与100nM pAb28233(抗催化结构域多克隆抗体)预温育1小时。用淬灭荧光肽测定检测随后的蛋白水解活性。尽管pAb28233与TACE催化结构域结合，但它并不抑制TACE活性。
图15.重组TACE胞外域单独或者与100nM mAb4.1(抗催化结构域单克隆抗体)预温育1小时。用淬灭荧光肽测定检测随后的蛋白水解活性。尽管mAb4.1与TACE催化结构域结合，但它并不抑制TACE活性。
图16.抗TACE抗体D1(A12)使KrasWT和KrasMT结直肠癌细胞对化疗处理敏感。
图17.抗TACE抗体在体外消除(abrogate)结直肠癌异种移植物(H630)生长。
图18.监测结直肠癌异种移植物中潜在TACE底物的血浆水平。
图19.在IGROV1卵巢癌异种移植物模型中检测抗-TACE抗体。
图20.在IGROV1卵巢癌异种移植物模型中监测潜在TACE底物的血浆/腹水(ascite)水平。
图21.单次剂量10mg/kg i.p.后，抗TACE抗体D1(A12)在裸鼠体内的药代动力学。在每个时间点，N=2或者更多小鼠。误差线代表平均值的标准误差。
详细说明
抗ATCE抗体分子
除非特别指出，否则本文中抗体残基的编号是根据Kabat编号体系。TACE的结构和结构域在图6中给出，TACE的氨基酸序列如ID NO:19所示。优选地，本发明的抗体分子能够结合如下的TACE多肽，其包含与SEQID NO:19所示的氨基酸215-651具有至少80%序列同一性的多肽，或其片段，其中该片段具有生物活性。
在一些实施方案中，本发明的抗体分子包含一个或多个如下的CDR序列：
(a)具有SEQ ID NO:1氨基酸序列，或者SEQ ID NO:1氨基酸序列中有一个或多个氨基酸替换、缺失或插入的CDR-H1；和/或
(b)具有SEQ ID NO:2氨基酸序列，或者SEQ ID NO:2氨基酸序列中有一个或多个氨基酸替换、缺失或插入的CDR-H2；和/或
(c)具有SEQ ID NO:3氨基酸序列，或者SEQ ID NO:3氨基酸序列中有一个或多个氨基酸替换、缺失或插入的CDR-H3；和/或
(d)具有SEQ ID NO:4氨基酸序列，或者SEQ ID NO:4氨基酸序列中有一个或多个氨基酸替换、缺失或插入的CDR-L1；和/或
(e)具有SEQ ID NO:5氨基酸序列，或者SEQ ID NO:5氨基酸序列中有一个或多个氨基酸替换、缺失或插入的CDR-L2；和/或
(f)具有SEQ ID NO:6氨基酸序列，或者SEQ ID NO:6氨基酸序列中有一个或多个氨基酸替换、缺失或插入的CDR-L3。
特别地，实施例中的数据显示，根据本发明的抗体分子通过VH结构域外缘(outskirt)上的残基与TACE Dis-Cys结构域相互作用，并通过VL结构域中的选定的残基与催化结构域相互作用。这进一步意味着，该抗体分子优先包含CDR-H1,CDR-H3,CDR-L1和CDR-L3。
如实施例中所示，本发明的抗体分子可以耐受CDR序列中的多个氨基酸改变，而仍然保持亲本抗体的性能。作为实例，与SEQ ID NO:1-6中任一个相比，抗体分子每一个CDR的氨基酸序列均可以包含1,2,3,4,5,6,7,8,9或10个氨基酸替换、缺失或插入。如实施例中的实验所支持的，CDR中的如下氨基酸残基优选得到保留，即它们不会是任何氨基酸替换、缺失或插入的对象：
CDR-H1:SH31和YH32；和/或
CDR-H2:SH52,SH56和YH58
CDR-H3:PH98,YH100,TH100B和WH100D
CDR-L1:QL27,SL28,IL29和YL32
CDR-L2:HL49和DL50
CDR-L3:SL91,FL92和IL94
其中残基的编号根据Kabat编号。如本领域众所周知地，CDR可以存在于多种不同的抗体类型或框架区中，任选地涉及一种或多种其他的序列改变，以确保保持如本文公开的抗体的有用性质。
VH和VL结构域分别典型地包含三个负责抗原结合的补体决定区(CDR)，它们中间被框架区隔开。在一个示例实施方案中，本发明提供的抗体分子包含如下的VH结构域，其包含分别具有SEQ ID NO:1,2和3序列的CDR-H1,CDR-H2和CDR-H3，和/或如下的VL结构域，其包含分别具有SEQ ID NO:4,5和6序列的CDR-L1,CDR-L2和CDR-L3。
优选地，抗体分子包括与SEQ ID NO:7的氨基酸序列有至少80%，更优选地90%，更优选地至少95%氨基酸同一性的VH结构域，和/或与SEQ IDNO:9的氨基酸序列有至少80%，更优选地90%，更优选地至少95%氨基酸同一性的VL结构域。
本发明还提供了一种IgG形式的抗体分子，其包含如SEQ ID NO:15中的氨基酸20起往后所示的重链氨基酸序列，以及如SEQ ID NO:16中的氨基酸21起往后所示的轻链氨基酸序列。
本发明还提供了一种Fab形式的抗体分子，其包括如SEQ ID No:11所示的重链氨基酸序列和如SEQ ID NO:12所示的轻链氨基酸序列。
一般地，本发明涉及能够抑制TACE生物活性的抗体分子，即本领域技术人员所理解的拮抗剂抗体分子。作为实例，这包括能够抑制TACE剪切底物活性的抗体分子，无论是天然存在的底物，例如在细胞表面上存在的底物，还是在体外剪切测定中的合成底物，例如发荧光底物甲氧香豆素基乙基-Lys-Pro-Leu-Gly-Leu-二硝基苯二氨基丙酰基-Ala-Arg-NH2。在一个典型实验中，TACE或其生物活性片段在可以发生底物剪切的条件下与底物接触。然后可以添加抗体分子，确定它们是否能够抑制TACE对底物的剪切。用于实施体外测定的条件实例在下面的实施例中提供。在下面实施例中描述了一种基于细胞的脱落测定，并使用Willems等(2010)描述的测定法。
关于TACE抑制的水平，还可能使用上面描述的测定对其进行定量。例如，本发明抗体分子对TACE的抑制可以和已知的TACE抑制剂，例如蛋白N-TIMP-3(登录号AAB34532)，例如全长或成熟N-TIMP-3，进行比较。优选地，在相同的测定条件下，本发明的抗体分子抑制TACE的能力比N-TIMP-3高至少2倍，更优选地高至少5倍。
并且/或者，本发明的抗体分子可以具有一种或多种其他的性质，例如提高它们与TACE相互作用的亲和力或特异性的性质。例如，成熟ADAM胞外域含有一个球状金属蛋白酶催化结构域、一个二硫键依赖的解联蛋白-富含半胱氨酸(Dis-Cys)结构域，和在一些情况下，一个表皮生长因子(EGF)样结构域(图6(A))。尽管大多数ADAM催化结构域似乎共享同源的结构拓扑学，但是在非催化的Dis-Cys结构域中普遍具有显著的序列变异（特别是在“超变”区(HVR)中(13)）。因此，优选地，本发明的抗体分子对完整TACE胞外域(即催化结构域和Dis-Cys结构域)相比于对分离的催化结构域具有亲和力偏好，从而有助于避免和具有相似的催化结构域的近缘ADAM家族蛋白发生交叉反应。优选地，相比于对，对完整的胞外域的亲和力偏好较之分离的催化结构域为至少2倍，更优选至少5倍，最优选至少10倍。抗体分子的亲和力偏好可以在本领域技术人员众所周知的竞争实验中加以确定。
抗-TACE抗体分子的结合动力学和亲和力(表示为平衡解离常数Kd)可以用标准技术加以确定，例如表面等离子体共振，例如使用BIAcore测定。
抗TACE抗体分子对TACE的解离常数可以小于50nM，小于40nM，小于30nM，小于20nM，小于10nM，或小于1nM。例如，抗体分子对TACE的亲和力可以为1-20nM,例如9-15nM。优选地，本发明抗体分子的亲和力常数(KD)小于10nM，更优选地小于5nM，最优选地小于2nM。结合TACE或TACE胞外域和/或TACE催化结构域的亲和力常数可以用本领域众所周知的技术加以确定，例如Biacore SPR分析，如下面实验实施例中举例说明的。
抗TACE抗体分子可以包括任何包含抗体抗原结合位点的多肽或蛋白，其，包括Fab，Fab2，Fab3，scFv，双抗体(diabody)，三抗体(triabody)，四抗体(tetrabody)，迷你抗体(minobody)，和单结构域抗体，以及任何同种型或亚类的完全抗体。抗体分子和用于构建和使用它们的方法在例如Holliger&Hudson,Nature Biotechnology23(9):1126-1136(2005)中有描述。
在一些优选实施方案中，抗TACE抗体分子可以是完整抗体(wholeantibody)。例如IgG,IgA,IgE或IgM或任何同种型亚类，特别是IgG1和IgG4。抗TACE抗体分子可以是单克隆抗体。抗TACE抗体分子可以是嵌合、人源化或人抗体。
本文中所述的抗TACE抗体分子可以是分离的，即没有污染物，例如能够结合其它多肽和/或血清组分的抗体。对于大部分目的而言单克隆抗体均是优选的，尽管也可以采用多克隆抗体。
用于产生抗TACE抗体分子的方法包括用蛋白或其片段免疫哺乳动物(例如小鼠、大鼠、家兔、马、山羊、绵羊或猴)。抗体可以用各种本领域已知的任何技术从被免疫动物获得，并进行筛选，优选地使用抗体与兴趣抗原的结合。例如，可以使用Western印迹技术或免疫沉淀(Armitage et al.,1992,Nature357:80-82)。从动物分离抗体和/或产抗体细胞可以伴随处死动物的步骤。
