CN103421676B - 一种核酸等温扩增反应系统及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种核酸等温扩增反应系统及其制备方法和应用，所述核酸等温扩增反应系统包括毛细管主体，所述毛细管主体中灌注有至少一个样品扩增反应液层，所述样品扩增反应液层的两端分别依次灌注有气体层和至少一个液体层；所述的核酸等温扩增反应系统在核酸扩增中的应用；及所述的核酸等温扩增反应系统在制备用于疾病检测的药物中的应用。本发明的系统消除了核酸等温扩增反应中气溶胶泄露污染的问题，大大提高了等温扩增技术的可信度；操作极为简单，成本低廉，易于集成，加热方式多样，信号的激发方式也多样，整个流程自始至终可以完全脱离外部电源的供给，最终信号可以用肉眼直接进行观察。

Description

一种核酸等温扩增反应系统及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及一种核酸扩增反应系统，尤其涉及一种核酸等温扩增反应系统及其制备方法和应用，属于生物技术领域。

背景技术

核酸等温扩增技术因其恒温的特性，而在核酸检测领域具有非常大的吸引力，例如环介导等温扩增技术（loop-mediatedisothermalamplification,LAMP）就是其中的典型代表。但是此类技术长期受制于气溶胶污染的问题，使其实际应用大受限制。LAMP比传统的聚合酶链式反应（polymerasechainreaction,PCR）灵敏得多，以致于它对痕量的污染也很敏感，经常出现假阳性。

目前已经有一些研究展示了用聚二甲基硅氧烷（polydimethylsiloxane,PDMS）制备的微反应器去做LAMP反应，但PDMS这种材料的固有属性是多孔、透气，这些属性对于细胞培养等工作是有利的，但是却不适合核酸扩增的应用，因为在这个微反应器中会有溶液的蒸发及气泡的产生。实际上，引起气溶胶污染的最常见的原因是扩增过程中气泡的爆裂，而这类气溶胶很容易冲破PDMS微反应器的封合界面。此外，PDMS很疏水，基于PDMS的微加工往往在微观尺度上几何形状并不规则，这些都会导致在加样和加热的过程中产生气泡，这些气泡很可能会冲破对进样口、出样口或不同反应池之间所做的封闭。虽然有一些研究工作针对上述PDMS的缺点，对原始的PDMS进行了一些材料改性，意图提高它的不可渗透性及几何形状的规则性，但这无疑增加了制备的复杂性与成本。

在实际应用中以一种廉价、简单的装置高效地执行多种靶标的同时检测，依旧是一种紧迫的需求。有工作将传统的PCR小管小型化集成到一个PDMS芯片上去做多重扩增，但芯片的制作依然依赖于精密微加工。在最近几年，芯片上的液滴技术也被越来越多地用于核酸扩增，但是它们都需要复杂的流体控制系统，外设往往庞大且需要外部供电，因此从整体上来看，此类装置并没有真正地实现小型化。

为了避免复杂的流体控制，最近有些研究工作展示了一种基于毛细管的开放式芯片，其在物理化学上已被证明可以减低微尺度下被加热液体的快速蒸发，但它们要么依赖于复杂的微加工技术，要么减低蒸发的效果有限。在封闭体系下做无污染的核酸扩增依然占据主导地位，关键问题是如何实现一种简单但有效的封闭。

因此，本发明需要设计一种制作材料便宜，且简单有效封闭的微反应器进行核酸等温扩增。

发明内容

因此，本发明的目的是针对目前的核酸等温扩增系统操作复杂和制造成本高，无法实现真正的小型化，并且不能有效封闭，提供一种核酸等温扩增反应系统及其制备方法和应用，以达到核酸等温扩增操作简单，制造成本低，能够实现真正的小型化和有效封闭。

针对上述目的，本发明的技术方案如下：

一方面，本发明提供一种核酸等温扩增反应系统，包括毛细管主体，所述毛细管主体中灌注有至少一个样品扩增反应液层，所述样品扩增反应液层的两端分别依次灌注有气体层和至少一个液体层。

