CN103409312A - 用于研究肿瘤细胞上皮-间充质转化的细胞力学模拟系统 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用于研究肿瘤细胞上皮-间充质转化的细胞力学模拟系统，该用于研究肿瘤细胞上皮-间充质转化的细胞力学模拟系统包括恒流泵、储液瓶、体外细胞力学模拟装置，所述恒流泵、储液瓶和体外细胞力学模拟装置通过导管串联成封闭圆环。与现有技术相比，本发明保护的用于研究肿瘤细胞上皮-间充质转化的细胞力学模拟系统可以放置多张载玻片，对种植于其上的肿瘤细胞进行剪切应力加载，所加载的流场均匀稳定，且通过流量的调节可以实现不同大小的剪切应力加载。该系统可用于观察种植于载玻片上的肿瘤细胞受流体剪切应力作用后发生上皮-间充质转化的动态情况，且通过串联的载玻片观察上游细胞在经过剪切应力作用后的局部迁移和粘附至下游载玻片的能力。

Description

用于研究肿瘤细胞上皮-间充质转化的细胞力学模拟系统

技术领域

本发明涉及一种工业化的模拟系统，特别涉及一种用于研究肿瘤细胞上皮-间充质转化的细胞力学模拟系统。

背景技术

恶性肿瘤是细胞不仅异常快速增殖，而且可发生扩散转移的肿瘤。临床肿瘤病人的死亡者中绝大部分是因为肿瘤的转移引起的，因此我们需要研究肿瘤转移的一般过程和规律。

现在，肿瘤转移相关的模型包括两大类：体外模型和体内模型。体外模型多为浸润或粘附模型研究，而体内模型主要为转移模型，包括人工转移和自发转移模型。目前体内模型的宿主多为小鼠，且由于裸鼠的出现，在鼠体内研究人肿瘤已经更加方便。但是体内模型也有明显的局限性，一是条件控制难度大，由于在生物体内，各种作用因素错综复杂，要控制或探明某一种因素的作用十分困难；二是生物体的个体差异，不同种的生物之间、同种异体的生物之间甚至同一生物个体的不同器官和组织之间，对肿瘤的反应都是不尽相同的，因此要准确研究肿瘤的性质，仅仅依靠有限的体内模型是不够的；三是观察不方便，由于观察对象位于生物体内，无法直接、准确地观察到，若是可运动的动物模型，还需要对动物进行固定，观察的时间、方法都很有限；四是实验周期长，从饲养或购买、制造模型、进行相应处理到观察、获得结果，所需的时间往往较长，实验效率不及体外模型。体外模型尽管不能完全模拟体内的情况，但它却克服了体内模型以上的不足。并且肿瘤在转移前后，其局部的粘附、运动等能力都会发生变化，研究肿瘤细胞的这些性质对阐明肿瘤转移的机理十分重要，再结合目前广泛应用的分子生物、分子影像等技术，所以当我们从肿瘤局部或肿瘤个体来研究肿瘤转移时，还是常常会从体外模型入手。

肿瘤在转移前后会在局部受到许多物理化学因素的影响。过去的研究者都着重研究各种化学因素，但近年来人们意识到，物理因素也是导致细胞发生变化的重要因素之一。在肿瘤组织中，有丰富的血管和淋巴管，肿瘤细胞在这些管道的管壁受到持续的力学因素刺激特别是低剪切应力（小于10dyn/cm²）作用。而肿瘤最常见的转移途径也是血道和淋巴道转移，因此我们有必要探明力学刺激特别是剪切应力刺激对肿瘤转移的影响。

在肿瘤特别是上皮来源的肿瘤转移的过程中，其粘附能力和运动能力都会发生较大的变化，从类似上皮样的粘附能力很强的细胞转化为粘附能力减弱、运动能力增强的间充质样的细胞，因此有人提出了肿瘤的上皮-间充质转化学说。上皮-间充质转化（Epithelial-mesenchymal transition,EMT）是指具有上皮表型的细胞通过特定的程序转化为具有间充质表型的细胞的生物学过程。EMT在胚胎发育、慢性炎症、组织重建、癌症转移和多种纤维化疾病中都发挥了重要作用，其主要特征有细胞黏附分子如E-cadherin表达减少、细胞骨架转化为以波形蛋白Vimentin为主及形态和功能上具有间充质细胞的特征等。通过EMT，上皮细胞失去了细胞极性、失去与基底膜连接，获得较高的迁移、抗凋亡等间充质细胞表型。近年来，越来越多的研究者认为EMT是上皮细胞来源的恶性肿瘤细胞获得迁移和侵袭能力的重要生物学过程。阐明调控恶性肿瘤细胞发生EMT过程的分子机制，明确其在恶性肿瘤的发生、发展、转移中的意义，并探索基于EMT关键分子的诊断方法及靶向EMT关键分子的治疗手段是肿瘤转移中EMT机制研究的关键科学问题。

