CN103476929A - 抗流感病毒中和抗体及其筛选方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种抗流感病毒抗体，并提供了生产它的方法，和用于确定受试对象是否携带该中和抗体的检测方法。所述抗体即使是在根据血凝素氨基酸的保守性而分类的两组流感病毒之间，也超越组间的障碍而具有中和活性。
Description
[技术领域]
本发明涉及一种抗流感病毒抗体，其超越了亚型之间的障碍，对所有流感病毒均显示普遍的中和活性，并涉及生产该抗体的方法和用于检测受试对象中该抗体的方法。
[背景技术]
流感病毒是一种RNA包膜病毒，颗粒直径为大约100nm，属于正粘病毒科。根据其内在蛋白的抗原性可以分成3型：甲型（A型）、乙型(B型)和丙型(C型)。流感病毒由被具有脂质双层结构的病毒包膜所包围的内部核衣壳或者与核蛋白会合的核糖核酸(RNA)核心，以及外部糖蛋白构成。病毒包膜的内层主要由基质蛋白形成，而外层大多由宿主来源的脂质形成。流感病毒的RNA呈现分节结构(segmentary structure)。全球范围内蔓延的流感是由甲型流感病毒导致的。甲型病毒具有血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)这两种包膜糖蛋白。根据抗原性不同，HA分为16种亚型，而NA可分成9种亚型。
近年来，高致病性的H5N1型禽流感病毒在全球猛烈蔓延；这样的状况，即使什么时候出现了人感染人的新型病毒，并引起大流行，也不会令人感到奇怪。为了应对这种情况，全球病毒检测系统正在被加强，大量储备达菲(Tamiflu)等治疗药物，疫苗的开发、生产和大量储备也正在进行。然而，情况是许多问题依然未被阐明，包括这样的病毒何时以及以什么形式出现，那时达菲等是否有治疗效果，所开发的疫苗是否有效，何时以及向谁接种，何时开始高预警状态以及何时宣告解除该状态。这是因为，我们要迎来要针对尚未出现的病原菌和病毒来准备疫苗和治疗药物这样的人类从未经历过的情况。特别地，疫苗开发因为如下事实而存在问题，即流感病毒基因组中，每年会在血凝素基因中导入很多突变，导致抗原漂移（抗原性改变），这被认为是疫情流行的原因所在。因此，接种与正在流行的型不匹配的疫苗不具有预期的预防效果。之所以不尝试开发流感病毒的抗体治疗药物（预防药物）的原因即在于，担心在开发期间本来可以被中和的病毒通过抗原漂移改变其特征，而导致通过巨大努力开发的药物不再有用。
本发明人们针对在1968-2004年间分离的12个H3N2型流感病毒株，筛选了由采集自单个个体的大量B淋巴细胞制作的噬菌体展示人抗体文库，结果发现，大部分显示中和活性的克隆是抗血凝素抗体，并且它们可以被粗略分为三组：特异性中和在1968-1973年间分离的病毒株的抗体，特异性中和在1977-1993年间分离的病毒株的抗体，或特异性中和在1997-2003年间分离的病毒株的抗体（非专利文献1）。尽管这一发现打破了传统的开发用于流感病毒的抗体治疗药物（预防药物）没有意义的普遍认识，但是迄今为止噬菌体抗体文库尚未被严肃地加以研究，因为重链和轻链的组合不一定反应生物体内情况等原因。
在这种状况下，三个研究组独立地成功分离了可以中和H5型流感病毒的人单克隆抗体（专利文献1和2，非专利文献2-4）。这些抗体不仅对H5型流感病毒，而且对其它亚型（例如H1型等）也具有中和活性。然而，尽管根据表位可以将血凝素的16种亚型（H1-H16）分成两个大组（组1和2），这些抗体仅对其中的组1（例如H1,H2,H5,H6,H8,H9型等）显示中和活性，对属于组2的流感病毒（例如H3和H7型等）不显示中和活性。也就是说，可超越基于血凝素的序列而划分的两个组之间的障碍，发挥广泛的中和活性的抗流感病毒抗体，至今尚没有分离、报告。
X-射线结构分析显示了这些抗体与血凝素的结合模式，可以显见，血凝素的38位氨基酸在组2的H3和H7型中变成了天冬酰胺，经历N型糖链修饰（非专利文献4和5）。而且，已有报道，H5的38位引入N型糖链修饰位点，会导致中和抗体的结合能力下降70%（非专利文献5）。还已知，当在血凝素中产生了突变的流感病毒逃离中和抗体时，这些突变主要集中在据报道含有中和表位的血凝素基因内的5个区域（A、B、C、D和E区）（非专利文献6和7）。这些发现提示，获得可以超越两组之间障碍的中和抗体是很困难的。
[现有技术文献]
[专利文献]
[专利文献1]WO2007/134327
[专利文献2]WO2008/028946
[非专利文献]
[非专利文献1]Virology Vol.397,pp.322-330,2010
[非专利文献2]Proc.Natl.Acad.Sci.USA.,Vol.105,pp.5986-5991,2008
[非专利文献3]PLoS ONE,Vol.3,pp.5986-5991,e3942,2008
[非专利文献4]Nature Structural&Molecular Biology,Vol.16,pp.265-273,2009
[非专利文献5]Science,Vol.324,pp.246-251,2009
[非专利文献6]Nature,Vol.289,pp.373-378,1981
[非专利文献7]J.Gen.Virol.,Vol.62,pp.153-169,1982
[发明概要]
[本发明所要解决的问题]
在准备应对预计在不久的将来发生的H5N1型流感的大流行以及随后很可能发生的H7和H9型病毒所致的大流行中，高度需要代替预测抗原性的变化来设计疫苗这样的传统的针对流感的预防概念，开发出基于更普遍、更可靠的新概念的预防手段。
因此，本发明的目的是提供抗流感病毒抗体，其发挥超越根据血凝素蛋白的氨基酸序列的保守性而分类的2组之间的障碍的中和活性，优选的是提供对H1-H16型的所有的亚型的流感病毒均具有中和活性的抗体，并提供制备该抗体的方法。此外，本发明的另一个目的是提供一种检测方法，其能够简单地并且相对廉价地考察受试对象是否携带上述通用的中和抗体。
[解决问题的方法]
本发明人使用单采血液成分术（apheresis）（分离采集血液中的一种组分），从单个个体采集了109个这样大量的B淋巴细胞，制作了反映几乎全部抗体谱的噬菌体展示人抗体文库，使用已灭活的H3N2流感病毒作为抗原，通过淘选法（panning method），网罗性地筛选了结合该抗原的抗体克隆。从选出的噬菌体回收抗体，测试其对属于组2的H3型流感病毒和属于组1的H1型、H2型和H5型流感病毒的中和活性。结果，令人惊讶地发现，成功获得了40个以上的克隆的下述抗体，所述抗体不仅对用作筛选抗原的H3型显示中和活性，而且对属于和H3型所属不同组的H1型、H2型和H5型流感病毒，也显示中和活性。这些克隆具有6种不同的重链可变域（VH）氨基酸序列，但对所有这些序列进行了IgBLAST检索，结果判断出它们全部属于VH1-69种系（germline）。而且，IgBLAST检索显示，这6种克隆所具有的轻链可变域（VL）限定为3种种系。
考虑到先前报道的针对H5型的中和抗体是利用VH1-69或者相似的VH1-e，以及X-射线结构分析所显示的该中和抗体与血凝素的结合模式，本发明人所获得的抗体能够中和H3型流感病毒是非常令人意外的事情。然而，本发明人想到，在检索可以中和与抗原所属不同组的病毒亚型的抗体时，通过彻底性地筛选与某种作为抗原的亚型相互反应的抗体，可能获得能够超越组间障碍、中和所有流感病毒亚型的抗体。因此，本发明人从一个个体采集了109个B淋巴细胞，比传统惯例大两个数量级，并生成了几乎完全反映供体抗体谱的人抗体文库，网罗性地筛选可以结合H3型流感病毒的抗体克隆，并检查其对H1型、H2型和H5型流感病毒的中和活性，从而首次成功分离了能够既中和组1又中和组2中流感病毒的抗体。
分析所得中和抗体的氨基酸序列显示，所有中和抗体均使用VH1-69基因作为重链可变域V区。值得注意的是，与其它克隆相比，对组1中流感病毒的中和活性比其他克隆高的克隆，在重链可变域V区中被发现具有一个氨基酸缺失。因为抗体产生细胞在生长和分化刺激下转化（抗体成熟）的过程，伴随着编码重链和轻链的DNA双链中的一条链被切割，并且在经常会导致错误的DNA聚合酶修复该切割的过程中引入了突变，所以生成的突变几乎都是基于单碱基取代的氨基酸替换。因此，缺失一个氨基酸（3个碱基）的频率极低；即使发生这种缺失，由于几乎都是具有坏的影响，其刺激生产该抗体的B细胞，进而在机体内作为记忆细胞长时间存在的机制启动的可能性进一步降低。考虑到相关技术常识，如下的发现是令人惊讶的，即由于在除了CDR3之外的重链可变域内的一个氨基酸的缺失，导致本来主要中和组2的流感病毒的抗体获得了也可以强力中和属于组1的流感病毒的活性。
本发明人根据这些发现进行了进一步的研究，并形成了本发明。
因此，本发明提供了：
[1]一种分离抗体，其中和选自组1的至少一种流感病毒和选自组2的至少一种流感病毒，其中组1由H1型、H2型、H5型、H6型、H8型、H9型、H11型、H12型、H13型和H16型流感病毒构成，组2由H3型、H4型、H7型、H10型、H14型和H15型流感病毒构成；
[2]根据如上[1]的抗体，其中该抗体至少中和H1型和/或H5型流感病毒，且中和H3型流感病毒；
[3]根据如上[1]的抗体，其中该抗体中和H1型-H16型流感病毒；
[4]根据如上[1]的抗体，其中该重链可变域V区利用VH1-69或VH1-e基因；
[5]根据如上[1]的抗体，其中该重链可变域V区具有氨基酸缺失；
[6]根据如上[5]的抗体，其中由VH1-69或VH1-e基因编码的该重链可变域V区中，至少具有缺失第27位甘氨酸的突变；
[7]根据如上[1]的抗体，其中该轻链可变域V区利用VL1-44,VL1-47或VL1-51基因；
[8]根据如上[1]的抗体，其中在该抗体在转变为IgG型时的、在灶形成抑制试验(focus formation inhibition test)中的最小抑制浓度为10-11-10-12M量级；
[9]根据如上[1]的抗体，其中该抗体是人抗体；
[10]根据如上[1]的抗体，其中该重链可变域的互补决定区1由序列号1所示氨基酸序列构成，互补决定区2由序列号2所示氨基酸序列构成；
[11]根据如上[10]的抗体，其中该重链可变域的框架区1由序列号3所示氨基酸序列构成；
[12]根据如上[1]的抗体，其中该重链可变域V区由序列号4-9中任一个所示的氨基酸序列构成；
[13]根据如上[1]的抗体，其中该重链可变域由序列号10-15中任一个所示的氨基酸序列构成；
[14]根据如上[1]的抗体，其中该重链可变域和轻链可变域分别由如下(a)-(l)中任一个所示的氨基酸序列构成：
(a)序列号10和序列号16;
(b)序列号10和序列号17;
(c)序列号10和序列号18;
(d)序列号10和序列号19;
(e)序列号10和序列号20;
(f)序列号10和序列号21;
(g)序列号10和序列号22;
(h)序列号11和序列号23;
(i)序列号13和序列号24;
(j)序列号14和序列号25;
(k)序列号15和序列号26;和
(l)序列号12和序列号70.