优选地，所述液体层外还设有固体封闭层，优选地，所述固体密封层为环氧胶层。

优选地，所述液体层和固体密封层间还灌注有气体层。

优选地，当所述样品扩增反应液层为2个以上时，所述样品扩增反应液层间灌注有至少一个气体层。

优选地，所述样品扩增反应液层包含待检测核酸的模板、待检测核酸的引物、DNA聚合酶和反应缓冲液，更优选地，所述待检测核酸为DNA和/或RNA，进一步优选地，当待检测核酸的模板为RNA时，所述样品扩增反应液层还含有逆转录酶。

优选地，所述DNA为质粒。

优选地，所述RNA为从待检测样品中提取的RNA。

优选地，当所述样品扩增反应液层间灌注有2个气体层以上时，所述气体层通过液体层相间隔。

优选地，当所述液体层为2个以上时，所述液体层间通过气体层相间隔。

优选地，所述毛细管主体为玻璃毛细管主体。

优选地，所述气体层为空气层。

优选地，所述液体层为水层。

再一方面，本发明提供一种核酸等温扩增反应系统的制备方法，包括以下步骤：

1）通过移液枪将液体推入毛细管内，并继续将移液枪按至第二档，使得枪头里的气体也被注入管内；

2）然后按照步骤1）的操作依次加入至少一个样品扩增反应液和液体。

还一方面，本发明提供一种核酸等温扩增反应系统的制备方法，包括以下步骤：

1）预先将纯水注满毛细管；

2）通过移液枪将毛细管的一端点上一滴液体，将毛细管的另一端接触吸水纸，将液滴带入毛细管内；

3）再按步骤2）的操作，将至少一个样品扩增反应液和分隔反应液的液体加入毛细管内。

优选地，还包括在毛细管的两端分别加一层固体密封层，更优选地，所述固体密封层为环氧胶层。

优选地，所述毛细管为玻璃毛细管，更优选地，所述液体为水。

再一方面，本发明提供一种本发明所述的核酸等温扩增反应系统在核酸扩增中的应用。

还一方面，本发明提供一种本发明所述的核酸等温扩增反应系统在制备用于疾病检测或核酸扩增的试剂盒中的应用。

优选地，所述疾病包括流感或艾滋病。

又一方面，本发明提供一种用于疾病检测或核酸扩增的试剂盒，所述试剂盒包括本发明所述的核酸等温扩增反应系统。

优选地，所述疾病包括流感或艾滋病。

本发明的核酸等温扩增反应系统在毛细管进行反应的突出优势在于，它易于大规模工业化制造，并且易于平行化地集成，这对于执行高通量反应非常有用。玻璃是最常用于制备医用毛细管的材料，因为它具有优异的生物相容性、良好的透光性、稳定的物理化学属性以及丰富的表面化学，毛细管成本低廉、物性均一、易于使用、可以防止溶液蒸发。对于一个足够简单的多重核酸等温扩增技术来讲；LAMP技术快速、等温、检测结果可以裸视读出；本发明将这些优点整合为一体；充分利用了玻璃毛细管所固有的诸多优异特性，在其管内部进行多重核酸等温扩增，并在管两端共用气体、液体、固体三种封闭方式，最大限度地消除可能发生的污染问题，增强等温扩增实验的可信度。

本发明所述的核酸等温扩增反应系统操作简便，成本极为低廉，且无需任何外部供电的液体驱动装置。

现有技术在单个PCR小管里做LAMP反应，每个小管只能做一个靶标，而本装置可以在一根毛细管里同时做多种靶标的检出，此装置既可以在同一根管内检测多种靶标，还易于将多个管进行平行化式的集成，从而方便地实现高通量检测。

