CN103462963B - Incarviatone A在制备治疗黄热病毒感染药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种Incarviatone？A在制备治疗或预防黄热病毒感染药物中的应用。Incarviatone？A能够有效地抑制黄热病毒的增殖，但是对细胞毒性很小，可进一步开发为治疗这些病毒感染引起的疾病的药物，具有广泛的应用前景。本发明涉及的Incarviatone？A在制备治疗黄热病毒感染药物中的用途属于首次公开，由于骨架类型属于全新的骨架类型，而且其对于黄热病毒抑制活性强得意想不到，不存在由其他化合物给出任何启示的可能，具备突出的实质性特点，同时用于黄热病毒感染的防治显然具有显著的进步。

Description

Incarviatone A在制备治疗黄热病毒感染药物中的应用

技术领域

本发明属于生物医药领域，更具体涉及一种IncarviatoneA在制备治疗或预防黄热病毒感染药物中的应用。

背景技术

黄热病毒(yellowfevervirus，YFV)属于黄热毒科黄病毒属的成员。黄热病毒能够引起黄热病，该病为急性传染病。国际上已将黄热病定为检疫传染病，中国也将其定为甲类传染病。1648年，美洲的YUCATAN半岛首次证实黄热病的流行。17～19世纪，此病通过交通运输被带到欧洲及北美，在差不多两个世纪内，黄热病成为美、非、欧三大洲一些地方最严重的瘟疫之一，造成大量人群死亡。20世纪以来，本病在北美及欧洲未再发生，但在中、南美、非洲的一些国家和地区仍不时流行。据WHO(1983)报告，1979～1982年期间，黄热病在非洲发生50例，南美洲发生695例，估计实际病例数为上述报告数的35～480倍。埃及伊蚊是主要传播媒介。迄今为止，中国尚无病例的报道，但是这并不能使我们放松对该病毒的警惕，因为中国的气候、地理环境复杂，蚊虫种类繁多，具备传播条件，同时随着国际交流的日益频繁，YFV传入中国境内的可能性非常大。

因此，我们应该高度重视对黄热病毒的研究，加强对其的科研力度，做好相关知识和药物的储备。

本发明涉及的化合物IncarviatoneA是一个2012年发表(Shen,Y.H.etal.,2012.IncarviatoneA,astructurallyuniquenaturalproducthybridwithanewcarbonskeletonfromIncarvilleadelavayi,anditsabsoluteconfigurationviacalculatedelectroniccirculardichroicspectra.RSCAdvances2,4175–4180.)的新骨架化合物，该化合物拥有全新的骨架类型，目前没有关于该化合物活性方面的报道，对于本发明涉及的IncarviatoneA在制备治疗黄热病毒感染药物中的用途属于首次公开，由于骨架类型属于全新的骨架类型，而且其对于黄热病毒抑制活性强得意想不到，不存在由其他化合物给出任何启示的可能，具备突出的实质性特点，同时用于黄热病毒感染的防治显然具有显著的进步。

发明内容

本发明的目的是在于提供了一种IncarviatoneA在制备治疗或预防黄热病毒感染药物中的应用，IncarviatoneA在10.0uM浓度下对YFV的抑郁率为96.25％。而IncarviatoneA在浓度为100uM条件下，Vero细胞的存活率为94.7％。IncarviatoneA能够有效地抑制黄热病毒的增殖，但是对细胞毒性很小，可进一步开发为治疗这些病毒感染引起的疾病的药物，具有广泛的应用前景。

所述化合物IncarviatoneA结构如式(Ⅰ)所示：

本发明涉及的IncarviatoneA在制备治疗黄热病毒感染药物中的用途属于首次公开，由于骨架类型属于全新的骨架类型，而且其对于黄热病毒抑制活性强得意想不到，不存在由其他化合物给出任何启示的可能，具备突出的实质性特点，同时用于黄热病毒感染的防治显然具有显著的进步。

为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

A.IncarviatoneA对Vero细胞的毒性实验：

Vero细胞是YFV的易感细胞。因此，本实验首先检测IncarviatoneA对Vero细胞的细胞毒性，以不同浓度的IncarviatoneA作用于Vero细胞，来了解在细胞存活率为90％以上的IncarviatoneA的最大使用浓度，为后续的IncarviatoneA对YFV的抑制作用实验提供参考数据。

B.IncarviatoneA对YFV的抑制实验：

以不同浓度的IncarviatoneA作用于已经感染了YFV的Vero细胞，来获得IncarviatoneA对病毒的抑制效率。本实验中的IncarviatoneA的使用浓度均在使Vero细胞在90％以上存活率的浓度的范围内，因此，可以排除IncarviatoneA的浓度过高而对实验数据的分析产生影响。

