CN103483429B - VirB蛋白的核心结构域及其编码基因和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了VirB蛋白的核心结构域及其编码基因和应用。本发明提供了VirB core片段或具有所述VirB core片段的融合蛋白；所述VirB core片段为如下（a）或（b）：（a）由序列表中序列1自N末端第22至143位氨基酸残基组成的蛋白质；（b）将（a）经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有与DNA结合的活性的由其衍生的蛋白质。本发明还保护所述VirB core片段或所述融合蛋白在制备用于结合DNA的产品中的应用、在制备用于识别DNA的产品中的应用。本发明提供了VirB蛋白的核心结构域，并在分子水平上揭示了VirB蛋白的工作原理，将为结构导向性药物设计提供精确和全方位的结构生物学信息。

Description

VirB蛋白的核心结构域及其编码基因和应用
技术领域
本发明涉及VirB蛋白的核心结构域及其编码基因和应用。
背景技术
志贺氏菌属（Shigella）又称痢疾杆菌，是一种具有高度传染性和严重危害的革兰氏阴性兼性厌氧杆菌。据WHO2009年统计世界有1亿左右人患病，死亡人数达到100万。其中大约99%的病例发生在发展中国家。在一些卫生条件和水源差的地方更容易大规模发生肠道疾病。
痢疾杆菌可导致传染性极强的细菌性痢疾。福氏痢疾杆菌可在10-100个细菌接种量下引发疾病。细菌性痢疾在我国及其他发展中国家广泛流行，依旧是全世界范围内公众卫生的首要威胁之一。细菌性痢疾每年造成数十万人死亡，尤其对儿童的威胁最大。痢疾杆菌主要通过入侵小肠上皮细胞并释放细菌毒素引发疾病。痢疾杆菌能粘附于肠道的上皮细胞表面，继而在一系列侵袭蛋白协助下穿入小肠上皮细胞。痢疾杆菌分泌的内毒素可引起发热，神志障碍，甚至中毒性休克。福氏痢疾杆菌是引起细菌性痢疾的主要病原体之一。我国流行的痢疾杆菌优势株为福氏2a301株。2002年，我国科学家在率先破译了福氏痢疾杆菌的基因组全序列，成为我国首个自主完成的微生物基因组计划。痢疾杆菌基因组的破译为进行痢疾致病机制、毒力基因进化、耐药性机理，疫苗和药物等多方面的研究提供论文重要的遗传学背景资料。福氏痢疾杆菌的基因组研究揭示了其侵袭性和毒力来源于该菌所特有的约230kb的侵袭性大质粒。一系列毒力及侵袭性相关基因集中排列于侵袭性大质粒上约31kb的“entry region”，聚集了一大批通过水平转移获得的毒力。这些毒力基因包括了三类：（1）ipa类基因，编码了各种外毒素，可导致巨噬细胞凋亡及肠道上皮细胞的破坏；（2）mxi基因和spa基因等编码了一个巨大而复杂的III型分泌系统，由数十种不同蛋白组成，是各种外毒素进行分泌的蛋白质分子机械；（3）icsA,icsB及virA基因产物参与致病菌进行细胞到细胞传播的过程。由此可见，痢疾杆菌对肠道上皮细胞的侵袭需要进行多种蛋白的大量物合成，对细菌的代谢过程造成很大的负担。因此，痢疾杆菌侵袭肠道上皮细胞的激活过程显然需要严格的控制。只有在特定的环境信号的刺激下（如中性的pH值和生理温度等），侵袭过程才能够启动。在环境温度不适宜的条件下，痢疾毒力基因的转录受到染色体编码的H-NS蛋白的抑制。H-NS蛋白属于痢疾杆菌全局的转录负调控因子。HN-S可结合启动子上游A+T富集DNA区段但并不识别特异DNA碱基序列。当细菌检测到适宜的环境信号，如生理温度（37℃）和生理pH（7.4），位于毒力大质粒的virF基因被激活，其蛋白产物VirF蛋白继而激活virB基因的表达。VirB蛋白可解除H-NS介导的转录抑制，从而激活大质粒上其他毒力基因的转录和表达，引发痢疾杆菌的侵袭。
VirB基因编码一个较小的碱性蛋白（35kDa）。其氨基酸序列同源比对分析表明VirB蛋白与所有已知的转录调控因子具有很小的同源性，但与质粒分割蛋白ParB，SopB蛋白具有明显的同源性。然而，质粒分割蛋白和转录调控因子在生物学功能上截然不同，VirB蛋白并不参与质粒分割过程，VirB蛋白是如何完成毒力基因的转录激活成为了科学界多年研究的热点。