结合上述力学因素，研究者期望探明剪切应力与EMT的关系，以进一步明确肿瘤转移的机制。为此，需要一个为肿瘤细胞加载剪切应力的体外模型，这个模型不仅能够进行体外恒定且可调的剪切应力加载，还要有足够的空间能观察到细胞的迁移与粘附。

微管和流动腔（流室）是当前生物流变学领域中最常见的两种体外研究方法。微管适用于单个细胞的定量研究，而流动腔则适用于研究一群细胞对流场的反应，且与微管相比，操作简便快速，能实现自动化控制，结果具有统计学意义。它既能保证细胞受到不同水平的恒流剪切应力作用，又能让细胞在受到剪切应力作用的同时保持粘附，以便适时观察记录，因此目前流动腔已经成为人们研究细胞在剪切应力作用下形态功能特征的重要手段之一。

流动腔是一种常用的在体外对细胞进行流体剪切应力加载的装置，该装置可以模拟细胞在体内流体环境（如血液、淋巴液、组织液等）中所受的力学因素，特别是流体剪切应力。将该装置置于以恒流泵为动力的闭合回路中，恒流泵使液体以一定的流量通过装置。液体在流过装置的过程中，会对流动腔的腔壁施加一定的切应力。我们将细胞种植于流动腔的腔壁上，就可以以液体对腔壁的切应力来模拟体内细胞所受到的切应力，从而为我们体外模拟细胞力学环境创造了条件。

然而，现在大多数用于细胞剪切应力加载的流动腔，都是由各个实验室或研究所根据自己的研究需要自行设计或改进的，并没有统一的规格或标准。如中国科学院力学研究所设计的一种平行圆板流动腔，以圆板的绕轴转动来为板上的细胞提供剪切应力，可以在同一块板上形成剪切应力梯度；重庆大学设计的流动腔尺寸较小，固定方便，入口与流动腔垂直，并设有缓冲池，可用于少量细胞的剪切应力加载；四川大学刘肖珩教授等设计的平行平板流动腔，在入口和出口处设有缓冲池，中间为放置载玻片的剪切应力作用区域，可将细胞种植在载玻片上后直接进行力学加载，刘肖珩教授等以此研究剪切应力与内皮细胞相关性质的关系；加州大学Nauman等人设计的流动腔，缓冲池的截面为三角形；美国GlycoTech公司的平行平板流动腔置于35mm培养皿内，整个作用区域为20mmx2.5mm的区域，以橡胶圈和负压吸引的方式密封，液体直接作用于种植于培养皿内的细胞。

虽然各种流动腔都有自己的特点，但也都或多或少地存在问题。首先，液体从流入作用区域到形成充分发展的流场需要一定的时间和空间，但很多流动腔却并没有考虑到这个问题，在液体流入流动腔后便直接与载玻片或流动腔壁上的细胞相作用；或者是在流动腔内放入载玻片等细胞的载体后，内部几何空间变得不标准，不适合剪切应力的计算与加载。再者，即使成为了充分发展的液体流，也并不是在作用区域内的所有地方受力均是一样的，所以还需要考虑有效的作用区域。第三，目前大多数流动腔都只针对单张载玻片或少量细胞设计，如果需要的细胞量很大，实验的重复度较高，或是因为实验需要较大的剪切应力作用区域比如多张载玻片串联，则目前的流动腔并不能满足要求。如果循环或串联使用流动腔，既费时费力，还可能改变实验环境，也增加了更多不确定因素，影响结果。

由于传统流动腔以上的不足，我们认为需要有一种新的装置来克服这些缺点。

发明内容

本发明的目的就在于提供一种用于研究肿瘤细胞上皮-间充质转化的细胞力学模拟系统，该用于研究肿瘤细胞上皮-间充质转化的细胞力学模拟系统可以放置多张载玻片，对种植于其上的肿瘤细胞进行剪切应力加载，并研究细胞的上皮-间充质转化和局部迁移、粘附的能力，进行剪切应力加载的流场均匀稳定，且通过流量的调节可以实现不同大小的剪切应力加载。

