CN103472102B - 基于阻抗分析的气味结合蛋白传感器的制备方法及应用 - Google Patents
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Landscapes
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Abstract
本发明公开了一种基于阻抗分析的气味结合蛋白传感器的制备方法及应用，本发明利用标准的MEMS工艺加工而成的平面叉指金电极阵列，使用硝酸纤维素膜处理叉指金电极表面，直接固定气味结合蛋白，获得所述阻抗传感器。利用阻抗和分子对接结合的分析方法，本发明将中华蜜蜂气味结合蛋白Acer-ASP2固定在叉指金电极上，用于花香物质和蜜蜂信息素的检测。本发明构建的电化学传感器可将气味结合蛋白稳定、简便地固定在叉指金电极表面，传感器检测灵敏度高，检测下限低，特异性强。
Description
技术领域
本发明涉及一种传感器件的制备技术，尤其涉及一种利用中华蜜蜂气味结合蛋白（Acer-ASP2）检测花香物质和蜜蜂信息素的电化学阻抗传感器制备方法以及阻抗传感技术与分子对接技术的联合应用分析方法。
背景技术
现阶段，花香物质和蜜蜂信息素等化学物质的检测主要通过质谱、荧光等方法，但是仪器设备精密，操作复杂。在生物传感领域，电化学阻抗检测技术由于其低成本、实时、无损、高通量、信号易于显示和处理而被广泛应用于细胞、蛋白特异性响应的检测当中。气味结合蛋白是一种胞外的低分子量疏水性蛋白，能够与目标分子特异性可逆结合。相较于嗅觉受体蛋白而言，气味结合蛋白更容易获取，结构稳定，可以作为生物敏感元件构建生物传感器。利用气味结合蛋白和阻抗传感器结合的优势，发展一种基于电化学阻抗谱分析的气味结合蛋白传感器，可以特异性的检测花香物质和蜜蜂信息素等化学物质，可以用于食品成分快速检测、昆虫养殖及害虫防治等领域。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种基于电化学阻抗分析的气味结合蛋白传感器的制备及应用。
本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：一种基于电化学阻抗分析的气味结合蛋白传感器的制备方法，包括以下步骤：
（1）加工叉指金电极阻抗传感器：以玻璃为基底，在玻璃上磁控溅射钛化钨薄膜作为粘附层，接着磁控溅射金薄膜作为电极层；用AZ光刻胶光刻出电极图形后，采用干法刻蚀将非电极区域刻蚀掉，得到叉指金电极，最后将芯片腔用环氧树脂胶封在玻璃基底上，制得叉指金电极阻抗传感器；
（2）固定气味结合蛋白：首先，依次使用无水乙醇和超纯水超声清洗步骤1得到的叉指金电极阻抗传感器5 min，用氮气吹干；配制硝酸纤维素膜甲醇溶液，其中，硝酸纤维素膜的面积与甲醇溶液的体积比为1:5（单位：mm2/μl）。取15μl硝酸纤维素膜甲醇溶液均匀滴加在叉指金电极上，等待5 min甲醇挥发后，叉指金电极上形成一层用于固定蛋白的硝酸纤维素膜；之后，加入15 μl 的浓度为500 μg/ml 的气味结合蛋白溶液，其中气味结合蛋白选取的是中华蜜蜂气味结合蛋白Acer-ASP2，溶剂为0.1M PBS缓冲液（pH=7.2，0.1M指的是PBS缓冲液中磷酸盐的摩尔浓度），室温下静止2h，使得中华蜜蜂气味结合蛋白Acer-ASP2与硝酸纤维素膜作用后固定在硝酸纤维素膜上；从芯片腔的进/出液口以恒定的速率（20 μl/s）缓慢通入PBS缓冲液，PBS缓冲液流入腔体后从另一进出口流出，用于清洗未被固定的中华蜜蜂气味结合蛋白Acer-ASP2，持续10 min后即可获得基于电化学阻抗分析的气味结合蛋白传感器，放在4℃条件下备用。
上述方法制备的基于电化学阻抗分析的气味结合蛋白传感器可用于检测花香物质和蜜蜂信息素，所述花香物质包括4-烯丙基藜芦醚、苯乙醛和香叶醇，所述蜜蜂信息素包括乙酸异戊酯和对羟基苯甲酸甲酯。