[15]一种用于流感的被动免疫治疗剂，其含有根据如上[1]的抗体；
[16]一种用于流感的被动免疫治疗方法，该方法包括向已被流感病毒感染的、或者存在被感染的可能性的哺乳类或鸟类受试对象给药有效量的根据如上[1]的抗体；
[17]根据如上[16]的方法，其中受试对象是人；
[18]一种生产根据如上[1]的抗体的方法，包括如下步骤：
(1)提供包含抗体克隆的抗体文库，所述抗体克隆是来自从一个个体采集到的大约108个以上的B细胞，
(2)以H1～H16中任一个的流感病毒、或该病毒的血凝素蛋白、或其胞外域作为抗原，使其与抗体文库(1)接触，网罗性地筛选与该抗原反应的抗体克隆，
(3)由在步骤(2)中筛选到的各抗体克隆回收抗体分子，
(4)针对在步骤(3)中获得的各抗体，检测所述抗体对选自组1的至少一种流感病毒和选自组2的至少一种流感病毒的中和活性，和
(5)使用产生中和属于组1的流感病毒和属于组2的流感病毒这二者的抗体的克隆来产生该抗体，回收该抗体；
[19]根据如上[18]的方法，其中该抗体是人抗体；
[20]根据如上[18]的方法，其中该抗体文库是噬菌体展示文库；
[21]根据如上[20]的方法，其中抗体克隆的数目为1010-1011；
[22]根据如上[18]的方法，其中B细胞通过单采血液成分术(apheresis)而采集到的；
[23]根据如上[18]的方法，其中，在上述步骤(2)中，使用所述采集了B细胞的个体没有感染史的流感病毒分离株、或其血凝素蛋白、或其胞外域作为抗原；
[24]根据如上[23]的方法，其中该流感病毒分离株属于H1、H2或H3型；
[25]根据如上[23]的方法，其中，所述流感病毒分离株属于所述采集了B细胞的个体没有感染史的血凝素亚型；
[26]根据如上[25]的方法，其中该流感病毒分离株属于H5、H7或H9型；
[27]根据如上[18]的方法，包括在上面的步骤(4)中检测对至少H1型和/或H5型流感病毒和H3型流感病毒的中和活性；
[28]根据如上[20]的方法，进一步包括将抗体转变成IgG型的步骤；
[29]一种在受试对象体内检测根据如上[1]的抗体的方法，包括如下步骤：
(1)向受试对象接种H1型～H16型中任一项的亚型的血凝素，
(2)接种后，在抗体产生细胞已充分地扩增时，从受试对象采集血液，和
(3)考察该血液中是否存在呈递下述抗体的抗体产生细胞，所述抗体结合选自组1的亚型的血凝素和选自组2的亚型的血凝素这二者，并且具有由VH1-69或VH1-e基因编码的重链可变域V区；
[30]一种在受试对象体内检测根据如上[1]的抗体的方法，包括如下步骤：
(1)向受试对象分别接种选自组1的亚型的血凝素和选自组2的亚型的血凝素，
(2)各血凝素接种后，在抗体产生细胞已充分地扩增时，从受试对象采集血液，和
(3)考察各血液中是否存在呈递下述抗体的抗体产生细胞，所述抗体结合选自与所接种了的凝血素不同的组的亚型的血凝素，并且具有由VH1-69或VH1-e基因编码的重链可变域V区，
等。
[发明效果]
根据本发明，可以获得具有针对所有流感病毒血凝素亚型的中和能力的人抗体。用该中和抗体进行被动免疫能够有效预防或治疗流感，甚至在抗原漂移以及抗原转变事件下也可以预防或治疗流感。本发明还能确定受试对象是否具有可以产生超越组间障碍、对流感病毒显示中和活性的抗体的记忆B细胞。
[附图简述]
图1-1显示了从噬菌体展示人抗体文库中以H3N2病毒株筛选得到的抗体，对所有12种H3N2病毒株和一种H1N1病毒株的结合活性的ELISA确定结果。
图1-2显示了从噬菌体展示人抗体文库中以H3N2病毒株筛选得到的抗体，对所有12种H3N2病毒株和一种H1N1病毒株的结合活性的ELISA确定结果。
图2显示了在筛选以组11和组22分类的克隆时，使用哪种H3型流感病毒株作为抗原。
图3显示了用于筛选组11中各抗体克隆的流感病毒株，以及所分离克隆的数目。
图4显示了组11中克隆的VH和VL的氨基酸序列，其中FR045-092的FR1区中显示的点“.”表示缺失的氨基酸。
图5显示了组11中的克隆与已报道的对H1株和H5株都显示中和活性的抗体的重链可变域的氨基酸比较结果，其中FR045-092的FR1区中显示的点“.”表示缺失的氨基酸。
图6显示了组11中的克隆针对H3N2流感病毒株的结合活性的ELISA确定结果。
图7提供的Western blot图显示了组11中的克隆可识别H3和H1株的HA。
图8显示了组11中的克隆针对H3型和H1型流感病毒的血细胞凝聚抑制活性研究结果。
图9显示了组11中的克隆针对H3型和H1型流感病毒的灶形成抑制活性研究结果。
图10显示了组11中的克隆是否竞争性抑制小鼠单克隆抗体C179与H3型流感病毒的结合活性的ELISA确定结果。在存在Fab-p3抗体(F022-360,F026-146,F026-427,F045-092,F005-126)和不存在（无Fab-p3）的条件下，用C179的甲型流感苏联型新喀里多尼亚株进行ELISA实验，其中与甲型流感苏联型新喀里多尼亚株HA无反应的F005-126用作阴性对照。
图11显示了小鼠单克隆抗体C179是否竞争性抑制组11中的克隆与H3型流感病毒的结合活性的ELISA确定结果。在存在(C179(+))和不存在(C179(-))C179的条件下，确定Fab-p3抗体(F022-360,F026-146,F026-427,F045-092)对甲型流感苏联型新喀里多尼亚株的作用。
图12显示了图2所示抗体克隆F005-1269(其对H3型流感病毒株具有广泛的株特异性)，和识别组11中H3型和H1型流感病毒这两者的抗体克隆，是否共有表位的ELISA确定结果。在存在Fab-p3抗体(F022-360,F026-146,F026-427,F045-092,F005-126,F019-102)和不存在（无Fab-p3）的条件下，进行ELISA实验，确定Fab-PP型F005-126对甲型流感香港型爱知株的作用，其中Fab-p3型F005-126用作竞争性抑制的阳性对照，F019-102用作不与甲型流感香港型爱知株反应的阴性对照。
图13显示了组11中的克隆对表达来自H3型流感病毒的血凝素的细胞的结合能力的FACS分析结果，其中所有灰色峰来自阴性对照F008-038，实线峰分别来自a)F026-427、b)F045-092和c)F49。
图14显示了各IgG抗体针对H3型、H5型、H2型和H1型流感病毒的中和活性的测量结果，其中纵轴表示感染抑制率（%），横轴表示抗体浓度（μg/mL）。
图15-1显示了Fab克隆对甲型流感病毒/H3N2爱知株HA0和HA1的反应性的图示，其中灰色峰表示模拟转染结果，绿色峰表示pDisp-Aic68HA0转染结果，粉色峰表示pDisp-Aic68HA1转染结果，蓝色峰表示pDisp-Fuk85HA0转染结果，橙色峰表示pDisp-Fuk85HA1转染结果。
图15-2显示了Fab克隆对甲型流感病毒/H3N2爱知株HA0和HA1的反应性的图示，其中灰色峰表示模拟转染结果，绿色峰表示pDisp-Aic68HA0转染结果，粉色峰表示pDisp-Aic68HA1转染结果，蓝色峰表示pDisp-Fuk85HA0转染结果，橙色峰表示pDisp-Fuk85HA1转染结果。
图16显示了识别HA分子表位B的抗体F004-104与组11中的抗体克隆是否共有表位的ELISA确定结果。在存在IgG抗体(F026-427IgG,F045-092IgG,F004-104IgG)和不存在(无IgG)的条件下进行ELISA，确定Fab-p3型单克隆抗体F026-427p3,F045-092p3,F004-104p3和小鼠来源抗甲型流感/H3N2抗体F49对甲型流感/H3N2巴拿马株的作用。
图17-1显示了流感病毒亚型和每种病毒株的HA1和HA2的氨基酸序列。
图17-2显示了流感病毒亚型和每种病毒株的HA1和HA2的氨基酸序列。
图18显示了各种HA抗体对如下细胞的结合能力的FACS分析结果，其中该细胞表达以苏氨酸或丙氨酸替换Aic68流感病毒株来源的血凝素的136位丝氨酸残基而产生的血凝素，其中灰色峰指示模拟转染的结果，绿色峰指示野生型Aic68的HA的结果，蓝色峰指示Aic68的HA的S136T的结果，粉色峰指示Aic68的HA的S136A的结果。
图19显示了F045-092对如下细胞的结合能力的FACS分析结果，其中该细胞表达通过相互替换来自各种H3N2流感病毒HA1的142-146位或133-137位氨基酸而产生的突变HA1，其中灰色峰指示模拟转染的结果，绿色峰指示对野生型的反应性，粉色峰指示移植了142-146位氨基酸序列的嵌合142A的反应性，蓝色峰指示移植了133-137位氨基酸序列的嵌合133A的反应性。
图20显示了通过相互替换来自各种H3N2流感病毒的HA1的142-146位或133-137位氨基酸而产生的突变HA1区域的91-260位氨基酸部分的三维结构，其中受体结合区域显示橙色，Aic68_野生型的133-137位氨基酸显示蓝色，142-146位氨基酸显示亮蓝色，Wyo03_野生型的133-137位氨基酸显示红色，142-146位氨基酸显示粉色，Fuk85_野生型的133-137位氨基酸显示绿色，142-146位氨基酸显示黄绿色。
图21显示了H3N2流感病毒HA1区的91-260位氨基酸部分的三维结构、被各种抗体识别的HA1区的位点、和用于通过EMAC方法确定位点的病毒株的名称，其中受体结合区域显示橙色，被各个抗-HA抗体识别的位点显示粉色，受体结合区内的氨基酸编号显示黑色，抗原识别位点的氨基酸编号显示蓝色，受体结合区中包含的作为抗原识别位点的氨基酸显示蓝色。
图22是与HA1中的A、B、C、D和E位点结合的各种抗-HA抗体与F045-092抗体之间竞争实验的结果图示，其中左图是以F045-092作为竞争者生成的，右图是以cp3型抗-HA抗体作为竞争者生成的(+:有cp3抗体,-:无cp3抗体)。所用的病毒株在图的左下方显示。无Fab-pp:使用PBS代替pp型抗体；无Ab:使用PBS代替所有抗体。
[本发明的实施方式]
本文中，流感病毒包括所有目前已知的亚型，甚至包括可能在将来分离和鉴定的亚型。目前已知的流感病毒亚型包括由从H1-H16中选出的血凝素类型和从N1-N9中选出的神经氨酸酶类型的亚型组合。
根据血凝素的氨基酸序列相似性，流感病毒可以被粗略分成两组。这里，由H1型、H2型、H5型、H6型、H8型、H9型、H11型、H12型、H13型和H16型流感病毒构成的组被称作组1，由H3型、H4型、H7型、H10型、H14型和H15型流感病毒构成的组被称作组2。在这些组中选择类别时，不考虑神经酰胺酶亚型。将来分离和鉴定出的新亚型将根据血凝素的氨基酸序列相似性分类到组1或组2中。
本发明提供了分离抗体，其中和至少一种选自组1（H1型、H2型、H5型、H6型、H8型、H9型、H11型、H12型、H13型和H16型）的流感病毒和至少一种选自组2（H3型、H4型、H7型、H10型、H14型和H15型）的流感病毒。优选地，本发明的中和抗体至少中和组1中的H1型和/或H5型流感病毒，且至少中和组2中的H3型流感病毒。更优选地，本发明的中和抗体进一步中和组1中的H9型流感病毒，还进一步中和组2中的H7型流感病毒。本发明的中和抗体特别优选地中和所有的H1-H16型流感病毒，最优选地，甚至中和在将来会分离和鉴定出的新型血凝素亚型流感病毒。
本发明的中和抗体可以通过如下的方法加以产生，包括如下步骤：
(1)提供包含抗体克隆的抗体文库，所述抗体克隆是来自从一个个体采集到的大约108个以上的B细胞，
(2)以H1～H16中任一个的流感病毒、或该病毒的血凝素蛋白、或其胞外域作为抗原，使其与抗体文库(1)接触，网罗性地筛选与该抗原反应的抗体克隆，
(3)由在步骤(2)中筛选到的各抗体克隆回收抗体分子，
(4)针对在步骤(3)中获得的各抗体，检测所述抗体对选自组1的至少一种流感病毒和选自组2的至少一种流感病毒的中和活性，和
(5)使用产生中和属于组1的流感病毒和属于组2的流感病毒这二者的抗体的克隆来产生该抗体，回收该抗体。