现有技术的单个PCR管所需的反应总体积为25微升，而本发明所述的核酸等温扩增反应系统针对每个靶标的反应总体积小于1微升；此本发明所述的反应系统体积小巧，制作简单，加热方式多种多样，并且提供了一种可以完全依赖裸视去读出扩增信号的方式。本发明可以在完全不依赖大型仪器、不依赖供电设备的情况下，实现高通量核酸等温扩增。本发明消除了核酸等温扩增反应中气溶胶泄露污染的问题，现有的PCR小管容易在加热的过程中被管内的蒸汽冲开，造成气溶胶的泄露，而毛细管一是有抑制蒸发的效果，二是用坚固的环氧胶进行了密封，因此不会被冲开，大大提高了等温扩增技术的可信度，从而会使得更多的人来利用这个方法。本发明所展示的毛细管系统操作极为简单，成本低廉，易于集成，加热方式多样，信号的激发方式也多样，整个流程自始至终可以完全脱离外部电源的供给，最终信号可以用肉眼直接进行观察。

附图说明

以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：

图1为本发明所述的核酸等温扩增反应系统的制备的流程图，其中，图1A为本发明所述的核酸等温扩增反应系统一种制备方法的流程图，图1B为本发明所述的核酸等温扩增反应系统另一种制备方法的流程图，图1C为制备好的本发明所述的核酸等温扩增反应系统的结构示意图，图中，1为毛细管主体，2为样品扩增反应液层，3为气体层，4为液体层，5为固体密封层；

图2为本发明实施例1中的核酸等温扩增反应系统的结构示意图及扩增结果，其中，（A）为实施例1中的核酸等温扩增反应系统的结构示意图；（B）为本发明实施例1中的核酸等温扩增反应系统扩增结果图，图中，1为毛细管主体，201为FluA扩增反应液层，202为流行性H1N1（PandemicH1N1）扩增反应液层，3为空气层，4为纯水层，5为环氧胶层；

图3为本发明实施例2中的核酸等温扩增反应系统的结构示意图及扩增结果，其中，（A）为实施例2中的核酸等温扩增反应系统的结构示意图，（B）为实施例2中的核酸等温扩增反应系统扩增结果图，图中，1为毛细管主体，201为不含质粒的扩增反应液层，202为含质粒的扩增反应液层，3为气体层，4为液体层，5为环氧胶层；

图4为本发明实施例3中的核酸等温扩增反应系统的结构示意图及扩增结果图，其中，（A）为实施例3中的核酸等温扩增反应系统的结构示意图，（B）为实施例3中的核酸等温扩增反应系统扩增结果图，图中，1为毛细管主体，201为不含质粒的扩增反应液层，202为含无关DNA的扩增反应液层，203为含质粒的扩增反应液层，3为气体层，4为液体层，5为环氧胶层；

图5为本发明实施例4中的核酸等温扩增反应系统的结构示意图及扩增结果图，其中，（A）为实施例4中的核酸等温扩增反应系统的结构示意图，（B）为实施例4中的核酸等温扩增反应系统扩增结果图，图中，1为毛细管主体，201为含质粒的扩增反应液层，3为气体层，4为液体层，5为环氧胶层；

图6为本发明实施例5中的核酸等温扩增反应系统扩增结果图，其中，1为2×10⁹拷贝待检测DNA质粒时的检测，2为2×10⁸拷贝待检测DNA质粒时的检测结果，3为2×10⁷拷贝待检测DNA质粒时的检测结果，4为2×10⁵拷贝待检测DNA质粒时的检测结果，8为2×10⁶拷贝待检测DNA质粒时的检测结果，5为2×10⁴拷贝待检测DNA质粒时的检测结果，6为2×10³拷贝待检测DNA质粒时的检测结果，7为2×10²拷贝待检测DNA质粒时的检测结果，9为2×10¹拷贝待检测DNA质粒时的检测结果，10为2个拷贝待检测DNA质粒时的检测结果，11为结果没有待检测DNA质粒时的检测结果；