本发明的有益效果是，本发明将中华蜜蜂气味结合蛋白（Acer-ASP2）固定在叉指金电极上，用于花香物质和蜜蜂信息素的检测。实验表明该方法构建的电化学传感器可将气味结合蛋白稳定、简便地固定在叉指金电极表面，传感器检测灵敏度高，检测下限低，特异性强。
附图说明
图1为叉指金电极排布示意图；
图2为本发明电化学阻抗传感器测试示意图；
图3为本发明气味结合蛋白传感器制备图；
图4为本发明气味结合蛋白传感器制备过程中每步处理后的电化学阻抗谱曲线；
图5为本发明气味结合蛋白传感器检测花香物质，蜜蜂信息素及丁二酮的阻抗图谱；
图6为本发明气味结合蛋白传感器分别与不同浓度的花香物质发生反应后电子传递阻抗与花香物质浓度对数之间的线性关系图；
图7为本发明气味结合蛋白传感器分别与不同浓度的蜜蜂信息素和丁二酮发生反应后电子传递阻抗与浓度对数之间的线性关系图；
图8为本发明气味结合蛋白传感器建立的等效模型。
具体实施方式
以下结合附图及具体实施例对本发明作详细描述，但并不是限制本发明。
本发明基于电化学阻抗分析的气味结合蛋白传感器的制备方法，包括以下步骤：
1、叉指金电极阻抗传感器的加工。
叉指金电极的加工采用标准的加工工艺。以厚度为0.5 mm、直径为4英寸的玻璃为基底，在玻璃上磁控溅射20 nm厚的钛化钨（TiW）薄膜作为粘附层，接着磁控溅射300 nm厚的金（Au）薄膜作为电极层；用AZ光刻胶光刻出电极图形后，采用干法刻蚀将非电极区域刻蚀掉，得到叉指金电极1，如图1所示。最后将有机玻璃材料制作而成的芯片腔3用环氧树脂胶封在玻璃基底上，如图2所示，制得叉指金电极阻抗传感器。
2、气味结合蛋白的固定。
首先，依次使用无水乙醇和超纯水超声清洗步骤1得到的叉指金电极阻抗传感器5 min，用氮气吹干。配制硝酸纤维素膜甲醇溶液，其中硝酸纤维素膜的面积与甲醇溶液的体积比为1:5 (单位：mm2/μl)。取15μl硝酸纤维素膜甲醇溶液均匀滴加在叉指金电极1上。等待5 min甲醇挥发后，叉指金电极1上形成一层用于固定蛋白的硝酸纤维素膜。之后，加入15 μl 的浓度为500 μg/ml 的气味结合蛋白溶液，其中气味结合蛋白选取的是中华蜜蜂气味结合蛋白（Acer-ASP2），溶剂为0.1M PBS缓冲液（pH=7.2，0.1M指的是PBS缓冲液中磷酸盐的摩尔浓度，本申请中使用的PBS缓冲液均是指0.1 M，pH=7.2的PBS缓冲液），室温下静止2h，使得中华蜜蜂气味结合蛋白（Acer-ASP2）与硝酸纤维素膜作用后固定在硝酸纤维素膜上，形成如图3所示结构。从芯片腔3的进/出液口4以恒定的速率（20 μl/s）缓慢通入PBS缓冲液，PBS缓冲液流入腔体后从另一进出口流出，用于清洗未被固定的中华蜜蜂气味结合蛋白(Acer-ASP2)，持续10 min后即可获得基于电化学阻抗分析的气味结合蛋白传感器，放在4℃条件下备用。中华蜜蜂气味结合蛋白Acer-ASP2的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
本发明基于电化学阻抗分析的气味结合蛋白传感器可用于检测花香物质和蜜蜂信息素，所述花香物质包括4-烯丙基藜芦醚、苯乙醛和香叶醇，蜜蜂信息素包括乙酸异戊酯和对羟基苯甲酸甲酯。该应用具体如下：首先进行空白对照曲线的测量。先将图2中的叉指金电极1的两个接触片2分别通过导线5连接电化学工作站6的两个输入端，电化学工作站6可以采用上海辰华仪器有限公司CHI660型号的产品。然后芯片腔3内加入100 μl氧化还原对溶液，氧化还原对溶液中含有5mM铁氰化钾、5mM亚铁氰化钾和0.1M的KCl，溶剂为水。再加入100μl 的PBS缓冲液作为空白对照，以电化学工作站6作为仪器平台对本发明基于电化学阻抗分析的气味结合蛋白传感器进行电化学阻抗谱扫描。