作为用肽免疫动物的替代或补充，可以从重组产生的表达免疫球蛋白可变域的文库(例如使用在其表面上展示功能性免疫球蛋白结合域的λ噬菌体或丝状噬菌体产生的)获得特异针对某种蛋白的抗体。文库可以是幼稚的，即是从未经任何所述蛋白(或片段)免疫过的生物体获得的序列构建的，或者可以是用从曾暴露于感兴趣的抗原的生物体获得的序列构建的。
在本发明中，实施例所述方法可以用于筛选具有拮抗性质的抗TACE抗体的其他实例。在产生和/或分离之后，可以对抗TACE抗体分子的生物活性进行测试。例如，可以确定抗体抑制TACE底物切割的能力。
抗体分子通常包含抗原结合结构域，其包含免疫球蛋白重链可变区(VH)和免疫球蛋白轻链可变区(VL)，尽管抗原结合区也可能仅包含重链可变区(VH)（例如骆驼源或鲨鱼抗体）。这些抗体均包含在本发明的范围内。
抗体分子之间的竞争可以在体外容易地进行测定，例如使用ELISA和/或在抗体分子上标记特异性报告分子，其能够在一种或多种其它非标记抗体分子的存在下被检测，从而能够鉴定结合相同表位或重叠表位的抗体分子。这些方法对于本领域普通技术人员而言是容易知晓的。
衍生化抗体分子
本发明的抗体分子可加以衍生化以改变其性质，尤其是其药理性质。一个实例是抗体分子与聚(亚烷基二醇)分子偶联，特别是聚乙二醇(PEG)分子，其可以用于提高多肽治疗的半衰期或其它药理性质。PEG化是用于修饰治疗多肽，例如肽、蛋白质和抗体，性质的已知策略。一般地，将PEG分子附着于多肽用于改变其构象、等电点或疏水性质，并可以提高其生物和药理性质，例如提高药物溶解性，减少剂量频率，调节(特别是提高)循环半衰期，增加药物稳定性，和增强对蛋白水解的耐受。PEG化通过将多肽与一个或多个PEG聚合物分子偶联增加治疗多肽的分子量发挥作用。这特别可用于完整抗体片段(例如Fab片段)的抗体分子类型。
这可以通过使抗体分子中存在的合适功能基团与反应性聚（亚烷基二醇）分子反应，从而对本发明的抗体分子实施该方法。根据本发明抗体分子中可得的功能基团，有可能以选择性的方式将抗体分子PEG化，例如通过鉴定抗体分子中合适的反应性半胱氨酸残基。聚（亚烷基二醇）分子在本领域可以和聚（烷基氧化物）分子互换使用，并且是聚酯。聚（亚烷基二醇）分子可以具有线性、分支、梳状或星形结构，并且一般是高度水溶性的。此外，基本聚（亚烷基二醇）结构可以被提供一个或多个反应性功能基团，例如羟基、氨基、羧酸、卤代烷基或硫醇，以方便聚（亚烷基二醇）分子与其它物质例如多肽的反应。优选的聚（亚烷基二醇）分子包括在一个或多个羟基位置被化学基团(例如具有1-4个碳原子的烷基)取代的分子。根据本发明使用的优选的聚（亚烷基二醇）分子是聚乙二醇("PEG")分子，尽管本领域技术人员能够用其它聚（亚烷基二醇）分子，例如聚丙二醇或聚乙烯-聚丙烯二醇共聚物，对本发明的抗体分子进行衍生化。聚（亚烷基二醇）分子(包括PEG)的分子量通常为大约400Da-大约80kDa，更优选地大约1kDa-大约60kDa，更优选地大约5kDa-大约50kDa，例如分子量为10kDa,20kDa,30kDa或40kDa。可以本发明使用的聚（亚烷基二醇）分子是本领域众所周知的，并可通过公共渠道获得，例如从商业来源如SigmaAldrich获得。
成像应用
本发明的抗体分子可以额外地加以标记，以使它们能够与其他治疗应用联合或独立地用于成像。用于标记抗体的技术是本领域众所周知的，能够使抗体用于多种成像或光谱学应用。这可能在许多不同的医学和研究应用中有用，例如在癌症、心血管医学或移植物排斥领域。
使用抗体分子成像的一个具体实例涉及使用核医学成像技术中的放射性核素标记，例如单光子发射型计算机体层摄影术(SPECT)，一种检测从放射性核素发射的γ射线以便产生样品或对象体内放射性核素分布的二维图像的成像技术，和正电子成像术(PET)，这是一种检测从被引入到样品或对象体内的发射正电子的放射性核酸间接发射的γ射线对产生三维图像的成像技术。具有放射性核素标记的抗体分子还可用于组合了成像技术的多模态研究，或者通过选择在超过一种成像技术中活跃的放射性核素或者通过用超过一种类型的标签标记抗体分子来进行。
本发明的抗体分子可以用放射性核素标记，放射性核素例如作为络合物提供的，或者与第二分子，例如能够与标签关联的接头偶联。用于成像技术或治疗的放射性核酸的实例包括锝、铼、铜、钴、镓和铟同位素如Tc-99m,Re-186,Re-188,Co-57,Ga-67,In-111(SPECT),Cu-64,Cu-60,Cu-61,Cu-62,Cu-67,Tc-94m,Ga-68,Co-55(PET)。一般地，使用锝同位素用于成像目的，铼同位素用于治疗目的，铜同位素同时用于成像和治疗。
医学用途
TACE已被报道具有多种底物，包括许多与癌症相关联的底物(见Murphy,2008,表1)。结果，使用本发明抗体治疗性抑制TACE可以是一种靶定TACE介导的病症和疾病，例如癌症、免疫相关疾病或银屑病，的有用方法。具体地，本发明的抗体分子可用于治疗脑癌、乳腺癌、结肠癌、胃癌、肾细胞癌、肝癌、肺癌、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌和结肠癌，或免疫相关的疾病如类风湿性关节炎。
在一些实施方案中，本发明的抗体分子可以和化疗剂或放射疗法联合施用。额外化疗剂的实例包括EGFR通路抑制剂，例如抗EGFR抗体或EGFR激酶抑制剂如西妥昔单抗(cetuximab)、帕尼单抗(panitumumab)、易瑞沙(Iressa)(吉非替尼(gefitinib)或(N-(3-氯-4-氟-苯基)-7-甲氧基-6-(3-吗啉-4-基丙氧基)喹唑啉-4-胺)(N-(3-chloro-4-fluoro-phenyl)-7-methoxy-
6-(3-morpholin-4-ylpropoxy)quinazolin-4-amine)、或特罗凯(Tarceva)(埃罗替尼(erlitonib)或N-(3-乙炔基苯基)-6,7-双(2-甲氧基乙氧基)]喹唑啉-4-胺(N-(3-ethynylphenyl)-6,7-bis(2-methoxyethoxy)quinazolin-4-amine))，或其它试剂例如HerceptinTM(曲妥珠单抗(trastuzumab))。进一步的化疗剂实例包括烷化剂，例如顺铂、卡铂和奥沙利铂、蒽环类、植物生物碱如紫杉烷类和长春花生物碱，和拓扑异构酶抑制剂如伊立替康、拓扑替康、安吖啶、足叶乙甙、磷酸依托泊苷、替尼泊苷，或氟尿嘧啶（5FU）。
另一种可能性是，本发明的抗体分子可以是抗体-药物缀合物，其中抗体分子与药物或毒素连接。可以这样做以将药物或毒素定位到生物系统中存在TACE的靶位点。该方法可以包括工程改造抗体分子，以提供能够与药物或毒素反应的功能基团，或者，使抗体分子具有能够与药物或毒素反应的接头基团。在本发明的这个方面中，药物还可以是前药，用于在患者体内的靶位点处转变成活性药。
关于TACE和底物/疾病联系的药物开发努力见Moss2008综述(PM18414459)。
在大多数比较肿瘤与正常组织(oncomine)的研究中，已知TACE被过表达。TACE已被报道在多种癌症中过表达，包括脑癌、乳腺癌、结肠癌、胃癌、肾癌、肝癌、肺癌、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌和结直肠癌(Murphy,2008,表2)。这意味着，这些病症可以潜在地用本发明的抗体分子治疗。此外，TACE的底物已经与癌症相关联，并且包括HB-EGF,双调蛋白,调蛋白,TNFα,TGFα,notch,MICA和MICB。然而，应当注意，本发明的抗体分子还可以用于如下情况，其中TACE仅以“正常的”生理水平表达，取决于TACE在该疾病发生中的作用。进一步，本发明的抗体分子还可以通过抑制机体内除疾病组织和细胞之外的细胞和组织中TACE的功能来实现治疗用途，所述细胞和组织中TACE活性可以导致配体释放，后者进而作用于癌细胞。一个这样的实例是基质细胞，其可以在肿瘤中发现，但是自身不是“癌”细胞。
HB-EGF–(Yotsumoto2010PM20499311),TACE配体HB-EGF是用于治疗乳腺癌的靶标，并潜在克服对曲妥珠单抗的耐受。
双调蛋白–Kenny2007显示TGFα和AREG在癌细胞中被下调，并且这可以克服恶性表型。Willmarth2008,PM18437539,综述了AREG作为乳腺癌的靶标。
在不依赖雄激素的前列腺癌中还与AREG,HB-EGF,TGFα的过表达相关联(Torring2000,PM10769639)。
TGFα–Kenny2007，同样地Borrell-Pages2003(PM12606576)，TACE是释放TGFα必需的，并且TGFα释放是激活EGFR必需的。
调蛋白–在NSCLC中通过Her3受体参与自分泌环。RNAi实验显示，调蛋白的释放受到TACE的驱动(Zhou2006,PM16843264)。
MICA和MICB–这些是自然杀伤系统受体如NKG2D的配体，并可能是TACE的底物。由于TACE活性导致肿瘤细胞表面上缺失这些免疫刺激分子，可能有助于它们逃逸自然杀伤细胞介导的抗肿瘤活性(Waldhauer2008PM18676862)。
因为TACE能够控制EGF家族配体的释放，已经有人提出，TACE抑制策略可能可以和EGFR通路的抑制剂如EGFR抗体(例如西妥昔单抗、潘尼单抗)和EGFR激酶抑制剂(例如易瑞沙、特罗凯)联合使用。
Merchant2008(PM18281553)证明，TACE抑制与EGFR通路抑制剂在结肠癌细胞系(HCA-7)中具有协同作用。