图7为本发明实施例6中的核酸等温扩增反应系统的结构示意图及扩增结果，其中，（A）为实施例6中的核酸等温扩增反应系统的结构示意图；（B）为实施例6中的核酸等温扩增反应系统扩增结果图，图中，1为毛细管主体，201为p24扩增反应液层，202为蛋白酶（Protease）基因扩增反应液层，3为气体层，4为液体层，5为环氧胶层。

具体实施方式

如图1-3所示，本发明所述的核酸等温扩增反应系统，包括毛细管主体1，所述毛细管主体1中灌注有至少一个样品扩增反应液层2，所述样品扩增反应液层2的两端分别依次灌注有气体层3、至少一个液体层4，所述毛细管主体为玻璃毛细管主体，所述气体层为空气层，所述液体层为水层。

优选地，所述液体层4外还设有固体封闭层5，所述固体密封层5为环氧胶层，所述液体层4和固体密封层5间还灌注有一气体层3。

优选地，当所述样品扩增反应液层2为2个以上时，所述样品扩增反应液层间灌注有至少一个气体层3。

优选地，所述样品扩增反应液层2间灌注有2个气体层3以上时，所述气体层3通过液体层4相间隔。

除非特别指明，以下实施例中的手电筒和验钞笔可以用电池供电，从而脱离有线电源，实现随时随地可以观察的便利。

除非特别指明，以下实施例中所述的暖贴加热的方式是一种脱离电力供应的加热方式，因此在不通电的资源匮乏的地区也可以应用本装置进行疾病筛查。暖贴有不同的规格，选择最高温度68℃、12小时内的平均温度为53℃，即可。其基本的操作方法是在两片暖贴之间插入待加热的毛细管，即可。由于毛细管体积很小，所以可以同时插入多根。

除非特别指明，以下实施例中所用的甜菜碱购自Sigma-Aldrich，BstDNA聚合酶、AMV逆转录酶均购自NewEnglandBiolabs，引物委托上海生工生物工程技术服务有限公司合成，并且是经过测序验证的。

实施例1

质粒扩增反应液的配制：

1×ThermoPol缓冲液（含有20.0mMTris-HCl、10.0mMKCl、10.0mM(NH₄)₂SO₄、0.1%TritonX-100、pH8.8)，8.0mMMgSO₄，0.5mMMnCl₂，25.0μM钙黄绿素，0.4mMdNTPs，流行性H1N1（PandemicH1N1）保守序列和FluA保守序列中的各引物的量分别如下：F3引物和B3引物各0.2μM，FIP引物和BIP引物各2.0μM，LF引物和LB引物各0.8μM，1.0M甜菜碱，0.32U/μlBstDNA聚合酶，少许待测插入有PandemicH1N1保守序列的pUC57载体和插入有FluA保守序列的pUC57载体（这两种质粒均购自上海生工生物工程技术服务有限公司）的DNA样品作为模板。

质粒有两种，分别扩增两种与甲型流感病毒相关的靶序列：

流行性H1N1保守序列：

GAAATAGCAATAAGACCCAAAGTGAGGGATCAAGAAGGGAGAATGAACTATTACTGGACACTAGTAGAGCCGGGAGACAAAATAACATTCGAAGCAACTGGAAATCTAGTGGTACCGAGATATGCATTCGCAATGGAAAGAAATGCTGGATCTGGTATTATCATTTCAGATACACCAGTCCACGATTGCAATACAACTTGTCAGACACCCAAGGGTGCTATAAACACCAGCCTCCCATTTCA（SEQIDNO:1）

FluA保守序列：

GCGCTCATGGAATGGCTAAAGACAAGACCAATCCTGTCACCTCTGACTAAGGGGATTTTAGGATTTGTGTTCACGCTCACCGTGCCCAGTGAGCGAGGACTGCAGCGTAGACGCTTTGTCCAAAATGCCCTTAATGGGAATGGGGATCCAAACAACATGGACAGAGCGGTCA（SEQIDNO:2）

