CN103439507A - 一种地高辛单抗检测内源性洋地黄样因子含量的试剂盒及使用方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种地高辛单抗检测内源性洋地黄样因子含量的试剂盒及使用方法，该试剂盒包括以下组份：一抗地高辛单克隆抗体、二抗兔抗鼠IgG、³H标记乌本苷、聚乙二醇（PEG）4000、pH=7.4的磷酸缓冲液（PBS缓冲液）、³H闪烁液、pH=7.4的三羟甲基氨基甲烷缓冲液（Tris缓冲液）、含有或者不含有乌本苷。本发明试剂盒具有操作简单方便、灵敏度高、特异性强等优点，并且能够稳定可靠的早期诊断孕期子痫，为之后的治疗提供有利依托。

Description

一种地高辛单抗检测内源性洋地黄样因子含量的试剂盒及使用方法

技术领域

本发明属于属于医疗器械技术领域，尤其是一种地高辛单克隆抗体检测内源性洋地黄样因子含量的试剂盒及使用方法。

背景技术

孕期先兆子痫（孕期早痫）是一种病发原因复杂的综合征，如果不及时治疗，可发展为子痫，危及生命。主要症状有高血压、蛋白尿，水肿，惊厥，肾功能损伤等，已成为世界上孕妇致死率最高的一种疾病，目前具体病因不明。有研究证明，胎盘产生的一种导致易感妇女母体血管内皮功能障碍的物质可能是早痫病发的其中一个原因。血压升高是该疾病最明显的标志，同时造成对产妇内皮，肾脏和肝脏的损害。

先兆子痫（早痫）在全球孕妇中发病率为6-8%，通常发病于妊娠二期晚期或妊娠三期，大部分在孕期32周之后发病（32周前发病被认为是早期发病），极少数孕妇会在孕期20周发病。初次怀孕的孕妇发病率最高，并且随着妊娠次数的增加，该疾病发病率大幅度降低。早痫多发于具有高血压史，糖尿病史，肥胖症史，自身免疫性疾病史如狼疮，和多胎妊娠（双胞胎或多胞胎）的孕妇中，其发病过程因人而异，大多数病例可以在分娩前被确诊。少数病例在分娩后六周才被确诊，称为“产后早痫”，确诊后除了剖腹产或引产手术，没有其他治疗方式。早痫是最常见的的妊娠综合症，同时影响母亲和胎儿，导致早产儿甚至对母婴造成生命危险。

传统上早痫的确诊标志是孕期高血压（两个独立的至少相隔六小时的测量值，收缩压为140以上和/或舒张压为90以上）和24小时尿液样本中的蛋白含量高于300毫克（蛋白尿）。比基线血压（BP）高30毫米汞柱的收缩压或高15毫米汞柱的舒张压，不能达到140/90的绝对标准，仍然被认为是重要发病信号，但并不能就此确诊。肿胀或水肿（尤其是在手和脸）最初曾被认为是诊断早痫的一个重要标志，但目前的医学实践证明，只有高血压和蛋白尿可以作为诊断标准。

虽然早痫是一种致命性疾病，但其早期发病通常无症状，且一般情况下，早痫的信号都不是特异性的，比如孕期惊厥，在怀孕过程中，其他原因比子痫更容易导致惊厥，因此早痫的早期诊断一直是医学界无法攻克的一个难题。

在早痫病人的症状中，一种钠钾泵抑制因子-内源性洋地黄样因子（endogenous digitalis-like factor，EDLF）水平的升高，是早痫的重要标志。这种因子能够导致血压升高，存在于人体和动物组织及体液中，其化学结构和生物活性与植物洋地黄中提取的类固醇强心剂相似，故名“洋地黄样因子”，此因子能够以与地高辛等强心剂类似的机制结合到钠钾泵上，并抑制其活性，但目前为止，此类因子的具体化学结构仍然未知。许多高血压病症均发现伴随内源性洋地黄样因子水平的升高，因此，该因子很可能是造成高血压的原因。