技术方案是：一种用于研究肿瘤细胞上皮-间充质转化的细胞力学模拟系统，该用于研究肿瘤细胞上皮-间充质转化的细胞力学模拟系统包括恒流泵、储液瓶、体外细胞力学模拟装置，所述恒流泵、储液瓶和体外细胞力学模拟装置通过导管串联成封闭圆环。

作为优选，所述体外细胞力学模拟装置包括上板和下板，所述上板包括一有机玻璃上基板，所述下板包括一有机玻璃下基板，该有机玻璃下基板上顺次设置有入口、入口缓冲池、出口缓冲池和出口，所述入口缓冲池与出口缓冲池之间为剪切应力作用区域，该剪切应力作用区域内设置有第一载玻片放置槽、第二载玻片放置槽和第三载玻片放置槽；所述体外细胞力学模拟装置上还设置有一圈硅胶圈放置槽。

作为优选，所述剪切应力作用区域从入口缓冲池出口到第一载玻片放置槽长度与第三载玻片放置槽到出口缓冲池入口的长度均为44.5mm，所述剪切应力作用区域宽度为95.0mm，高度为0.6mm；第一载玻片放置槽、第二载玻片放置槽和第三载玻片放置槽居中串联放置，所述第一载玻片放置槽、第二载玻片放置槽和第三载玻片放置槽长轴与所述有机玻璃下基板长轴垂直；所述入口与出口缓冲池长度与高度均为1.0cm，宽度为9.5cm，所述入口和出口分别位于缓冲池的宽的正中。

作为优选，所述第一载玻片放置槽、第二载玻片放置槽和第三载玻片放置槽居中放置的载玻片均为75mm×25mm×1mm，与第一载玻片放置槽、第二载玻片放置槽和第三载玻片放置槽大小相同，相邻两个载玻片放置槽之间距离为0.5cm，每个载玻片放置槽与所述剪切应力作用区域两边的距离为1.0cm。

作为优选，所述上板和下板通过螺丝钉和六角螺帽固定。

作为优选，所述入口、出口缓冲池、载玻片槽位均为凹槽，所述入口顶部、出口缓冲池的顶部与剪切应力作用区域的顶部平齐，载玻片槽位顶部与剪切应力作用区域底部平齐。

作为优选，所述储液瓶还与CO₂输入装置相连。

本发明的另一目的是提供一种上述模拟系统的使用方法。

技术方案是：一种使用上述用于研究肿瘤细胞上皮-间充质转化的细胞力学模拟系统的方法，该方法包括以下步骤：

①调节好恒流泵的流量，启动恒流泵，将储液瓶中的培养基泵入体外细胞力学模拟装置中；

②培养基从入口首先流入入口缓冲池，培养基在填满入口缓冲池后，沿体外细胞力学模拟装置长轴流动，并在剪切应力作用区域内形成充分发展的流场，其内每一点的速度不再随时间而改变；

③待液体在剪切应力作用区域内形成均匀的充分发展流场后，与剪切应力作用区域中央三块载玻片作用，使其表面受到均匀、持续的切应力；

④培养基流过剪切应力作用区域后，进入出口缓冲池，并经出口回到储液瓶；

⑤在进行了一段时间的剪切应力加载后，将载玻片取出，使用直接观察、免疫组织化学、免疫荧光、免疫印迹、流式细胞术或RT-PCR方法检测细胞相关分子，观察细胞形态和其他特征的变化，来确定细胞是否发生了上皮-间充质转化及局部迁移。