针对流行性H1N1保守序列的LAMP引物（5’~3’）为：

流行性H1N1-F3：CAATAAGACCCAAAGTGAGG（SEQIDNO:3）

流行性H1N1-B3：TGTCTGACAAGTTGTATTGC（SEQIDNO:4）

流行性H1N1-LF：CTAGTGTCCAGTAATA（SEQIDNO:5）

流行性H1N1-LB：GGAAAGAAATGCTGGATC（SEQIDNO:6）

流行性H1N1-FIP：AATGTTATTTTGTCTCCCGGCTGATCAAGAAGGGAGAATGAAC（SEQIDNO:7）

流行性H1N1-BIP：ATCTAGTGGTACCGAGATATGCAGTGGACTGGTGTATCTGAA（SEQIDNO:8）

针对FluA保守序列的LAMP引物（5’-3’）为：

FluA-F3：GCGCTCATGGAATGGCTAA（SEQIDNO:9）

FluA-B3：TGACCGCTCTGTCCATGTT（SEQIDNO:10）

FluA-LF：AAATCCTAAAATCCCC（SEQIDNO:11）

FluA-LB：CGCTTTGTCCAAAATGCC（SEQIDNO:12）

FluA-FIP：GGCACGGTGAGCGTGAACACACCAATCCTGTCACCTCTGA（SEQIDNO:13）

FluA-BIP：GAGCGAGGACTGCAGCGTAGGTTTGGATCCCCATTCCCAT（SEQIDNO:14）

将其按图2中的（A）所示的样品分布，装于玻璃毛细管中，然后将装有样品的玻璃毛细管在65℃水浴下反应1个小时，阳性样品即可在台式紫外灯紫外光的照射下，发射出肉眼可见的荧光（如图2中的（B）所示）。

并且，在传统的PCR小管里用相同的质粒扩增反应液，在相同的条件下进行LAMP反应，得到了相同的可视化结果。

本实施例证明了在一个毛细管中同时检测多个样品的可行性，这是实现高通量检测的一个途径。

实施例2

反应液的组成、反应条件、反应时间均与实施例1相同，只是通入玻璃毛细管内的液体顺序不同，具体通入情况如图3中的（A）所示，并且用柔性电加热片加热，于65℃下反应1个小时。其特点在于，不含质粒的反应液两端都有含质粒的反应液，但是它们之间分别用两个水滴隔开，通过紫外手电筒紫外光的照射下，观察发出紫色荧光的试验结果如图3中的（B）所示。

并且，在传统的PCR小管里用相同的质粒扩增反应液，在相同的条件下进行LAMP反应，得到了相同的可视化结果。

本实施例证明了用两段水柱间隔开相邻的反应液是可以避免反应液间交叉污染的。

实施例3

反应液的组成、反应条件、反应时间均与实施例1相同，只是通入玻璃毛细管内的液体顺序不同，具体通入情况如图4中的（A）所示，并且用热片加热，于65℃下反应1个小时。其特点在于，含质粒的反应液的一侧有两段反应液，这两段反应液均不含有靶序列，其中一个完全不含DNA，另一个含有非靶序列的DNA，这三者之间分别用两个水滴隔开，通过紫外验钞笔紫外光的照射下，观察发出紫色荧光的试验结果如图4中的（B）所示。

并且，在传统的PCR小管里用相同的质粒扩增反应液，在相同的条件下进行LAMP反应，得到了相同的可视化结果。

本实施例证明了阳性反应液在加热1个小时的过程中所产生的蒸汽不会从一侧单方向地流至另一侧。

实施例4

反应液的组成、反应条件、反应时间均与实施例1相同，只是通入毛细管内的液体顺序不同，具体通入情况如图5中的（A）所示，并且用暖贴加热，于65℃下反应1个小时。其特点在于，阳性反应液的进样体积有大有小，通过紫外手电筒紫外光的照射下，观察发出紫色荧光的试验结果如图5中的（B）所示。

