CN102872057B

CN102872057B - Gypensapogenin A在制备治疗黄热病毒感染药物中的应用

Info

Publication number: CN102872057B
Application number: CN2012104192213A
Authority: CN
Inventors: 施桦; 张广; 吴俊华
Original assignee: 吴俊华
Current assignee: Nantong San Intellectual Property Service Co ltd
Priority date: 2012-10-26
Filing date: 2012-10-26
Publication date: 2013-07-17
Anticipated expiration: 2032-10-26
Also published as: CN102872057A

Abstract

本发明公开了一种Gypensapogenin A在制备治疗或预防黄热病毒感染药物中的应用。Gypensapogenin A能够有效地抑制黄热病毒的增殖，但是对细胞毒性很小，可进一步开发为治疗这些病毒感染引起的疾病的药物，具有广泛的应用前景。本发明涉及的Gypensapogenin A在制备治疗黄热病毒感染药物中的用途属于首次公开，由于骨架类型属于全新的骨架类型，而且其对于黄热病毒抑制活性强得意想不到，不存在由其他化合物给出任何启示的可能，具备突出的实质性特点，同时用于黄热病毒感染的防治显然具有显著的进步。

Description

Gypensapogenin A在制备治疗黄热病毒感染药物中的应用

技术领域

本发明属于生物医药领域，更具体涉及一种Gypensapogenin A在制备治疗或预防黄热病毒感染药物中的应用。

背景技术

黄热病毒（yellow fever virus，YFV）属于黄热毒科黄病毒属的成员。黄热病毒能够引起黄热病，该病为急性传染病。国际上已将黄热病定为检疫传染病，中国也将其定为甲类传染病。1648年，每周的YUCATAN半岛首次证实黄热病的流行。17~19世纪，此病通过交通运输被带到欧洲及北美，在差不多两个世纪内，黄热病成为美、非、欧三大洲一些地方最严重的瘟疫之一，造成大量人群死亡。20世纪以来，本病在北美及欧洲未再发生，但在中、南美、非洲的一些国家和地区仍不时流行。据WHO（1983）报告，1979~1982年期间，黄热病在非洲发生50例，南美洲发生695例，估计实际病例数为上述报告数的35~480倍。埃及伊蚊是主要传播媒介。迄今为止，中国尚无病例的报道，但是这并不能使我们放松对该病毒的警惕，因为中国的气候、地理环境复杂，蚊虫种类繁多，具备传播条件，同时随着国际交流的日益频繁，YFV传入中国境内的可能性非常大。

因此，我们应该高度重视对黄热病毒的研究，加强对其的科研力度，做好相关知识和药物的储备。

本发明涉及的化合物Gypensapogenin A是一个2012年发表（Li, N. et al., 2012. Triterpenes possessing an unprecedented skeleton isolated from hydrolyzate of total saponins from Gynostemma pentaphyllum. European Journal of Medicinal Chemistry 50, 173–178.）的新骨架化合物，该化合物拥有全新的骨架类型，目前的用途仅仅涉及人肿瘤细胞株的细胞毒活性（Li, N. et al., 2012. Triterpenes possessing an unprecedented skeleton isolated from hydrolyzate of total saponins from Gynostemma pentaphyllum. European Journal of Medicinal Chemistry 50, 173–178.），对于本发明涉及的Gypensapogenin A在制备治疗黄热病毒感染药物中的用途属于首次公开，由于骨架类型属于全新的骨架类型，而且其对于黄热病毒抑制活性强得意想不到，不存在由其他化合物给出任何启示的可能，具备突出的实质性特点，同时用于黄热病毒感染的防治显然具有显著的进步。

发明内容

本发明的目的是在于提供了一种Gypensapogenin A在制备治疗或预防黄热病毒感染药物中的应用，Gypensapogenin A在10.0 uM浓度下对YFV的抑郁率为96.58%。而Gypensapogenin A在浓度为100 uM条件下，Vero细胞的存活率为91.8%。Gypensapogenin A能够有效地抑制黄热病毒的增殖，但是对细胞毒性很小，可进一步开发为治疗这些病毒感染引起的疾病的药物，具有广泛的应用前景。

所述化合物Gypensapogenin A结构如式（Ⅰ）所示：

本发明涉及的Gypensapogenin A在制备治疗黄热病毒感染药物中的用途属于首次公开，由于骨架类型属于全新的骨架类型，而且其对于黄热病毒抑制活性强得意想不到，不存在由其他化合物给出任何启示的可能，具备突出的实质性特点，同时用于黄热病毒感染的防治显然具有显著的进步。

为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

A. Gypensapogenin A对Vero细胞的毒性实验：

Vero细胞是YFV的易感细胞。因此，本实验首先检测Gypensapogenin A对Vero细胞的细胞毒性，以不同浓度的Gypensapogenin A作用于Vero细胞，来了解在细胞存活率为90%以上的Gypensapogenin A的最大使用浓度，为后续的Gypensapogenin A对YFV的抑制作用实验提供参考数据。