目前，地高辛多克隆抗体Digibind在美国已被FDA批准用于二期临床实验治疗重症早痫，并取得良好疗效。

为了实现对妊娠早痫的早期诊断，达到早期治疗的目的，需要发明一种可以特异性精确测量样品中内源性洋地黄样因子的方法，并制成操作简便快捷的试剂盒。这种需要长期使用的免疫学分析试剂盒，要求抗体为可“无限量”供应、高特异性、高均一性的单克隆抗体。Digibind是多克隆抗体，并且价格昂贵。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种操作简单方便、灵敏度高、特异性强、稳定可靠的利用地高辛单抗检测内源性洋地黄样因子含量的试剂盒及使用方法，本试剂盒的检测可以达到nM即纳摩尔/升，为后续治疗提供有利依托。

本发明实现目的的技术方案如下：

一种地高辛单抗检测内源性洋地黄样因子含量的试剂盒，包括如下组份

一抗地高辛单抗、二抗兔抗鼠IgG、³H标记乌本苷、聚乙二醇4000、pH=7.4的磷酸缓冲液、³H闪烁液、pH=7.4的Tris缓冲液。

而且，还包括乌本苷。

而且，所述一抗地高辛单抗10纳克/毫升、二抗兔抗鼠IgG2.3×10^-8摩尔/升，所述³H标记乌本苷浓度为10.0Ci/mmol，所述聚乙二醇4000浓度为30wt%。

而且，所述试剂盒用于检测人体血清、胎盘组织分泌液、以及冷冻胎盘组织中的内源性洋地黄样因子的含量。

一种地高辛单抗检测内源性洋地黄样因子含量的试剂盒的使用方法，步骤如下

(1)采集胎盘，切成组织块，液氮冷冻，保存于-80℃；

(2)将冷冻胎盘组织块切成薄片，置于匀浆器中，放入液氮罐中冷冻1分钟；以1500rpm的速度将组织薄片匀浆5分钟；

(3)收集匀浆组织，加入等量的甲醇，混匀，离心去除蛋白；收集离心上清液，真空浓缩，4℃保存；

(4)取出试剂盒中地高辛单克隆抗体、二抗兔抗鼠IgG、³H标记乌本苷、pH=7.4的三羟甲基氨基甲烷缓冲液，分别等量加入，与等量待测样品充分混合，室温孵育；

(5)再加入等量的PEG4000溶液，8000rpm离心10分钟，得到沉淀物；

(6)沉淀物用500微升pH7.4的PBS重悬，加入³H闪烁液；

(7)测量样品放射量，根据标准曲线计算出样品中所含内源性洋地黄样因子浓度。

本发明的优点和积极效果是：

1、本发明中的试剂盒，利用一种特异性和灵敏性接近Digibind的单克隆抗体，提供了一种在临床上不需将内源性洋地黄样因子分离，但仍可以灵敏测定该因子浓度的方法，解决了该因子被发现后的几十年中，研究的最大困难，即该因子在体内的含量非常低，并且由于结构还未被确定，目前还没有方法可以把它（们）从体内分离出来。

2、本试剂盒可以用于测量人体胎盘和血清样品中内源性洋地黄样因子的浓度，为进一步对该因子的致病机制、体内合成调节的研究打下良好基础，并使孕期早痫的病理研究工作向前迈进了一大步。

附图说明

图1为本发明试剂盒提供的地高辛单克隆抗体标准曲线（按照标准曲线绘制方法得到），横坐标代表乌本苷溶液浓度的log（摩尔/升）值；纵坐标代表标准乌本苷溶液经本发明所述方法测得的放射性含量，y=16.007e^-0.539x，R²=0.9756。

图2为本发明试剂盒测出的七份独立胎盘样本中分泌的内源性洋地黄样因子的浓度，样本来自正常孕妇，其中，横坐标1-7分别代表七份独立样本；纵坐标代表内源性洋地黄样因子浓度，单位纳摩/升。