采集B细胞作为抗体产生细胞用于生产抗体文库的供体，可以是任何曾经被流感病毒感染的哺乳动物（例如人、猪、马等）或鸟类（鸡、鸭等）；可以适当地选择与作为用本发明中和抗体进行被动免疫的受试对象相同的动物物种，比如选择人。在选择人的情况下，供体的年龄、性别、疫苗接种状态（已接种或未接种）等不受限制；然而，因为供体理想地具有尽可能多的流感病毒感染经历，所以供体优选地为20岁以上，优选地30岁以上，再优选地40岁以上，特别优选地50岁以上，然而，这并不是限制。显示出超越组间障碍的中和活性的抗体，由于能够中和组内和亚型内所有病毒分离株，所以具有可产生该中和抗体的细胞的供体被认为不易被每年的季节性流感所感染。因此，在过去给定时期内没有甲型流感病毒感染史的人是更理想的。
用于采集足以制备普通抗体文库的B细胞的采血量为大约20-30mL，该血量中含有的B细胞数目为大约107。分离出针对高致病性H5N1禽流感病毒的人中和抗体的所有研究组，均通过从多个供体采集普通量的血液生成了其大约1010个克隆的抗体文库。而本发明人尝试生成可以反映整个抗体谱的大小的抗体文库，目的是彻底地(网罗性)地获得可以结合某种血凝素亚型的抗体。通常，在单次操作中，从一个人采集的血量极限为大约200-300mL；因此，使用这种方法可以采集到的B细胞数量为大约108。因此，本发明人使用单采血液成分术，从一个个体采集了超过上述量的血液中所含的B细胞。优选地，用于本发明目的的抗体文库是由109个以上的B细胞构成的。例如，通过单采血液成分术从大约3L血液分离B细胞可以实现从一个人个体采集大约109个B细胞。
只要含有来自一个个体的大约108个或更多个，优选地大约109个或更多个B细胞，用于生成抗体文库的抗体产生细胞可以进一步包括来自另一个个体的抗体产生细胞。具体地，例如，通过单采血液成分术回收相当于大约3L血液的单核细胞数量，之后通过例如Ficoll-Paque密度梯度离心等方法分离和回收B细胞。
抗体文库包括，但不仅限于，例如噬菌体展示文库，通过用EB病毒使B细胞永生获得的文库，通过融合B细胞与骨髓瘤细胞获得的杂交瘤文库，等。优选地，可以使用噬菌体展示文库。
如这里提到的用于产生噬菌体展示人抗体文库的方法实例包括，但不仅限于，如下。
尽管所用噬菌体的选择没有特别限制，但是丝状噬菌体（filamentousphage，Ff噬菌体）通常是优选使用的。将外来蛋白呈递到噬菌体表面上的方法包括，表达外来蛋白并将其作为与包膜蛋白g3p(cp3)和g6p(cp6)-g9p(cp9)其中之一的融合蛋白呈递到包膜蛋白上的方法，和通常使用的方法，其中外来蛋白与cp3或cp8的N端融合。噬菌体展示载体包括1）以融合形式将外来基因引入噬菌体基因组包膜蛋白基因内，从而使所有包膜蛋白作为与外来蛋白的融合蛋白被呈递到噬菌体表面上的方法，以及2）插入与野生型包膜蛋白基因分离的编码融合蛋白的基因，从而同时表达融合蛋白和野生型包膜蛋白，和3）使携带有编码融合蛋白的基因的噬菌粒载体的肠埃希氏菌被具有野生型包膜蛋白基因的辅助噬菌体感染，并产生同时表达融合蛋白和野生型包膜蛋白的噬菌体颗粒。在1）的实例中，与大的外来蛋白融合会导致感染性丧失；因此，在这种情况下，使用2）或3）型方法产生抗体文库。
具体地，有用的载体包括Holt等(Curr.Opin.Biotechnol.,11:445-449,2000)介绍的载体。例如，pCES1(见J.Biol.Chem.,274:18218-18230,1999)是Fab表达型噬菌粒载体，其携带置于cp3信号肽下游的编码κL链恒定区的DNA，编码CH3的DNA，并且该cp3编码序列通过His-标签、c-myc标签和琥珀终止密码子(TAG)置于cp3信号肽的下游，受到一个乳糖启动子的控制。该载体在被引入到具有琥珀突变的大肠埃希氏杆菌内时，会将Fab呈递到cp3包膜蛋白上面。然而，当在没有琥珀突变的HB2151菌株等内表达时，该菌株产生可溶性Fab抗体。有用的scFv表达型噬菌粒载体包括，例如，pHEN1(J.Mol.Biol.,222:581-597,1991)等。
同时，辅助噬菌体包括，例如，M13-KO7、VCSM13等。
其它的噬菌体展示载体包括如下的载体，其被设计成将包含编码半胱氨酸的密码子的序列连接到抗体基因3'端和包膜蛋白基因5'端，从而同时和分别（不作为融合蛋白）表达两个基因，并通过被引入的半胱氨酸残基间的S-S键使抗体呈递到噬菌体表面的包膜蛋白上(Morphosis公司的CysDisplayTM技术)等。
本发明中生成的抗体文库的种类包括天然(naive)/非免疫文库、合成文库、免疫文库等。
天然(naive)/非免疫文库是通过RT-PCR获取正常动物保留的VH和VL基因，并将其随机克隆到上述噬菌体展示载体其中之一内获得的。通常，来自正常动物外周血、骨髓、扁桃体的淋巴细胞（优选地外周血淋巴细胞）的mRNA或类似物用作模板。通过仅扩增来自如下IgM的mRNA生成的文库，其中IgM由于抗原敏化而未经历种类变换，从而避免与V基因有关的偏向，被特别称作天然文库。
代表性的天然/非免疫文库包括CAT公司的文库(见J.Mol.Biol.,222:581-597,1991;Nat.Biotechnol.,14:309-314,1996),MRC公司的文库(见Annu.Rev.Immunol.,12:433-455,1994),Dyax公司的文库(见J.Biol.Chem.,1999(ibid.);Proc.Natl.Acad.Sci.USA,14:7969-7974,2000)等。
合成文库的产生，是通过选择在人B细胞中发挥功能的特殊抗体基因，并用编码具有合适长度的随机氨基酸序列的DNA代替V基因片段的一部分，例如CDR3的抗原结合区部分等。合成文库被认为在抗体表达效率和稳定性方面是优异的，因为它们能够用可产生从一开始便具有功能的scFv和Fab的VH和VL基因的组合加以构建。代表性的实例包括Morphosys公司的HuCAL文库(见J.Mol.Biol.,296:57-86,2000),BioInvent公司的文库(见Nat.Biotechnol.,18:852,2000),Crucell公司的文库(见Proc.Natl.Acad.Sci.USA,92:3938,1995;J.Immunol.Methods,272:219-233,2003)等。当使用合成文库时，理想地使用VH1-69和VH1-e基因片段作为重链可变域的V基因片段。
免疫文库的产生，是通过从具有针对靶抗原的高血液抗体滴度的人，例如疫苗接种的受体，采集的淋巴细胞制备mRNA，或者从通过外部免疫等用靶抗原人工免疫的人采集的淋巴细胞制备mRNA，其执行方式与上述天然/非免疫文库的方式相同，并通过RT-PCR扩增VH和VL基因。因为期望的抗体基因在一开始便已存在于文库中，所以甚至在文库体积相对较小时就可获得期望的抗体。然而，在人的实例中，因为通过接种注射的特异针对病毒亚型的抗体得到了扩增，所以当用机体中预期已经存在多种针对它的抗体的H1-H3血凝素亚型之一的流感病毒进行接种时，会导致具有窄范围中和活性的抗体扩增，从而使该亚型中仅有特定的分离物被中和；这恐怕会掩盖期望的中和抗体。因此，在接种时，优选地接种如下亚型的流感病毒，其广泛传染迄今为止尚未见报道（例如在人类实例中，H5、H7、H9等）。
文库的多样性越大越好；然而实际上，考虑到在随后淘选操作(panningoperation)中可以处理的噬菌体数目（1011-1013个噬菌体）和在普通淘选中用于克隆分离和扩增所需的噬菌体数目(100-1,000个噬菌体/克隆)，适当的文库尺寸为大约108-1011个克隆。优选地，对于VH和VL基因，大小分别为109和106个克隆，Fab或scFv克隆的数目为1010-1011个克隆。
通过用EB病毒使细胞永生产生抗体文库的方法包括，但不仅限于，例如PLos Medicine4(5):e1780928-9936(2007)中介绍的方法。大部分人对EB病毒免疫，因为他们已经以传染性单核细胞增多症的无症状感染方式被病毒感染过；然而，当使用普通EB病毒时，还是会产生病毒体(virion)，因此必须进行适当的纯化。还优选地使用保留使B淋巴细胞永生的能力、但缺乏病毒体复制能力（例如缺乏用于从晚期感染状态转变成裂解感染状态的开关基因等）的重组EB病毒，作为永远不会被病毒污染的EB系统。
因为狨猴来源的B95-8细胞分泌EB病毒，所以使用其培养物上清可以容易地转化B淋巴细胞。产抗体B细胞系的获得，可以通过例如用补充有血清和青霉素/链霉素(P/S)的培养基（例如RPMI1640）或补充有细胞增殖因子的无血清培养基培养细胞，之后通过过滤和离心等分离培养物，以合适的浓度（例如大约107个细胞/mL）悬浮其中的产抗体B淋巴细胞，并通常在20-40°C，优选地30-37°C孵育悬浮液，通常大约0.5-2小时。当产人抗体的细胞作为混合淋巴细胞提供时，优选地先通过使它们与例如绵羊红细胞等形成E玫瑰花结除去T淋巴细胞，从而增加转化频率，因为大部分人具有对被EB病毒感染的细胞有毒性的T淋巴细胞。还可能选择特异针对靶抗原的淋巴细胞，其是通过将事先与可溶抗原偶联的绵羊红细胞与产抗体的B淋巴细胞混合，并使用Percoll密度梯度等分离玫瑰花结。进一步，因为抗原特异性B淋巴细胞被所添加的大幅过量的抗原覆盖，导致它们不再将IgG呈递到表面上，所以与事先用抗-IgG抗体偶联的绵羊红细胞混合，仅有抗原非特异性B淋巴细胞会形成玫瑰花结。因此，通过用Percoll密度梯度等从该混合物采集未形成玫瑰花结的细胞层，有可能选择抗原特异性B淋巴细胞。
由于转化而获得无限增殖能力的抗体分泌细胞可以和小鼠或人骨髓瘤细胞回融合（back-fused），以便稳定保持抗体分泌能力。骨髓瘤细胞的实例包括小鼠骨髓瘤细胞例如NS-1,P3U1,SP2/0和AP-1，和人骨髓瘤细胞例如SKO-007,GM1500-6TG-2,LICR-LON-HMy2和UC729-6。
通过细胞融合生成抗体文库，可以根据用于产生单克隆抗体的杂交瘤制备的普通程序加以实现。具体地，产抗体的杂交瘤可以通过将从供体采集的B细胞与上述的骨髓瘤细胞之一融合加以制备。
融合操作可以根据已知的方法执行，例如Koehler和Milstein[Nature,vol.256,p.495(1975)]的方法。融合促进剂包括聚乙二醇(PEG)、仙台病毒等，优选地使用PEG等。尽管PEG的分子量没有特别限制，但是低毒性和相对低粘性的PEG1000-PEG6000是优选的。PEG浓度的实例包括大约10-80%，优选地大约30-50%。用于稀释PEG的有用溶液包括各种缓冲溶液，例如无血清培养基（例如RPMI1640），包含大约5-20%血清的完全培养基，磷酸缓冲盐（PBS）和Tris缓冲液。可以根据期望添加DMSO（例如大约10-20%）。融合溶液的pH实例包括大约4-10，优选地大约6-8。
B细胞与骨髓瘤细胞的比例通常为大约1:1-20:1；通过在正常20-40°C，优选地30-37°C孵育通常1-10分钟，可以实现高效的细胞融合。
杂交瘤筛选和繁殖通常用适用于动物细胞的包含5-20%FCS的培养基（例如RPMI1640）或补充有细胞增殖因子的无血清培养基执行，并添加HAT（次黄嘌呤、氨基喋呤、胸苷）。次黄嘌呤、氨基喋呤和胸苷的浓度实例分别包括大约0.1mM、大约0.4μM和大约0.016mM等。为了筛选人-小鼠杂交瘤，可以使用乌本苷抗性。因为人细胞系比小鼠细胞系对乌本苷更敏感，所以有可能通过向培养基添加大约10-7-10-3M乌本苷清除未融合的人细胞。
在选择杂交瘤时，优选地使用滋养细胞或特定细胞的培养物上清。作为滋养细胞，一种具有寿命极限从而在帮助杂交瘤出现后死亡的同种异体细胞类型，使用能够产生大量有利于杂交瘤出现的生长因子并且增殖潜力被放射性辐照等降低的细胞。例如，小鼠滋养细胞包括脾细胞、巨噬细胞、血液、胸腺细胞等；人滋养细胞包括外周血单核细胞等。细胞培养物上清包括，例如，上述各种细胞的原代培养物上清和各种已建立细胞系的培养物上清。