发明内容
本发明的目的是提供VirB蛋白的核心结构域及其编码基因和应用。
本发明提供了VirB core片段或具有所述VirB core片段的融合蛋白；所述VirBcore片段为如下（a）或（b）：（a）由序列表中序列1自N末端第22至143位氨基酸残基组成的蛋白质；（b）将（a）经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有与DNA结合的活性的由其衍生的蛋白质。
所述融合蛋白可为如下（c）或（d）：（c）由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；（d）将（c）经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有与DNA结合的活性的由其衍生的蛋白质。
编码所述VirB core片段的基因也属于本发明的保护范围。所述基因可为如下（1）或（2）或（3）或（4）所述的DNA分子：（1）序列表的序列2自5’末端第64至429位核苷酸所示的DNA分子；（2）序列表的序列2自5’末端第64至432位核苷酸所示的DNA分子；（3）在严格条件下与（1）或（2）限定的DNA序列杂交且编码具有与DNA结合的活性的蛋白的DNA分子；（4）与（1）或（2）限定的DNA序列至少具有90%以上同源性且编码具有与DNA结合的活性的蛋白的DNA分子。上述严格条件可为在6×SSC，0.5%SDS的溶液中，在65℃下杂交，然后用2×SSC、0.1%SDS和1×SSC、0.1%SDS各洗膜一次。
编码所述融合蛋白的基因也属于本发明的保护范围。所述基因可为如下（5）或（6）或（7）或（8）所述的DNA分子：（5）序列表的序列2自5’末端第1至429位核苷酸所示的DNA分子；（6）序列表的序列2所示的DNA分子；（7）在严格条件下与（5）或（6）限定的DNA序列杂交且编码具有与DNA结合的活性的蛋白的DNA分子；（8）与（5）或（6）限定的DNA序列至少具有90%以上同源性且编码具有与DNA结合的活性的蛋白的DNA分子。上述严格条件可为在6×SSC，0.5%SDS的溶液中，在65℃下杂交，然后用2×SSC、0.1%SDS和1×SSC、0.1%SDS各洗膜一次。
含有编码所述VirB core片段的基因的表达盒、重组载体、转基因细胞系或重组菌均属于本发明的保护范围。
含有编码所述融合蛋白的基因的表达盒、重组载体、转基因细胞系或重组菌均属于本发明的保护范围。
本发明还保护所述VirB core片段或所述融合蛋白在制备用于结合DNA的产品中的应用。所述DNA具体可为实施例4的步骤一中的三种双链DNA分子。
本发明还保护一种用于结合DNA的产品，其活性成分为所述VirB core片段或所述融合蛋白。所述DNA具体可为实施例4的步骤一中的三种双链DNA分子。
本发明还保护所述VirB core片段或所述融合蛋白在制备用于识别DNA的产品中的应用。所述DNA具体可为实施例4的步骤一中的三种双链DNA分子。
本发明还保护一种用于识别DNA的产品，其活性成分为所述VirB core片段或所述融合蛋白。所述DNA具体可为实施例4的步骤一中的三种双链DNA分子。
实施例4的步骤一中的三种双链DNA分子为单链DNA分子icsB-for-26和单链DNA分子icsB-rev-26组成的双链DNA分子icsB，单链DNA分子micsB-for-26和单链DNA分子micsB-rev-26组成的双链DNA分子micsB或单链DNA分子A-for-26和单链DNA分子A-rev-26组成的双链DNA分子A。
icsB-for-26：5’-AAA CTCGTTTCATCATGAAATCCCAC-3’；
icsB-rev-26：3’-GAGCAAAGTAGTACTTTAGGGTG TTT-5’。
micsB-for-26：5’-AAA CTCGTTTCATCGCTGGGCCCCAC-3’；
micsB-rev-26：3’-GAGCAAAGTAGCGACCCGGGGTG TTT-5’。