并且，在传统的PCR小管里用相同的质粒扩增反应液，在相同的条件下进行LAMP反应，得到了相同的可视化结果。

本实施例证明了在毛细管内的核酸扩增反应对反应体积没有严格要求，这降低了对进样精度的要求，简化了操控。

实施例5

反应液的组成、反应条件、反应时间均与实施例1相同，具体通入情况如图6所示，其特点在于，平行化集成了多个毛细管，每个毛细管中初始模板的数量不同，通过紫外验钞笔紫外光的照射下，观察发出紫色荧光的试验结果。

并且，在传统的PCR小管里用相同的质粒扩增反应液，在相同的条件下进行LAMP反应，得到了相同的可视化结果。

本实施例证明了毛细管中的LAMP可以达到2个拷贝的检出限，另外也展示了毛细管易于做平行化集成、从而实现高通量的检测。

实施例6

HIV病毒扩增反应液的配制：

1×ThermoPol缓冲液（含有20.0mMTris-HCl、10.0mMKCl、10.0mM(NH4)₂SO₄、0.1%TritonX-100、pH8.8)，8.0mMMgSO₄，0.5mMMnCl₂，25.0μM钙黄绿素，1.4mMdNTPs，F3引物和B3引物各0.2μM，FIP引物和BIP引物各1.6μM，LF引物和LB引物各0.8μM，0.4M甜菜碱，0.32U/μlBstDNA聚合酶，0.025U/μlAMV逆转录酶，少许提取的HIV病毒RNA作为模板。

HIV的靶序列有两种：p24基因和蛋白酶（Protease）基因。HIV检测中用到的引物是参照下述文献而来的：

RapiddetectionofHIV-1byreverse-transcription,loop-mediatedisothermalamplification(RT-LAMP).JVirolMethods,2008,151(2):264-270.

针对p24基因的LAMP引物为：

HIV_p24-F3：ATTATCAGAAGGAGCCACC（SEQIDNO:15）

HIV_p24-B3：CATCCTATTTGTTCCTGAAGG（SEQIDNO:16）

HIV_p24-LF：TTTAACATTTGCATGGCTGCTTGAT（SEQIDNO:17）

HIV_p24-LB：GAGATCCAAGGGGAAGTGA（SEQIDNO:18）

HIV_p24-FIP：CAGCTTCCTCATTGATGGTTTCTTTTTAACACCATGCTAAACACAGT（SEQIDNO:19）

HIV_p24-BIP：TGTTGCACCAGGCCAGATAATTTTGTACTGGTAGTTCCTGCTATG（SEQIDNO:20）

针对蛋白酶基因的LAMP引物为：

HIV_蛋白酶-F3：AAAGATAGGGGGGCAACT（SEQIDNO:21）

HIV-蛋白酶-B3：GTTGACAGGTGTAGGTCCTA（SEQIDNO:22）

HIV_蛋白酶-LF：TATTTCTTCTAATACTGTATCA（SEQIDNO:23）

HIV_蛋白酶-LB：TATCAAAGTAAGACAGTA（SEQIDNO:24）

HIV_蛋白酶-FIP：GGTTTCCATCTTCCTGGCAAATTTTTTCTCTATTAGATACAGGAGCAGA（SEQIDNO:25）

HIV_蛋白酶-BIP：TGATAGGGGGAATTGGAGGTTTTTTTCCTATAGCTTTATGTCCACAGA（SEQIDNO:26）

将其按图7中的（A）所示的样品分布，装于玻璃毛细管中，然后将装有样品的玻璃毛细管用烘箱加热，于65℃下反应45分钟，阳性样品即可在紫外光的照射下，发射出肉眼可见的荧光（图7中的（B））。

先从三个不同的艾滋病血样（取自中国疾病预防控制中心的三个不同的艾滋病血样，并且患者都签了知情同意书）中提取病毒RNA，每个血样对应一根毛细管，按照图7中的（A）的方式分别注入管中，进行扩增反应，均给出了正常阳性信号。