B. Gypensapogenin A对YFV的抑制实验：

以不同浓度的Gypensapogenin A作用于已经感染了YFV的Vero细胞，来获得Gypensapogenin A对病毒的抑制效率。本实验中的Gypensapogenin A的使用浓度均在使Vero细胞在90%以上存活率的浓度的范围内，因此，可以排除Gypensapogenin A的浓度过高而对实验数据的分析产生影响。

一种Gypensapogenin A在制备治疗或预防黄热病毒感染药物中的应用，其步骤是：

A. Gypensapogenin A对Vero细胞的毒性实验：

Vero细胞（非洲绿猴肾细胞）是YFV的易感细胞。实验中的Vero细胞购买于中国科学院上海生科院细胞资料中心；MTT试剂盒购于碧云天生物技术研究所；胎牛血清（Fetal Bovine Serum，FBS）购买于美国GIBCO公司；细胞培养板购买于德国Greiner bioone公司；DMEM培养基和MEM培养基购买于美国GIBCO公司。

实验步骤如下：

1：接种Vero细胞：用含10%（v/v）胎牛血清的DMEM培养基配成单个细胞悬液，以每孔1000-10000个细胞接种到96孔细胞培养板，每孔接种体积100 ul；

2：培养Vero细胞：在37℃，5%（v/v）CO₂培养条件下，培养2天；

3：加入Gypensapogenin A：吸弃每个孔中的DMEM培养基，向各个孔中加入100 ul用含10%（v/v）胎牛血清的DMEM培养基稀释成相应浓度（0 uM，0.4 uM，1.2 uM，3.7 uM，11 uM，33 uM，100 uM，300 uM）的Gypensapogenin A，对照孔加不加含10%（v/v）胎牛血清的DMEM培养基100 ul；

4：呈色：培养48小时后，每孔加MTT溶液10 ul，在37℃，5%（v/v）CO₂培养条件下继续孵育4小时，然后加入Formazan溶解液，在37℃，5%（v/v）CO₂培养条件下继续孵育4小时，直至在普通光学显微镜下观察发现Formazan全部溶解；

1、：测量：在570 nm测定吸收值(表1)。

表1不同浓度的Gypensapogenin A对Vero细胞的毒性

B. Gypensapogenin A对YFV的抑制实验：

以Vero细胞为培养病毒YFV的细胞，MOI为0.1，实验步骤如下：

在24孔细胞培养板中接入Vero细胞，24小时后细胞长至单层（细胞覆盖孔底的面积约为80%~90%），吸出培养基，接入病毒样品200 ul，37℃吸附2小时。吸附完成后，吸弃各孔中的病毒液，用DMEM培养基洗去未吸附的病毒。加入用含10%（v/v）胎牛血清的DMEM培养基稀释的指定浓度（0 uM，0.04 uM，0.12 uM，0.37 uM，1.1 uM，3.3 uM，10.0 uM）的Gypensapogenin A，于37℃、5%（v/v）CO₂的培养箱中培养42小时，收集各个孔中的上清，做病毒噬斑实验。

病毒噬斑实验：在24孔板中接入Vero细胞，24小时后细胞长至单层（细胞覆盖孔底的面积约为80%~90%），吸弃各孔中的培养基，接入用含3%（v/v）胎牛血清的DMEM培养基10倍系列稀释的病毒样品200ul，37℃吸附2小时。吸附完成后将各个孔的上清板吸弃，用10%（v/v）FBS的DMEM培养基洗去未吸附的病毒。加入新鲜的45℃预热的半固定培养基[A成分：3%（v/v）FBS，2×MEM培养基，青霉素（美国AMRESCO）和链霉素（美国AMRESCO）终浓度分别为100U/ml，0.1mg/ml；B成分：1%（w/v）的琼脂糖（法国Biowest）。A成分：B成分=1:1（v/v）]，于37℃、5%（v/v）CO₂的培养箱中培养48~72小时。待噬斑形成后用结晶紫（美国AMRESCO）染色（2%（w/v）结晶紫溶于10%（v/v）甲醛），2小时后用流水冲去结晶紫和琼脂糖，在显微镜下对每孔产生的细胞噬斑，根据噬斑数和稀释倍数计算病毒的滴度（PFU/ml，PFU：plaque formation unit 噬斑形成单位）。PFU=病毒稀释度×P/V，（P：空蚀斑数目；V：接种量）。在2次不同的时间进行实验(表2)。

表2不同浓度的Gypensapogenin A对YFV滴度降低及抑制作用

本发明与现有技术相比，具有以下优点和效果：

本发明通过对YFV的抑制实验证实了Gypensapogenin A对YFV具有很好的抑制作用，从本质上证明了Gypensapogenin A在治疗YFV感染疾病中具有广泛的应用背景。