A-for-26：5’-AAA AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA-3’；
A-rev-26：3’-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT TTT TTT-5’。
在细菌性痢疾的广泛流行过程中，痢疾杆菌已经出现了耐药性。然而目前尚缺乏疫苗和药物设计的新思路。VirB是激活痢疾杆菌毒力的关键转录调控因子，因此该蛋白可能成为理想的药物设计的靶位。VirB蛋白识别DNA的分子基础不明，严重制约的这一重要的转录调控蛋白的工作原理以及毒力蛋白激活的分子机制的研究进展。因此，解析VirB蛋白与DNA复合物的晶体结构将有助于解决这一科学问题，基于晶体结构的药物筛选和药物设计将有助于开发和应用治疗细菌性腹泻的药物。本发明提供了VirB蛋白的核心结构域，并在分子水平上揭示了VirB蛋白的工作原理，将为结构导向性药物设计提供精确和全方位的结构生物学信息。
附图说明
图1为分子筛层析图谱。
图2为VirB core片段溶液的SDS-PAGE电泳图。
图3为硒代VirB core/BrU-icsB晶体的Rikagu衍射结果。
图4为天然VirB core/icsB晶体与VirB core/BrU-icsB晶体的晶体结构照片。
图5为天然VirB core/icsB晶体的晶格排列方式。
图6为VirB Core与icsB复合物的结构。
图7为显示VirB Core蛋白结合Box2模序的图片。
图8为天然VirB core/icsB晶体中，显示HTH模序与DNA磷酸骨架结合的图片。
图9为天然VirB core/icsB晶体中，高分辨率清晰的定位出的52个核苷酸。
图10为大沟和小沟宽度的变化。
图11为实施例4中的电泳图。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
本发明的发明人基于大量实验和验证工作，发现了VirB蛋白的核心结构域及其编码基因以及它们的特性。VirB蛋白的核心结构域又称VirB core片段或VirB core蛋白，如序列表的序列1自N末端第22至143位氨基酸残基所示。VirB蛋白的核心结构域的编码基因，又称VirB core基因，如序列表的序列2自5’末端第64至429位核苷酸所示。
质粒pET-28a(+)：Novagen:69864-3。大肠杆菌Rosseta：Novagen:71402-4。
实施例1、VirB core片段的制备
一、重组质粒的构建
将序列表的序列2自5’末端第64至429位核苷酸所示的双链DNA分子插入质粒pET-28a(+)的Nde1和Xhol酶切位点之间，得到重组质粒pET28a-VirB core。重组质粒pET28a-VirB core中，外源基因与质粒pET-28a(+)中的部分核苷酸形成序列表的序列2所示的融合基因，表达序列表的序列1所示的融合蛋白（序列1中，自N末端第5至10位氨基酸残基组成His标签，第22至143位氨基酸残基组成VirB core片段）
二、VirB core片段的制备
1、将步骤一得到的重组质粒pET28a-VirB core导入大肠杆菌Rosseta的感受态细胞，得到重组菌。
2、将步骤1得到的重组菌的单克隆接种至20ml含50mg/L卡那霉素和50mg/L氯霉素的LB液体培养基，37℃、220rpm振荡培养过夜。
3、取20ml步骤2得到的菌液，以1：50的体积比接种至1L含50mg/L卡那霉素和50mg/L氯霉素的LB液体培养基，37℃、180rpm培养至OD600nm=1.2后放置冰上；冰上放置半小时后加入IPTG并使其浓度为0.5mmol/L，18℃、180rpm振荡培养12小时。
4、取完成步骤3的培养体系，4000rpm离心15min，收集菌体，用100ml高盐裂解液（溶剂为pH7.5、50mM的Tris-HCl缓冲液，含2M NaCl、12mM咪唑、0.1%β-巯基乙醇和1mM PMSF)重悬，然后在冰上进行超声波破碎（功率600W，作用5s，间隔5s，99次），然后15000rpm离心30min，取上清液，用0.45μm滤膜过滤并收集滤液。