RankL(也称作TRANCE)是另一种受TACE调节的配体。见PM10224132，其公开了RANKL脱落受到TACE的调节的证据，PM20166980提供了靶定RANKL的一般性综述，并可用于多发性骨髓瘤，和PM19714603，其描述了在多发性骨髓瘤中测试针对RANKL的疗法(denosumab)的具体实例。
巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)受体是另一种受TACE调节的配体(PM19762488)。
TACE抑制还可以和其它受ErbB驱动的肿瘤的抑制剂联合使用。例如，已经有报道，TGFα能够阻碍赫赛汀(曲妥珠单抗)下调Her2的能力，并且抑制TACE能够减少TGFα，并与赫赛汀治疗具有协同作用(Valabrega2005,PM15735715)。
此外，后来人们描述了TACE的这样一种作用，其中TACE的诱导与化疗耐受/放疗耐受有关，并且抑制TACE可以用于和化疗和放疗联合使用(Kyula2010PM20570921)。
TACE活性的调节可能在炎症疾病，例如关节炎，中是重要的，其中TACE靶蛋白如TNFα,L-选择素和可溶IL6受体与疾病密切联系，并且抑制TACE活性可能在治疗上是有用的(Moss2008综述,PM18414459)TACE作为RA的一个靶标。
抑制TACE还被提出作为治疗卒中(Lovering2005,PM15857301)和糖尿病(Serino2007,PM17646208)的一种治疗策略。
在气道炎症模型中抑制TACE已知是治疗基于炎症或变应性的疾病(如哮喘)的一种策略(Trifilief et al2002,PM11934805)。
药物组合物
本发明的抗TACE抗体分子可以和药学可接受的赋形剂一起包含在药物组合物中。
药学可接受的赋形剂可以是加入药物组合物中的化合物或化合物组合，其不会引起副反应，并且方便例如抗TACE抗体分子的施用、增加其在机体内的半衰期和/或效力，或者提高其在溶液中的溶解性。这些药学可接受的媒介是众所周知的，并可以由本领域的技术人员根据抗TACE抗体分子的给药方式进行适应性修改。
在一些实施方案中，抗TACE抗体分子可以用冻干的形式提供，在给药前重新构建。例如，冻干的抗体分子可以在无菌水中重新构建，并在施用给个体之前与盐溶液混合。
抗TACE抗体分子通常以药物组合物的形式施用，其除了抗体分子之外还包含至少一种组分。因此，除了抗TACE抗体分子之外，药物组合物可以包括药学可接受的赋形剂、载体、缓冲液、稳定剂或其它本领域技术人员已知的材料。这些材料应当是无毒的，并且不应干扰抗TACE抗体分子的效力。载体或其它材料的确切性质取决于给药的途径，其可以是药丸、灌注、注射或其它合适的途径，如下面讨论的。
对于静脉内给药，或者通过注射，包含抗TACE抗体分子的药物组合物可以处于非肠道可接受的水溶液形式，其没有热原并具有合适的pH、等渗性和稳定性。本领域相关的技术人员能够使用例如等渗媒介制备合适的溶液，例如氯化钠注射液、林格氏液注射液、乳酸林格氏注射液。防腐剂、稳定剂、缓冲剂、抗氧化剂和/或添加剂可以根据需要使用，包括缓冲剂如磷酸盐、柠檬酸盐和其它有机酸；抗氧化剂如抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(如十八烷基二甲基苄基氯化铵；六烃季铵氯化物；苯扎氯铵；苄索氯铵；苯酚，丁基或苄醇；烷基对羟基苯甲酸酯类，如甲基或羟基苯甲酸丙酯；邻苯二酚；间苯二酚；环己醇；3’-戊醇；和间甲酚)；低分子量多肽；蛋白质如血清白蛋白、凝胶或免疫球蛋白；亲水聚合物如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸、或赖氨酸；单糖，双糖和其他碳水化合物包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，如EDTA；糖，如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；成盐的反离子，如钠；金属配合物（例如锌蛋白复合物）；和/或非离子表面活性剂，如TWEENTM、PLURONICSTM或聚乙二醇（PEG）。
包含抗TACE抗体分子的药物组合物可以单独施用或者与其它治疗联合施用，同时或顺次，取决于所治疗的疾病。
本文中所述的抗TACE抗体分子可以用于人或动物的治疗，包括预防性治疗(在个体中发生疾病之前的治疗，用于降低该个体中疾病发生的危险；延迟其发生；或在发生后降低其严重性)。治疗方法可以包括向有需要的个体施用抗TACE抗体分子。
给药通常以足以对患者显示益处的“治疗有效量”给药。这些益处可以是至少减缓至少一种症状。实际的给药量、给药速度和时间周期取决于所治疗疾病的特性和严重程度，所治疗的特殊哺乳动物，个体患者的临床条件，疾病的原因，输送组合物的位置，给药方法，给药时间表和医疗从业人员已知的其它因素。治疗的处方，例如诊断决定等，是一般从业者和其它医生的责任范围，并可以取决于症状的严重性和/或所治疗疾病的进程。合适的抗体分子剂量是本领域众所周知的(Ledermann J.A.et al.(1991)Int.J.Cancer47:659-664;Bagshawe K.D.et al.(1991)Antibody,Immunoconjugates andRadiopharmaceuticals4:915-922)。对于所用药物类型而言合适的具体剂量可以在本文中指出或者在Physician's Desk Reference(2003)中指出。治疗有效量或合适剂量的抗体分子可以通过比较其体外活性和在动物模型体内的活性加以确定。将小鼠和其它实验动物中的有效剂量换算成人的剂量的方法是已知的。确切剂量取决于多种因素，包括抗体是用于预防还是用于治疗，所处理区域的大小和位置，抗体确切性质(例如完全抗体、片段)和附着在抗体上的任何可检测标签或其它分子的性质。
典型的抗体剂量范围，对于系统应用是100μg-1g，对于局部应用是1μg-1mg。可以施用最初较高的负荷剂量，随后是一次或多次较低的剂量。通常，抗体是完全抗体，例如IgG1或IgG4同种型。这是成年患者单次治疗的剂量，其可以对孩童和婴儿按比例调整，还可以根据分子量的比例对其它抗体形式进行调整。治疗可以每天重复1次、每周2次、每周1次、每月1次，取决于医生的判断。治疗可以每2-4周皮下施用1次，和每4-8周静脉内施用1次。治疗可以是周期性的，给药之间的周期为大约2周或更长，例如大约3周或更长，大约4周或更长，或者大约每月1次。治疗可以在手术之前和/或之后施用，和/或可以直接施用或应用于手术治疗或侵入性操作的解剖位置处。合适的剂型和给药途径如上所述。
在一些优选实施方案中，抗TACE抗体分子的治疗效果可以持续数个半衰期，这取决于剂量。例如，抗TACE抗体分子单次剂量的治疗效果可以在个体内持续1个月或更长时间，2个月或更长时间，3个月或更长时间，4个月或更长时间，5个月或更长时间，或者6个月或更长时间。
材料和方法
重组人TACE成熟的重组TACE胞外域(Arg215-Arg651)在杆状病毒感染的sf9细胞中表达，并如Milla et al.(28)所述地进行纯化。TACE的成熟催化结构域(Arg215-Val477-GlySer-His6)使用相同的杆状病毒系统制备，并使用固定化金属亲和色谱(IMAC)纯化。
选择抑制性抗TACE胞外域人ScFv抗体重组人TACE胞外域(Arg215-Arg651)用N-琥珀酰亚胺生物素(Invitrogen AL-01)以1:1的比例生物素化，并在淬灭荧光肽剪切测定(见下文)中检查野生型活性，并在50μM CT1746(24)存在下暴露于McCafferty(23)的人scFv噬菌体展示文库。经过两轮溶液相筛选之后，将洗脱的单克隆scFv群体克隆到pSANG10-3F(29)中并转化到BL21(DE3)RIPL大肠杆菌(Stratagene230280)中。从大肠杆菌周质分离各个scFv克隆，并在没有CT1746的条件下进行针对固定化重组TACE胞外域的ELISA筛选。详尽的筛选细节在先前已有描述(19,23)。在初始筛选之后，在500mL自诱导(30)摇瓶培养物中表达14个单独的抗TACE scFv克隆，并通过IMAC纯化周质级分。对纯化的scFv，在淬灭荧光肽测定(见下文)中筛选其对重组TACE的抑制，和在PMA刺激的HB-EGF碱性磷酸酶测定(见下文)中筛选其对细胞表面TACE的抑制。
淬灭荧光肽剪切测定在50mM Tris-HCl,10mM CaCl2,0.05%Brij35,1%DMSO,pH7.4中将重组人TACE催化结构域和TACE胞外域稀释到1nM，并在室温下与滴定浓度的抑制剂预温育4小时。温育后，将每个反应分到96孔黑色Microwell平板(Nunc237105)的200μL技术四分组(technicalquadruplet)中，并向每个孔添加发荧光底物甲氧香豆素基乙基-Lys-Pro-Leu-Gly-Leu-二硝基苯二氨基丙酰基-Ala-Arg-NH2(PeptidesInternational SMO-3670-PI)(终浓度=1μM)。在Tecan Infinite-200中，每隔30秒在320nm激发荧光，并在405nm记录发光(37℃，2000秒)。将各个读数相对仅有底物的对照进行标准化，并汇总以产生每个变体的平均趋势。用GraphPad Prism计算每个反应的线性回归斜率(ΔFU sec-1)，将蛋白水解活性表示为未处理对照的斜率百分比(%ΔFU sec-1)。最终的结果代表三次独立实验的平均值。