通过噬菌体展示方法选择针对靶抗原的抗体的步骤称作淘选(panning)。具体地讲，通过重复大约2-4次如下系列的操作浓缩呈递抗原特异性抗体的噬菌体：使上面固定有H1-H16任一亚型流感病毒或病毒血凝素蛋白或其胞外域的载体（carrier）与噬菌体文库彼此接触，洗掉未结合的噬菌体，之后从载体洗脱结合的噬菌体，并用噬菌体感染大大肠埃希氏杆菌以扩增噬菌体。在本发明中，用作抗原的流感病毒可以通过福尔马林处理使之失活。优选地，用作抗原的流感病毒分离株是作为B细胞采集来源的个体从未感染过的。这是因为，当使用个体曾经感染过的病毒分离物作为抗原时，恐怕使仅显示窄范围中和活性的抗体克隆占据优势，从而掩盖本发明期望的中和抗体。因此，优选地，属于作为B细胞采集来源的个体从未感染过的血凝素亚型的流感病毒或其血凝素，可以用作抗原。实例包括H5型、H7型和H9型流感病毒。可选择地，当使用属于H1-H3型任意之一的流感病毒分离株作为抗原时，理想地，例如，使用在作为B细胞采集来源的个体出生前曾经流行过的亚型分离物。
编码各种亚型血凝素的cDNA序列是公知的；使用普通的基因重组技术可以产生任何期望亚型的重组血凝素。而且，根据上述非专利文献6中介绍的方法可以产生血凝素的三聚体胞外域结构。
用于固定抗原的有用载体包括在普通抗原-抗体反应或亲和色谱中使用的各种载体，例如不溶性多糖如琼脂糖、葡聚糖和纤维素；合成树脂如聚苯乙烯、聚丙烯酰胺和硅；包含玻璃、金属或类似物的微孔板、试管、膜、柱、球珠等；表面等离子体共振(SPR)传感器芯片，和类似物。对于抗原固定，可以使用物理吸附，也可以接受使用化学键合方法，其在蛋白或酶等的不可溶和固定化中使用。例如，优选使用生物素-(链霉)亲合素系统等。对于未结合噬菌体的清洗，可以顺次使用封闭溶液例如BSA溶液（一次或两次）、含有表面活性剂如吐温的PBS（3-5次）和类似物。有一个报道提到，使用柠檬酸缓冲液(pH5)或类似物是优选的。对于特异噬菌体的洗脱，通常使用酸（例如0.1M盐酸或类似物）；也可能使用特异蛋白酶切割（例如可以再抗体基因和包膜蛋白基因之间的连接位点中引入一个编码胰蛋白酶切割位点的基因序列；在这种情况下，甚至当所有包膜蛋白以融合蛋白形式表达时，也可能实现大肠埃希氏杆菌感染和扩增，因为被洗脱的噬菌体表面上存在野生型包膜蛋白），用可溶抗原竞争洗脱，或通过还原S-S键洗脱（例如在前述的CysDisplayTM中，在进行淘选之后，可以通过使用合适的还原剂使抗体和包膜蛋白解吸附，回收抗原特异性噬菌体）。当用酸进行洗脱时，洗脱物用Tris等中和，然后用洗脱的噬菌体感染大肠埃希氏杆菌，然后进行培养，之后通过传统方法回收噬菌体。
在将抗原固定到载体上时，有可能使用酵母展示在细胞膜表面上表达血凝素三聚体。
在通过淘选浓集呈递抗原特异性抗体的噬菌体之后，用噬菌体感染大肠埃希氏杆菌，并将细胞接种在平板上并进行细胞克隆。再次回收噬菌体，通过抗体滴度测定（例如ELISA、RIA、FIA等）或利用荧光激活细胞分选（FACS）或表面等离子体共振（SPR）的测量方法确认抗原结合活性。
用上面获得的噬菌体抗体克隆感染大肠埃希氏杆菌并从培养物上清回收抗体的步骤可以如下执行，例如，当使用在抗体基因和包膜蛋白基因之间的连接位点含有琥珀终止密码子的载体时，用噬菌体感染不具有琥珀突变的大肠埃希氏杆菌株（例如HB2151菌株），在周质或培养基中产生和分泌可溶抗体分子，用溶菌酶等裂解细胞壁，回收细胞外馏分，用与上面用于噬菌体展示载体的相同纯化技术纯化馏分。假如已经事先引入了His-标签或c-myc标签，使用IMAC、抗c-myc抗体柱子等可以容易地纯化抗体。当在淘选中使用特异蛋白酶进行切割时，通过蛋白酶对其发挥作用，可以从噬菌体表面分离抗体分子，从而通过执行相同的纯化操作可以纯化期望的抗体。在本发明中，因为当抗体是IgG型竞争抗体时，抗体的中和活性比Fab型高大约100-1000倍，所以从所得噬Fc菌体克隆回收质粒DNA，通过基因操作添加相应于连接IgG之Fc的结构域的序列，用其转化大肠埃希氏杆菌，并培养转化体，其操作如下面的实施例所述。用IgG琼脂糖柱纯化从培养物上清回收的抗体，然后测试其中和活性。
期望的抗体也可以通过如下的方法从使用EB病毒或细胞融合术获得永生的抗体产生细胞系中选出，例如，使先前用荧光物质标记的上述抗原与永生化细胞或融合细胞反应，然后用荧光激活细胞分选(FACS)法分离与抗原结合的细胞。在这种情况下，可以直接选出产生针对靶抗原的抗体的杂交瘤或永生B细胞，从而显著减轻克隆的劳动量。
可以使用各种方法克隆可产生针对靶抗原的单克隆抗体的杂交瘤。因为氨基喋呤会抑制许多细胞功能，所以优选地尽快从培养基中除去它。然而，人杂交瘤在融合后通常用含有氨基喋呤的培养基维持大约4-6周。理想地，在除去氨基喋呤后1周或更久时间后，除去次黄嘌呤和胸苷。当克隆出现并且直径达到大约1mm时，可以测量培养上清中的抗体含量。
抗体量可以用例如如下的方法测量，其中向上面吸附有靶抗原或其衍生物或部分肽的固相（例如微孔板）添加杂交瘤培养物，靶抗原等可以是单独吸附，或者与载体、抗-免疫球蛋白(IgG)抗体(针对来自于与所使用作为最初抗体产生细胞来源的动物属于相同物种的IgG的抗体)或蛋白A一起吸附，载体等事先用放射性物质（例如125I,131I,3H,14C)、酶（例如β-半乳糖苷酶、β-葡萄糖苷酶、碱性磷酸酶、过氧化物酶、苹果酸脱氢酶）、荧光物质（例如荧光胺、异硫氰基荧光素）、化学发光物质（例如鲁米诺、鲁米诺衍生物、虫荧光素、光泽精）或类似物标记，检测与固相结合的针对靶抗原的抗体；或者如下的方法，其中向上面吸附有抗-IgG抗体或蛋白A的固相添加杂交瘤培养物上清，添加用与上面相同的标记物标记的靶抗原或其衍生物或其部分肽，并检测与固定结合的针对靶抗原的抗体，等。
尽管通常使用有限稀释作为克隆方法，但是也可能使用软琼脂克隆或使用FACS克隆（如上所述）。通过有限稀释进行克隆可以通过例如如下的程序执行，然而不应认为这具有限制意义。
如上所述地测量抗体量，选择阳性孔。先前，选择合适的滋养细胞并添加到96孔板中。从抗体阳性孔吸取细胞，并悬浮在完全培养基中[例如补充了10%FCS（胎牛血清）和P/S的RMPI1640]，密度为30个细胞/mL；向添加有滋养细胞的96孔板添加0.1mL悬液（3个细胞/孔）；将部分剩余细胞悬液稀释成10个细胞/mL，并用相同的方法接种到其它孔中（1个细胞/孔）；将再剩余的细胞悬液稀释成3个细胞/mL，并接种到其它孔中（0.3个细胞/孔）。将这些细胞培养2-3周，直到出现肉眼可见的克隆；测量抗体量，选择阳性孔，并再次克隆。在人细胞情况下，克隆相对困难，因此还要准备含有每孔10个细胞的板。尽管通常通过两次亚克隆可以获得生产单克隆抗体的杂交瘤，但是理想地将再克隆规律性地重复更多个月，以确认其稳定性。
杂交瘤可以在体外或体内培养。
体外培养方法包括从孔板逐渐放大如上所述获得的产单克隆抗体的杂交瘤，同时将细胞密度保持在例如大约105-106个细胞/mL，并逐渐降低FCS浓度的方法。
体内培养方法包括例如将矿物油腹腔注射到小鼠体内（小鼠与杂交瘤的亲本株是组织相容的）诱导浆细胞骨髓瘤(MOPC)，5-10天后腹腔注射大约105-107个杂交瘤细胞，并2-5周后在麻醉状态下采集腹水。
单克隆抗体的分离和纯化根据免疫球蛋白的分离和纯化方法执行[例如盐析、乙醇沉淀、等电点沉淀、电泳、用离子交换剂（如DEAE,QEAE）吸附-解吸、超离心、凝胶过滤、通过抗原偶联固相或活性吸附剂如蛋白A或蛋白G选择性采集抗体的特异性纯化、和解交联吸附获得抗体，等]，其执行方式与普通的多克隆抗体制备和纯化方式相同。
如上所述，通过在温血动物体内或体外培养杂交瘤，并从体液或其培养物采集抗体，可以筛选与特殊血凝素亚型流感病毒结合的单克隆抗体。
这样获得的单克隆抗体是否能够超越组间的障碍中和流感病毒，可以通过检测对至少一种选自组1中的流感病毒和至少一种选自组2中的流感病毒的中和活性加以确定。
通常，对流感病毒的中和活性的研究常常通过血凝抑制(HI)试验加以执行。流感病毒通过血凝素头部区域，以呈递在红细胞表面上的含唾液酸的糖链（唾液酸的糖链，sialosugar chain）作为流感病毒受体，与红细胞结合。结果，流感病毒导致红细胞凝集。因为具有流感病毒中和活性的抗体会识别并结合血凝素，所以流感病毒的血凝性质被中和抗体抑制。因此，是否抑制血凝可以用作是否存在中和活性的指示。尽管参与血凝素凝血的区域可能经历抗原漂移，但是参与该区域唾液酸键合的氨基酸在流感病毒亚型中趋向于是高度保守的，提示具有广泛中和活性的本发明中和抗体可以识别该氨基酸作为表位。可选择地，本发明的中和活性测试方法包括，例如，灶形成抑制试验[J.Clin.Microbiol.Vol.28,pp.1308-1313(1990)]。具体地，流感病毒和宿主细胞在存在和不存在测试抗体的条件下彼此接触，并根据测试抗体是否显著抑制由于病毒感染宿主细胞导致的细胞灶形成，确定是否存在中和活性及其水平。
尽管待进行中和活性测试的流感病毒的亚型没有特殊限制，优选地包括组1中的至少H1型和/或H5型流感病毒和组2中的至少H3型流感病毒。可选择地，还优选地进一步测试对组1中H9型流感病毒和对组2中H7型流感病毒的中和活性。
对于在抗体分子中和活性测试中已经被确认中和至少一种选自组1的流感病毒和至少一种选自组2的流感病毒的抗体，使用产生该抗体分子的克隆可以大量产生该抗体分子。当所用抗体文库是噬菌体展示文库时，可以用呈递期望中和抗体Fab或scFv的噬菌体克隆感染大肠埃希氏杆菌，其可以被培养产生Fab型抗体或scFv型抗体，优选地将它们转变成IgG型抗体，以显著提高其中和活性。例如，Fab向IgG的转换，可以通过从噬菌体DNA切除编码VHCH1和VLCL的片段，将该片段插入到含有编码Fc区的片段的质粒中，构建包含编码重链和轻链的DNA的质粒，用其转染动物细胞例如CHO细胞，并培养细胞使之在培养物上清中分泌IgG型抗体。所获得的抗体可以通过已知的方法加以纯化和回收。
当所用抗体文库是通过用EB病毒或细胞融合加以永生化的B细胞制备的杂交瘤时，有可能如上所述地使杂交瘤在体外或体内生产抗体分子，通过传统方法纯化抗体，并回收抗体。
为了中和所得的抗体，有可能在体外模拟免疫系统所采用的步骤（体细胞突变和选择），以提高其对抗原的亲和性。抗体基因中的突变方法包括链重排、使用很可能缺乏修复系统的大肠埃希氏杆菌从而发生突变的随机突变、或易错聚合酶链反应（error-prone PCR）、CDR步移等。对抗原具有更高亲和性的中和抗体的筛选，可以通过从由突变产生的突变体文库中选择高亲和性中和抗体实现。例如，可以使用1)用低浓度的用于筛选的抗原回收具有高亲和力的抗体噬菌体的方法，2)用强冲洗条件回收不容易离开抗原的抗体噬菌体的方法，3)采用拮抗反应的方法，等。
如上所述获得的本发明中和抗体的种类大多利用VH1-69或VH1-e基因作为重链可变域V区。这个特征是各种迄今已经报道可以中和多种组1中亚型流感病毒的抗体所共有的；需要有兴趣地指出，尽管采用相同的V基因片段，但是在所显示的中和活性范围内存在一定的差异，本发明中和抗体的一个特征是，只使用VL1-44,VL1-47或VL1-51基因作为轻链可变域V区。另外，本发明的中和抗体在IgG型抗体的细胞灶形成抑制测试中具有10-11-10-12M量级的最小抑制浓度，比迄今已报道的所有可中和组1中多种亚型流感病毒的抗体显示出更高水平的中和活性。
抗体经过免疫球蛋白基因重排，即在B细胞分化过程中重链可变域V、D和J区的重组或轻链可变域V和J区的重组，之后在可变区的碱基序列中引入体细胞突变。结果，可以产生具有高抗原亲和性的可变区的抗体。因此，本发明中和抗体的种类，其是B细胞来源的抗体克隆，甚至可以包括具有在原始免疫球蛋白基因中通过体细胞突变产生的氨基酸序列的中和抗体。在中和抗体与流感病毒抗原形成抗原-抗体偶联时，所有与血凝素分子接触的点均存在于重链可变域内；因此重链可变域被认为是对流感病毒中和抗体的亲和性具有最基本贡献的位点；然而，在轻链可变域的突变中也观察到了收敛(convergence)，提示轻链可变域在本发明的中和抗体中也发挥某种作用。因此在本发明的中和抗体中，互补决定区3(CDR3)对抗原结合的贡献较小，所以重链可变域V区中存在的互补决定区1和2更重要。这里，重链可变域V区（轻链可变域V区）是指重排后构成重链（轻链）可变区的V区，并可以是包含例如框架区1、2、3和互补决定区1、2的区域。重链（轻链）可变区是指抗体的一部分，其不是Fab区的恒定区域，并且可以是包含例如框架区1、2、3和互补决定区1、2、3的区域。因此，本发明的中和抗体优选地是，例如，以序列号1氨基酸序列作为重链可变域互补决定区1，并以序列号2氨基酸序列作为互补决定区2的中和抗体。