图3为本发明试剂盒用于确定胎盘组织中内源性洋地黄样因子的浓度，样品来自早痫孕妇，其中，横坐标1-6分别代表6独立样本；纵坐标代表内源性洋地黄样因子浓度，单位纳摩/升。

图4为本发明试剂盒用于测量早痫孕妇血清中内源性洋地黄样因子的浓度，其中，横坐标1-8分别代表8份独立样本；纵坐标代表内源性洋地黄样因子浓度，单位纳摩/升。

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明作进一步详述，以下实施例只是描述性的，不是限定性的，不能以此限定本发明的保护范围。

本发明所述的一抗地高辛单克隆抗体购自Sigma、二抗兔抗鼠IgG购自Sigma、³H标记乌本苷购自Perkin Elmer、聚乙二醇4000购自Calbiochem、pH=7.4的磷酸缓冲液（PBS缓冲液）自配、³H闪烁液购自National Diagnostics、乌本苷购自Sigma、pH=7.4的三羟甲基氨基甲烷缓冲液（Tris缓冲液）购自Sigma，DMEM培养液购自Gibson。

本试剂盒的组成如下：

一抗地高辛单克隆抗体10纳克/毫升、二抗兔抗鼠IgG2.3×10^-8摩尔/升、³H标记乌本苷浓度为10.0Ci/mmol、聚乙二醇4000浓度为30wt%、pH=7.4的磷酸缓冲液（PBS缓冲液）、³H闪烁液、乌本苷、pH=7.4的Tris缓冲液。

本发明所述的试剂盒需要可以测量³H放射性的仪器设备进行测量。（设备名为scintillation counter。任何做放射性实验的实验室都有，操作过程为把样品放进去，运行操作软件，直接出结果。）