ScFv D1VL-交换将TACE抑制性scFv D1的VH结构域克隆到由McCafferty开发的天然人轻链(λ和κ)噬菌体展示文库中，并对所得的文库(下文称作D1-VH-新-VL文库)的随机克隆进行PCR筛选，评估VH插入率(全部scFv的86%)。将滴定浓度(0.01nM,0.1nM,1nM和10nM)的1:1生物素化TACE胞外域(无CT1746)暴露于D1-VH-新-VL文库进行两轮溶液相筛选。此外，针对固定在链亲和素包被的免疫管(Immuno-Tubes)(Nunc444202)上的生物素化TACE胞外域进行相同的滴定筛选(固相筛选)。经过两次选择各两轮之后，将洗脱的单克隆scFv群体单独克隆到pSANG10-3F中，并转化到大肠杆菌BL21(DE3)中。从大肠杆菌周质总共分离了超过1,000个单独的scFv克隆，并针对固定化的重组TACE进行ELISA选择。从全部10个选择中，将最好的24个克隆单独表达在50mL自诱导摇瓶培养物中，并通过IMAC(Satorius VS-MCMINI24)纯化周质级分。对滴定浓度的所有成熟scFvs(包括原始D1scFv)针对100nM TACE胞外域和催化结构域进行ELISA筛选，以鉴定双结合物(dual binder)。
互补位丙氨酸扫描诱变通过同源建模(26)鉴定D1(A12)互补位残基，并使用定点突变(Stratagene200521)产生各个丙氨酸突变体。将纯化的重组scFv进行8-点荧光计量滴定(8-point fluorometric titration)([TACE]=1nM)(如上)和16-点滴定ELISA([TACE]=500nM)。用GraphPad Prism计算D1(A12)(WT)和每种丙氨酸突变体(Ala)的IC50和EC50值。使用如下公式计算吉布斯自由能变化(ΔΔG)：ΔΔG=+RTln(Ala/WT)。
重组D1(A12)人FAb的表达将D1(A12)的VH和VL结构域克隆到基于pET22b(+)的新型人FAb表达载体中(分别在人CH1和CL-κ的上游)。在5L台式发酵罐中将转化的BL21(DE3)RIPL大肠杆菌培养到OD600>40，用10mM IPTG诱导，再经过4小时后收集。通过渗压休克分离周质级分，通过蛋白G亲和色谱(GE17-0404-01)纯化人FAb。
表面等离子体共振(SPR)使用胺、醛或生物素偶联将TACE固定在Biacore SPR芯片上会使蛋白快速变性(仅暴露线性表位)。这可以解释为什么没有使用TACE的SPR实验报道。为了避免这个问题，将是单价D1(A12)FAb或N-TIMP-3均用胺偶联到CM5芯片(GE Healthcare)(～200响应单位(RU))上，并注射滴定浓度的TACE。结果代表每个浓度变体三个减去空白的技术重复的平均值。所有实验均在Biacore T100(GE Healthcare)上实施，在37℃下，流速为40μL/sec。结合常数用Biacore T100Evaluation Software软件计算(1:1结合模型;Rmax<200RU;tc>1x108;Chi2<0.5RU2）。
重组D1(A12)人IgG1的表达将D1(A12)的VH和VL结构域克隆到新型pBudCE4.1(Invitrogen V532-20)人IgG1表达载体中(κ-变异体)，并使用Fugene6(Roche11988387001)转染到HEK-293细胞中。稳定转染的HEK-293群体在10层HYPERFlasks(Corning10030)中生长至最大汇合，通过蛋白-L亲和色谱(Pierce89929)从条件培养基中纯化人IgG1。用Melon凝胶技术(Pierce45206)除去痕量的牛血清蛋白，并将最终的D1(A12)人IgG1的缓冲液交换为无菌PBS。
TNF-α切割测定将重组人TACE与滴定浓度的D1(A12)FAb(稀释于50mM Tris-HCl,10mM CaCl2,0.05%Brij35,1%DMSO,pH7.4中)合并，并立即添加到5μM GST-TNF-α(31)。每个反应在37℃下温育，用12%SDS-PAGE分离，考马斯蓝染色，并通过密度测定(ImageQuant TL(GE Healthcare))定量各个条带。
TACE细胞表面脱落测定对于所有的脱落测定，将4x104个细胞/孔(置于300μL培养基中)接种在48孔板中36个小时，用无血清培养基清洗3次，并与D1(A12)人IgG1,N-TIMP-3或对照人血浆IgG(R&D Systems1-001-A)(在无血清培养基中稀释)预温育1小时。每个孔用100μg/mL12-豆蔻酸-13-乙酸佛波醇(PMA)刺激，并在1小时后收集上清。通过夹心式ELISA(R&DSystem Duoset)定量可溶的TNF-α,TGF-α和双调蛋白，HG-EGF碱性磷酸酶的测定如Willems et al(2010)所述。
结果
抗TACE胞外域抑制性人抗体的分离尽管大多数TACE药物发现项目均集中在抑制分离的催化结构域的蛋白水解活性上，但是本发明人有目的地选择拮抗完整的胞外域(即催化结构域和Dis-Cys结构域)。根据最近的结构研究进展和先前的生化观察，发明人提出如下假说：选择性靶定完整TACE胞外域的非催化区会产生更特异的细胞表面抑制剂。为此，将重组人TACE胞外域生物素化，检查野生型活性，并暴露于幼稚的人scFv抗体噬菌体展示文库(23)进行两轮溶液相选择。因为先前直接靶定金属蛋白酶催化位点的尝试会导致非期望的交叉反应(例如TIMPs,前结构域和SMI)，我们在最初选择期间用广谱金属蛋白酶抑制剂CT1746(24)阻断了TACE催化裂口(图1(B))。因此，所得的TACE胞外域抗原不会选择这样的抗体：其针对的表位依赖于催化位点深处的残基。经过ELISA筛选(图7(A))之后，对随后的阳性scFv克隆进行测序以排除重复，在大肠杆菌中表达并亲和纯化(固定化金属亲和色谱(IMAC))，用于功能表征。尽管根据阻碍TACE淬灭荧光(QF)肽蛋白水解的能力鉴定了数个抑制性抗体(图7(C))，但是当针对HB-EGF的细胞表面脱落进行测试时，只有scFv D1仍保持该抑制性谱(图7(D))。详尽的QF肽分析显示，scFv D1抑制TACE胞外域的强度(IC50=5.4(±0.4)nM)与天然TACE氨基酸结构域抑制剂TIMP-3,N-TIMP-3(IC50=3.2(±0.2)nM)相似(图2(A))。然而，与N-TIMP-3不同，scFv D1不结合TACE的分离催化结构域(图2(B))。我们先前已经显示，蛋白二硫键异构酶(PDI)能够改变TACE Dis-Cys结构域的三维拓扑结构(19)。与Dis-Cys结合scFv D3的方式相似，TACE胞外域的PDI调变会严重干扰scFv D1免疫反应性(图2(C))。同时考虑到缺少对分离催化结构域的结合，这个观察结果提示，scFv D1主要结合非催化的TACE Dis-Cys结构域。单个scFv D1补体决定区(CDR)环的丙氨酸扫描诱变显示，scFv D1的可变重链(VH)残基主要负责TACE胞外域结合。相反，可变轻链(VL)的CDR环似乎对活性D1互补位没有显著贡献(图2(D))。尽管有保守的互补位，scFv D1似乎完全选择针对人TACE(图8)。总之，我们得出结论，scFv D1是一种选择性的VH依赖的抑制性抗体，其主要结合非催化的TACE Dis-Cys结构域。
通过VL交换引入催化结构域因为scFv D1通过其VH结构域与非催化区结合，但与催化位点足够接近以至于能够阻断小肽水解，所以我们认为，当前没有被讨论的VL结构域非常靠近TACE催化结构域。而且，我们进一步假设，非功能的D1VL-CDR可以被工程化引入TACE催化结构域结合。为了探究这一观点，将D1-VH结构域克隆到幼稚的(naive)人VL噬菌体展示文库中，并将最终的“D1-VH-新-VL文库”针对滴定浓度的生物素化TACE胞外域进行严格的再选择。因为D1-VH通过Dis-Cys结合已经是完全的TACE选择性(图8)，所以我们从全部D1-VH-新-VL选择中除去CT1746，以提供可以不受干扰地接近TACE催化位点的新-VL结构域。所得的筛选方案有利于全部D1-VH-新-VL scFv保持TACE选择性(通过D1-VH与胞外域Dis-Cys区结合)，同时使新-VL结构域暴露于先前不可接近的催化裂口表位(由于不存在小分子拮抗剂)(图1(B))。
经过两轮液相和固相选择后，对超过1000个D1-VH-新-VL scFv再次筛选TACE胞外域结合。分离出最好的30个克隆，测序除去重复，将它们在大肠杆菌中单独表达并亲和纯化。然后对D1-VH-新-VL前导scFv ELISA筛选它们同时结合完整TACE胞外域和分离的催化结构域的能力(图3(A))。如预期地，在不存在CT1746的条件下严格选择针对TACE的新-VL链产生了多个D1-VH-新-VL scFv变异体，它们能够独立地结合分离的TACE催化结构域和完整的胞外域。前导scFv“A12”(下文称作D1(A12))对两种抗原具有最高的亲和力，并被用于进一步的分析。