5、将步骤4得到的滤液上样于镍柱，先用10倍柱体积的除杂液（溶剂为水，含150mMNaCl、50mM Tris、12mM咪唑，pH7.5）洗脱以去除杂蛋白，再用洗脱液(溶剂为水，含75mM NaCl、50mM Tris、250mM咪唑、0.1%β-巯基乙醇，pH7.5)洗脱以收集目的蛋白，取过柱后的洗脱液，用0.45μm滤膜过滤并收集滤液。
6、将步骤5得到的滤液上样并进行阳离子交换层析。
阳离子交换层析采用Hitrap SP HP层析柱，柱子型号为1.6×2.5cm；用洗脱液（溶剂为pH7.0、50mM的tris缓冲液，含1M NaCl）进行洗脱(5,)，流速为1.5ml/min，收集保留体积为54mL-88mL之间的过柱后洗脱液。
7、取步骤6得到的过柱后洗脱液，采用截留分子量为10KD的超滤浓缩管进行超滤浓缩，得到1ml左右的浓缩液。
8、将步骤7得到的浓缩液上样并进行分子筛层析。
分子筛层析采用Superose6层析柱，柱子型号为Superose6,10/300GL；用洗脱液（溶剂为pH7.5、20mM的tris缓冲液，含150mM NaCl）进行洗脱，流速为0.5ml/min，收集保留体积为16.5mL-22.5mL之间的过柱后洗脱液。层析图谱见图1。
9、取步骤8得到的过柱后溶液，采用截留分子量为10KD的超滤浓缩管进行超滤浓缩，得到约1mL的溶液（蛋白浓度约为13mg/ml），将其命名为VirB core片段溶液。VirBcore片段溶液的SDS-PAGE电泳图见图2。
实施例2、硒代VirB core片段的制备
1、将实施例1的步骤一得到的重组质粒pET28a-VirB core转化大肠杆菌B834，得到重组菌。
2、将步骤1得到的重组菌的单克隆接种至3ml含50μg/μL卡那霉素的LB液体培养基，37℃、250rpm振荡培养过夜。
3、取步骤2得到的菌液，接种至200mL含50μg/μL卡那霉素的LB液体培养基，37℃、250rpm培养12小时，离心收集菌体沉淀。
4、制备硒代甲硫氨酸培养基：（1）从试剂套装(Molecular dimensions公司，货号MD12-501B)中称取86.4克medium base，溶解于4L超纯水，121℃高压灭菌15分钟，冷却后4℃保存；（2）从试剂套装中称取20.4克nutrient mix（Moleculardimensions公司，货号MD12-502），溶解于200ml超纯水，0.22μm滤膜抽滤除菌，4℃保存；（3）使用前，将步骤（1）和步骤（2）的培养基分别恢复至室温，按照每1L medium base培养基加50ml nutrient mix培养基的配比混合。
5、在通风橱中配制硒代甲硫氨酸储液，方法如下：用1ml超纯水溶解100mg硒代甲硫氨酸，加入50μl浓盐酸帮助溶解。
6、用4L步骤4得到的培养基重悬步骤3得到的菌体沉淀，按照每升培养体系加入500μl硒代甲硫氨酸储液的配比加入硒代甲硫氨酸储液，振荡混匀，于37℃、180rpm振荡培养至OD600nm=1.2；加入IPTG并使其浓度为500μmol/L，16℃、180rpm振荡培养12小时。
然后依次进行实施例1的步骤二的4至9，得到蛋白浓度约为13mg/ml的蛋白溶液，将其命名为硒代VirB core片段溶液。
用硒原子取代蛋白质分子中甲硫氨酸的硫原子可以产生便于利用的X-射线异常衍射，用于推定蛋白质晶体的相位。
实施例3、VirB core片段与DNA分子形成的复合物的晶体解析
一、复合物的组装
1、分别合成单链DNA分子甲和单链分子乙，将每种单链DNA分子分别溶解在pH8.5、100mM的Tris缓冲液中并使其浓度为100μM，然后将两种单链DNA分子溶液等体积混合，95℃孵育10分钟，自然冷却至4℃，得到双链DNA分子溶液(icsB溶液)。
单链DNA分子甲：5’-AAA CTCGTTTCATCATGAAATCCCAC-3’；
单链DNA分子乙：3’-GAGCAAAGTAGTACTTTAGGGTG TTT-5’。