本发明人还获得了如下克隆，其与其它克隆相比，对属于组1的H1、H2和H5型具有显著的中和活性，同时对属于组2的H3型流感病毒具有中和活性。该克隆与其它克隆不同，其结构在重链可变域的框架区1中缺少一个氨基酸（序列号27的第27位甘氨酸）。因此，重链可变域的框架区1由序列号3所示氨基酸序列构成的中和抗体也优选地作为本发明的中和抗体。
另一个具体的实例包括如下的中和抗体，其中重链可变域V区由序列号4-9中任一个所示的氨基酸序列构成的中和抗体，重链可变域由序列号10-15中任一个所示的氨基酸序列构成的中和抗体，重链可变域(序列号10-15)和轻链可变域(序列号16-26和70)由下面所示氨基酸序列组合其中之一构成的中和抗体。
(a)序列号10,序列号16;
(b)序列号10,序列号17;
(c)序列号10,序列号18;
(d)序列号10,序列号19;
(e)序列号10,序列号20;
(f)序列号10,序列号21;
(g)序列号10,序列号22;
(h)序列号11,序列号23;
(i)序列号13,序列号24;
(j)序列号14,序列号25;
(k)序列号15,序列号26:或
(l)序列号12,序列号70
实例还包括以序列号71-76所示碱基序列分别作为编码前述抗体(序列号10-15)重链可变域氨基酸序列的碱基序列，以序列号77-88所示碱基序列分别作为编码轻链可变域氨基酸序列(序列号16-26和70)的碱基序列。因此，本发明的中和抗体可以用如下的中和抗体举例，其中中和抗体的重链可变域由序列号71-76中任一个所示碱基序列编码的氨基酸序列构成，中和抗体的重链可变域和轻链可变域由如下所示碱基序列组合中的其中一个编码氨基酸序列构成。
(a)序列号71,序列号77;
(b)序列号71,序列号78;
(c)序列号71,序列号79;
(d)序列号71,序列号80;
(e)序列号71,序列号81;
(f)序列号71,序列号82;
(g)序列号71,序列号83;
(h)序列号72,序列号84;
(i)序列号74,序列号85;
(j)序列号75,序列号86;
(k)序列号76,序列号87;或
(l)序列号73,序列号88
这些发现证明，本发明的方法非常有用，因为它不仅提供了能够比通过传统方法获得的抗体显示更广范围中和活性的抗体，即超越了组间障碍，还提供了比通过传统方法获得的抗体具有更高中和活性的抗体。
由于其中和活性的广泛性，考虑通过本发明方法获得的流感病毒中和抗体的识别位点与传统中和抗体所识别的表位不同。如果本发明中和抗体识别的表位明确的话，那么包含该表位氨基酸序列（抗原氨基酸序列）的肽可以用作流感病毒的疫苗，包含编码该抗原肽的碱基序列的核酸（基因）可以用作流感测试剂和测试剂试剂盒。免疫反应表位可以用公知的方法加以鉴定；实例包括1)检查通过酶学或化学处理血凝素制备的有限降解产物与本发明获得的IgG型中和抗体之间的反应性的方法，2)检查通过参考氨基酸序列数据库合成的重叠肽与本发明获得的IgG型中和抗体之间的反应性的方法，等。
在转录和翻译后，血凝素作为前体经过糖基化；糖基化血凝素已知被切割成两个亚基(subunit)HA1和HA2。表1显示了各种流感病毒HA1和HA2亚基的氨基酸序列和序列号之间的对应关系。
[表1]
被报道的由三个组鉴定的、与H1和H5型有反应性的抗体与本发明的抗体具有如下的共同特征，即重链可变域中利用VH1-69；提示它们可能共有表位。因此，可以预期，该表位存在于HA2亚基（参与膜融合的区域）中。然而，出人意料的是，本发明人证明，本发明的中和抗体不与抗体(C179)竞争，C179与上述报道的抗体竞争表位(Nature Structural&MolecularBiology,Vol.16,pp.265-273,2009)。这支持如下的事实，即虽然均利用VH1-69，但是这些抗体并不共有表位。而且，本发明的中和抗体显示红细胞凝集抑制(HI)活性，提示它识别并结合HA1亚基（细胞受体结合区）。
VH1-69的CDR2区中存在的异亮氨酸（序列号27氨基酸序列中的第54位氨基酸）和苯丙氨酸（序列号27氨基酸序列中的第55位氨基酸）是连续的疏水氨基酸残基，已知会形成疏水性端部（hydrophobic tip），并与疏水簇相互作用。本发明中和抗体中的前述异亮氨酸被苯丙氨酸替代，提示对与疏水簇的结合能力具有一些影响。血凝素含有具有高度保守氨基酸的疏水口袋，即唾液酸结合位点，该位点被列为表位候选(Nature,Vol.333,pp.426-431,1988)。形成该唾液酸结合位点的氨基酸包括，例如，A/爱知/2/68流感病毒HA1等的第98位酪氨酸、第153位色氨酸、第155位苏氨酸、第183位组氨酸、第190位谷氨酸、第194位赖氨酸、第134-138位氨基酸、和第224-228位氨基酸（在不同亚型或株的流感病毒实例中，是相应的氨基酸）。因此，包含这些氨基酸的区域可能是表位。流感病毒的HA1已报道含有易积累突变的5个位点[A,B(B1,B2),C(C1,C2),D,和E区](P.A.Underwood,J.Gen.Virol.vol.62,153-169,1982;Wiley et al.,Nature,vol.289,366-378,1981)。在本发明中，A区是指序列号28中第121-146位氨基酸或者相应于该氨基酸区的区域；B1区是指序列号28中第155-163位氨基酸或者相应于该氨基酸区的区域；B2区指序列号28中第155-163位氨基酸或者相应于该氨基酸区的区域；C1区是指序列号28中第50-57位氨基酸或者相应于该氨基酸区的区域；C2区是指序列号28中第275-279位氨基酸或者相应于该氨基酸区的区域；D区是指序列号28中第207-229位氨基酸或者相应于该氨基酸区的区域；E区是指序列号28中第62-83位氨基酸或者相应于该氨基酸区的区域。因为本发明抗体的种类，特别是F045-092，与识别HA1中存在的A区、B1区和B2区邻近区域的抗体竞争，提示A和B区的邻近区域是表位。
因为本发明的中和抗体能够超越组的障碍中和所有血凝素亚型的流感病毒，所以是有效的预防和/或治疗手段，不仅针对由抗原漂移导致的季节性流感，而且针对由于抗原转变导致的大流行。因此，通过施加中和抗体，可以进行针对所有流感病毒亚型的被动免疫，其预期对已经感染由于任何流感病毒导致的流感的患者具有治疗效果，并且对恐怕会被流感病毒感染或者将会被感染的受试对象具有预防效果。此外，本发明的中和抗体被认为不太可能产生副作用，因为它是一种人体中已经存在的抗体。
本发明的中和抗体可以用作流感的被动免疫治疗剂，直接使用或者在通过与药物可接受的载体混合制备成药物组合物后使用。
这里，作为药物可接受的载体，可以使用通常用作药物材料的各种有机或无机载体物质，它们可以被制成赋形剂、溶剂（分散剂）、助溶剂、悬浮剂、稳定剂、等渗剂、缓冲剂、pH调节剂、镇痛剂等。根据需要也可以使用药物添加剂如防腐剂和抗氧化剂。
合适的赋形剂实例包括乳糖、蔗糖、D-甘露糖、D-山梨糖、淀粉、α淀粉、糊精、晶状纤维素、低取代羟丙基纤维素、羧甲基纤维素钠、阿拉伯树胶、普鲁兰多糖、轻质硅酸酐(light silicic anhydride)、合成硅酸铝、偏铝硅酸镁(magnesium metasilicoaluminate)等。
合适的溶剂实例包括注射用水、生理盐水、林格氏溶液、酒精、丙二醇、聚乙二醇、芝麻油、玉米油、橄榄油、棉籽油等。
合适的助溶剂实例包括聚乙二醇、丙二醇、D-甘露醇、海藻糖、苯甲酸苄酯、乙醇、三羟甲基氨基甲烷、胆固醇、三乙醇胺、碳酸钠、柠檬酸钠、水杨酸钠、醋酸钠等。
合适的悬浮剂实例包括表面活性剂如硬脂酸三乙醇胺（stearyltriethanolamine）、十二烷基硫酸钠、十二烷基丙酸（laurylaminopropionic acid）、卵磷脂、苯扎氯铵、苄索氯铵，和单硬脂酸甘油酯；亲水聚合物如聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、羟甲基纤维素、羟乙基纤维素和羟丙基纤维素；聚山梨酯、聚氧乙烯硬化蓖麻油（polyoxyethylene hardened castor oil）等。
合适的稳定化剂实例包括人血清白蛋白（HSA）、焦亚硫酸钠、保险粉(Rongalite)、偏亚硫酸氢钠（sodium hydrogen metasulfite）等。
合适的等渗剂实例包括氯化钠、甘油、D-甘露醇、D-山梨醇、葡萄糖等。
合适的缓冲剂实例包括缓冲液，例如磷酸盐缓冲液、醋酸盐缓冲液、碳酸盐缓冲液和柠檬酸盐缓冲液等。
合适的pH调节剂实例包括酸或碱，例如盐酸和氢氧化钠。
合适的镇痛剂实例包括苯甲醇等。
合适的防腐剂实例包括对邻羟基苯甲酸酯、三氯叔丁醇、苯甲醇、苯乙醇、脱氢乙酸、山梨酸等。
合适的抗氧化剂实例包括亚硫酸盐、抗坏血酸盐等。
前述药物组合物的剂型实例包括，可注射制备物如注射剂（例如皮下注射、静脉内注射、肌内注射、腹腔注射、动脉内注射等）、滴注等。
这些药物组合物可以通过制药技术领域中常用的方法加以生产，例如日本药典等介绍的方法。制备药物制备物的具体方法在下文有详细介绍。药物组合物中的抗体含量可以根据剂型、剂量等改变，例如占重量的大约0.1%-100%。
例如，注射剂的生产可以通过在水溶剂（例如蒸馏水、生理盐水、林格氏溶液等）或油性溶剂（例如植物油如橄榄油、芝麻油、棉籽油和玉米油、丙二醇等）中，将抗体与分散剂（例如聚山梨酯80、聚氧乙烯氢化蓖麻油60、聚乙二醇、羧甲基纤维素、海藻酸钠等）、防腐剂（例如羟苯甲酯、羟苯丙酯、苯甲醇、三氯叔丁醇、苯酚等）、等渗剂（例如氯化钠、甘油、D-甘露醇、D-山梨醇、葡萄糖等）和类似物一起溶解、悬浮或乳化。如果期望，可以使用添加剂，例如助溶剂（如水杨酸钠、醋酸钠等）、稳定化剂（例如人血清白蛋白等）和镇痛剂（如苯甲醇等）。这些注射液可以经过灭菌处理，例如根据需要使用膜滤器等的过滤灭菌，并且通常填充在合适的容器内，例如安瓿。
注射剂也可以通过溶解（分散）通过用真空干燥等方法处理上述液体制备成的粉末，获得新鲜供给加以使用。真空干燥的方法实例包括冷冻干燥和使用Speedback浓缩器(SAVANT Company)的方法。当进行冷冻干燥时，优选地使用实验室烧瓶或工业设备中的托盘或小瓶将样品冷却到-10°C以下冻干。当使用Speedback浓缩器时，在大约20mmHg或更低，优选的大约10mmHg或更低的真空下在大约0-30°C进行冻干。优选地，向待干燥的液体添加缓冲剂，例如磷酸盐，使pH为大约3-10。通过冻干获得的粉末制备物作为长期稳定的制备物，在使用前，可以通过溶解在注射用水、生理盐水、林格氏溶液等中，或者通过分散在橄榄油、芝麻油、棉籽油、玉米油、丙二醇等中，制备成新鲜的注射剂。
根据需要，上述抗体可以和另一种治疗药物组合使用。治疗剂的实例包括达菲、乐感清(Relenza)、金刚烷胺等。
可选择地，根据需要，上述抗体可以和另一种治疗药物偶联。抗体将药物运输到流感病毒存在的位置或其附近，并抑制病毒进入细胞，在那里，药物杀死病毒或治疗、减轻或缓解流感症状。药物的实例包括所有已用作或者将用作流感治疗药物的药物。这些药物是，例如，合成或天然存在的，低分子量或高分子量，蛋白，非蛋白，核酸或核苷酸物质。抗体与药物的偶联优选地通过连接子实现。连接子的一个实例是如下的连接子，其包含取代或未被取代的脂肪族亚烷基链，在其两端具有能够和抗体或药物结合的功能基团，例如N-羟基琥珀酰亚胺基、酯基、巯基、亚氨碳酸基、醛基等(KoutaiKogaku Nyumon,Chijin Shokan,1994)。
抗体还可以被包裹在脂质体中，以便根据需要将药物输送到细胞内。优选的脂质体包括正电荷脂质体、正电荷胆固醇、跨膜肽结合脂质体等(MamoruNakanishi et al.,Protein,Nucleic Acid and Enzyme,44:1590-1596(1999),Shiroh Futaki,Kagaku To Seibutsu,43:649-653(2005),Clinical CancerResearch59:4325-4333(1999)等)。
本发明的中和抗体通过非经口途径给药，例如静脉内、腹腔内、肌肉内、皮下、透皮给药等。活性成分抗体含量的实例为，但不仅限于，对于成人患者，每个剂量100-2,500μg/mL，或者每公斤体重1.0-10mg。剂量频率为，例如，每1-2周一次，给药一到数次，或者每2-3周一次，给药大约2个月。