D1(A12)–TACE相互作用的动力学表征先前的筛选ELISA提示，D1-VH-新-VL克隆D1(A12)可以同时独立地结合TACE胞外域和分离的催化结构域。此外，与亲本scFv D1相比，D1(A12)对TACE Dis-Cys结构域的PDI调变高度耐受(图3(B))。总之，这些结果提示，D1(A12)表位含有来自TACE的催化结构域的残基以及Dis-Cys结构域的残基。为了表征两种相互作用的动力学，将D1(A12)重新构建成单价人FAb，胺偶联于CM5Biacore芯片，并注射滴定浓度的TACE胞外域或分离的催化结构域。表面等离子体共振(SPR)显示，D1(A12)对完整TACE胞外域的亲和常数(KD)为461(±65)pM，但对分离的催化结构域仅为5,210(±102)pM(ΔKD=KD Cat/KD Ecto=11.3)(图3(C))。尽管N-TIMP-3的深催化裂口焦点支持与分离的TACE催化结构域的良好结合(KD Cat=211(±32)pM)，但是在额外存在非催化TACE Dis-Cys结构域时，与完整胞外域的结合被严重干扰(KD Ecto=7,221(±84)pM)(DKD=KD Cat/KD Ecto=0.03)。通过反向滴定ELISA也观察到了相当的>10倍的EC50差异(图3(D))(ΔEC50=EC50 Cat/EC50 Ecto=12.1)。因此D1(A12)是第一种对完整的胞外域显示出相比于分离的催化结构域的亲和性偏好的ADAM抑制剂。这种亲和性亲和性的差异与D1(A12)表位的通过“两步”噬菌体展示筛选产生的多结构域的性质相关联。
D1(A12)互补位扫描诱变D1(A12)是一种抑制性TACE人抗体，对完整胞外域的亲和性比对分离的催化结构域有>10倍的亲和性偏好。因为最初的D1scFv不与TACE催化结构域反应，但通过VL-交换可有效引入催化结构域结合，所以我们提出假设，原始D1-VH内的残基与TACE Dis-Cys相互作用，且新-A12-VL内的残基与催化结构域相互作用。为了详尽地表征该D1(A12)互补位，将延伸超过β-碳(extending beyond theβ-carbon)的所有残基均单独突变成丙氨酸(n=30)，在大肠杆菌中表达，并亲和纯化。为每种突变体的溶液相QF肽计算针对完整TACE胞外域(IC50 Ecto)和分离的催化结构域(IC50 Cat)的IC50(n=60)。此外，同时使用相同的程序计算“野生型”D1(A12)scFv针对TACE胞外域(IC50 Ecto:WT=0.89(±0.04)nM)和催化结构域(IC50 Cat:WT=2.3(±0.09)nM)的IC50(IC50 WT)。随后为每种突变体和抗原计算吉布斯自由能变化(ΔΔG)(ΔΔG=+RTln(IC50 Ala/IC50 WT))(图4(A))。与scFv D1的CDR突变(图2(D))一致，许多D1(A12)VH残基对IC50 Ecto:WT有贡献。有趣的是，CDR-H1残基SH31和YH32，和CDR-H2残基SH52(Kabat编号)似乎仅对IC50 Ecto:WT有贡献，而对获得IC50 Cat:WT几乎完全不必要。相反，CDR-L1残基QL27,SL28和IL29,和CDR-L3残基SL91和FL92仅似乎对IC50 Cat:WT有贡献，而对获得IC50 Ecto:WT几乎完全不必要。为了与该溶液相分析对应，对所有互补位突变体也计算了固相ELISA EC50ΔΔG值(图4(B))。尽管它们的方法学完全不同，但是溶液相和固相D1(A12)互补位ΔΔG分布却相当相似(胞外域相关性=0.86±0.05;R2=0.91)(催化结构域相关性=0.82±0.06;R2=0.86)。这种一致性提示，D1(A12)结合是TACE抑制的一个直接代替(directproxy)。重要的是，VH残基SH31,YH32,和SH52重复了其偏好胞外域的行为，而VL残基QL27,SL28,IL29,SL91和FL92则继续对分离的催化结构域结合起贡献。
当作图到D1(A12)Fv罗塞塔抗体模型(Rosseta antibody model)上时(26)，显示任一抗原偏倚性的残基聚集在互补位的极性末端。此外，CDR-H3代表互补位核心内的一个双重重要性中间区域。总之，这些数据强烈提示，D1(A12)藉由VH结构域的外缘(outskirt)上的残基与TACE Dis-Cys结构域相互作用，并且藉由VL结构域内的选定残基与催化结构域排他性地相互作用。
D1(A12)与TIMP-3共享一个表位已知外源金属蛋白酶抑制剂TIMP-3紧密对接在分离的TACE催化结构域的催化裂口内。不幸的是，TIMP-3还结合许多金属蛋白酶的催化位点，因此限制了其作为靶向治疗剂的用处。因为D1(A12)部分结合TACE催化结构域，我们假设，它可能与TIMP-3共享一个重叠的表位。为了研究这个观点，将TACE胞外域固定在免疫吸收板(immunosorp plate)上，封闭表面，每个孔用滴定浓度的单价D1(A12)人FAb或对照人血浆IgG温育。随后用N-TIMP-3探测显示，D1(A12)FAb剂量依赖地干扰N-TIMP-3结合TACE胞外域(图9(A))。通过反转D1(A12)和N-TIMP-3的方向观察到了相似的行为(图9(B))。两种方法均指示，D1(A12)和N-TIMP-3以1:1的主探针:TACE胞外域摩尔比干扰结合。尽管它们具有实质上不同的结合动力学，但是我们认为，D1(A12)与内源TACE抑制剂TIMP-3至少共享部分表位。
D1(A12)强烈抑制完整TACE胞外域通过使用两步抗体噬菌体展示探究ADAM多结构域拓扑学，我们工程化了第一个对完整胞外域的亲和性比对分离的催化结构域的亲和性显著更高的ADAM拮抗剂。因为该方法的最终目的是开发优秀的TACE抑制剂，我们对将这种提高的胞外域亲和性转化为抑制潜力进行了表征。这是本领域中首次报道一种针对TACE的拮抗性抗体，尽管TACE的克隆已经在WO96/041624中公开。
单价D1(A12)FAb证明能够抑制大分子GST-TNF-α底物被TACE胞外域和分离的催化结构域蛋白水解(图5(A))。与先前的亲和数据相关联，D1(A12)FAb对TACE胞外域活性的抑制比对分离的催化结构域活性的抑制更强烈(IC50 Ecto=73.9(±3.2)nM;IC50 Cat=124.7(±6.2)nM)。而且，在全面的QF肽分析中，D1(A12)FAb仍保持这一强烈的抑制能力(图5(B))。D1(A12)FAb抑制分离的TACE催化结构域的能力与天然的前导TACE抑制剂N-TIMP-3相似(ΔIC50=IC50 Cat:N-TIMP-3/IC50 Cat:D1(A12)=1.35)。然而，当用完整TACE胞外域实施相同的测定时，D1(A12)比N-TIMP-3好>5倍(ΔIC50=IC50 Ecto:N-TIMP-3/IC50 Ecto:D1(A12)=5.75)。
因为抑制完整TACE胞外域的理由是产生一种优秀的细胞表面TACE抑制剂，D1(A12)被重新构建成人IgG1，并在多个基于癌细胞的脱落测定中与N-TIMP-3进行比较(图5(C))。在4种人癌细胞系上研究了D1(A12)IgG1对4种不同TACE配体的脱落的影响。有趣的是，D1(A12)和N-TIMP-3的QF-肽TACE胞外域抑制分布在所有四种细胞表面脱落测定中几乎相同地重现。无论底物、细胞系或TACE表达水平，D1(A12)人IgG1抑制细胞表面TACE活性的能力一律比N-TIMP-3高5倍。用单价D1(A12)FAb获得了相似的抑制谱(图9)——提示每个IgG只有一个可变结构域结合细胞表面TACE。ELISA、QF肽和细胞表面脱落测定还确认了D1(A12)特异性靶定TACE，而不靶定与之紧密相关的蛋白酶(图10)。由于只有TACE胞外域存在于细胞表面，所以这些数据综合起来证明了特异性靶定完整TACE胞外域的拮抗价值。
表S1.D1(A12)IC50数据.(A)来自图9(B)的IC50值。(B)来自图9的IC50值。此外，描述了来自TNFR1α脱落的结果。全部±代表SD。
Figure BDA0000390194030000271
Figure BDA0000390194030000281
抗TACE抗体D1(A12)使KrasWT和KrasMT CRC细胞对化疗敏感测试抗TACE抗体D1(12)，确定其在与5-氟尿嘧啶联合使用时使5种结直肠癌(CRC)细胞系对化疗敏感的效果。将LoVo,H630,Dks-8,HKH-2,和HCT-116人CRC细胞系保持在DMEM中，并用指示浓度的5-氟尿嘧啶和抗TACE Ab D1(12)处理。所有培养基均添加10%FCS,50μg/mL青霉素-链霉素,2mmol/L L-谷氨酰胺和1mmol/L丙酮酸钠(Invitrogen)。所有细胞均在37℃5%CO2的湿润气氛中生长。细胞活力通过四唑染料[3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐,Sigma]测定加以评估。细胞以2,000-4,000细胞/孔接种在96孔板中。细胞用递增浓度的5-氟尿嘧啶与指示剂量的D1(A12)抗体一起处理72h。处理后，细胞用1×PBS清洗一次，并用含有3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐的培养基在37℃温育3h。除去含有3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐的培养基，将甲月替(formazan)晶体重新溶解在200μL DMSO(Sigma)中。细胞活性通过用酶标仪(MolecularDevices)测量570nm吸光度加以确定。IC50的计算使用Prism软件包。每个数值是至少三次独立实验的代表。