发明原理：本专利中这种用于研究肿瘤细胞上皮-间充质转化的细胞力学模拟系统就可以克服背景技术中的不足，准确地模拟体内流体剪切应力作用的状态，因为：

液体在进入剪切应力作用区域后并不是立即形成充分发展的流场，而是要有一个发展的过程。在发展过程中，其流场并不是均匀稳定的，对壁面的剪切应力自然也不是均匀的。这种从流体入口到充分发展流动之间流动状态随时间变化的现象我们称为入口效应。与之相对的是出口效应。另外，在靠近剪切应力作用区域两侧墙壁的部分，由于液体与墙壁的相互作用，其流场与中央的流场也不相同，这种现象称为墙壁效应。为了避免入口效应、出口效应和墙壁效应对剪切应力作用的影响，我们使用了数值模拟的方式来确定上述效应所涉及的范围，在设计载玻片槽位的时候尽量减少上述效应的影响。在流动腔作用区域的几何设计上，我们使用了下沉式（凹槽）的载玻片槽位设计方案，载玻片高度与槽位高度相同，使载玻片可以恰好填补腔内的空缺，载玻片放入后腔内剪切应力作用区域成为一个规则的立方体空间。在可供加载的细胞数量上，我们设计的装置采用了多个载玻片槽位串联的方式，槽位的数量可以根据需要在制作时改变。这样的设计有利于我们进行多个种植肿瘤细胞载玻片的剪切应力加载及研究它们的局部迁移和粘附能力。先在上游载玻片上种植肿瘤细胞、下游载玻片空白或进行特定处理（如包被纤连蛋白、细胞外基质等），然后进行力学处理，如果肿瘤细胞发生了EMT并进行了局部的迁移，则细胞会先从上皮表型转化为间充质表型，其细胞与细胞间的黏附、细胞与基底（玻片或纤连蛋白Fibronectin,FN）的黏附能力降低，运动能力增强，然后随液体流动方向移动。到达新的环境后，再由间充质表型转化为上皮表型，运动能力减弱，黏附能力增强，粘附在新的环境（下游载玻片）中。因此经过一段时间的剪切应力加载后，观察上下游载玻片上的细胞表型转换的动态情况，即可确定肿瘤细胞是否由上游的载玻片迁移到了下游载玻片，并成功发生上皮-间充质转化。进一步，我们可以对这些细胞进行分子、影像等检测。

与现有技术相比，本发明的有益效果在于：

首先，该系统具有较长的剪切应力作用区域长度，使流场有足够的时间与空间充分发展；

其次，该系统将载玻片置于整个剪切应力作用区域的中心，尽量使细胞所在的部位受到相同的剪切应力，不会因为靠近边缘而使不同细胞的受力差别过大；

再次，该系统内部空间足够大，可以同时对多张载玻片上的肿瘤细胞进行流体剪切应力加载，并观察细胞局部迁移与粘附能力，以及上皮-间充质转化的动态过程。如果肿瘤细胞发生了EMT并进行了局部的迁移，则细胞会先从上皮表型转化为间充质表型，其细胞与细胞间的黏附、细胞与基底（玻片或FN）的黏附能力降低，运动能力增强，然后随液体流动方向移动。到达新的环境后，再由间充质表型转化为上皮表型，运动能力减弱，黏附能力增强，粘附在新的环境。因此结合细胞形态、功能、分子标记等的变化，该系统为我们研究剪切应力与EMT的关系创造了条件，为研究癌细胞转移提供了一种新的途径。如果需要，该系统还可以调整载玻片槽位的数量。