研制抗黄热病毒引起的疾病的药物，以便对疾病进行有效的预防和治疗，具有巨大的社会效益和研究价值。

具体实施方式

本发明所涉及化合物Gypensapogenin A的制备方法参见文献（Li, N. et al., 2012. Triterpenes possessing an unprecedented skeleton isolated from hydrolyzate of total saponins from Gynostemma pentaphyllum. European Journal of Medicinal Chemistry 50, 173–178.和Wei, J.X. et al., 1982. Two new dammaran sapogenins from leaves of Panax notoginseng. Planta Medica, 45(3): 167-171.）。

以下通过实施例对本发明作进一步详细的说明，但本发明的保护范围不受具体实施例的任何限制，而是由权利要求加以限定。

实施例1：本发明所涉及化合物Gypensapogenin A片剂的制备：

取20克化合物Gypensapogenin A，加入制备片剂的常规辅料180克，混匀，常规压片机制成1000片。

实施例2：本发明所涉及化合物Gypensapogenin A胶囊剂的制备：

取20克化合物Gypensapogenin A，加入制备胶囊剂的常规辅料如淀粉180克，混匀，装胶囊制成1000片。

下面通过药效学实验来进一步说明其药物活性。

实验例1：

A. Gypensapogenin A对Vero细胞的毒性实验

Vero细胞（非洲绿猴肾细胞）是YFV的易感细胞。

实验步骤如下：

1：接种Vero细胞：用含10%（v/v）胎牛血清的DMEM培养基配成单个细胞悬液，以每孔1000-10000个细胞接种到96孔细胞培养板，每孔接种体积100ul；

3：加入Gypensapogenin A：吸弃每个孔中的DMEM培养基，向各个孔中加入100ul用含10%（v/v）胎牛血清的DMEM培养基稀释成相应浓度（0uM，0.4uM，1.2uM，3.7uM，11uM，33uM，100uM，300uM）的Gypensapogenin A，对照孔加不加含10%（v/v）胎牛血清的DMEM培养基100ul；

4：呈色：培养48小时后，每孔加MTT溶液10ul，在37℃，5%（v/v）CO₂培养条件下继续孵育4小时，然后加入Formazan溶解液，在37℃，5%（v/v）CO₂培养条件下继续孵育4小时，直至在普通光学显微镜下观察发现Formazan全部溶解；

5：测量：在570nm测定吸收值。

6：实验结果见表1。

B. Gypensapogenin A对YFV的抑制作用：

以Vero细胞为培养病毒YFV的细胞，MOI为0.1，实验步骤如下：

1. 在24孔细胞培养板中接入Vero细胞，24小时后细胞长至单层（细胞覆盖孔底的面积约为80%~90%），吸出培养基，接入病毒样品200ul，37℃吸附2小时。吸附完成后，吸弃各孔中的病毒液，用DMEM培养基洗去未吸附的病毒。加入用含10%（v/v）胎牛血清的DMEM 培养基稀释的指定浓度（0 uM，0.04 uM，0.12 uM，0.37 uM，1.1 uM，3.3 uM，10.0 uM）的Gypensapogenin A，于37℃、5%（v/v）CO₂的培养箱中培养42小时，收集各个孔中的上清，做病毒噬斑实验。

2. 病毒噬斑实验：在24孔板中接入Vero细胞，24小时后细胞长至单层（细胞覆盖孔底的面积约为80%~90%），吸弃各孔中的培养基，接入用含3%（v/v）胎牛血清的DMEM培养基10倍系列稀释的病毒样品200ul，37℃吸附2小时。吸附完成后将各个孔的上清板吸弃，用10%（v/v）FBS的DMEM培养基洗去未吸附的病毒。加入新鲜的45℃预热的半固定培养基[A成分：3%（v/v）FBS，2×MEM培养基，青霉素和链霉素终浓度分别为100U/ml，0.1mg/ml；B成分：1%（w/v）的琼脂糖（法国Biowest）。A成分：B成分=1:1（v/v）]，于37℃、5%（v/v）CO₂的培养箱中培养48~72小时。待噬斑形成后用结晶紫（美国AMRESCO）染色（2%（w/v）结晶紫溶于10%（v/v）甲醛），2小时后用流水冲去结晶紫和琼脂糖，在显微镜下对每孔产生的细胞噬斑，根据噬斑数和稀释倍数计算病毒的滴度（PFU/ml，PFU：plaque formation unit 噬斑形成单位）。PFU=病毒稀释度×P/V，（P：空蚀斑数目；V：接种量）。

3. 实验结果见表2。

结论：Gypensapogenin A对YFV具有很强的抑制作用，而且安全，因此Gypensapogenin A在治疗YFV感染疾病中具有广泛的应用背景。

Claims

1.一种Gypensapogenin A在制备治疗或预防黄热病毒感染药物中的应用，所述化合物Gypensapogenin A结构如式（Ⅰ）所示：

式（Ⅰ）。