本发明的中和抗体不仅可用于预防和/或治疗人类流感，还可以用于预防和/治疗禽类流感，例如鸡，和非人哺乳动物，例如猪和马，通过向这些动物给药，可以提前降低人类感染的风险。当向动物应用本发明的中和抗体时，可以使用如上相同的制备药物制备物的技术。
本发明的中和抗体是通过筛选最初存在于人体中的抗体分离得到的。有理由认为，这些抗体已经以一定的频率被人类携带，而不是极其罕见地出现。因此，能够产生本发明中和抗体的个体可认为也对新型流感耐受。同时，缺少产生这类抗体的能力的个体可以被称作受到有可能被新型流感感染的威胁。假如能够通过相对方便的程序确定是否携带该中和抗体，就能够判断对非中和抗体携带者理想地优先进行被动免疫预防措施。
因此，本发明还提供了在受试对象检测本发明中和抗体的方法，包括如下步骤：
(1)向受试对象接种H1型～H16型中任一项的亚型的血凝素，
(2)接种后，在抗体产生细胞已充分地扩增时，从受试对象采集血液，和
(3)考察该血液中是否存在呈递下述抗体的抗体产生细胞，所述抗体结合选自组1的亚型的血凝素和选自组2的亚型的血凝素这二者，并且具有由VH1-69或VH1-e基因编码的重链可变域V区，或者
包括如下步骤的方法：
(1)向受试对象分别接种选自组1的亚型的血凝素和选自组2的亚型的血凝素，
(2)各血凝素接种后，在抗体产生细胞已充分地扩增时，从受试对象采集血液，和
(3)考察各血液中是否存在呈递下述抗体的抗体产生细胞，所述抗体结合选自与所接种了的凝血素不同的组的亚型的血凝素，并且具有由VH1-69或VH1-e基因编码的重链可变域V区。
为了以少量采血来检测到目的中和抗体，需要将产生期望抗体的B淋巴细胞增殖和浓集。因此，本发明通过引入血凝素接种，对属于不同组的血凝素的结合活性为指标，并利用本发明中和抗体大多数种类共有的V基因片段，检测该中和抗体是否存在。
下文通过参考实施例对本发明进行更详细的解释，实施例只是举例，不用于限制本发明。
[实施例]
采血
通过单采血液成分术从一位1974年出生的儿科医师采集相当于3L血量的单核细胞。采血在2004年5月进行。
人噬菌体抗体文库的制备
人噬菌体抗体文库通过噬菌体展示方法制备。从采血获得的血液组分中通过Ficoll-Paque回收了大约109个淋巴细胞，分离了RNA。从RNA扩增cDNA分，别构建抗体的重链（VH）和轻链（VL）文库。重链和轻链的克隆数目分别为大约109个和106个。然后，组合重链和轻链，构建Fab-cp3型人噬菌体抗体文库，其是包含大约1010个克隆的文库。
所用的流感病毒株
在本实施例中使用如下的流感病毒株。除非另外指出，否则下面实施例中的缩写表示如下的流感病毒株。
(H3N2型)
Aic68:A/爱知/2/68,Fuk70:A/福冈/1/70,Tok73:A/东京/6/73,Yam77:A/山梨/2/77,Nii81:A/新泻/102/81,Fuk85:A/福冈/C29/85,Gui89:A/贵州/54/89,Kit93:A/北九州/159/93,Syd97:A/悉尼/5/97,Pan99:A/巴拿马/2007/99,Wyo03:A/怀俄明/3/2003,NY04:A/纽约/55/2004
(H1N1型)
NC99:A/新喀里多尼亚/20/99,SI06:A/所罗门群岛/3/2006
筛选
筛选通过淘选方法(panning method)执行。将通过福尔马林处理灭活的流感病毒株涂布到免疫管上，随后进行涂布在管内的病毒株与噬菌体抗体文库之间的抗原-抗体反应。用PBS清洗管后，用酸洗脱与抗原结合的噬菌体，然后立即中和和回收。用回收的噬菌体感染大肠埃希氏杆菌，计算回收率，并制备噬菌体抗体。使用该噬菌体，重复上述操作。该操作进行三次，并用洗脱的噬菌体感染大肠埃希氏杆菌，其随后在LBGA平板上培养过夜，得到单集落。将该单集落分离，制备Fab-cp3抗体，通过ELISA确认抗体对用于筛选的病毒株的结合活性。使用显示了结合活性的克隆作为阳性克隆，进行进一步的分析。
Fab-cp3型抗体的制备
将用筛选中获得的噬菌体感染了的大肠埃希氏杆菌接种到含有0.05%葡萄糖、100μg/ml氨苄青霉素和1mM IPTG的YT中，30°C振荡培养过夜。通过离心回收含有大肠埃希氏杆菌分泌的Fab-cp3型抗体的培养物上清，用于ELISA、竞争ELISA、Western blotting、流式细胞术等实验。
ELISA
将通过福尔马林处理灭活的病毒株溶液添加到96孔Maxisorp酶标板中，在37°C涂布1小时。从孔去除病毒溶液，添加5%BSA/PBS封闭1小时。除去BSA溶液后，添加含有Fab-cp3型抗体的大肠埃希氏杆菌培养物上清，并反应1小时。用补充有0.05%Tween20的PBS（PBST）清洗之后，添加兔抗-cp3抗体，反应1小时。用PBST进一步清洗后，添加羊抗-兔IgG(H+L)-HRP，并反应1小时。用PBST清洗后，添加OPD溶液，其是HRP的底物，并在室温下反应，然后通过2N硫酸终止反应，之后在492nm波长下测量OD。除非另外指出，否则所有反应在37°C下进行。
分离的抗体克隆的序列分析
对病毒抗原显阳性的克隆的重链（VH）和轻链（VL）的碱基序列，通过测序反应加以确认。
分离的克隆的分组
在确认了克隆的VH碱基序列之后，将序列转变成氨基酸序列，并在分离的克隆之间进行比较该序列。以VH的氨基酸序列的相似性，特别是CDR3序列中的相似性为中心，将克隆分组。
Western blotting
对福尔马林处理了的病毒株，在非还原性状态下进行SDS-PAGE来分离级分，并转印到PVDF膜上。PVDF膜用补充有2.5%脱脂奶的PBST封闭1小时，然后用PBST清洗，并与培养物上清中的Fab-cp3型抗体反应1小时。用PBST清洗后，将膜与兔抗-cp3抗体反应1小时，用PBST进一步清洗后，与羊抗-兔IgG(H+L)-HRP反应1小时。用PBST清洗后，膜与ECL溶液反应4-5分钟，用CCD相机检测条带。所有的反应在室温下进行。
Fab-pp型抗体的制备
将Fab-cp3型抗体的质粒DNA通过遗传工程转变成Fab-pp型（PP是蛋白A的Fc结合域），然后转化大肠埃希氏杆菌。将大肠埃希氏杆菌接种到补充有0.05%葡萄糖、100μg/ml氨苄青霉素和1mM IPTG的YT中，30°C过夜振荡培养。通过离心回收含有大肠埃希氏杆菌分泌的Fab-pp型抗体的培养物上清，用硫酸铵沉淀后，溶解于PBS中，用IgG-琼脂糖柱纯化，用于HI活性、病毒中和活性等实验。
HI活性测量
将纯化的Fab-pp型抗体用PBS系列稀释，分别以每孔4HA/单位的病毒溶液混合，在室温下反应1小时。添加血红细胞并混和后，在室温下反应30min-1h。结果以抗体的稀释倍率表示。
从N文库分离的克隆对H3N2流感病毒株的结合活性
将由N文库筛选而分离的抗体的克隆的、对用于筛选的12种H3N2病毒株、以及对于1种H1N1病毒株的结合活性，以ELISA结果显示。是确定筛选而分离的克隆对病毒株显示何种交叉反应的实验。结果如图1所示。
分离的克隆按照针对各病毒的结合活性程度而分组。最左边表示组号。克隆名称右侧的“分离的克隆数目”列，是表示筛选而分离的克隆中显示相同VH氨基酸序列的克隆的数目，其再右侧的“分离的病毒株”表示这些克隆是以何种病毒株而筛选分离的。
ELISA的数值处理如下：
大于等于1：红色
小于1、大于等于0.5：桔色
小于0.5、大于等于0.1：黄色
小于0.1：白色
最右面的Western Blotting(WB)列仅显示了进行了实验的克隆的结果。在HA位置可以检测到条带的克隆被表记为“HA”，对在其它位置检测到条带的克隆表记为“？”，因为目前并不知道它们识别的是什么。空栏表示没有进行实验。
N文库筛选结果
显示了在H3N2株的各筛选中拣到的克隆数目（在用ELISA确认之前），以及它们之中的属于组11和组22的克隆（图1）是用哪种病毒株筛选而分离的(图2)。
组11是将H3-H1两株作为抗原而识别的抗体克隆的组，组22是识别所有的12种H3株、但不识别H1株的抗体克隆的组。
属于组11的克隆的分离情况
显示了属于组11的各个抗体克隆分离时的筛选病毒株，以及筛选中分离到的数目(图3)。
显示了基于各克隆的VH序列（未考虑VL序列），具有相同VH序列的克隆的分离数目。
属于组11的克隆的氨基酸序列
图4显示了属于组11的克隆的VH和VL的氨基酸序列。
(1)VH氨基酸序列
根据用NCBI的IgBlast进行的种系检索，发现属于组11的克隆与IGHV1-69*01具有最高的相同度。因此，判断IGHV1-69*01为种系。
由该结果，在IGHV1-69*01和各克隆之间进行VH氨基酸序列比较。“与种系的相同度（%）FR1-FR3”是与IGHV1-69*01的FR1-FR3氨基酸序列的相同度计算结果。此外，与IGHV1-69*01的氨基酸序列进行比较的结果，将具有不同氨基酸的部分用不同的颜色突出显示。然而，至于CDR3和FR4，克隆的各序列之间不同的氨基酸用不同的颜色突出显示。
(2)VL氨基酸序列
迄今为止，已经分离了15个与F022-360具有相同VH氨基酸序列的克隆。对其中12个克隆的VL序列进行序列分析，结果鉴定了是7种VL。结果发现，F022-360具有的VH序列中有7种VH-VL组合。在这7种组合中，灰色突出显示的VL序列是F022-360的组合。对于具有其它VH序列的克隆，由于仅确认了表记的克隆的VL序列，因此，迄今为止仅确认了一种类型的组合。F026-245的VL序列尚未被确认。
与VH相似，根据NCBI的IgBlast检索结果，以具有最高相同度的种系作为各VL的氨基酸序列的种系。因为检测到了一些、大约3种的种系，所以基于IGLV1-44*01将各克隆的序列进行比较。将不同的氨基酸用其它颜色突出显示。
先前已报道的可以中和H1和H5并且克隆种系为1-69的抗体克隆、与
属于组11的克隆之间的VH氨基酸序列的比较
先前已有三篇文献（精确地讲，4篇文献）报道了可以中和H1-H5两株的人抗体，它们所有的克隆的种系均为IGHV1-69。因此，将这些克隆与IGHV1-69*01种系和属于组11的克隆的氨基酸序列进行比较（图5）。
与IGHV1-69*01相同的氨基酸用条棒(bars)显示。
各文献的卷和页如下：
2009Nat.Struct.Mol.Biol.:Vol.16265-273
2009Science:Vol.324246-251(2008PLoS One:Vol.3e3942是与该克隆分离相关的文献)
2008PNAS:Vol.1055986-5991
属于组11的克隆的对于H3N2流感病毒株的结合活性
属于组11的克隆对于在筛选中使用的H3病毒株12种和H1病毒株的结合活性，通过ELISA进行了确认。对各病毒株的测定一式两份进行，并计算平均值和标准差（图6）。
属于组11的克隆的Western blotting
这些实验为显示属于组11的克隆识别H3和H1病毒株的HA的实验（图7）。
所有样品均在非还原状态下进行SDS-PAGE。
图7上半部分显示了关于F022-360和F045-092的数据，图7下半部分显示了关于F026-146和F026-427的数据。左右之间的差异是数据捕获的曝光时间的差异。
F032-093是针对H3株A/北九州/159/93的HA的阳性对照，F078-155是针对H1株/新喀里多尼亚/20/99的HA的阳性对照。
属于组11的克隆的HI活性
对属于组11的克隆是否具有HI活性进行了确认（图8）。
HIU以抗体浓度从100μg/ml以2倍递增稀释时的稀释倍率来表示。
Fab-pp型抗体的中和活性
对属于组11的克隆是否中和H3和H1流感病毒株进行了确认（图9）。
添加250和100μg/ml的Fab-pp型抗体时，以%抑制来表示灶(focus)形成的抑制率。
Fab-p3对C179ELISA活性的抑制
在存在或不存在Fab-p3抗体(F022-360,F026-146,F026-427,F045-092,F005-126;F005-126是不与甲型流感苏联型(Sobiet Union type Influenza A)新喀里多尼亚病毒株HA反应的阴性对照)的条件下，将可中和甲型流感苏联型新喀里多尼亚病毒株的小鼠单克隆抗体C179与已经吸附了该病毒株疫苗的免疫平板反应。然后，免疫平板与HRP标记的抗小鼠IgG（MBL公司生产）反应，并通过OPD显色，以检测与疫苗结合了的C179。