图16显示，本发明抗TACE抗体对TACE的抑制导致与化疗剂如5-FU协同杀死所测试的结直肠癌细胞系中的每一种。这证实了基于组合使用本发明的抗TACE抗体和其它化疗剂的方法的有效性。
抗TACE抗体在体内消除结直肠异种移植物(H630)生长用14天时间建立H630异种移植物，然后在6周的时期内每周一次腹膜内注射对照(仅PBS)或指示浓度的D1(A12)抗TACE抗体进行处理，并监测肿瘤生长。每组由8只动物组成。雌性BALB/c重症联合免疫缺陷小鼠被保持在无菌和可控环境条件下(22℃,50±10%相对湿度,12-h/12-h白天/黑夜循环,高压灭菌垫料)，自由饮食饮水。经过14天隔离期之后，将小鼠纳入我们的实验方案。实验的实施符合动物法(科学程序)(Animals(Scientific Procedures)Act),1986的规定。为了确定肿瘤体积，使用数字Vernier卡尺测量肿瘤的两个轴。肿瘤体积用如下的公式计算：(最长肿瘤直径)×(最短肿瘤直径)2。H630异种移植物小鼠模型通过用Matrigel(BD Biosciences)皮下接种2×106个细胞至侧腹来建立。让肿瘤生长至达到～200mm3(第14天)，此时第一组通过腹膜内注射接受安慰剂(PBS)，其余组接受每周注射指示剂量的D1(A12)抗体。每个处理组包含8只动物。肿瘤用卡尺在二维尺度每周测量三次。统计显著性用非配对双尾Student's t检验进行分析。
如图17所示，用本发明抗TACE抗体如D1(12)抑制TACE可抑制H630结直肠癌肿瘤异种移植物的生长。这证明，本发明的抗体可以在体内有效地用作治疗剂。
结直肠癌异种移植物中潜在TACE底物的血浆水平用14天时间建立H630异种移植物，然后在6周的时期内每周一次腹膜内注射对照(仅PBS)或指示浓度的D1(A12)抗TACE抗体进行处理，并监测肿瘤生长。每组包含8只动物。处死之后收集血浆用于分析TACE底物水平。通过夹心式ELISA(R&D System Duoset)定量可溶TNF-α,TGF-α,双调蛋白和sIL6-R，如Willems等(2010)所述测量HG-EGF碱性磷酸酶。
如图18所示，用本发明抗TACE抗体如D1(12)抑制TACE可降低H630结直肠癌肿瘤异种移植物中数种TACE底物的水平。这证明该抗体在体内具有活性，因此支持其作为治疗剂的用途。
抗TACE抗体在IGROV1卵巢癌异种移植物模型中的作用我们检测了每周腹膜内注射10mg/kg D1(A12)对IGROV1-Luc异种移植物的作用，并与10mg/kg英夫利昔单抗和PBS溶媒进行比较。第一次剂量在第4天施用，之后每7天给予剂量，直至终点，即肿瘤负荷达到最大允许程度时。通过生物发光测量肿瘤生长。对雌性Balb/c裸鼠腹膜内5x106个IGROV1-Luc细胞，每天观察肿瘤生长和临床指征。当肿瘤负荷开始造成临床体征例如活动减少时，定义为终点。
每周一次通过生物发光成像定量肿瘤负荷。每个组的肿瘤特异性生长速度(SGR)用如下的已公开公式加以计算：SGR=ln(V2/V1)/T2-t1，其中V1是治疗前第4天(t1)的初始平均体积，V2是终点(t2)时的最终平均肿瘤体积。肿瘤加倍时间(DT)（以日计）=ln(2)/SGR。作为对这些数据的进一步分析，用Graphpad PRISM的实验曲线拟合函数计算每只小鼠的肿瘤生长速度，然后比较每组的平均k(速度常数)。治疗和溶媒组之间的显著性用t检验计算。
处死动物后收集血浆用于分析TACE底物水平。用R&D Systems Duoset试剂盒:人TNF-α(TNFSF1A,cat.No.DY210),人可溶TNFR1-α(TNFRSF1A,cat.No.DY225),人TGF-α(cat.No.DY239),和人双调蛋白(AREG)(cat.No.DY262)对TACE底物进行ELISA分析。DY210试剂盒被确认针对人TNF-α是特异性的，因为用该试剂盒测试重组小鼠TNF-α显示没有交叉反应性。
图20显示，抑制TACE(使用我们的D1(12)抗体)还导致IGROV1卵巢癌异种移植物模型中数种TACE底物的水平降低。这证明该抗体在体内具有活性，因此支持作为治疗剂的用途。数据还显示，用我们的D1(A12)抗体处理的组中肿瘤生长降低(见图19)。
抗TACE抗体在裸鼠中的药代动力学抗TACE抗体的药代动力学(PK)在不携带肿瘤的小鼠中以单次10mg/kg剂量i.p.进行研究。图21显示了单次剂量10mg/kg i.p.的结果，每个时间点N=2或更多只小鼠。误差线代表平均值的标准误差。PK参数的计算使用WinNonLin非房室分析程序：血浆Cmax=523+/-58nM,Tmax2天,半衰期8.6天。这与人IgG在小鼠血浆中半衰期的公开数值一致。
序列表
SEQ ID NO:1:CDR-H1氨基酸序列(来自D1(A12))
CAASGFTFSSYAMS
SEQ ID NO:2:CDR-H2氨基酸序列(来自D1(A12))
AISGSGGSTYYADSVKG
SEQ ID NO:3:CDR-H3氨基酸序列(来自D1(A12))
CVKDFGPGYGTGWFDY
SEQ ID NO:4:CDR-L1氨基酸序列(来自D1(A12))
CRASQSISSYLN
SEQ ID NO:5:CDR-L2氨基酸序列(来自D1(A12))
IHDASSLQSGV
SEQ ID NO:6:CDR-L3氨基酸序列(来自D1(A12))
CQQSFSIPLTFGG
SEQ ID NO:7:VH结构域氨基酸序列(来自D1(A12)scFv)
EVQLVESGGGLVRPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNTKNSLYLQMTSLRADDTAFYYCVKDFGPGYGTGWFDYWGPGTLVTVSA
SEQ ID NO:8:VH结构域氨基酸序列(来自D1(A12)scFv)
GAAGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACGGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTTAGCAGCTATGCCATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCTCAGCTATTAGTGGTAGTGGTGGTAGCACATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCAGAGACAACACCAAGAACTCCCTGTATCTGCAAATGACGAGTCTGAGAGCTGACGACACGGCCTTTTATTACTGTGTAAAAGATTTCGGACCCGGTTATGGCACTGGCTGGTTTGACTACTGGGGCCCGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCGCA
SEQ ID NO:9:VL结构域氨基酸序列(来自D1(A12)scFv)
SDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIHDASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSFSIPLTFGGGTKMDIKR
SEQ ID NO:10:VL结构域氨基酸序列(来自D1(A12)scFv)
AGCGACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCCGGGCAAGTCAGAGCATTAGCAGCTATTTAAATTGGTATCAGCAGAAGCCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCCATGATGCATCCAGTTTGCAAAGTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCAACTTACTACTGTCAACAGAGTTTCAGTATTCCCCTCACTTTCGGCGGAGGGACCAAAATGGATATCAAACGT
SEQ ID NO:11:D1(A12)氨基酸序列,FAb形式,重链
EVQLVESGGGLVRPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNTKNSLYLQMTSLRADDTAFYYCVKDFGPGYGTGWFDYWGPGTLVTVSAASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSC
SEQ ID NO:12:D1(A12)氨基酸序列,FAb形式,轻链
SDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIHDASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSFSIPLTFGGGTKMDIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