附图说明

图1为本发明整体结构示意图；

图2为本发明体外细胞力学模拟装置下板立体结构示意图；

图3为本发明体外细胞力学模拟装置下板俯视图示意图；

图4为本发明肿瘤细胞发生局部迁移与粘附示意图；

图5为本发明数值模拟的流场区域示意图；

图6为本发明壁面剪切应力数值0.1g/s模拟结果示意图；

图7为本发明壁面剪切应力数值0.3g/s模拟结果示意图；

图8为本发明壁面剪切应力数值0.5g/s模拟结果示意图；

图9为本发明壁面剪切应力数值0.8g/s模拟结果示意图；

图10为本发明壁面剪切应力数值（底面）0.1g/s模拟结果示意图；

图11为本发明壁面剪切应力数值（底面）0.3g/s模拟结果示意图；

图12为本发明壁面剪切应力数值（底面）0.5g/s模拟结果示意图；

图13为本发明壁面剪切应力数值（底面）0.8g/s模拟结果示意图；

图14为本发明壁面剪切应力数值（底面）0.1g/s均匀的范围示意图；

图15为本发明壁面剪切应力数值（底面）0.3g/s均匀的范围示意图；

图16为本发明壁面剪切应力数值（底面）0.5g/s均匀的范围示意图；

图17为本发明壁面剪切应力数值（底面）0.8g/s均匀的范围示意图。

具体实施方式

下面将结合附图对本发明作进一步说明。

一种用于研究肿瘤细胞上皮-间充质转化的细胞力学模拟系统，由一个体外细胞力学模拟装置1、装载循环液体的储液瓶3和一个提供动力的恒流泵2组成（图1）。体外细胞力学模拟装置1由上、下两块板构成，上板为一块完整的板，构成装置的顶部；下板中空，包括液体的入口4、入口缓冲池5、剪切应力作用区域13、出口缓冲池9和出口10。在体外细胞力学模拟装置1外围设有一圈硅胶圈11以将内部空间密封，防止体外细胞力学模拟装置1内液体逸出；上下板通过螺丝钉与六角螺帽固定。入口4、出口缓冲池9与载玻片槽位（第一载玻片放置槽6、第二载玻片放置槽7和第三载玻片放置槽8）均为下沉式（凹槽），入口4、出口缓冲池9的顶部与剪切应力作用区域13的顶部平齐，载玻片槽位（第一载玻片放置槽6、第二载玻片放置槽7和第三载玻片放置槽8）顶部与剪切应力作用区域13底部平齐。剪切应力作用区域13（剪切应力加载区域）中，从入口缓冲池5出口到第一载玻片槽6的长度与第三一个载玻片槽8到出口缓冲池9入口的长度均为44.5mm，剪切应力作用区域13宽度为95.0mm，高度为0.6mm；载玻片槽位居中串联放置，载玻片长轴与装置长轴垂直，载玻片采用75mm×25mm×1mm规格，载玻片槽位大小与载玻片大小相同，各槽位之间距离为0.5cm，距两侧墙壁的距离均为1.0cm，以使载玻片处于充分发展的流场中。载玻片槽位个数可根据需要改变。入口4与出口缓冲池9长度与高度均为1.0cm，宽度为9.5cm，入口4与出口10位于缓冲池宽的正中。入口4管道与恒流泵2连接，出口10管道与储液瓶3相连接。在体外细胞力学模拟装置1外围设有一圈硅胶圈11以将内部空间密封，防止体外细胞力学模拟装置1内液体逸出；上下板通过螺丝钉与六角螺帽固定（图2、图3）与螺丝孔12。储液瓶3有三个口，分别连接恒流泵2、体外细胞力学模拟装置1和CO₂发生装置（如果需要）。恒流泵2为系统中的液体提供持续、均匀的动力。储存于储液瓶3中的液体通过恒流泵2的作用经入口4流入入口缓冲池5，再流过剪切应力作用区域13并与该区域载玻片上的细胞进行作用，之后经出口缓冲池9、出口10，流出到储液瓶2中，如此循环，组成一个定常流加载系统。该体外细胞力学模拟装置1可以放置多张载玻片，对种植于其上的肿瘤细胞进行剪切应力加载，并研究细胞的上皮-间充质转化和局部迁移、粘附的能力。进行剪切应力加载的流场均匀稳定，且通过流量的调节可以实现不同大小的剪切应力加载。可以在体外对多张载玻片上的细胞进行持续的流体剪切应力加载，且可通过不同的流量而对细胞施加不同大小的剪切应力。该系统可用于观察种植于载玻片上的肿瘤细胞受流体剪切应力作用后的上皮-间充质转化情况，并且可以通过串联的载玻片观察上游细胞在经过剪切应力作用后的局部迁移和粘附至下游载玻片的能力。经该系统处理后的细胞可以用于进一步的观察、培养、鉴定等相关实验。

实施例：（图1）一种用于研究肿瘤细胞上皮-间充质转化的细胞力学模拟系统，由提供流体动力的恒流泵2、储液瓶3（该实施例液体采用含5%胎牛血清的RPMI1640培养基）、实施流体剪切应力加载的体外细胞力学模拟装置1及将三者相连的导管组成。其中储液瓶3拥有三个管口，分别连接恒流泵2、体外细胞力学模拟装置1和CO₂输入装置。体外细胞力学模拟装置1由有机玻璃板制成。整个装置水平放置，置于37℃的环境中。

该实施例采用三联设计（图2、图3），即在体外细胞力学模拟装置1的作用区域内串联排列三个载玻片槽位，可同时放置三张载玻片。使用前准备好用于力学加载的培养基，利用壁面剪切应力计算公式：