具体测试参数为：初始电压为0.2V，交流电压幅度为5mV，扫频范围为1Hz~100KHz。得到电化学阻抗扫频曲线，电路拟合后得到空白对照的电子传递电阻Rct。测量结束后，从进/出液口3一以恒定的速率（20μl/s）缓慢通入PBS缓冲液至原溶液全部排出测试腔体2。然后再分别加入100μl氧化还原对溶液和100μl的10-6 M的4-烯丙基藜芦醚气味分子溶液（溶剂为PBS缓冲液）进行相同的测量，得到10-6M对应的奈奎斯特图。一次测量结束后，以恒定的速率（20μl/s）向腔体中通入PBS缓冲液，清洗15min以消除上次实验残留的铁氰化钾/亚铁氰化钾及4-烯丙基藜芦醚气味分子混合溶液的影响。之后再次加入100 μl氧化还原对溶液和100 μl的10-5 M 4-烯丙基藜芦醚气味分子溶液进行相同的测量。重复上述测量过程直至完成10-4 M 和10-3 M的测量。最终得到中华蜜蜂气味结合蛋白（Acer-ASP2）与4个不同浓度（10-6, 10-5, 10-4, 10-3M）下的4-烯丙基藜芦醚相互作用的阻抗谱曲线，如图5所示。可见，本发明基于电化学阻抗分析的气味结合蛋白传感器可用于检测4-烯丙基藜芦醚。
对于其他2种花香物质（苯乙醛和香叶醇）和2种蜜蜂信息素（乙酸异戊酯和对羟基苯甲酸甲酯）以及阴性对照（丁二酮）进行相同的实验，可以得到每一种物质和中华蜜蜂气味结合蛋白（Acer-ASP2）相互作用的阻抗谱曲线，如图5和图6所示。
以传递电阻Rct的变化值((Rct_PBS - Rct_odor)/ Rct_PBS)为纵坐标，气味分子浓度的对数值为横坐标，制作线性曲线。3种花香物质对应的线性关系如图5所示。2种蜜蜂信息素以及阴性对照（丁二酮）的线性拟合结果如图6所示。最后将6种物质的线性拟合曲线信息总结于表1中。
表1：本发明线性拟合结果和分子对接结果。
阻抗测量的同时还可以进行分子对接和阻抗建模的联合分析研究。分子对接即两个或多个分子之间的识别过程，其过程涉及分子之间的空间匹配和能量匹配。实验中首先用I-TASSER服务器构建了中华蜜蜂气味结合蛋白（Acer-ASP2）的三级结构，然后依据气味分子与中华蜜蜂气味结合蛋白（Acer-ASP2）作用的“锁-钥原理”(lock and key principle)，模拟气味分子与中华蜜蜂气味结合蛋白（Acer-ASP2）的相互作用。通过Molegro Virtual Docker （4.2版本）的计算，可以预测两者间的结合模式和亲和力。其中亲和力可以用打分函数给出，打分函数值的负值越低，表明气味分子和中华蜜蜂气味结合蛋白（Acer-ASP2）的亲和力越强，如表1中MolDock值所示。
依据气味结合蛋白三级结构所特有的腔体结构以及气味分子与气味结合蛋白结合是发生在腔体内，可以构建一个包含腔体的气味结合蛋白阻抗模型，如图8所示。其中，整个电路的阻抗7可以等效为两部分：电极部分8和蛋白部分9。电极部分主要等效为一个电容（Ce）和一个阻抗（Ze）的影响；而对于气味结合蛋白部分又可以分为氨基酸骨架和结合腔体10两部分。依据传统的模型，任意两个相互作用的氨基酸可以等效为一个R-C电路，而蛋白质是氨基酸形成的拓扑网络构成，因此也可以等效成为一个R-C电路，其中Rp和Cp分别代表气味结合蛋白中氨基酸骨架之间的电阻和电容，用于表示气味分子和气味结合蛋白结合后氨基酸拓扑网络结构电学特性的改变。对于气味结合蛋白的结合腔体结构，由于其具有电阻特性，也具有电容特性，所以也可以等效为典型的R-C电路，Rc和Cc分别代表了结合腔体的电阻和电容特性。结合分子对接的结果，该阻抗模型可以用于分析气味结合蛋白传感器中引起电荷转移电阻Rct变化的原因：气味分子与气味结合蛋白结合后气味结合蛋白的氨基酸骨架以及气味结合蛋白的结合腔体的介电特性发生了变化，使得电子更容易穿过气味结合蛋白和硝酸纤维素膜到达叉指金电极表面。
<110> 浙江大学
<120> 基于阻抗分析的气味结合蛋白传感器的制备方法及应用