在存在和不存在Fab-p3抗体(F022-360,F026-146,F026-427,F045-092,F005-126)时，所观察到的ELISA数值没有显著差异（图10）。因此，发现C179与疫苗的反应不被F022-360,F026-146,F026-427或F045-092抑制。这提示C179与F022-360,F026-146,F026-427或F045-092的识别表位不同。
C179对Fab-p3的ELISA活性的抑制
在存在或不存在C179的条件下，使Fab-p3抗体(F022-360,F026-146,F026-427,F045-092,F005-126)与已经吸附了甲型流感苏联型新喀里多尼亚病毒株疫苗的免疫平板反应。然后免疫平板与兔抗-p3多克隆抗体反应，随后与HRP标记的抗兔IgG（MBL公司生产）反应，并通过OPD显色，以检测与疫苗结合了的Fab-p3抗体。
在存在和不存在C179时，所观察到的ELISA数值没有显著差异（图11）。因此，发现F022-360,F026-146,F026-427或F045-092与疫苗的反应不被C179抑制。这提示F022-360,F026-146,F026-427或F045-092与C179的识别表位不同。
Fab-p3对F005-126的ELISA活性的抑制
在存在或不存在Fab-p3抗体(F022-360,F026-146,F026-427,F045-092,F005-126,F019-102;F019-102是不与甲型流感香港型爱知病毒株反应的阴性对照)的条件下，使Fab-PP型单克隆抗体F005-126与已经吸附了甲型流感香港型爱知病毒株的疫苗的免疫平板反应。然后，免疫平板与HRP标记的兔IgG反应，并通过OPD显色，以检测与疫苗结合了的Fab-PP型F005-126。
F005-126是不与甲型流感苏联型新喀里多尼亚病毒株反应，但广泛与多种甲型流感香港型病毒株反应并中和它们的抗体。因为F022-360,F026-146,F026-427和F045-092也广泛地与多种甲型流感香港型病毒株反应，因此设想可能有相近的识别表位。出于这个原因，进行了与F005-126的竞争抑制实验。当在存在Fab-p3抗体(F022-360,F026-146,F026-427,F045-092,F019-102)和不存在的条件下，使Fab-PP型F005-126与甲型流感香港型爱知病毒株的疫苗反应时，所观察到的ELISA数值没有显著差异（图12）。在作为阳性对照的Fab-p3型F005-126的存在下，ELISA数值显著降低。因此，发现F005-126与疫苗的反应性不被F022-360,F026-146,F026-427或F045-092抑制。这提示F005-126与F022-360,F026-146,F026-427或F045-092所识别的表位不同。
F026-427和F045-092对293T细胞上表达的HA的反应性
将甲型流感香港型山梨病毒株的HA基因插入到表达载体pNOW的克隆位点，制备pNOW-Yam77HA。pNOW-Yam77HA与lipofectamine LTX混合，并添加给93T细胞进行转染。培养24小时后，回收被转染的细胞，随后用2.5%BSA-PBS-0.05%Na-N3在4°C封闭30min，与Fab-p3抗体(F026-427,F045-092,F008-038)在4°C反应30min（F008-038时不与山梨病毒株HA反应的阴性对照）。然后，将细胞与兔抗-p3多克隆抗体反应，然后与Alexa488-标记的抗兔IgG（Pierce生产）反应，进行FACS分析。相似地，作为阳性对照，细胞与甲型流感香港型小鼠单克隆抗体F49反应，然后与Alexa488-标记的抗小鼠IgG（Pierce生产）反应，进行FACS分析。
与不和甲型流感香港型山梨病毒株HA反应的阴性对照F008-038相比，F026-427和F045-092的FACS出现了峰漂移（图13）。因此，F026-427和F045-092被认为是针对山梨病毒株的抗体。
针对流感病毒的完全人IgG的中和活性的测量
[样品和试剂]
1.纯化的完全人IgG抗体
F026-427(批号100614),F045-092(批号100614)
2.病毒
使用如下的病毒株。
人H3N2;A/爱知/2/1968株,A/北九州/159/1993株
禽H3N8;A/虎皮鹦鹉/爱知/1/1977株
大流行H1N1;A/Suita/1/2009pdm株
猪H1N1;A/猪/北海道/2/1981株
人H1N1;A/新喀里多尼亚/20/1999株
人H2N2;A/Okuda/1957株
禽H2N2;A/鸭/香港/273/1978株
禽重配H5N1;
A/鸭/蒙古/54/2001(H5N2)株HA x A/鸭/蒙古/47/2001(H7N1)株NA x A/鸭/北海道/49/98(H9N2)株内部（internal）
人H5N1;A/越南/1194/2004株
人H5N1;A/安徽/1/2005株
人H5N1;A/印度尼西亚/5/2005株
3.细胞核介质
MDCK细胞在含有10%FCS的MEM中亚培养，对于中和测试和病毒感染后的培养，使用含有0.4%BSA而不含FCS的MEM。
4.用于PAP染色的试剂
针对流感A NP的小鼠单克隆抗体(C43)
针对小鼠IgG（整个分子）的兔抗血清cappel55436
针对兔IgG（整个分子）的羊抗血清cappel55602
兔过氧化酶抗过氧化物酶(PAP)cappel55968
3,3’-二氨基联苯胺四盐酸盐Sigma D5637
过氧化氢特级试剂Sigma-Aldrich13-1910-5
[实验方法]
制备具有各自克隆F026-427和F045-092的VH和VL氨基酸序列的人IgG抗体，并用于中和测试。将每种纯化人IgG抗体溶液用含有0.4%BSA的MEM稀释为250μg/mL和100μg/mL，并且用100μg/mL溶液作为储液进行4倍系列稀释。对于所得的每种稀释抗体溶液，添加等量的每种亚型被调节成100FFU的流感病毒溶液，之后在37°C进行1小时中和反应。在96孔板中对最初在含有10%FCS的MEM中亚培养的MDCK细胞进行单层培养，用PBS(-)清洗后，使用30μL/孔的、在中和反应后补充了反应溶液的含有0.4%BSA的MEM，在37°C与病毒吸附1小时。除去中和溶液，用PBS(-)清洗一次后，以50μL/孔添加含有0.4%BSA的MEM，在CO2存在下在37°C培养16小时。除去培养溶液后，用100%乙醇固定细胞，并干燥。随后，用酶抗体技术（PAP方法）对感染细胞进行染色，通过计数显微镜下被感染细胞的数量，计算感染抑制率。结果如图14所示。
F026-427显示对人H3N3株、禽H3N8株、人H1N1株和人H2N2株显示中和活性，并对人H5N1株有弱的中和活性。另一方面，F045-092对人H3N2株、禽H3N8株、人H1N1株、人和禽H2N2株显示中和活性，并对人和禽H5N1株有弱中和活性。上面的结果提示，F026-427和F045-092对人来源病毒株和禽来源病毒株显示反应性，除了少数例外之外，对猪来源的病毒株无反应性。
F026-427和F045-092对293T细胞上表达的HA0和HA1的反应性
将甲型流感/H3N2型爱知病毒株的HA0和HA1基因插入到表达载体pDisplay的克隆位点，制备pDisp-Aic68HA0和pDisp-Aic68HA1。以相同的方式，将甲型流感/H3N2型福冈病毒株的HA0和HA1基因插入到表达载体pDisplay的克隆位点，制备pDisp-Fuk85HA0和pDisp-Fuk85HA1。将这四种质粒每一个与lipofectamine LTX混合，并添加到293T细胞进行转染。同时制备仅向293T添加了lipofectamine LTX而没有质粒的样品，作为阴性对照（模拟转染）。培养24小时后，回收转染的细胞，用2.5%BSA-PBS-0.05%Na-N3在4°C封闭30min，随后与Fab-PP抗体(F026-427PP,F045-092PP)、
抗甲型流感/H3N2型抗体F49或兔抗-V5标签抗体在4°C反应30min。对于阳性对照，抗流感A/H3N2型爱知病毒株的Fab-PP抗体F003-137PP，在4°C与被pDisp-Aic68HA0和pDisp-Aic68HA1转染的细胞和模拟转染的细胞反应30min。类似地，对于阳性对照，甲型流感/H3N2型福冈县病毒株的Fab-PP抗体F019-102PP，在4°C与被pDisp-Fuk85HA0和pDisp-Fuk85HA1转染的细胞和模拟转染的细胞反应30min。然后，分别将与Fab-PP型抗体反应的细胞与Alexa488-标记的抗人IgG（Pierce生产）反应，将与F49反应的细胞与Alexa488-标记的抗小鼠IgG（Pierce生产）反应，将与兔抗V5标签抗体反应的细胞与Alexa488-标记的抗兔IgG（Pierce生产）反应，并进行FACS分析。
与不表达HA的对照模拟转染细胞相比，F045-092PP与表达甲型流感/H3N2型爱知病毒株的HA0和HA1和甲型流感/H3N2型福冈县病毒株的HA0和HA1的细胞反应，造成FACS中峰漂移（图15-1）。与不表达HA的对照模拟转染细胞相比，F026-427PP与表达甲型流感H3N2型爱知病毒株的HA0和HA1的细胞有微弱反应，造成FACS中峰漂移（图15-2）。作为用于确认HA0和HA1表达的抗体的V5标签抗体，显示在任何HA0和HA1表达细胞中均被充分表达。另外，F004-137PP和F019-102PP足以分别和HA0和HA1反应。F49与HA0反应，但不与HA1反应。
因为F026-427和F045-092与HA1反应，因此认为，这些抗体识别的表位存在于HA1分子上，并且其识别的表位与F49不同，其中F49与F026-427和F045-092具有同样地广泛的病毒株特异性。来自VH1-69种系的抗体近年已被报道具有广泛的病毒株特异性，其识别的表位主要位于HA2区，并被认为通过抑制融合活性发挥中和活性。然而，来自VH1-69种系的所述F026-427和F045-092的识别表位处于HA1区，并且从图8可以显见，因此认为，它们由于其HI活性而显示中和活性。尚没有具有这种性质的抗体的先例，因此，这是具有全新性质的抗体。而且，正如从图16可以显见，F026-427和F045-092的识别表位被认为在表位B的附近。
F004-104对ELISA活性的抑制
在存在IgG抗体(F026-427IgG,F045-092IgG,F004-104IgG)和不存在(无IgG)的条件下，将Fab-p3型单克隆抗体F026-427p3,F045-092p3和F004-104p3，和小鼠来源的抗甲型流感/H3N2型抗体F49，与已经吸附了甲型流感/H3N2型巴拿马病毒株疫苗的免疫平板反应。然后，为了检测与疫苗结合的Fab-p3抗体，与兔来源的抗-p3抗体反应，随后与HRP标记的抗兔IgG抗体反应，通过OPD显色。另外，为了检测F49，与HRP标记的抗兔IgG抗体反应，通过OPD显色。结果如图16所示。
完全观察到了在相同类型抗体之间ELSIA活性的显著抑制。F045-092IgG和F004-104IgG抑制F026-427p3,F045-092p3和F004-104p3任一个的ELISA活性。另外，F026-427IgG抑制F004-104p3的ELISA活性。另一方面，F026-427IgG不显著抑制F045-092p3，其被认为是由于F045-092与F026-427相比具有强得多的结合活性。对于F49，没有观察到IgG抗体对其ELISA活性有显著抑制。
通过逃逸突变分析，F004-104是识别表位位于HA1分子第159位和190位氨基酸序列附近的抗体（图17-1，图17-2）。通过竞争ELISA，F026-427和F045-092的识别表位被认为在F004-104的识别表位附近。因此，F026-427和F045-092的识别表位被推定位于HA1分子第159位和190位氨基酸序列附近。