$\mathrm{\τ}=\frac{6\mathrm{\μQ}}{H^{2}W}$

计算出模拟剪切应力τ所需的流量Q，以便控制恒流泵的流量。公式中τ为均匀的充分发展的流场中间某点所受的切应力大小；μ为流体的粘滞系数；Q为单位时间内流过作用区域某一横截面的流量；w为体外细胞力学模拟装置作用区域的宽度；h为体外细胞力学模拟装置作用区域的高度。

本实施例采用1.4dyn/cm²的低剪切应力与细胞进行作用，使用公式计算得到相应的流量应调整为57.2ml/min。将已经包被好纤连蛋白（fibronectin，FN）、种好细胞（此处使用人喉鳞癌细胞Hep-2）的载玻片放入体外细胞力学模拟装置1下板的载玻片上游槽位内（第一载玻片放置槽6），下游两张（第二载玻片放置槽7和第三载玻片放置槽8）为仅包被FN、无细胞的载玻片。载玻片与槽的高度均相等。用硅胶垫和螺丝将体外细胞力学模拟装置1密封，出口10、入口4接入系统。调节好恒流泵2的流量，启动恒流泵2，将储液瓶3中的培养基泵入体外细胞力学模拟装置1中。培养基从入口4首先流入入口缓冲池5，在这里其流场会得到缓冲，避免高速、不均匀地冲入剪切应力作用区域13内。并且由于剪切应力作用区域13为入口缓冲池5和出口缓冲池9顶部的延伸，在液体填充入口缓冲池5和出口缓冲池的过程中可以排走气体，避免气体滞留对流场造成影响。培养基在填满入口缓冲池5和出口缓冲池后，沿体外细胞力学模拟装置1长轴流动，并在剪切应力作用区域13内形成充分发展的流场，其内每一点的速度不再随时间而改变。待液体在剪切应力作用区域13内形成均匀的充分发展流场后，与剪切应力作用区域13中央三块载玻片作用，使其表面受到均匀、持续的切应力。培养基流过剪切应力作用区域13后，进入出口缓冲池，并经出口回到储液瓶3。

在进行了一段时间的剪切应力加载后，将载玻片取出，也可以在该循环系统中提取脱离粘附后的细胞，使用直接观察、免疫组织化学、免疫荧光、免疫印迹、流式细胞术、RT-PCR等方法检测细胞相关分子，观察细胞形态和其他特征的变化，来确定细胞是否发生了上皮-间充质转化及局部迁移。

对于在体外细胞力学模拟装置1内的液体能否形成充分发展的流场并对底面施加均匀的剪切应力，我们进行了数值模拟。数值模拟采用有限元体积法，在软件ANSYS14.0中完成。先使用Gambit2.4.6构建几何模型，然后在ANSYSFLUENT自带的工具中进行自动的网格划分，指定好边界条件、初始条件与模型，进行迭代求解并输出结果。

数值模拟模型的几何尺寸与实例模型严格一致（图5）。计算区域的网格划分由软件自动完成，在作用区域主要为立方体，在缓冲池区域主要为四面体单元。网格划分后模型拥有62509个单元。液体使用的液态水（密度0.998g/cm³，粘度0.01g/(cms)），以流量作为初始条件，控制方程使用SIMPLC方法求解。当迭代残差小于10^-4时，认为计算结果是收敛的。

我们分别计算了流量为1.0g/s、3.0g/s、5.0g/s、8.0g/s时的壁面剪切应力分布，计算结果如图6～图17所示。其中图6～图9为整体壁面剪切应力分布情况，图10～图13为与肿瘤细胞剪切应力加载相关的剪切应力作用区域13底面剪切应力分布情况，图14～图17为剪切应力作用区域13底面剪切应力均匀分布的范围。我们取剪切应力作用区域13底面中央的剪切应力大小作为标准，与其大小相差在5%以内的区域我们认为其剪切应力作用是均匀的。图14～图17中的绿色部分即为均匀剪切应力分布的区域。可以看到在液体在进入作用区域后，经过一段距离，其剪切应力分布即达到均匀分布，但这段距离根据流量的增加而增加。在流量不大于5.0g/s时，在底面能作为剪切应力加载的矩形区域（图14～图17的矩形框）均在115.8mm×90mm以上，距剪切应力作用区域13入口和两侧边缘的距离均小于40mm和6mm，低于体外细胞力学模拟装置1设计的44.5mm和10mm，可以说我们的设计是可以保证载玻片上的细胞均受到均匀一致的剪切应力的。