实施例1：

试剂盒用于测量胎盘组织分泌的内源性洋地黄样因子含量

(1)采集分娩时间少于6小时的新鲜人胎盘；

(2)拨开羊膜，取5mmX5mmX5mm大小的组织块4-5块，放入PBS中洗掉残留血液；

(3)将组织块剪成微粒，去除肉眼可见血块和血管，用PBS洗至无血液残留，在无菌滤纸上吸干PBS，放入DMEM培养液中，37℃、5%CO₂培养48小时；

(4)收集培养液，离心去除残留组织块，4℃保存；

(5)取出试剂盒中地高辛单克隆抗体、二抗兔抗鼠IgG、³H标记乌本苷，分别取100微升，与100微升待测样品充分混合，室温孵育；

(6)再加入400微升PEG4000溶液，8000rpm离心10分钟，得到沉淀物；

(7)沉淀物用500微升pH7.4的PBS重悬，加入4毫升³H闪烁液；

(8)测量样品放射量，根据标准曲线计算出样品中所含内源性洋地黄样因子浓度。

结果如图2所示，利用此试剂盒测量出独立胎盘组织中分泌的内源性洋地黄样因子浓度，单位为纳摩/升，此浓度可以被本发明提供的试剂盒精确测量。

实施例2：

该试剂盒用于测量人体冷冻胎盘组织中内源性洋地黄样因子的含量

(1)采集新生儿胎盘，切成2cm×2cm×2cm大小的组织块，液氮冷冻，保存于-80℃；

(2)将冷冻胎盘组织块切成薄片，置于匀浆器中，放入液氮罐中冷冻1分钟；以1500rpm的速度将组织薄片匀浆5分钟；

(3)收集匀浆组织，加入5毫升甲醇，混匀，以2000rpm的速度离心5分钟，去除蛋白；收集离心上清液，真空浓缩，4℃保存；

测量样品方法同实施例1中步骤(5)-(8)。

如图3所示，此试剂盒可测量冷冻胎盘组织中内源性洋地黄样因子的浓度，平均为实施例1中的100倍，样品来源均被确诊为早痫病发者。

实施例3：

该试剂盒用于测量人体血清中内源性洋地黄样因子的含量

测量方法同实施例1中步骤(5)-(8)。

结果如图4所示，该试剂盒可以精确测量出人体血清中低含量的内源性洋地黄样因子。

孕妇血清中内源性洋地黄样因子浓度超过150纳摩/升，即可初步判断为早痫患者。

此处指孕妇血清中内源性洋地黄样因子含量，因为医院在孕妇分娩前，化验血清是最方便的。但由于此因子在胎盘中产生，胎盘含量要远远高于血清含量，如图3与图4对比；又如图2，显示正常孕妇胎盘分泌到培养液中的因子浓度，与图4中早痫患者的血清中因子浓度具可比性，进一步证实了血清中含量远远少于胎盘，血清中该因子的低含量，以及化验血清比胎盘便捷，是本发明的重要创新。

标准曲线绘制步骤如下：

(1)取浓度分别为10纳摩/升，20纳摩/升，50纳摩/升，0.1微摩/升，0.2微摩/升，0.5微摩/升的乌本苷溶液各100微升；

(2)取出试剂盒中地高辛单抗、二抗兔抗鼠IgG、pH=7.4的Tris缓冲液，分别加100微升到上述不同浓度的乌本苷溶液中，充分混合，室温孵育；

(3)再加入400微升PEG4000溶液，8000rpm离心10分钟，得到沉淀物；

(4)沉淀物用500微升pH7.4的PBS重悬，加入³H闪烁液；

(5)测量样品放射量，得到样品中所含内源性洋地黄样因子浓度，绘制曲线，得到标准曲线。

由于乌本苷能够以与内源性洋地黄样因子相同的结合率结合到地高辛单抗上，可利用已知的乌本苷标准溶液的浓度代表样本中内源性洋地黄样因子的浓度。

Claims (5)

1.一种地高辛单克隆抗体检测内源性洋地黄样因子含量的试剂盒，其特征在于：包括如下组份

一抗地高辛单克隆抗体、二抗兔抗鼠IgG、³H标记乌本苷、聚乙二醇4000、pH=7.4的磷酸缓冲液、³H闪烁液、pH=7.4的Tris缓冲液。

2.根据权利要求1所述的地高辛单克隆抗体检测内源性洋地黄样因子含量的试剂盒，其特征在于：还包括乌本苷。

3.根据权利要求1所述的地高辛单克隆抗体检测内源性洋地黄样因子含量的试剂盒，其特征在于：所述一抗地高辛单抗10纳克/毫升、二抗兔抗鼠IgG2.3×10^-8摩尔/升，所述³H标记乌本苷浓度为10.0Ci/mmol，所述聚乙二醇4000浓度为30wt%。

4.根据权利要求1所述的地高辛单抗检测内源性洋地黄样因子含量的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒用于检测人体血清、胎盘组织分泌液、以及冷冻胎盘组织中的内源性洋地黄样因子的含量。

5.一种如权利要求1所述的地高辛单抗检测内源性洋地黄样因子含量的试剂盒的使用方法，其特征在于：步骤如下

(1)采集胎盘，切碎，液氮冷冻，保存于-80℃；

(2)将冷冻胎盘组织块切成薄片，置于匀浆器中，放入液氮罐中冷冻1分钟；以1500rpm的速度将组织薄片匀浆5分钟；

(3)收集匀浆组织，加入等量的甲醇，混匀，离心去除蛋白；收集离心上清液，真空浓缩，4℃保存；

(4)取出试剂盒中地高辛单克隆抗体、二抗兔抗鼠IgG、³H标记乌本苷、pH=7.4的三羟甲基氨基甲烷缓冲液，分别等量加入，与等量待测样品充分混合，室温孵育；

(5)再加入等量的PEG4000溶液，离心，得到沉淀物；

(6)沉淀物用500微升pH7.4的PBS重悬，加入³H闪烁液；

(7)测量样品放射量，根据标准曲线计算出样品中所含内源性洋地黄样因子的浓度。

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