2、将实施例1得到的VirB core片段溶液和步骤1得到的双链DNA分子溶液按照蛋白和DNA等摩尔的配比混合，冰上孵育3个小时。
3、分别合成单链DNA分子丙和单链分子丁，将每种单链DNA分子分别溶解在pH8.5、100mM的Tris缓冲液中并使其浓度为100μM，然后将两种单链DNA分子溶液等体积混合，95℃孵育10分钟，自然冷却至4℃，得到双链DNA分子溶液（BrU-icsB溶液）。
单链DNA分子丙：5’-AAA CbrUCGTTTCATCATGAAAbrUCCCAC-3’；
单链DNA分子丁：3’-G AGCAAAGTAGTACTTT AGGGTG TTT-5’。
4、将实施例2得到的硒代VirB core片段溶液和步骤3得到的双链DNA分子溶液按照蛋白和DNA等摩尔的配比混合，冰上孵育3个小时。
5、分别取步骤2的产物和步骤4的产物，在优化条件(即0.1M MgCl2,0.1M醋酸钠,pH4.6,28%PEG400)下获得其晶体结构。硒代VirB core/BrU-icsB晶体在瑞士PSIX06DA线站收集。数据处理与整合使用XDS软件包（Kabsch,W.Xds.[J].ActaCrystallogr D Biol Crystallogr.201066,125-32）。硒代VirB core/BrU-icsB晶体经过数据处理定义空间群分别为P21212。在每个非对称单元中，一个蛋白分子对应一个DNA分子。使用SHLEX C/D/E计算重原子的位置(在硒代VirB core/BrU-icsB晶体中定位到一个硒原子和2个溴原子)并推导计算相位（Sheldrick,G.M.Experimentalphasing with SHELXC/D/E:combining chain tracing with density modification.[J]Acta Crystallogr D Biol Crystallogr.2010,479-85.）。最后产生完整的电子密度云图。使用Coot（Emsley,P.&Cowtan,K.Coot:model-building tools formolecular graphics.[J].Acta Crystallogr D Biol Crystallogr.2004.60,2126-32.）进行手动建模。天然VirB core/icsB晶体通过分子置换（以硒代蛋白和溴代DNA作为最初的模型）解析结构(Phaser,CCP4package)（McCoy,A.J.et al.Phasercrystallographic software.[J].J Appl Crystallogr.2007.40,658-674）。最后通过PHENIX（Adams,P.D.et al.PHENIX:a comprehensive Python-based systemfor macromolecular structure solution.[J].Acta Crystallogr D BiolCrystallogr.2010.66,213-21）来优化整个结构。
硒代VirB core/BrU-icsB晶体的Rikagu衍射结果见图3和表1。晶体结构照片见图4。硒代蛋白和溴代DNA重复出了与天然蛋白同样大小和高质量的晶体。
表1晶体数据
天然VirB core/icsB晶体的晶格排列方式见图5。在整个晶格中DNA双螺旋通过首尾的末端相连形成曲折的螺旋。分子间通过AAA/TTT处连接，VirB Core蛋白分子通过与DNA螺旋轴垂直连接两个平行的DNA分子。这种晶体堆积方式稳定了分子间的作用力，利于晶格的稳定。
VirB Core与icsB复合物的结构见图6。图6A中，上图为用于结晶的DNA序列，下图为目的DNA和标准的B型DNA的结构比较。图6B为VirB Core与icsB复合物结构的晶体结构（两个不同的视角）。VirB Core片段有7个α螺旋共同组成N端和C端结构域，N端的α2-α3形成典型的HTH结构域参与DNA的结合。C端α4-α7形成扭曲的4股螺旋束通过一个连接于HTH模序结合。HTH模序与DNA结合，DNA稍微发生扭曲，但仍旧以B-DNA形式存在。VirB Core与DNA复合物的结构高度保守，尤其是HTH结构域，在二级结构比对中发现，VirB蛋白在N端结构域与HTH结构域比较保守，而解析结构的结果表明确实如此。说明了蛋白在分子进化过程中，保留了其基本的功能，即参与结合DNA的能力。