并且，在传统的PCR小管里用相同的样品扩增反应液，在相同的条件下进行LAMP反应，得到了相同的可视化结果。

本实施例证明了反转录LAMP在毛细管中也可以进行，还证明了本方法和本装置对实际临床样品应用的可行性。

因而，以上的每个实施例中，我们都平行地在传统的PCR小管里用相同的混合液做了相同的LAMP反应，均得到了相同的可视化结果，证明本方法与传统方法的具有一致性。

Claims (22)

1.一种核酸等温扩增反应系统，包括毛细管主体，所述毛细管主体中灌注有至少一个样品扩增反应液层，所述样品扩增反应液层的两端分别依次灌注有气体层和至少一个液体层；

其中，所述液体层外还设有固体密封层；

其中，所述液体层和固体密封层间还灌注有气体层。

2.根据权利要求1所述的核酸等温扩增反应系统，其特征在于，所述固体密封层为环氧胶层。

3.根据权利要求1或2所述的核酸等温扩增反应系统，其特征在于，当所述样品扩增反应液层为2个以上时，所述样品扩增反应液层间灌注有至少一个气体层。

4.根据权利要求1或2所述的核酸等温扩增反应系统，其特征在于，所述样品扩增反应液层包含检测核酸的模板、待检测核酸的引物、DNA聚合酶和反应缓冲液。

5.根据权利要求4所述的核酸等温扩增反应系统，其特征在于，所述待检测核酸的模板为DNA和/或RNA。

6.根据权利要求5所述的核酸等温扩增反应系统，其特征在于，当待检测核酸的模板为RNA时，所述样品扩增反应液层还含有逆转录酶。

7.根据权利要求5所述的核酸等温扩增反应系统，其特征在于，所述DNA为质粒或所述RNA为从待检测样品中提取的RNA。

8.根据权利要求1或2所述的核酸等温扩增反应系统，其特征在于，当所述样品扩增反应液层间灌注有2个气体层以上时，所述气体层通过液体层相间隔。

9.根据权利要求1或2所述的核酸等温扩增反应系统，其特征在于，当所述液体层为2个以上时，所述液体层间通过气体层相间隔。

10.根据权利要求1或2所述的核酸等温扩增反应系统，所述毛细管主体为玻璃毛细管主体。

11.根据权利要求1或2所述的核酸等温扩增反应系统，所述气体层为空气层或所述液体层为水层。

12.根据权利要求1至11中任一项所述的核酸等温扩增反应系统的制备方法，包括以下步骤：

1)通过移液枪将液体推入毛细管内，并继续将移液枪按至第二档，使得枪头里的气体也被注入管内；

2)然后按照步骤1)的操作依次加入至少一个样品扩增反应液和液体。

13.根据权利要求1至11中任一项所述的核酸等温扩增反应系统的制备方法，包括以下步骤：

1)预先将纯水注满毛细管；

2)通过移液枪将毛细管的一端点上一滴液体，将毛细管的另一端接触吸水纸，将液滴带入毛细管内；

3)再按步骤2)的操作，将至少一个样品扩增反应液和分隔反应液的液体加入毛细管内。

14.根据权利要求12或13所述的核酸等温扩增反应系统的制备方法，其特征在于，还包括在毛细管的两端分别加一层固体密封层。

15.根据权利要求14所述的制备方法，其特征在于，所述固体密封层为环氧胶层。

16.根据权利要求12或13所述的核酸等温扩增反应系统的制备方法，其特征在于，所述毛细管为玻璃毛细管。

17.根据权利要求12或13所述的核酸等温扩增反应系统的制备方法，其特征在于，所述液体为水。

18.根据权利要求1或2所述的核酸等温扩增反应系统在核酸扩增中的应用。

19.根据权利要求1或2所述的核酸等温扩增反应系统在制备用于疾病检测或核酸扩增的试剂盒中的应用。

20.根据权利要求19所述的应用，其特征在于，所述疾病包括流感或艾滋病。

21.一种用于疾病检测或核酸扩增的试剂盒，所述试剂盒包括权利要求1或2所述的核酸等温扩增反应系统。

22.根据权利要求21所述的试剂盒，其特征在于，所述疾病包括流感或艾滋病。