一种IncarviatoneA在制备治疗或预防黄热病毒感染药物中的应用，其步骤是：

A.IncarviatoneA对Vero细胞的毒性实验：

Vero细胞(非洲绿猴肾细胞)是YFV的易感细胞。实验中的Vero细胞购买于中国科学院上海生科院细胞资料中心；MTT试剂盒购于碧云天生物技术研究所；胎牛血清(FetalBovineSerum，FBS)购买于美国GIBCO公司；细胞培养板购买于德国Greinerbioone公司；DMEM培养基和MEM培养基购买于美国GIBCO公司。

实验步骤如下：

1：接种Vero细胞：用含10％(v/v)胎牛血清的DMEM培养基配成单个细胞悬液，以每孔1000-10000个细胞接种到96孔细胞培养板，每孔接种体积100ul；

2：培养Vero细胞：在37℃，5％(v/v)CO₂培养条件下，培养2天；

3：加入IncarviatoneA：吸弃每个孔中的DMEM培养基，向各个孔中加入100ul用含10％(v/v)胎牛血清的DMEM培养基稀释成相应浓度(0uM，0.4uM，1.2uM，3.7uM，11uM，33uM，100uM，300uM)的IncarviatoneA，对照孔加不加含10％(v/v)胎牛血清的DMEM培养基100ul；

4：呈色：培养48小时后，每孔加MTT溶液10ul，在37℃，5％(v/v)CO₂培养条件下继续孵育4小时，然后加入Formazan溶解液，在37℃，5％(v/v)CO₂培养条件下继续孵育4小时，直至在普通光学显微镜下观察发现Formazan全部溶解；

5.：测量与计算：在570nm测定吸收值，SarcabosideA不同浓度下的细胞存活率为该浓度下细胞吸光值比上SarcabosideA的浓度为0uM时的吸光值，再乘以100％。

表1不同浓度的IncarviatoneA对Vero细胞的毒性

B.IncarviatoneA对YFV的抑制实验：

以Vero细胞为培养病毒YFV的细胞，MOI为0.1，实验步骤如下：

在24孔细胞培养板中接入Vero细胞，24小时后细胞长至单层(细胞覆盖孔底的面积约为80％～90％)，吸出培养基，接入病毒样品200ul，37℃吸附2小时。吸附完成后，吸弃各孔中的病毒液，用DMEM培养基洗去未吸附的病毒。加入用含10％(v/v)胎牛血清的DMEM培养基稀释的指定浓度(0uM，0.04uM，0.12uM，0.37uM，1.1uM，3.3uM，10.0uM)的IncarviatoneA，于37℃、5％(v/v)CO₂的培养箱中培养42小时，收集各个孔中的上清，做病毒噬斑实验。

病毒噬斑实验：在24孔板中接入Vero细胞，24小时后细胞长至单层(细胞覆盖孔底的面积约为80％～90％)，吸弃各孔中的培养基，接入用含3％(v/v)胎牛血清的DMEM培养基10倍系列稀释的病毒样品200ul，37℃吸附2小时。吸附完成后将各个孔的上清板吸弃，用10％(v/v)FBS的DMEM培养基洗去未吸附的病毒。加入新鲜的45℃预热的半固定培养基[A成分：3％(v/v)FBS，2×MEM培养基，青霉素(美国AMRESCO)和链霉素(美国AMRESCO)终浓度分别为100U/ml，0.1mg/ml；B成分：1％(w/v)的琼脂糖(法国Biowest)。A成分：B成分＝1:1(v/v)]，于37℃、5％(v/v)CO₂的培养箱中培养48～72小时。待噬斑形成后用结晶紫(美国AMRESCO)染色(2％(w/v)结晶紫溶于10％(v/v)甲醛)，2小时后用流水冲去结晶紫和琼脂糖，在显微镜下对每孔产生的细胞噬斑，根据噬斑数和稀释倍数计算病毒的滴度(PFU/ml，PFU：plaqueformationunit噬斑形成单位)。PFU＝病毒稀释度×P/V，(P：空蚀斑数目；V：接种量)。在2次不同的时间进行实验(表2)。

表2不同浓度的IncarviatoneA对YFV滴度降低及抑制作用

本发明与现有技术相比，具有以下优点和效果：

本发明通过对YFV的抑制实验证实了IncarviatoneA对YFV具有很好的抑制作用，从本质上证明了IncarviatoneA在治疗YFV感染疾病中具有广泛的应用背景。

研制抗黄热病毒引起的疾病的药物，以便对疾病进行有效的预防和治疗，具有巨大的社会效益和研究价值。

具体实施方式

本发明所涉及化合物IncarviatoneA的制备方法参见文献(Shen,Y.H.etal.,2012.IncarviatoneA,astructurallyuniquenaturalproducthybridwithanewcarbonskeletonfromIncarvilleadelavayi,anditsabsoluteconfigurationviacalculatedelectroniccirculardichroicspectra.RSCAdvances2,4175–4180.)。