SEQ ID NO:13:D1(A12)核酸序列,FAb形式,重链
GAAGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACGGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTC CTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTTAGCAGCTATGCCATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAG GGGCTGGAGTGGGTCTCAGCTATTAGTGGTAGTGGTGGTAGCACATACTACGCAGACTCCGTGAAG GGCCGGTTCACCATCTCCAGAGACAACACCAAGAACTCCCTGTATCTGCAAATGACGAGTCTGAGA GCTGACGACACGGCCTTTTATTACTGTGTAAAAGATTTCGGACCCGGTTATGGCACTGGCTGGTTTG ACTACTGGGGCCCGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCGCAGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGT
下划线文本=可变域,正常文本=恒定域.
SEQ ID NO:14:D1(A12)核酸序列,FAb形式,轻链
AGCGACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACC ATCACTTGCCGGGCAAGTCAGAGCATTAGCAGCTATTTAAATTGGTATCAGCAGAAGCCAGGGAAA GCCCCTAAGCTCCTGATCCATGATGCATCCAGTTTGCAAAGTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCA GTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCAACTTACTA CTGTCAACAGAGTTTCAGTATTCCCCTCACTTTCGGCGGAGGGACCAAAATGGATATCAAACGTACTGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGT
下划线文本=可变域,正常文本=恒定域
SEQ ID NO:15和16:D1(A12)氨基酸序列,IgG1形式,重链和轻链
SEQ ID NO:15–重链(前导肽用下划线标示):
MDWTWRVFCLLAVAPGAHSEVQLVESGGGLVRPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNTKNSLYLQMTSLRADDTAFYYCVKDFGPGYGTGWFDYWGPGTLVTVSAASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO:16–轻链(前导肽用下划线标示):
MAWTPLWLTLFTLCIGSVVSSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIHDASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSFSIPLTFGGGTKMDIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
SEQ ID NO:17和18:D1(A12)核酸序列,IgG形式.
SEQ ID NO:17-重链(前导肽用下划线标示):
ATGGACTGGACCTGGAGGGTCTTCTGCTTGCTGGCTGTAGCACCAGGTGCCCACTCCGAAGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACGGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTTAGCAGCTATGCCATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCTCAGCTATTAGTGGTAGTGGTGGTAGCACATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCAGAGACAACACCAAGAACTCCCTGTATCTGCAAATGACGAGTCTGAGAGCTGACGACACGGCCTTTTATTACTGTGTAAAAGATTTCGGACCCGGTTATGGCACTGGCTGGTTTGACTACTGGGGCCCGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCGCAGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTATAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAA
SEQ ID NO:18-轻链(前导肽用下划线标示):
ATGGCCTGGACCCCTCTCTGGCTCACTCTCTTCACTCTTTGCATAGGTTCTGTGGTTTCTAGCGACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCCGGGCAAGTCAGAGCATTAGCAGCTATTTAAATTGGTATCAGCAGAAGCCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCCATGATGCATCCAGTTTGCAAAGTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCAACTTACTACTGTCAACAGAGTTTCAGTATTCCCCTCACTTTCGGCGGAGGGACCAAAATGGATATCAAACGTACTGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGT
SEQ ID NO:19:TACE氨基酸序列.
信号序列–氨基酸1-17(斜体)
前结构域–氨基酸18-214(下划线)
催化结构域–氨基酸215-477
Dis-Cys–氨基酸478-671(斜体)
跨膜结构域–氨基酸672-694(下划线)
胞内域–氨基酸695-824
在实施例的实验中使用的TACE片段(Arg215-Arg651)位于SEQ ID NO:19中以粗体文本显示的R残基之间并包含这些R残基。
MRQSLLFLTSVVPFVLAPRPPDDPGFGPHQRLEKLDSLLSDYDILSLSNIQQHSVRKRDLQTSTHVET LLTFSALKRHFKLYLTSSTERFSQNFKVVVVDGKNESEYTVKWQDFFTGHVVGEPDSRVLAHIRDDDVII RINTDGAEYNIEPLWRFVNDTKDKRMLVYKSEDIKNVSRLQSPKVCGYLKVDNEELLPKGLVDREPPEE LVHRVKRRADPDPMKNTCKLLVVADHRFYRYMGRGEESTTTNYLIELIDRVDDIYRNTSWDNAGFKGYGIQIEQIRILKSPQEVKPGEKHYNMAKSYPNEEKDAWDVKMLLEQFSFDIAEEASKVCLAHLFTYQDFDMGTLGLAYVGSPRANSHGGVCPKAYYSPVGKKNIYLNSGLTSTKNYGKTILTKEADLVTTHELGHNFGAEHDPDGLAECAPNEDQGGKYVMYPIAVSGDHENNKMFSNCSKQSIYKTIESKAQECFQERSNKVCGNSRVDEGEECDPGIMYLNNDTCCNSDCTLKEGVQCSDRNSPCCKNCQFETAQKKCQEAINATCKGVSYCTGNSSECPPPGNAEDDTVCLDLGKCKDGKCIPFCEREQQLESCACNETDNSCKVCCRDLSGRCVPYVDAEQKNLFLRKGKPCTVGFCDMNGKCEKRVQDVIERFWDFIDQLSINTFGKFLADNIVGSVLVFSLIFWIPFSILVHCVDKKLDKQYESLSLFHPSNVEMLSSMDSASVRIIKPFPAPQTPGRLQPAPVIPSAPAAPKLDHQRMDTIQEDPSTDSHMDEDGFEKDPFPNSSTAAKSFEDLTDHPVTRSEKAASFKLQRQNRVDSKETEC
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本文中引用在本专利说明书中提到的所有文献的全部内容作为参考。
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Martin et al.,BMC Biotechnology6:46,2006.