晶体结构显示。VirB Core蛋白只结合Box2模序，在天然VirB core/icsB晶体结构中，HTH模序均结合Box2的大沟（图7）。但其结合模式稍微不同。大部分情况下，HTH模序的α3即识别螺旋，嵌入DNA大沟中，α3螺旋轴与碱基平面平行。VirB core蛋白与Box2的互作主要有HTH模序的残基介导。
在天然VirB core/icsB晶体结构中，HTH模序与DNA磷酸骨架有6个接触，其中4个主要集中在Box2的一侧，其它2个在另一侧(见图8)。VirB Core蛋白与icsB DNA作用，其中K152、Y151、T166、Q170、K164、F190参与了DNA磷酸骨架的识别。R167、R162、A163参与了DNA碱基特异性识别。这种骨架识别的不对称性对于VirB core的正确定位至关重要。之前的研究表明K152，K164对于蛋白结合DNA至关重要。该晶体结构显示，K152侧链的Nζ原子与icsB中的G8b磷酸骨架中的()Op2原子形成强烈的盐键，而NH与icsB-wt中的A7b(138°).的Op2原子形成氢键。而K164侧链的Nζ原子与icsB-wt中的T2c磷酸骨架中的()Op2原子形成另一个盐键。此外，Y151，T166，Q170和F190也参与了DNA磷酸骨架的识别。
在天然VirB core/icsB晶体中，HTH模序与icsB有3个碱基接触。其中R167和R162是特异性碱基识别。在天然VirB core/icsB晶体中，R167与icsB中G3c形成2个氢键(R167Nη2–G3c N7：167°；R167Nη1–G3c O6：157°)，其侧链的胍基平面相对应G3C中的鸟嘌呤被扭曲24度平面角，这样就使R167的侧链与相邻的T4b形成另外一个氢键(R167Nη2–T4b O4：132°)。R162侧链与A7b(125.5°)形成一个氢键，其侧链的胍基平面几乎与腺苷平面垂直。最后，在天然VirB core/icsB晶体中A163与T5b形成一个氢键。
在天然VirB core/icsB晶体结构中，其高的分辨率清晰的定位出52个核苷酸，见图9A。icsB双螺旋DNA由于蛋白的结合引起大约22°的弯曲。DNA的弯曲主要发生在Box2，而Box1相对平直，仅有5.5°的弯曲。而Box2弯曲大约～24.0°，特别是在GAAAT(G3-T7)的AT富集区域，其两个核苷酸的平均弯曲度是3.3°，而剩余的碱基弯曲度为1.5°，此外，与传统的B-DNA（见图9B）相比，Box2显示了很明显的DNA小沟宽度的波动，A1-G3的小沟宽度明显变宽而使A4-T7的小沟宽度压缩（见图10）。相反，在icsB或的box1碱基因没有蛋白的结合，其小沟宽度没有发生波动。DNA小沟宽度的改变并没有引起DNA大沟的明显改变。
蛋白引起DNA构型改变，在本研究中即DNA发生弯曲或者是小沟变窄，是一个值得探讨的问题，通常情况下，AT-串是一种内在的构型，这种构型是结合DNA的一种方式，即DNA的形状决定了DNA的结合，而另外一种解释是DNA结合引起DNA构型变化或是小沟的变窄，那么这两种情况对VirB蛋白而言，发明人认为是VirB蛋白结合DNA从而引发DNA弯曲，而这种结合是在DNA的大沟，大沟的结合必然引发小沟的变窄。因为在DNA序列中存在两个对称的box1，即box1和box2，而VirB蛋白选择性结合box2，造成这两个box的对称性发生改变。从而引发弯曲和小沟的变窄。此外，AT串通常有较强的柔性，这种柔性更增加了蛋白引发DNA构型的改变和小沟的改变。
实施例4、VirB core片段与DNA分子结合的特性
一、制备双链DNA分子
1、制备单链DNA分子icsB-for-26和单链DNA分子icsB-rev-26组成的双链DNA分子icsB。
icsB-for-26：5’-AAA CTCGTTTCATCATGAAATCCCAC-3’；