以下通过实施例对本发明作进一步详细的说明，但本发明的保护范围不受具体实施例的任何限制，而是由权利要求加以限定。

实施例1：本发明所涉及化合物IncarviatoneA片剂的制备：

取20克化合物IncarviatoneA，加入制备片剂的常规辅料180克，混匀，常规压片机制成1000片。

实施例2：本发明所涉及化合物IncarviatoneA胶囊剂的制备：

取20克化合物IncarviatoneA，加入制备胶囊剂的常规辅料如淀粉180克，混匀，装胶囊制成1000片。

下面通过药效学实验来进一步说明其药物活性。

实验例1：

一种IncarviatoneA在制备治疗或预防黄热病毒感染药物中的应用，其步骤是：

A.IncarviatoneA对Vero细胞的毒性实验

Vero细胞(非洲绿猴肾细胞)是YFV的易感细胞。

实验步骤如下：

1：接种Vero细胞：用含10％(v/v)胎牛血清的DMEM培养基配成单个细胞悬液，以每孔1000-10000个细胞接种到96孔细胞培养板，每孔接种体积100ul；

2：培养Vero细胞：在37℃，5％(v/v)CO₂培养条件下，培养2天；

3：加入IncarviatoneA：吸弃每个孔中的DMEM培养基，向各个孔中加入100ul用含10％(v/v)胎牛血清的DMEM培养基稀释成相应浓度(0uM，0.4uM，1.2uM，3.7uM，11uM，33uM，100uM，300uM)的IncarviatoneA，对照孔加不加含10％(v/v)胎牛血清的DMEM培养基100ul；

4：呈色：培养48小时后，每孔加MTT溶液10ul，在37℃，5％(v/v)CO₂培养条件下继续孵育4小时，然后加入Formazan溶解液，在37℃，5％(v/v)CO₂培养条件下继续孵育4小时，直至在普通光学显微镜下观察发现Formazan全部溶解；

5：测量：在570nm测定吸收值。

6：实验结果见表1。

B.IncarviatoneA对YFV的抑制作用：

以Vero细胞为培养病毒YFV的细胞，MOI为0.1，实验步骤如下：

1.在24孔细胞培养板中接入Vero细胞，24小时后细胞长至单层(细胞覆盖孔底的面积约为80％～90％)，吸出培养基，接入病毒样品200ul，37℃吸附2小时。吸附完成后，吸弃各孔中的病毒液，用DMEM培养基洗去未吸附的病毒。加入用含10％(v/v)胎牛血清的DMEM培养基稀释的指定浓度(0uM，0.04uM，0.12uM，0.37uM，1.1uM，3.3uM，10.0uM)的IncarviatoneA，于37℃、5％(v/v)CO₂的培养箱中培养42小时，收集各个孔中的上清，做病毒噬斑实验。

2.病毒噬斑实验：在24孔板中接入Vero细胞，24小时后细胞长至单层(细胞覆盖孔底的面积约为80％～90％)，吸弃各孔中的培养基，接入用含3％(v/v)胎牛血清的DMEM培养基10倍系列稀释的病毒样品200ul，37℃吸附2小时。吸附完成后将各个孔的上清板吸弃，用10％(v/v)FBS的DMEM培养基洗去未吸附的病毒。加入新鲜的45℃预热的半固定培养基[A成分：3％(v/v)FBS，2×MEM培养基，青霉素和链霉素终浓度分别为100U/ml，0.1mg/ml；B成分：1％(w/v)的琼脂糖(法国Biowest)。A成分：B成分＝1:1(v/v)]，于37℃、5％(v/v)CO₂的培养箱中培养48～72小时。待噬斑形成后用结晶紫(美国AMRESCO)染色(2％(w/v)结晶紫溶于10％(v/v)甲醛)，2小时后用流水冲去结晶紫和琼脂糖，在显微镜下对每孔产生的细胞噬斑，根据噬斑数和稀释倍数计算病毒的滴度(PFU/ml，PFU：plaqueformationunit噬斑形成单位)。PFU＝病毒稀释度×P/V，(P：空蚀斑数目；V：接种量)。

3.实验结果见表2。

结论：IncarviatoneA对YFV具有很强的抑制作用，而且安全，因此IncarviatoneA在治疗YFV感染疾病中具有广泛的应用背景。

Claims (1)

1.一种IncarviatoneA在制备治疗黄热病毒感染药物中的应用，所述化合物IncarviatoneA结构如式（Ⅰ）所示：

式（Ⅰ）。