Claims (8)

1.一种用于研究肿瘤细胞上皮-间充质转化的细胞力学模拟系统，其特征在于：该用于研究肿瘤细胞上皮-间充质转化的细胞力学模拟系统包括恒流泵、储液瓶、体外细胞力学模拟装置，所述恒流泵、储液瓶和体外细胞力学模拟装置通过导管串联成封闭圆环。

2.根据权利要求1所述的用于研究肿瘤细胞上皮-间充质转化的细胞力学模拟系统，其特征在于：所述体外细胞力学模拟装置包括上板和下板，所述上板包括一有机玻璃上基板，所述下板包括一有机玻璃下基板，该有机玻璃下基板上顺次设置有入口、入口缓冲池、出口缓冲池和出口，所述入口缓冲池与出口缓冲池之间为剪切应力作用区域，该剪切应力作用区域内设置有第一载玻片放置槽、第二载玻片放置槽和第三载玻片放置槽；所述体外细胞力学模拟装置上还设置有一圈硅胶圈放置槽。

3.根据权利要求2所述的用于研究肿瘤细胞上皮-间充质转化的细胞力学模拟系统，其特征在于：所述剪切应力作用区域从入口缓冲池出口到第一载玻片放置槽长度与第三载玻片放置槽到出口缓冲池入口的长度均为44.5mm，所述剪切应力作用区域宽度为95.0mm，高度为0.6mm；第一载玻片放置槽、第二载玻片放置槽和第三载玻片放置槽居中串联放置，所述第一载玻片放置槽、第二载玻片放置槽和第三载玻片放置槽长轴与所述有机玻璃下基板长轴垂直；所述入口与出口缓冲池长度与高度均为1.0cm，宽度为9.5cm，所述入口位于入口缓冲池的正中，所述出口位于出口缓冲池的正中。

4.根据权利要求2所述的用于研究肿瘤细胞上皮-间充质转化的细胞力学模拟系统，其特征在于：所述第一载玻片放置槽、第二载玻片放置槽和第三载玻片放置槽居中放置的载玻片均为75mm×25mm×1mm，与第一载玻片放置槽、第二载玻片放置槽和第三载玻片放置槽大小相同，相邻两个载玻片放置槽之间距离为0.5cm，每个载玻片放置槽与所述剪切应力作用区域两边的距离为1.0cm。

5.根据权利要求2所述的用于研究肿瘤细胞上皮-间充质转化的细胞力学模拟系统，其特征在于：所述上板和下板通过螺丝钉和六角螺帽固定。

6.根据权利要求2所述的用于研究肿瘤细胞上皮-间充质转化的细胞力学模拟系统，其特征在于：所述入口、出口缓冲池、载玻片槽位均为凹槽，所述入口顶部、出口缓冲池的顶部与剪切应力作用区域的顶部平齐，载玻片槽位顶部与剪切应力作用区域底部平齐。

7.根据权利要求1所述的用于研究肿瘤细胞上皮-间充质转化的细胞力学模拟系统，其特征在于：所述储液瓶还与CO₂输入装置相连。

8.一种使用权利要求1-7所述的用于研究肿瘤细胞上皮-间充质转化的细胞力学模拟系统的方法，该方法包括以下步骤：

①调节好恒流泵的流量，启动恒流泵，将储液瓶中的培养基泵入体外细胞力学模拟装置中；

②培养基从入口首先流入入口缓冲池，培养基在填满入口缓冲池后，沿体外细胞力学模拟装置长轴流动，并在剪切应力作用区域内形成充分发展的流场，其内每一点的速度不再随时间而改变；

③待液体在剪切应力作用区域内形成均匀的充分发展流场后，与剪切应力作用区域中央三块载玻片作用，使其表面受到均匀、持续的切应力；

④培养基流过剪切应力作用区域后，进入出口缓冲池，并经出口回到储液瓶；

⑤在进行了一段时间的剪切应力加载后，将载玻片取出，使用直接观察、免疫组织化学、免疫荧光、免疫印迹、流式细胞术或RT-PCR方法检测细胞相关分子，观察细胞形态和其他特征的变化，来确定细胞是否发生了上皮-间充质转化及局部迁移。

Images