icsB-rev-26：3’-GAGCAAAGTAGTACTTTAGGGTG TTT-5’。
2、制备单链DNA分子micsB-for-26和单链DNA分子micsB-rev-26组成的双链DNA分子micsB(与双链DNA分子icsB发生了box2突变)。
micsB-for-26：5’-AAA CTCGTTTCATCGCTGGGCCCCAC-3’；
micsB-rev-26：3’-GAGCAAAGTAGCGACCCGGGGTG TTT-5’。
3、制备单链DNA分子A-for-26和单链DNA分子A-rev-26组成的双链DNA分子A。
A-for-26：5’-AAA AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA-3’；
A-rev-26：3’-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT TTT TTT-5’。
二、分组处理
第一组：将双链DNA分子icsB、双链DNA分子micsB和双链DNA分子A混合，混合体系中DNA浓度为1.2μM，冰上孵育30分钟。
第二组：将实施例1得到的VirB core片段溶液和双链DNA分子icsB混合，混合体系中蛋白的浓度为3μM，DNA的浓度为1.2μM，冰上孵育30分钟。
第三组：将实施例1得到的VirB core片段溶液和双链DNA分子icsB混合，混合体系中蛋白的浓度为6μM，DNA的浓度为1.2μM，冰上孵育30分钟。
第四组：将实施例1得到的VirB core片段溶液和双链DNA分子icsB混合，混合体系中蛋白的浓度为12μM，DNA的浓度为1.2μM，冰上孵育30分钟。
第五组：将实施例1得到的VirB core片段溶液和双链DNA分子micsB混合，混合体系中蛋白的浓度为3μM，DNA的浓度为1.2μM，冰上孵育30分钟。
第六组：将实施例1得到的VirB core片段溶液和双链DNA分子micsB混合，混合体系中蛋白的浓度为6μM，DNA的浓度为1.2μM，冰上孵育30分钟。
第七组：将实施例1得到的VirB core片段溶液和双链DNA分子micsB混合，混合体系中蛋白的浓度为12μM，DNA的浓度为1.2μM，冰上孵育30分钟。
第八组：将实施例1得到的VirB core片段溶液和双链DNA分子A混合，混合体系中蛋白的浓度为3μM，DNA的浓度为1.2μM，冰上孵育30分钟。
第九组：将实施例1得到的VirB core片段溶液和双链DNA分子A混合，混合体系中蛋白的浓度为6μM，DNA的浓度为1.2μM，冰上孵育30分钟。
第十组：将实施例1得到的VirB core片段溶液和双链DNA分子A混合，混合体系中蛋白的浓度为12μM，DNA的浓度为1.2μM，冰上孵育30分钟。
第一组至第十组分别对应图11中的泳道1至10。
三、完成步骤二的处理后，分别从各个体系取样，进行6%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，电泳图见图11。结果表明，VirB core片段均可结合上述各个双链DNA分子，形成低分子量复合物。

Claims (4)

1. VirB core片段在制备用于结合DNA的产品中的应用；所述VirB core片段由序列表中序列1自N末端第22至143位氨基酸残基组成的蛋白质。
2.一种用于结合DNA的产品，其活性成分为VirB core片段；所述VirB core片段由序列表中序列1自N末端第22至143位氨基酸残基组成的蛋白质。
3.VirB core片段在制备用于识别DNA的产品中的应用；所述VirB core片段由序列表中序列1自N末端第22至143位氨基酸残基组成的蛋白质。
4.一种用于识别DNA的产品，其活性成分为VirB core片段；所述VirB core片段由序列表中序列1自N末端第22至143位氨基酸残基组成的蛋白质。
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