Claims (37)

1.一种分离的抗体分子，其特异性结合TNF-α转化酶(TACE)并抑制TACE的生物活性。
2.权利要求1的抗体分子，其中所述抗体通过与TACE的催化结构域和Dis-Cys结构域二者结合来抑制TACE的生物活性。
3.权利要求1或2的抗体分子，其中抗体分子能够抑制TACE对底物的切割。
4.权利要求3的抗体分子，其中切割是在体外底物切割测定中确定的，并且所述底物是合成底物。
5.权利要求3的抗体分子，其中切割是在基于细胞的脱落测定中确定的，并且所述底物附接于细胞表面。
6.前述任一权利要求的抗体分子，其中在相同的测定条件下，所述抗体分子是比N-TIMP-3至少强2倍的TACE抑制剂。
7.前述任一权利要求的抗体分子，其中抗体分子对完整TACE胞外域相比于对分离的催化结构域有至少2倍的亲和性偏好。
8.前述任一权利要求的抗体分子，其能够结合如下的TACE多肽，所述TACE多肽包括与SEQ ID NO:19所示的氨基酸215-651具有至少80%序列同一性的多肽。
9.前述任一权利要求的抗体分子，其中所述抗体分子包含具有SEQ IDNO:1的氨基酸序列、或者具有SEQ ID NO:1中替换、缺失或插入一个或多个氨基酸的氨基酸序列的CDR-H1。
10.前述任一权利要求的抗体分子，其中所述抗体分子包含具有SEQ IDNO:2的氨基酸序列、或者具有SEQ ID NO:2中替换、缺失或插入一个或多个氨基酸的氨基酸序列的CDR-H2。
11.前述任一权利要求的抗体分子，其中所述抗体分子包含具有SEQ IDNO:3的氨基酸序列、或者具有SEQ ID NO:3中替换、缺失或插入一个或多个氨基酸的氨基酸序列的CDR-H3。
12.前述任一权利要求的抗体分子，其中所述抗体分子包含具有SEQ IDNO:4的氨基酸序列、或者具有SEQ ID NO:4中替换、缺失或插入一个或多个氨基酸的氨基酸序列的CDR-L1。
13.前述任一权利要求的抗体分子，其中所述抗体分子包含具有SEQ IDNO:5的氨基酸序列、或者具有SEQ ID NO:5中替换、缺失或插入一个或多个氨基酸的氨基酸序列的CDR-L2。
14.前述任一权利要求的抗体分子，其中所述抗体分子包含具有SEQ IDNO:6的氨基酸序列、或者具有SEQ ID NO:6中替换、缺失或插入一个或多个氨基酸的氨基酸序列的CDR-L3。
15.权利要求9-14中任一项的抗体分子，其中所述抗体分子的CDR的氨基酸序列与SEQ ID NO:1-6中任一个相比包含1,2,3,4,5,6,7,8,9或10个氨基酸替换、缺失或插入。
16.权利要求9-14中任一项的抗体分子，其中所述抗体分子的CDR的序列中的氨基酸替换、缺失或插入保留如下的氨基酸残基：
CDR-H1:SH31和YH32
CDR-H2:SH52,SH56和YH58
CDR-H3:PH98,YH100,TH100B和WH100D
CDR-L1:QL27,SL28,IL29和YL32
CDR-L2:HL49和DL50
CDR-L3:SL91,FL92和IL94
其中残基根据Kabat编号进行编号。
17.根据前述任一权利要求的抗体分子，包含：VH域，其包含分别具有SEQ ID NO:1,2和3的序列的CDR-H1,CDR-H2和CDR-H3；和/或VL域，其包含分别具有SEQ ID NO:4,5和6的序列的CDR-L1,CDR-L2和CDR-L3。
18.权利要求17的抗体分子，包含：VH域，其与SEQ ID NO:7的氨基酸序列具有至少90%的氨基酸序列同一性，和/或VL域，其与SEQ ID NO:9的氨基酸序列具有至少90%的氨基酸序列同一性。
19.前述任一权利要求的抗体分子，其中所述抗体分子是完全抗体、Fab片段、F(ab')2片段、scFv、双抗体或三抗体。
20.前述任一权利要求的抗体分子，其中所述抗体分子是人抗体、人源化抗体、双特异性抗体或嵌合抗体。
21.根据权利要求1-18中任一项的抗体分子，其是完整抗体。
22.一种药物组合物，其包含根据权利要求1-21中任一项的抗体分子和药学可接受的赋形剂。
23.根据权利要求1-21中任一项的抗体分子，供在治疗人或动物体的方法中使用。
24.根据权利要求1-21中任一项的抗体分子，供在治疗TACE介导的病症的方法中使用。
25.根据权利要求1-21中任一项的抗体分子制造用于治疗TACE介导的病症的药物中的用途。
26.一种治疗患有TACE介导的病症的个体的方法，包括向有该需要的个体施用根据权利要求1-21中任一项的抗体分子。
27.权利要求23-26中任一项的用于治疗方法的抗体、用途或方法，其中所述TACE介导的病症是癌症、免疫相关疾病、银屑病或基于炎症或变应性的疾病例如哮喘。
28.根据权利要求27的用于治疗方法的抗体、用途或方法，其中所述癌症是脑癌、乳腺癌、结肠癌、胃癌、肾癌、肝癌、肺癌、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌或结直肠癌。
29.根据权利要求27的用于治疗方法的抗体、用途或方法，其中所述免疫相关疾病是类风湿性关节炎。
30.根据权利要求23-29中任一项的用于治疗方法的抗体、用途或方法，其中抗体与化疗剂联合施用，或与放疗联合施用。
31.根据权利要求30的用于治疗方法的抗体、用途或方法，其中所述化疗剂是烷化剂例如顺铂、卡铂和奥克赛铂，蒽环类抗生素，植物生物碱例如紫杉烷类和长春花生物碱，拓扑异构酶抑制剂例如伊立替康、拓扑替康、安吖啶、依托泊苷、磷酸依托泊苷和替尼泊苷，或氟尿嘧啶(5FU)。
32.根据权利要求30的用于治疗方法的抗体、用途或方法，其中所述抗体与EGFR通路抑制剂联合施用。
33.根据权利要求32的用于治疗方法的抗体、用途或方法，其中所述EGFR通路抑制剂是抗EGFR抗体或EGFR激酶抑制剂。
34.根据权利要求33的用于治疗方法的抗体、用途或方法，其中所述EGFR通路抑制剂是西妥昔单抗、帕尼单抗、易瑞沙(吉非替尼或(N(3-氯-4-氟-苯基)-7-甲氧基-6-(3-吗啉-4-基丙氧基)-喹唑啉-4-胺)，或特罗凯(埃罗替尼或N-(3-乙炔基苯基)-6,7-双(2-甲氧基乙氧基)喹唑啉-4-胺)。
35.根据权利要求30的用于治疗方法的抗体、用途或方法，其中抗体与曲妥珠单抗联合施用。
36.一种用于产生特异性结合ADAM家族金属蛋白酶的抗体分子的方法，其中所述抗体能够通过结合所述金属蛋白酶的催化结构域和Dis-Cys结构域二者来抑制该ADAM家族金属蛋白酶的蛋白酶活性，该方法包括：
(a)鉴定包含可变重链结构域的抗体，所述可变重链结构域能够结合包含所述催化结构域和所述Dis-Cys结构域的金属蛋白酶多肽，其中所述催化结构域结合于ADAM家族金属蛋白酶的抑制剂；
(b)鉴定包含可变轻链结构域的抗体，所述可变轻链结构域能够结合所述ADAM家族金属蛋白酶的分离的催化结构域；和
(c)产生包含步骤(a)中鉴定的可变重链结构域和步骤(b)中鉴定的可变轻链结构域的抗体分子。
37.权利要求36的方法，其中ADAM家族金属蛋白酶是TNF-α转化酶(TACE)。
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