F045-092和F026-427对第136位氨基酸突变的反应性
Aic68病毒株HA的第136位丝氨酸残基被苏氨酸(突变体Aic68S136T)或丙氨酸(突变体Aic68S136A)替换，制备突变体HA。在293T细胞上表达这些突变体和野生型Aic68病毒株Aic68wt，并与F026-427,F045-092,F003-137,F035-015或F033-038反应，之后通过流式细胞仪分析检测反应性。结果如图18所示。
结果，F035-015和F033-038针对这两种突变体的反应性没有变化。F045-092对Aic68S136T的反应性比对Aic68wt略微减弱。F045-092对Aic68S136A的反应性更弱。因为第136位丝氨酸残基的突变会影响F045-092对HA的识别，因此推定第136位残基是F045-092的HA识别表位或其附近的氨基酸。
F045-092对嵌合HA133A和142A的FCM分析
将Wyo03病毒株HA的142-146位氨基酸序列移植到Aic68病毒株HA的142-146位氨基酸序列中，制备嵌合HA(Aic68_142A)。相反，将Aic68病毒株HA的142-146位氨基酸序列移植到Wyo03病毒株HA的142-146位氨基酸序列中，制备嵌合HA(Wyo03_142A)。另一方面，将Aic68病毒株HA的142-146位氨基酸序列移植到Fuk85病毒株HA的142-146位氨基酸序列中，制备嵌合HA(Fuk85_142A)。进一步，将Wyo03病毒株HA的133-137位氨基酸序列移植到Fuk85病毒株HA的133-137位氨基酸序列中，制备嵌合HA(Fuk85_133A)。在293T细胞上表达这些突变体和野生型Aic68病毒株HA(Aic68_Wild),野生型Wyo03病毒株HA(Wyo03_Wild),野生型Fuk85病毒株HA(Fuk85_Wild)，随后与F045-092反应，之后通过流式细胞仪分析检查反应性（EMAC方法[通过嵌合分析进行表位作图]；Okada等,Journal ofGeneral Virology,vol.92,326-335,2011）。结果如图19和20所示。
F045-092与Aic68_Wild现实足够强的反应性，但与移植了Wyo03病毒株HA142-146位氨基酸序列的嵌合Aic68_142A反应弱。这证明，Wyo03病毒株的142-146位氨基酸序列可抑制F045-092对HA的识别。Wyo03病毒株的142-146位氨基酸序列具有许多相对高分子量的氨基酸残基，提示当抗体与HA结合时造成空间障碍的可能性。另一方面，F045-092与Fuk85_Wild反应非常弱，但与移植了Wyo03病毒株HA133-137位氨基酸序列的嵌合Fuk85_133A反应强烈。为了影响F045-092对HA的识别，认为133-137位氨基酸序列优选地是Wyo03病毒株类型，而非Fuk85病毒株类型。因此，推定133-137位氨基酸序列是F045-092的识别表位，或者位于其附近。
竞争研究中使用的抗-HA抗体的HA1抗原识别位点
从蛋白质数据库（Protein Data Bank）下载H3的HA X-射线晶体结构分析文件(1HA0)，用Rasmol2.7.5软件构建HA1区中91-260位氨基酸部分的三维结构（图21）。根据EMAC方法，预先预测每种H3N2流感病毒的每种H3N2抗体的抗原识别位点。例如对于F033-038，A区和B区被估计是Aic68病毒株HA的抗原识别位点。
与HA1A,B,C,D和E位点结合的抗-HA抗体与F045-092抗体间的竞
争研究
通过EMAC方法在已经鉴定了抗原上识别位点的抗-HA抗体(F041-342,F041-360,F019-102,F004-111,F033-038,F010-073,F010-014,F004-136,F010-077,F008-055,F008-038,F008-046,F010-032,F035-015,F037-115,F004-104,F003-137)与F045-092抗体之间进行竞争ELISA。结果如图22所示。
制备每种抗-HA抗体的Fab-pp和Fab-cp3型，并添加pp型抗体和cp3型抗体作为竞争者，对抗原进行竞争，之后测量pp型抗体对抗原的结合活性。具体地，将用福尔马林灭活的H3N2病毒株涂布在免疫平板上，用5%BSA封闭。每个50μl最佳浓度的Fab-pp抗体，和20μg/ml cp3型抗体F045-092，或通过20倍稀释大肠埃希氏杆菌培养物上清制备的Fab-cp3型抗体，封闭完全后，向免疫平板添加该混合物，37°C孵育1小时。用PBST清洗后，添加兔抗-链霉亲和素-HRP抗体，用以检测与抗原结合的pp型抗体，并进一步在37°C孵育1小时。清洗平板后，添加HRP底物OPD，并反应20min，然后用2N硫酸终止反应，之后用492nm波长测量样品OD。
所用H3N2型病毒株如下：
Aic68:A/爱知/2/68
Yam77:A/山梨/2/77
Syd97:A/悉尼/5/97
Pan99:A/巴拿马/2007/99
F045-092抗体根本不与识别C位点的F041-342和F041-360、识别E位点的F019-102、或同时识别C和E位点的F004-111抗体竞争，被认为不结合C和E位点。另一方面，同时识别A和B位点的抗-HA抗体(F033-038,F010-073,F010-014,F004-136,F010-077)与F045-092高度竞争。至于识别受体结合区周围A位点的抗体(F035-015)，仅识别B位点的抗体(F008-055,F008-038,F008-046,F010-032,F037-115,F004-104)和识别B2/D位点的抗体(F003-137)，尽管它们与F045-092抗体竞争，但是除F008-038之外的抗体，并没有提供与同时识别A和B位点的抗体相当的竞争结果。提示了F045-092抗体识别A和B位点，以及位于它们之间并且在病毒类型中具有高度氨基酸保守性的受体结合区的可能性。这与F045-092显示HI活性一致。
[工业适用性]
根据本发明，可以筛选对所有流感病毒亚型均显示中和活性的人抗体。本发明还有可能确定受试对象是否携带针对流感病毒的抗体。人类的一个重要任务就是开发用于防止新型病毒株大流行的方法，如果出现，用于检查传染扩散的方法，和开发真正有效的疫苗的方法，以赢得向许多人接种的时间。当前正在采用的措施包括实现全球病毒监视系统，大量储备治疗药物例如达菲，和开发、生产和大量储备疫苗，但是在新型病毒实际出现之前，没有人能够告知将会出现何种形式的新型病毒。作为一种新的有希望的解决方法，本发明将为公共健康和医疗做出巨大贡献。
本专利申请是基于在美国提出的临时专利申请Nos.61/380,051和61/452,785，和在美国提出的非临时专利申请No.13/198,147，本文引用了其全部内容。
Claims (30)
1.一种分离抗体，该抗体中和选自组1的至少一种流感病毒和选自组2的至少一种流感病毒，所述组1由H1型、H2型、H5型、H6型、H8型、H9型、H11型、H12型、H13型和H16型流感病毒构成，所述组2由H3型、H4型、H7型、H10型、H14型和H15型流感病毒构成。
2.根据权利要求1的抗体，其中，该抗体至少中和H1型和/或H5型流感病毒、并且中和H3型流感病毒。
3.根据权利要求1的抗体，其中，该抗体中和H1型-H16型流感病毒。
4.根据权利要求1的抗体，其中，重链可变域V区利用VH1-69或VH1-e基因。
5.根据权利要求4的抗体，其中，重链可变域V区具有氨基酸的缺失。
6.根据权利要求5的抗体，其中，由VH1-69或VH1-e基因编码的重链可变域V区中，至少具有缺失第27位甘氨酸的突变。
7.根据权利要求1的抗体，其中，轻链可变域V区利用VL1-44,VL1-47或VL1-51基因。
8.根据权利要求1的抗体，其中，该抗体在转变为IgG型抗体时的、在灶形成抑制试验中的最小抑制浓度为10-11-10-12M量级。
9.根据权利要求1的抗体，其是人抗体。
10.根据权利要求1的抗体，其中，重链可变域的互补决定区1由序列号1所示氨基酸序列构成，并且，互补决定区2由序列号2所示氨基酸序列构成。
11.根据权利要求10的抗体，其中，重链可变域的框架区1由序列号3所示氨基酸序列构成。
12.根据权利要求1的抗体，其中，重链可变域V区由序列号4-9中任一个所示的氨基酸序列构成。
13.根据权利要求1的抗体，其中，重链可变域由序列号10-15中任一个所示的氨基酸序列构成。
14.根据权利要求1的抗体，其中，重链可变域和轻链可变域分别由下述(a)～(l)中的任一个所示的氨基酸序列构成：
(a)序列号10和序列号16;
(b)序列号10和序列号17;
(c)序列号10和序列号18;
(d)序列号10和序列号19;
(e)序列号10和序列号20;
(f)序列号10和序列号21;
(g)序列号10和序列号22;
(h)序列号11和序列号23;
(i)序列号13和序列号24;
(j)序列号14和序列号25;
(k)序列号15和序列号26;和
(l)序列号12和序列号70.
15.一种用于流感的被动免疫治疗剂，其含有根据权利要求1的抗体。
16.一种用于流感的被动免疫治疗方法，该方法包括，向已被流感病毒感染的、或者存在被流感病毒感染的可能性的哺乳类或鸟类受试对象给药有效量的根据权利要求1的抗体。
17.根据权利要求16的方法，其中，受试对象是人。
18.一种生产根据权利要求1的抗体的方法，该方法包括以下步骤：
(1)提供包含抗体克隆的抗体文库，所述抗体克隆是来自从一个个体采集到的大约108个以上的B细胞，
(2)以H1～H16中任一个的流感病毒、或该病毒的血凝素蛋白、或其胞外域作为抗原，使其与抗体文库(1)接触，网罗性地筛选与该抗原反应的抗体克隆，
(3)由在步骤(2)中筛选到的各抗体克隆回收抗体分子，
(4)针对在步骤(3)中获得的各抗体，检测所述抗体对选自组1的至少一种流感病毒和选自组2的至少一种流感病毒的中和活性，和
(5)使用产生中和属于组1的流感病毒和属于组2的流感病毒这二者的抗体的克隆来产生该抗体，回收该抗体。
19.根据权利要求18的方法，其中，抗体是人抗体。
20.根据权利要求18的方法，其中，抗体文库是噬菌体展示文库。
21.根据权利要求20的方法，其中，抗体克隆的数目为1010～1011。
22.根据权利要求18的方法，其中，前述B细胞是通过单采血液成分术而采集到的。
23.根据权利要求18的方法，其中，在上述步骤(2)中，使用所述采集了B细胞的个体没有感染史的流感病毒分离株、或其血凝素蛋白、或其胞外域作为抗原。
24.根据权利要求23的方法，其中，所述流感病毒分离株是H1、H2或H3型。
25.根据权利要求23的方法，其中，所述流感病毒分离株属于所述采集了B细胞的个体没有感染史的血凝素亚型。
26.根据权利要求25的方法，其中，所述流感病毒分离株属于H5、H7或H9型。
27.根据权利要求18的方法，其中，在所述步骤(4)中，检测对至少H1型和/或H5型流感病毒和对H3型流感病毒的中和活性。
28.根据权利要求20的方法，其进一步包括将抗体转变成IgG型的步骤。
29.一种检测受试对象中的根据权利要求1的抗体的方法，该方法包括以下步骤：
(1)向受试对象接种H1型～H16型中任一项的亚型的血凝素，
(2)接种后，在抗体产生细胞已充分地扩增时，从受试对象采集血液，和
(3)考察该血液中是否存在呈递下述抗体的抗体产生细胞，所述抗体结合选自组1的亚型的血凝素和选自组2的亚型的血凝素这二者，并且具有由VH1-69或VH1-e基因编码的重链可变域V区。
30.一种检测受试对象中的根据权利要求1的抗体的方法，该方法包括以下步骤：
(1)向受试对象分别接种选自组1的亚型的血凝素和选自组2的亚型的血凝素，
(2)各血凝素接种后，在抗体产生细胞已充分地扩增时，从受试对象采集血液，和
(3)考察各血液中是否存在呈递下述抗体的抗体产生细胞，所述抗体结合选自与所接种了的凝血素不同的组的亚型的血凝素，并且具有由VH1-69或VH1-e基因编码的重链可变域V区。
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