<160> 1
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 142
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 1
Met Asn Thr Leu Val Thr Val Thr Cys Leu Leu Ala Ala Leu Thr Val
1 5 10 15
Val Arg Gly Ile Asp Gln Asp Thr Val Val Ala Lys Tyr Met Glu Tyr
20 25 30
Leu Met Pro Asp Ile Met Pro Cys Ala Asp Glu Leu His Ile Ser Glu
35 40 45
Asp Ile Ala Thr Asn Ile Gln Ala Ala Lys Asn Gly Ala Asp Met Lys
50 55 60
Gln Leu Gly Cys Leu Lys Ala Cys Val Met Lys Arg Ile Asp Met Leu
65 70 75 80
Lys Gly Thr Glu Leu Asn Ile Glu Pro Val Tyr Lys Met Ile Glu Val
85 90 95
Val His Ala Gly Asn Ala Asp Asp Ile Gln Leu Val Arg Gly Ile Ala
100 105 110
Asn Glu Cys Ile Glu Asn Ala Lys Gly Glu Ala Asp Glu Cys Ser Ile
115 120 125
Gly Asn Lys Tyr Thr Asp Cys Tyr Ile Glu Lys Leu Phe Ser
130 135 140
Claims (2)
1.一种基于电化学阻抗分析的气味结合蛋白传感器的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）加工叉指金电极阻抗传感器：以玻璃为基底，在玻璃上磁控溅射钛化钨薄膜作为粘附层，接着磁控溅射金薄膜作为电极层；用AZ光刻胶光刻出电极图形后，采用干法刻蚀将非电极区域刻蚀掉，得到叉指金电极，最后将芯片腔用环氧树脂胶封在玻璃基底上，制得叉指金电极阻抗传感器；
（2）固定气味结合蛋白：首先，依次使用无水乙醇和超纯水超声清洗步骤（1）得到的叉指金电极阻抗传感器5 min，用氮气吹干；配制硝酸纤维素膜甲醇溶液，其中，硝酸纤维素膜的面积与甲醇溶液的体积比为1mm2:5μl；取15μl硝酸纤维素膜甲醇溶液均匀滴加在叉指金电极上，等待5 min甲醇挥发后，叉指金电极上形成一层用于固定蛋白的硝酸纤维素膜；之后，加入15 μl 的浓度为500 μg/ml 的气味结合蛋白溶液，其中气味结合蛋白选取的是中华蜜蜂气味结合蛋白Acer-ASP2，溶剂为PBS缓冲液，PBS缓冲液的pH=7.2，所述PBS缓冲液中磷酸盐的摩尔浓度为0.1M，室温下静止2h，使得中华蜜蜂气味结合蛋白Acer-ASP2与硝酸纤维素膜作用后固定在硝酸纤维素膜上；从芯片腔的进/出液口以20 μl/s的速率缓慢通入PBS缓冲液，PBS缓冲液流入腔体后从另一进出口流出，用于清洗未被固定的中华蜜蜂气味结合蛋白Acer-ASP2，持续10 min后即获得基于电化学阻抗分析的气味结合蛋白传感器，放在4℃条件下备用。
2.一种权利要求1所述方法制备的基于电化学阻抗分析的气味结合蛋白传感器的用途，其特征在于，所述基于电化学阻抗分析的气味结合蛋白传感器用于检测花香物质和蜜蜂信息素，所述花香物质包括4-烯丙基藜芦醚、苯乙醛和香叶醇，所述蜜蜂信息素包括乙酸异戊酯和对羟基苯甲酸甲酯。
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